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Verfahren zur Darstellung eines chemisch reinen Hormons aus weiblichen
innersekretorischen Organen Es sind bereits eine Anzahl von Verfahren bekannt, um
aus weiblichen innersekretorisehen Organen physiologisch wirksame Stoffe in mehr
oder weniger hochgereinigter Form zu gewinnen. Aber auch die reinsten bisher erhaltenen
Produkte konnten, ungeachtet ihrer ziemlich konstanten Zusammensetzung und ihrer
wohldefinierten, chemischen und physikalischen Eigenschaften, nicht mit Sicherheit
als chemisch einheitliche Körper angesprochen werden.
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Gegenstand vorliegender Erfindung ist nun ein Verfahren, welches die
Isolierung eines neuen Hormons aus weiblichen innersekretorischen Organen in chemisch
reiner Form als wohldefinierte, chemisch einheitliche Verbindung gestattet.
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Als Ausgangsmaterial für das Verfahren dienen vorgereinigte Extrakte
aus weiblichen innersekretorischen Organen. Zur Reinigung werden in bekannter Weise
Phosphatide, Cholesterin, Cholesterinester, Fette sowie die freien Fettsäuren entfernt,
letztere zweckmäßig durch Fällung mit fettsäurefällenden Salzen von Schwermetallen
oder alkalischen Erden in solchen organischen Lösungsmitteln, in denen die entstehenden
Metallseifen unlöslich sind. Als Fettsäurefällungsprodukte haben sich insbesondere
neutrales oder schwach ammoniakalisches Bleiacetat sowie Acetate alkalischer Erden
in inethylalkoholischer Lösung bewährt. Das neue Verfahren besteht nun darin, daß
man das von Metallseifen und überschüssigen Metallsalzen sowie vom Lösungsmittel
befreite Extrakt in Petroläther aufnimmt und zur Entfernung von Resten in Petroläther
löslicher Metallseifen ungesättigter Fettsäuren mit einem Elektrolyten behandelt,
dessen Kationen mit diesen Säuren und dessen Anionen mit dein in Petroläther gelösten
Kation, z. B. Blei, in Petroläther umlösliche Salze geben, wie Kalium- oder Natriumsulfat,
Silbernitrat. Auf diese Weise erhaltenes hochkonzentriertes Hormon kann noch einer
weiteren Reinigung unterzogen werden. Letztere erfolgt zweckmäßig auf folgende beiden
Weisen: i. Man konzentriert die Lösung des Hormons in einem geeigneten, absoluten
Lösungsmittel, z. B. trockenem Äther, und friert die Lösung bei sehr , niedriger
Temperatur (zweckmäßig unterhalb - 5o' C_) aus, wobei die wirksame Substanz
sich kristallinisch abscheidet. Gewünschtenfalls kann man dieselbe aus Äther u.
dgl. in der Kälte umkristallisieren.
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2. Man führt das Hormon in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise
Äther oder Eisessig, mittels Brom in sein Dibromid über, woraus durch Entbromung,
vorzugsweise mit verkupfertem oder amalgamiertein Zinkstaub, das Hormon in reiner
Form gewonnen werden kann.
Die neue Substanz ist schwach hellgelb
gefärbt und unter o0 C kristallinisch. Sie ist gegenüber Sauerstoff und Luft
etwas empfindlich, worauf bei der Isolierung und Aufbewahrung Rücksicht zu nehmen
ist. Die Elementaranalyse und Molekulargewichtsbestimmung verweisen auf die Formel
C"H, .# 0, Das Hormon ist ein Lakton einer Oxysäure mit einer Doppelbindung zwischen
dem 12. und 13. Kohlenstoffatorn, was sowohl die Oxydation als auch die Ozonisierung
beweisen. Die durch Aufspaltung des Laktons erhaltene Oxysäure ervkicht bei 35'C
und schmilzt bei et-,va 4o1' C.
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Das neue Hormon ist in Methylalkohol, Äthylalkohol, Äther, Petroläther
und Benzol leicht löslich. Es zeigt in Methylalkohol die optische
Es gibt folgende Reaktionen: Reaktion von C a r r und P r i c e negativ,
Reaktion von Raspail und Pottenk o f e r positiv, Reaktion von F e a r o
n negativ.
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Die Chloroformlösung gibt mit Schwefelsäure und Essigsäureanhydrid
eine Rotfärbung, welche schnell in eine bleibende Braunfärbung übergeht.
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Durch Behandlung der Substanz mit Thionylchlorid und Hydrazinhydrat
erhält man einen in feinen Nadeln kristallisierten Körper vom Schmelzpunkt 104,5'
C, welcher als dimolekulares Hydrazid mit eine Ätherbrücke aufgefaßt wird.
Ihm kommt die Formel C82H6603N4 ZU.
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Von der in der Patentschrift 309 482, beschriebenen, durch
Vakuumdestillation gereinigten, wirksamen Substanz: aus weiblichen innersekretorischen
Organen unterscheidet sich das Produkt des vorliegenden Verfahrens in mehrfacher
Hinsicht, u. a. durch seinen niedrigeren Kohlenstoff- und seinen höheren Wasserstoff-
und Sauerstoffgehalt und durch seine optische Aktivität.
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Das neue Hormon bewirkt in geringen Dosen starke Vergrößerung der
weiblichen Sexualorgane und Auslösung der Brunst bei kastrierten Tieren. Das Hormon
soll zu therapeutischen Zwecken verwendet werden. Beispiel i i Teil entblutete und
getrocknete Placenta wird feinst gepulvert und im Extraktionsapparat mit Benzol
oder einem anderen Lösungsmittel, z. B. Alkohol, bis zur Erschöpfung extrahiert.
Das Lösungsmittel wird hierauf möglichst abdestilliert und der Rückstand mit dem
mehrfachen Volumen Aceton aufgenommen. Der in Aceton unlösliche Anteil wird abfiltriert
und mehrmals mit dem halben Gewichte an Aceton aufgekocht. Die Filtrate werden hierauf
mit dein Hauptfiltrat vereinigt, worauf man die acetonige Lösung kalt stellt und
hernach von den ausgefällten und auskristallisierten Substanzen durch Filtrieren
befreit. Das Aceton wird abdestilliert und der Rückstand Mit 2 Teilen Methylalkohol
aufgenommen. Dieses wird so lange wiederholt, bis sich die Substanz sowohl in Methylalkohol
als auch in Aceton und in Äther ohne Trübung löst. Hierauf wird sie in methylalkoholischer
Lösung mit einer schwach ammoniakalischen, methylalkoholischen Bleiacetatlösung
so lange versetzt, als noch eine Fällung auftritt. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt
und hernach in Wasser gegossen. Hierauf wird mehrmals mit Petroläther ausgeschüttelt
und die Petrolätherlösung zur Entfernung des überschüssigen Bleiacetats so lange
mit Wasser geschüttelt, bis das Wasser keine Bleireaktion mehr gibt.
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Zur Entfernung von in Petroläther löslichen Bleiseifen aus dem so
vorgereinigten Extrakt schüttelt man die petrolätherische Lösung tüchtig mit einer
wässerigen Lösung von Natriumsulfat, bis eine filtrierte Probe des Petroläthers
mit Schwefelammonium nicht mehr Bleireaktion zeigt. Es scheiden sich hierbei die
gefällten Natriumseifen sowie Bleisulfat ab. Sollte die petrolätherische Lösung
noch immer Spuren Blei enthalten, so wird das Lösungsmittel im Vakuum vollständig
verjagt, der Rückstand mit wenig Methylalkohol aufgenommen und der bleibaltige Rückstand
verworfen.
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Die in dieser Weise von Fettsäuren befreite Petrolätherlösung wird
hierauf eingeengt und der Rückstand in absolutem Äther aufgenommen. Die ätherische
Lösung engt man bis zur passenden Konzentration ein und friert sie mit.einem Gemisch
von Kohlensäureschnee und Äther aus. Die wirksame Substanz scheidet sich in Kristallen
ab und kann durch Dekantieren oder durch geeignetem Absaugevorrichtungen von der
ätherischen Mutterlauge getrennt werden. Zwecks weiterer Reinigung kann das so erhaltene
Hormon nochmals in Äther gelöst und hieraus durch Kälte abgeschieden werden. Aus
den #lutterlaugen erhält man durch passendes Konzentrieren und Ausfrieren weitere
Mengen der Substanz, welche man nun bis zur Analysenreinheit umkristallisieren kann.
Die Substanz zeigt die in der Einleitung beschriebenen Eigenschaften. Beispiel 2
i Teil eines nach Beispiel i vorgereinigten Extraktes aus Ovarien wird in
3 Teilen Petroläther aufgenommen. Die Lösung wird zur Entfernung von in Petroläther
löslichen Bleiseifen mit einer konzentrierten Silbernitratlösung
mehrmals
ausgeschüttelt, bis im Petrolätlier keine Bleireaktion mehr nachgewiesen werden
kann. Man engt den metallfreien Petrolätherauszug ein, nimmt den Rückstand mit Äther
oder Eisessig auf und setzt die durch einen kleinen Vorversuch ermittelte Menge
Brom in ätherischer oder eisessigsaurer Lösung hinzu. Die von einer etwaigen geringen
Abscheidung abfiltrierte Lösung wird vorerst mit Soda oder einem gleichwertigen
Mittel von überschüssigem Brom befreit, hierauf das Lösungsmittel im Vakuum entfernt,
der Rückstand mit der mehrfachen Menge verkupfertem oder amalgarniertem Zinkstaub
so lange in alkoholischer Lösung gekocht, bis das Brom entfernt ist. Hierauf wird
vom Zink abfiltriert, in Wasser gegossen und mit einem Lösungsmittel ausgeschüttelt.
Letzteres wird so lange mit Wasser geschüttelt, bis das Wasser keine Zink- oder
Bromreaktion mehr gibt, Hierauf wird im Vakuum vom Lösungsmittel befreit, wobei
das neue Hormon in reinem Zustande hinterbleibt. Es ist identisch mit dem nach Beispiel
i gewonnenen Produkt.