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Verfahren zur Darstellung ; von neuen Hormonen aus Testikeln.
Es wurden bereits verschiedene Hodenpräparate therapeutisch verwendet-in den letzten Jahren in immer abnehmendem Masse-, ohne dass aber bisher aus Hodenextrakten eine definierte chemische Verbindung gewonnen worden wäre. Das Spermin (C2HúN ?), eine angeblich piperazinähnliche Base, die früher für das aktive Prinzip gehalten worden ist, kommt in verschiedenen Organen vor und ist auch
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von den unwirksamen Beimengungen zu befreien und aus dem so isolieitpn Gemisch zwei genau definierte Verbindungen zu gewinnen, wobei es vorläufig dahingestellt bleiben mag, in welcher Weise diese beiden chemischen Individuen zusammenwirken, bzw. einander ergänzen.
Das Verfahren geht in der Anfangsstrecke einen gleichartigen Weg, wie ihn der Erfinder und sein Mitarbeiter Dr. Herrmann in den öbterr. Pat. Nr. 71382, Nr. 75153 und Nr. 75154 zur Darstellung eines neuen Hormons aus weiblichen innersekretorischen Organen beschrieben hat. Nach diesen bekannten Verfahren wird der physiologisch wirksame Stoff durch Extraktion des geeigneten Ausgangsmaterials neben Phosphatiden und sonstigen Beimengungen in Lösung gebracht, worauf man die Phosphatide ausfällt und das Hormon aus der Mutterlauge durch Befreiung von beigemengten Fetten, Cholesterin und Cholesterinestern isoliert.
Es ist ferner schon vorgeschlagen werden, Extrakte aus weiblichen innersekretorischen Drüsen (Plazenten, Ovarien oder corpora lutea) durch Fällung mit Bieiazetat, allenfalls in Kombination mit einer Tieftemperaturbehandlung zu reinigen (D. R. P. Nr. 430770).
Es hat langwieriger und schwieriger Untersuchungen bedurft, um physiologisch wirksame Stoffe aus Testikeln zu isolieren. Dass sich nach vielen Vorversuchen der Weg an den Gang zur Darstellung von Hormonen aus weiblichen Drüsen schliesslich angenähert hat, war keineswegs etwas, elbstverständlich Voraussehbares, sondern das letzte Ergebnis sorgfältiger Experimentaiforschung.
Gemäss der vorliegenden Erfindung werden aus einem Hodenextrakt, der entweder unmittelbar
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wässerigen Auszugs von tierischen Hoden und Extraktion dieses Auszugs mit flüchtigen Lösungsmitteln gewonnen wurde, die Phosphatide, Fette und Cholesterinverbindungen ausgeschieden und der so vorgereinigte Extrakt hernach mit Fettsäurefällungsmitteln behandelt und nach Abtrennung von den ausgeschiedenen Fettsäuren vom Lösungsmittel befreit.
Als Ausgangsmaterial dienen entblutete, feuchte oder getrocknete Testikel. Das zur Herstellung des Extraktes verwendete Lösungsmittel kann wasserlöslich sein, wie z. B. Alkohol, oder auch wasserunlöslich, wie beispielsweise Benzol. Der Extrakt kann unmittelbar durch Extraktion der Testikel mit flüchtigen Lösungsmitteln gewonnen werden. Das Gewebe kann aber auch mit angesäuertem Wasser ausgezogen und erst der eingeengt Auszug mit dem flüchtigen Lösungsmittel behandelt werden. Der auf die eine oder andere Art gewonnene Extrakt wird zunächst durch Ausfällung der Phosphatide von diesen Begleitstoffen befreit.
Zu diesem Zweck wird die Lösung eingeengt und beispielsweise mit Azeton versetzt oder nach völliger Verdampfung des Lösungsmittels mit Azeton erschöpfend ausgeholt. Der zweite Schritt ist die Entfernung der beigemengten Fette und Clrolesterinverbindul1gen, welche z. B. aus der azetonischen Lösung in der Kälte auskristallisieren. Dasselbe Ziel kann aber auch durch Fällung mit kaltem Alkohol, vorzugsweise Methylalkohol, erreicht werden. Selbstverständlich kann man auch diese beiden Methoden miteinander verbinden.
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Die von den ausgefällten und auskristallisierten Beimengungen getrennte Lösung wird nun einem Teilverfahren unterworfen, das die Entfernung der Fettsäuren und sonstigen noch vorhandenen unwirksamen Beimengungen zum Ziel hat. Zu diesem Behuf wird die Lösung mit geeigneten Fettsäuleffä] lungs-
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Die im Syrup enthaltenen beiden Verbindungen lassen sich auf zwei verschiedene Arten voneinander trennen.
Nach der einen Methode wird der Syrup in absolutem Äther oder Methylalkohol aufgenommen und auf tiefe Temperatur abgekühlt. Hiebei scheidet sich ein kristallinischer Niederschlag aus der Lösung ab. Durch Konzentration des Äthers erhält man noch weitere Ausscheidungen. Die au-kri'-tallisierte Verbindung zerfliesst bei Zimmertemperatur wieder zu einem Öl. Aus den Mutterlaugen gewinnt man die zweite Verbindung durch Verdunstenlassen des Lösungsmittels.
Nach einer zweiten Methode wird die verschiedene Löslichkeit der Halogenadditionsprodukte zur Trennung der beiden Verbindungen benutzt. Werden die Hormone beispielsweise in ätherischer Lösung bromiert, so kristallisiert das eine Bromid sogleich aus. Dieses ist in den gewöhnlichen Lösungsmitteln
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zeigt den Schmelzpunkt (Zersetzungspunkt) 195-200''und entspricht der empirischen Formel CHBrO. Durch Reduktionsmittel, welche gelinde einwirken, z. B. Zinkstaub, kann die Verbindung ; eder ent- bromt werden. Man erhält in dieser Weise eine syruspöse, in der Kälte kristallisierende Lösung.
Die ätherische Mutterlauge wird, nach rascher Entfernung des überschüssigen Broms mit Hilfe
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der zweiten Verbindung durch Abdunsten und eventuelles Waschen mit geringen Mengen von Methylalkohol oder einem gleichwertigen Lösungsmittel gewonnen. Diese Verbindung enthält nach der Analyse 19 oder 20 Kohlenstoffatome, 4 Bromatome, 3 Sauerstoffatome und 32-36 Wasserstoffatome. Sie ist also als Tetrabromid einer doppelt ungesättigten Verbindung aufzufassen ; da sie sieh mit Natriumäthylat verseifen lässt, scheint ein Lakton vorzuliegen. Auch diese Verbindung kann mit einem milden Reduktionsmittel entbromt werden.
Ausführungsbeispiele :
1. Entblutete Testikeln werdengetroeknet und mit Alkhol extrahiert, worauf man das Lösungsmittel aus dem Extrakte vollständig verjagt und den Rückstand mit Azeton erschöpfend extrahiert. Die aze- tonige Lösung wird in die Kälte gestellt und hernach von den ausgefällten und auskristallisierten Sub- stanzen durch Filtration befreit. Das vom Azeton vollkommen befreite Filtrat wird in Methylalkohol aufgenommen und mit einer neutralen oder schwach ammoniakalischen Lösung von Bleiaztat so lange versetzt, als noch eine Fällung auftritt. Man filtriert vom Niederschlag ab, konzentriert die Lösung im Vakuum, giesst sie in Wasser und nimmt das Öl mit leichtsiedendem Petroiäther auf.
Die Lösung wird mit Wasser bleifrei gewaschen und sodann mit Kalium-, Natrium- oder Silbersulfatlösung geschüttelt, filtiiert, gewaschen und getrocknet. Wenn die Lösung keine Bleireaktion mehrgibt, wird sie im Vakuum abgedunstet.
2. Der nach dem Ausführungsbeispiel 1 hergestellte syrupöse Rückstand wird in absolutem Äther oder Methylalkohol gelöst und mit einer Kältemischung für Tieftemperaturen abgekühlt. Der hiebei entstehende kristallinische Niedersehlag wird auf gut gekühlten Filtern gesammelt und mit sehr k :) ! tem Äther ausgewaschen. Die ätherische Lösung wird eingeengt und von den weiteren Ausscheidungen in gleicher Weise getrennt. Nach dem Verjagen des Äthers aus der Mutterlauge erhält man als Rückstand die zweite Verbindung.
3. Der nach dem Beispiel 1 gewonnene syrupöse Rückstand wird in absolutem Äther gelöst und die ätherische Lösung mit einem kleinen Überschuss einer genau eingestellten ätherischen Bromlösung
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Die Mutterlauge enthält das Tetrabron d@ der laktonartigen Substanz. Der durch Umkdsta11isieren aus siedendem Eisessig gereinigte kristallinische Niederschlag wird mit verkupfertem Zinkstaub entbromt.
Zu diesem Zweck wird Zinkstaub mit 1 iger Salz-äuie einige Minuten gekocht, um die Oberfläche vom Oxyd zu befreien. Nach Entfernung der Säure wird das Zink mit einer #%igen Kupfersulfatlösung so
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gewaschen. Das so hergestellte verkupferte Zink wird der in Alkohol suspendierten Substanz zugesetzt, worauf man die Mischung mehrere Stunden lang erwärmt. Das eingeengte Filtrat wird in Wasser gegossen und mit Äther aufgenommen. Die Losing enthält den gesuchten Körper.
Die das Tetrabromid des laktonartigen Korpers enthaltende ätherische Mutterlauge wird möglichst
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noch mit Methylalkohol od. dgl. gewaschen werden kann. Die Entbromung erfolgt in der oben beschriebenen Weise.
PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Darstellung'von neuen Hormonen aus Testikeln, dadurch gekennzeichnet, dass aus einem Hodenextrakt, der entweder unmittelbar durch Extraktion von tierischen Hoden mit flüchtigen Lösungsmitteln oder durch Bereitung eines sauren wässerigen auszuges von tierischen Hoden und Extraktion dieses Auszugs mit fluchtigen Lösungsmittelngewonnen wurde, die Phosphatide, Fette und Cholesteiin- verbindungen ausgesehieden werden und der so vorgereingte Extrakt hernach mit Fettsäurefällungsmitteln behandelt und nach Abtrennung von den ausgesehledenen Fettsäuren vom Lösungsmittel befreit wird.