FR2591606A1 - Composition a utiliser dans un systeme biphasique ou multiphasique pour l'extraction, la purification, la concentration et/ou la separation de substances biologiques. - Google Patents
Composition a utiliser dans un systeme biphasique ou multiphasique pour l'extraction, la purification, la concentration et/ou la separation de substances biologiques. Download PDFInfo
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Abstract
Composition à utiliser dans un système biphasique ou multiphasique pour l'extraction, la purification, la concentration et/ou la séparation de substances biologiques. La composition est caractérisée en ce qu'elle contient un hydroxyalkyl-amidon présentant un degré moyen de substitution supérieur à 0,02 groupes hydroxyalkyles par motif glucose et une masse moléculaire moyenne inférieure à 800 000, de préférence d'au plus 400 000, et mieux encore, d'au plus 250 000.
Description
La présente invention concerne une composition à utiliser dans un système
biphasique ou multiphasique pour l'extraction, la purification, la concentration et/ou la
séparation de substances biologiques.
Des systèmes biphasiques ou multiphasiques sont décrits dans "Partition of Cell Particles and Macromolecules" NY o (1971), du Pr. Per-Ake Albertsson. Ces systèmes sont faits
pour rendre possible la réalisation d'une extraction liquide-
liquide de macromolécules biologiques, par exemple les protéines et les acides nucléiques, et de particules, par exemples les membranes cellulaires, les organites cellulaires,
les cellules et les virus.
On obtient lesdits systèmes en mélangeant des solutions aqueuses de deux substances polymères ou plus. Les différentes solutions de polymères sont enrichies, chacune dans une phase. La composition et les volumes des phases dépendent de la nature et des masses moléculaires des polymères, de
leur concentration et de la température.
Les propriétés, qui sont uniques pour ces systèmes, et qui les rendent utiles dans l'extraction, la purification,
la concentration et/ou la séparation de substances biolo-
giques, sont la très haute teneur en eau des phases liquides, souvent de 85-99 %, et la possibilité de traiter aussi bien des substances solubles que des substances formées de
particules.
Les systèmes qui se sont antérieurement révélés comme ayant les propriétés les plus avantageuses en ce qui concerne les temps de séparation et la répartition des
substances biologiques entre les phases polymères sont cons-
titués des polymères dextranes et du polyéthylèneglycol (PEG). Les polymères dextranes sont si chers qu'un emploi industriel dans un système biphasique est impossible d'un point de vue économique. De plus, le dextrane engendre également une viscosité assez élevée dans la phase contenant le dextrane. Ceci provoque une prolongation du temps de traitement. Albertsson a essayé un certain nombre de systèmes
biphasiques de polymères à base d'autres polymères hydro-
solubles que le PEG et les dextranes. Ces autres systèmes de polymères présentent plusieurs inconvénients tels qu'une stabilité médiocre, de mauvaises propriétés de partage, ou une viscosité élevée qui s'accompagne de temps de séparation
irraisonnablement longs.
Ce que l'on exige d'un polymère qui pourrait remplacer le dextrane dans les systèmes ci-dessus mentionnés,
lorsque l'on doit les utiliser pour le traitement de subs-
tances biologiques sur une grande échelle, c'est que le prix du polymère soit suffisamment bas, que sa viscosité soit faible, et que les propriétés de partage du système formé soient aussi bonnes, ou meilleures, que celles de systèmes
contenant du dextrane.
De façon tout à fait surprenante, il est maintenant possible, selon la présente invention, de satisfaire aux exigences ci-dessus, et de fournir une composition à employer dans un système biphasique ou dans un système multiphasique pour l'extraction, la purification, la concentration, et/ou la séparation de substances biologiques. Cette composition
est caractérisée en ce qu'elle contient de l'amidon hydroxy-
alkylé, qui présente un degré moyen de substitution supérieur à 0,02 groupes hydroxyalkyles par motif glucose, et une
masse moléculaire moyenne inférieure à 800 000.
De préférence, la masse moléculaire moyenne de l'amidon hydroxyalkylé est au plus de 400 000, et encore
mieux, elle est au plus de 250 000.
Un degré moyen de substitution inférieur à 0,02 groupes hydroxyalkyles par motif glucose donnent des
solutions de polymères qui ont une stabilité médiocre, c'est-
à-dire qui forment un gel.
Comme on l'a mentionné, la masse moléculaire de l'amidon hydroxyalkylé devrait au mieux s'élever au plus à S 250 000. On obtient alors un système biphasique présentant de meilleures propriétés en ce qui concerne la répartition des substances biologiques entre les phases du système. De plus, dans le cas d'un amidon hydroxyalkylé à faible poids moléculaire, il est par exemple possible de traiter une plus grande quantité de protéines par volume de polymère dissous dans l'eau que dans le cas d'un amidon hydroxyalkylé
à poids moléculaire élevé.
L'emploi d'un amidon hydroxyalkylé, conformément à l'invention, fournit un système présentant une viscosité assez faible pour un usage industriel. Les solutions de
polymères ont également une bonne stabilité.
La composition conforme à l'invention contient de
préférence un hydroxypropyle-amidon (HPA).
En plus, la composition conforme à l'invention contient aussi, habituellement, au moins un polymère choisi
parmi le groupe constitué du polyéthylèneglycol, du poly-
propylèneglycol, du méthoxy-polyéthylèneglycol, du poly(alcool
vinylique), de la polyvinyl-pyrrolidone, de la méthyl-
cellulose, de l'éthylhydroxyéthylcellulose, de l'hydroxyéthyl-
cellulose, et du Ficoll.
Lors de l'emploi de la composition conforme à l'invention, l'amidon hydroxyalkylé et le ou les polymère(s)
supplémentaires sont convenablement dissous dans l'eau.
L'amidon hydroxyalkylé et les autres polymères
constituent souvent de 1 à 400% de la solution aqueuse.
Puis on ajoute la substance biologique que l'on
doit traiter, après quoi on agite le tout.
Lorsque l'agitation a été arrêtée, il se forme des
couches liquides (phases) distinctement séparées. Les diffé-
rents composants de la substance biologique sont alors en
train de se répartir entre les phases.
Enfin, on récupère les différents composants à partir des phases particulières. Les composants peuvent
ensuite être encore purifiés d'une façon convenable.
Selon un mode de réalisation de l'invention, il est possible d'obtenir une répartition plus sélective des composants de la substance biologique entre les différentes phases. On peut alors utiliser ce que l'on appelle un partage par affinité, dans laquelle on ajoute à la solution
de polymèresau moins un ligand substitué.
Les ligands utilisés peuvent être constitués de groupes chargés ou non chargés. Comme exemples de ligands
chargés positivement, on peut mentionner les groupes quater-
naires triméthylamino, diéthylaminoéthyle, et aminoéthyle.
Les ligands négativement chargés peuvent par exemple contenir des groupes carboxyliques, sulfonates,
carboxyméthyles, carboxyéthyles, sulfateset phosphates.
D'autres exemples de ligands convenables sont les acides gras ou les dérivés d'acides gras, les colorants triazines tels que le bleu Cibacron et le jaune Procion, des
lectines, des coenzymes, des analogues de l'adénosine-
triphosphate, de l'adénosine-diphosphate et de l'adénosine-
monophosphate, les protéines fixant la thiamine, les glyco-
protéines, les protéines fixant la flavine et lesprotéines
fixant la biotine.
Pour réaliser un partage par affinité, les ligands ci-dessus peuvent être liés à au moins un polymère dans le système biphasique, c'est-à-dire à l'amidon hydroxyalkylé et/ou à un polymère choisi parmi le groupe constitué du
polyéthylèneglycol, du polypropylèneglycol, du méthoxy-poly-
éthylèneglycol, du poly(alcool vinylique), de la polyvinyl-
pyrrolidone, de la méthylcellulose, de l'hydroxyéthyl-
cellulose, de l'éthylhydroxyéthylcellulose et du Ficoll.
Habituellement, le ligand et le polymère sont liés
ensemble par des liaisons covalentes.
L'avantage obtenu par l'emploi des ligands est qu'ils fixent sélectivement certains composants de la substance biologique. Donc, une proportion plus grande d'un composé particulier se retrouvera dans une certaine phase, et bien sûr, le rendement en sera meilleur. Une autre façon de contrôler la répartition des composants biologiques entre les phases est d'ajouter un sel soluble dans l'eau à la solution de polymères. Ladite répartition est également influencée par le poids moléculaire
des polymères présents.
La présente invention est davantage expliquée en liaison avec les exemples de réalisation ci-dessous et les figures 1 à 7 et les tableaux 1 à 5 annexés. Les exemples 1-9, 18-22, 24-26, 28, 29 et 31-47 illustrent l'invention, tandis que le reste des exemples concerne des essais de comparaison qui se
trouvent en dehors du cadre de l'invention.
Exemple_!
Dans un bécher, on dissout dans de l'eau, conjoin-
tement avec du polyéthylèneglycol présentant une masse molé-
culaire moyenne de 8000, un hydroxypropyl-amidon présentant
un degré moyen de substitution de 0,14 groupes hydroxy-
propyles par motif glucose.
Pour une quantité constante d'eau, on fait varier
les proportions d'hydroxypropyle-amidon et de polyéthylène-
glycol. On agite les mélanges obtenus pendant un court
moment, après quoi on arrête l'agitation. Ensuite, on con-
trôle si l'on obtient deux phases ou non. Les résultats sont représentés dans la figure 1 sous la forme de ce que l'on
appelle un diagramme de phases.
Exemple_2
On dissout dans de l'eau, conjointement avec O,25g de polyéthylèneglycol présentant une masse moléculaire moyenne de 8000, 0,7 g d'hydroxypropylamidon présentant un degré moyen de substitution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif glucose, et une masse moléculaire moyenne de 000. On ajoute du phosphate de sodium à la solution de polymèresobtenue, jusqu'à obtenir une concentration de 10 mN. La quantité totale du système biphasique est de 5 g.
On ajoute, en agitant, 96 unités de l'enzyme B-
galactosidase. On poursuit l'agitation pendant un bref instant. Après l'arrêt de l'agitation, la solution forme deux phases. Puis on mesure la quantité d'enzyme dans les deux phases, grâce à quoi on peut calculer une mesure de la répartition de l'enzyme entre les phases. Le résultat est
indiqué dans le tableau 1.
Exmple 3 On répète le mode opératoire de l'exemple 2, avec
la différence que l'on utilise un polyéthylèneglycol présen-
tant une masse moléculaire moyenne de 20 000. Le résultat
est indiqué dans le tableau 1.
Exeml!e_4 On répète le mode opératoire de l'exemple 2, avec la différence que l'on ajoute du chlorure de sodium en une concentration de 0,1 M. Le résultat est indiqué dans le
tableau 1.
Exemple_5
On répète le mode opératoire de l'exemple 3, avec la différence que l'on ajoute du chlorure de sodium en une concentration de 0,1 M. Le résultat est indiqué dans le
tableau 1.
Exemple 6
On répète le mode opératoire de l'exemple 2, avec la différence que l'enzyme est de la catalase. Le résultat
est indiqué dans le tableau 1.
On répète le mode opératoire de l'exemple 3, avec la différence que l'enzyme est de la catalase. Le résultat
est indiqué dans le tableau 1.
Exemple _
On répète le mode opératoire de l'exemple 4, avec la différence que l'enzyme est de la catalase. Le résultat
est indiqué dans le tableau 1.
On répète le mode opératoire de l'exemple 5, avec la différence que l'enzyme est de la catalase. Le résultat
est indiqué dans le tableau 1.
Exemple 10-
On répète le mode opératoire de l'exemple 2, avec
la différence que l'on utilise, à la place de l'hydroxy-
propyl-amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire
moyenne de 500 000. Le résultat est indiqué dans le tableau 1.
Exemple 11
On répète le mode opératoire de l'exemple 3, avec
la différence que l'on utilise, à la place de l'hydroxy-
propyl-amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire
moyenne de 500 000. Le résultat est indiqué dans le tableau 1.
On répète le mode opératoire de l'exemple 4, avec
la différence que l'on utilise, à la place de l'hydroxy-
propyl-amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire
moyenne de 500 000. Le résultat est indiqué dans le tableau 1.
Exemple 13
On répète le mode opératoire de l'exemple 5, avec
la différence que l'on utilise, à la place de l'hydroxy-
propyl-amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire
moyenne de 500 000. Le résultat est indiqué dans le tableau 1.
Exemple 14
On répète le mode opératoire de l'exemple 6, avec la différence que l'on utilise, à la place de l'hydroxy- propyl-amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire
moyenne de 500 000. Le résultat est indiqué dans le tableau 1.
Exple 15 On répète le mode opératoire de l'exemple 7, avec
la différence que l'on utilise, à la place de l'hydroxy-
propyl-amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire
moyenne de 500 000. Le résultat est indiqué dans le tableau 1.
Exemple 16
On répète le mode opératoire de l'exemple 8, avec
la différence que l'on utilise, à la place de l'hydroxy-
propyl-amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire
moyenne de 500 000. Le résultat est indiqué dans le tableau i.
Exemple 17
On répète le mode opératoire de l'exemple 9, avec
la différence que l'on utilise, à la place de l'hydroxy-
propyl-amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire
moyenne de 500 000. Le résultat est indiqué dans le tableau '.
D'après les résultats indiqués dans le tableau 1, il est évident que plus de 60 % de l'enzyme se retrouvent dans la phase dupolyéthylèneglycol, lorsque l'on opère conformément aux exemples 2, 6, 10 et 14. Dans l'exemple 2, plus de 95 % de l'enzyme se retrouvent dans la phase du polyéthylèneglycol.
Il est également évident, d'après le tableau 1.
que plus de 85 % de l'enzyme se retrouvent dans la phase infé-
rieure (respectivement, hydroxypropyl-amidon et dextrane)
lorsque l'on opère conformément aux exemples 5, 9, 13 et 1-.
Ainsi, les résultats montrent que le système hydroxypropylamidon/polyéthylèneglycol fournit un système biphasique qui est aussi efficace que le système dextrane/ polyéthylèneglycol. E----E l
Dans 1 ml d'eau, on dissout 0,025 g d'hydroxy-
propyl-amidon présentant une massé moléculaire moyenne de 800 000 et un degré moyen de substitution de 0,14 groupes
hydroxypropyles par motif glucose.
On ajoute à la solution de polymère, tout en agi-
tant, 3,75 mg de gammaglobuline de lapin.
On retrouve 90 % de la gammaglobuline dans la
solution d'amidon.
On poursuit l'expérience en ajoutant une quantité croissante d'hydroxypropyl-amidon. Alors, la quantité de
gammaglobuline précipitée augmente avec la teneur en hydroxy-
propyl-amidon, ce qui est représenté sur la figure 2.
Exemple 19
On répète le mode opératoire de l'exemple 18, avec
la différence que l'on utilise un hydroxypropyl-amidon pré-
sentant une masse moléculaire moyenne de 125 000.
Dans ce cas, on n'observe pas de précipitation de
la gammaglobuline, pour aucune concentration de l'hydroxy-
propyl-amidon, ce qui est représenté sur la figure 2.
Une comparaison des résultats des exemples 18 et 19 montre qu'un hydroxypropyl-amidon présentant une masse moléculaire moyenne entrant dans le cadre de cette invention
ne provoque pas de précipitation de la gammaglobuline, lors-
que la concentration de polymère augmente. Au contraire, l'effet de précipitation est considérable lorsque l'on
utilise un hydroxypropyl-amidon présentant une masse molé-
culaire sortant du cadre de cette invention.
Exemple 20
On dissout dans un bêcher, dans 7,5 g d'un tampon
au phosphate de sodium 10 mMl à pH 7,0, 0,9 g d'hydroxy-
propyl-amidon présentant un degré moyen de substitution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif glucose, et une masse
moléculaire moyenne de 125 000, avec 0,6 g de polyéthylène-
glycol présentant une masse moléculaire moyenne de 20 000, et avec 0,06 g d'un ligand substitué constitué de bleu Cibacron-polyéthylèneglycol. Ce dernier polyéthylèneglycol
présente la masse moléculaire indiquée ci-dessus.
On ajoute, tout en agitant, 1 g de levure de
boulanger contenant par exemple l'enzyme phosphofructo-
kinase.
On poursuit l'agitation pendant un court moment.
Puis on arrête, et la solution forme alors deux phases.
C'est la phase inférieure qui contient l'hydroxypropyl-
amidon. Le résultat du partage de l'enzyme entre les deux
phases est indiqué dans le tableau 2.
Exemple 21
On répète le mode opératoire de l'exemple 20, avec
la différence que l'on utilise, à la place de l'hydroxy-
propyl-amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire moyenne de 500 000. Le résultat du partage de l'enzyme entre
les deux phases est indiqué dans le tableau 2.
Exemplne 22 On répète le mode opératoire de l'exemple 20, avec la différence que l'on utilise, à la place de l'extrait de
levure de boulanger, l'enzyme glucose-6-phosphate-déshydro-
génase. Le résultat du partage de l'enzyme entre les deux
phases est indiqué dans le tableau 2.
ExemEle 23 On répète le mode opératoire de l'exemple 22, avec
la différence que l'on utilise, à la place d'hydroxypropyl-
amidon, un dextrane présentant une masse moléculaire moyenne de 500 000. Le résultat est indiqué dans le
tableau 2.
Exemple 24
On répète le mode opératoire de l'exemple 20, avec la différence que l'on n'ajoute pas de ligand substitué. Le
résultat est indiqué dans le tableau 2.
Exemple 25
On répète le mode opératoire de l'exemple 21, avec la différence que l'on n'ajoute pas de ligand substitué. Le
résultat est indiqué dans le tableau 2.
Exemple 26
On répète le mode opératoire de l'exemple 22, avec la différence que l'on n'ajoute pas de ligand substitué. Le
résultat est indiqué dans le tableau 2.
Exemple 27
On répète le mode opératoire de l'exemple 23, avec la différence que l'on n'ajoute pas de ligand substitué. Le
résultat est indiqué dans le tableau 2.
Les exemples 20-27 montrent que des systèmes biphasiques constitués de HPA et de PEG, avec un ligand, travaillent de la même manière que des systèmes biphasiques à base de dextrane et de PEG, avec un ligand, en ce qui concerne la purification des enzymes phosphofructokinases et glucose6-phosphate-déshydrogénase. Les enzymes se retrouvent alors de façon sélective dans la phase supérieure
lorsqu'un ligand est présent dans le système.
Exemple 28
Dans un bêcher, on place 0,7 g d'hydroxypropyl-
amidon, présentant un degré moyen de substitution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif glucose et une masse moléculaire moyenne de 125 000, et on le dissout dans une solution tampon au phosphate de sodium 10 mM présentant un pH de 7,0, conjointement avec 0,25 g de polyéthylèneglycol
présentant une masse moléculaire moyenne de 8000. La quan-
tité totale du système biphasique est de 5 g. -
Dans d'autres bêchers, on réalise des systèmes biphasiques tels que décrits ci-dessus, avec la différence que 0,5-2,5 % du polyéthylèneglycol consiste en un
ligand substitué constitué de bleu Cibacron-polyéthylène-
glycol, le polyéthylèneglycol ayant le poids moléculaire sus-mentionné. En outre, 3 %O de l'hydroxypropyl-amidon sont remplacés par un ligand substitué constitué de jaune Procion-hydroxypropyl-amidon, l'hydroxypropyl-amidon ayant
les spécifications mentionnées ci-dessus.
Tout en agitant, on ajoute 0,4 g d'un extrait de levure de boulanger contenant entre autres choses l'enzyme glucose-6-phosphate-déshydrogénase. On poursuit l'agitation pendant un court moment, puis on l'arrête, ce qui provoque la formation de deux phases. La phase supérieure
contient le polyéthylèneglycol.
Par addition du ligand bleu Cibacron-polyéthylène-
glycol, l'enzyme se retrouve de plus en plus dans la phase supérieure. De façon analogue, l'enzyme se retrouve dans la phase inférieure lorsque l'on ajoute le jaune Procion-hydroxypropyl-amidon. Ce résultat est indiqué dans
la figure 3.
Exemple 29
Dans un bécher, on dissout dans 20 ml d'eau 2,8 g d'hydroxypropyl-amidon, présentant un degré moyen de substitution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif
glucose, et une masse moléculaire moyenne de 125 000, con-
jointement avec 1,0 g de polyéthylèneglycol présentant une
masse moléculaire moyenne de 8000.
Après agitation, il se forme deux phases, dont la phase inférieure est constituée d'hydroxypropyl-amidon. On détermine la viscosité de cette phase en mesurant le temps nécessaire à 5 ml de solution pour traverser une
pipette de 10 ml. Ce temps est de 21,6 secondes.
Exemple 30
On répète le mode opératoire de l'exemple 29, avec
la différence que l'on utilise, à la plase de l'hydroxy-
* propyl-amidon, un dextrane présentant une masse molécu-
laire moyenne de 500 000.
Après agitation, il se forme deux phases, dont la phase inférieure contient le dextrane. Le temps nécessaire pour le passage à travers la pipette est de
37,5 secondes.
La comparaison des résultats des exemples 29 et 30 montre que l'hydroxypropyl-amidon conforme à l'invention confère une viscosité considérablement inférieure à celle que donne le dextrane. Cela signifie donc que le temps de
traitement dans un système biphasique hydroxypropyl-amidon-
polyéthylèneglycol est plus court que dans un système
biphasique dextrane-polyéthylèneglycol.
Exemple31-
On sépare des enzymes par ce que l'on appelle un
partage à contre-courant dans des systèmes biphasiques.
Comme tampon, on utilise une solution 0,25 M de phosphate de sodium, présentant un pH de 7,0, et contenant 5 mM de
B-mercaptoéthanol, 0,1 mM de EDTA, et 0,02 mM de MgC12.
Dans 53 g du tampon sus-mentionné, on dissout
21 g d'hydroxypropyl-amidon, présentant une masse molécu-
laire moyenne de 125 000 et un degré moyen de substitution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif glucose. La solution-tampon additionnée de HPA constitue la solution n 1. Dans 69 g du tampon ci-dessus mentionné, on dissout 7,1 g de polyéthylèneglycol présentant une masse moléculaire moyenne de 20 000 et 0,37 g d'un ligand substitué, le bleu Cibacron-polyéthylèneglycol. La solution tampon addi- tionnée de PEG et du ligand constitue la solution n 2. Le polyéthylèneglycol présente les spécifications mentionnées ci-dessus. On répartit la solution n 1 dans 55 béchers, à raison de 0,87 ml dans chacun. Dans les trois premiers de ces béchers, on ajoute, tout en agitant, 1,13 ml de solution n 2 et 0,27 g d'extrait de levure de boulanger contenant les enzymes suivantes: hexokinase, phosphofructokinase, 3-phosphoglycérate-kinase, glucose-6phosphate-déhydrogénase,
glycéraldéhyde-3-phosphate-déhydrogénase, énolase, phospho-
glycérate-mutase et alcool-déhydrogénase.
Lorsque l'on arrête l'agitation, il se forme deux phases, dont l'une est constituée d'hydroxypropyl-amidon
et d'eau. Un premier partage des enzymes a lieu. Pour amé-
liorer ce premier partage, on transfère la phase supérieure du premier bécher dans le second bécher, après quoi on
ajoute 1,13 ml de la solution n 2 dans le premier bécher.
Après une nouvelle agitation, il se forme deux phases, dans le premier bécher ainsi que dans le second bécher. Au même moment, les enzymes se partagent entre les phases. On transfère la phase supérieure du second bécher dans le troisième bécher. En même temps, on transfère la phase supérieure du premier bécher dans le second bécher, et on ajoute encore 1, 13 ml de solution n 2 dans le premier
bécher.
On répète ce processus jusqu'à ce que tous les béchers contiennent deux phases. De cette manière, on obtient une séparation des enzymes, les enzymes qui se retrouvent en forte proportion dans la phase supérieure se trouvant dans les béchers de numéros élevés, tandis que les enzymes qui se retrouvent en grande proportion dans la phase inférieure se trouvent dans les béchers de numéros
peu élevés.
Le résultat est représenté sur la figure 4.
Dans un bécher, on dissout dans 81 g d'eau 14 g
d'hydroxypropyl-amidon, présentant un degré moyen de substi-
tution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif glucose et une masse moléculaire moyenne de 125 000, conjointement avec 25 g de polyéthylèneglycol présentant une masse moléculaire
moyenne de 8000.
Après agitation, il se forme deux phases.
On contrôle la stabilité du système biphasique en
le stockant dans un réfrigérateur à une température de +4 C.
On n'observe pas de tendance à la formation de gel au bout
de 14 jours.
Exemple 33
On répète le mode opératoire de l'exemple 32, avec la différence que l'hydroxypropyl-amidon présente un degré de substitution de 0,01 groupes hydroxypropyles par motif
glucose, et une masse moléculaire moyenne de 14 000.
On a pu observer au bout de 3 jours une tendance
à la formation d'un gel.
La comparaison des résultats des exemples 32 et 33 montre que le degré de substitution par les groupes hydroxypropyles a une influence sur la stabilité des
systèmes biphasiques spécifiques.
L'avantage d'un système biphasique stable à froid est que certaines substances biologiques nécessitent un
traitement à froid.
Exemple-34
On teste la capacité de différents dérivés
d'amidon à former des systèmes biphasiques avec le poly-
éthylèneglycol. Comme indiqué sur le tableau 3, seuls les dérivés hydroxyalkylés de l'amidon forment des systèmes
biphasiques fonctionnels avec le polyéthylèneglycol.
Exemple 35
On sépare l'acide désoxyribonucléique, ADN, et l'acide ribonucléique, ARN, à l'aide d'un système de partage biphasique à contre-courant tel que décrit dans l'exemple 31. On utilise comme tampon une solution tampon de phosphate de sodium 10 mM, présentant un pH de 7,0 et
contenant 0,1 mM de chlorure de sodium.
On dissout dans 22,2 g de la solution tampon 7,8 g d'hydroxypropyl-amidon présentant une masse moléculaire moyenne de 125 000 et un degré moyen de substitution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif glucose. Cette solution est appelée solution n 1. Dans 27 g de la solution
tampon mentionnée ci-dessus, on dissout 3,0 g de polyéthy-
lèneglycol présentant une masse moléculaire moyenne de
8000. Cette solution est appelée solution n 2.
Dans 10 tubes à essai, on place 3 g de solution n 1. Dans le tube à essai n 1, on ajoute 3 g de solution n 2, ainsi que 5 mg de ADN et 5 mg de ARN. On secoue le
tube à essai pendant un court moment. Quand on cesse l'agi-
tation, il se forme deux phases. On transfère la phase supérieure dans le second tube à essai. Ensuite, on ajoute
3 g de solution n 2 au premier tube à essai.
On poursuit ce mode opératoire conformément à l'exemple 31, mais en n'utilisant que 10 tubes à essai. La figure 5 indique le résultat obtenu de la séparation de
ADN et ARN.
Exemple 36
Dans un bécher, on dissout dans une solution tampon de 10 mM de phosphate de sodium, présentant un pH de 7,0, 0,65 g d'hydroxypropyl-amidonprésentant une masse
moléculaire moyenne de 125 000 et un degré moyen de substi-
tution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif glucose, ainsi que 0,25 g de polyéthylèneglycol présentant une masse moléculaire moyenne de 8000, la quantité totale de la solution étant de 5 g.
Tout en agitant, on ajoute 10 mg de levure de bou-
langer. On laisse l'agitation se poursuivre pendant un court moment. Lorsque l'agitation s'arrête, il se forme deux phases. Le tableau 4 indique le partage résultant des
cellules de levure.
Exemple 37
On répète le mode opératoire de l'exemple 36, avec la différence que la solution tampon contient 12,5 mM de
chlorure de sodium.
Le tableau 4 indique le partage résultant des
cellules de levure.
Exemple 38
On répète le mode opératoire de l'exemple 36, avec la différence que la solution tampon contient 25 mM de chlorure de sodium. Le tableau 4 indique le partage résultant
des cellules de levure.
ExempleI _9
On répète le mode opératoire de l'exemple 36, avec la différence que la solution tampon contient 50 mM de
chlorure de sodium. Le tableau 4 indique le partage résul-
tant des cellules de levure.
Exemple 40
On répète le mode opératoire de l'exemple 36, avec la différence que la solution tampon contient 75 mM de
chlorure de sodium. Le tableau 4 indique le partage résul-
tant des cellules de levure.
Emple 41 On répète le mode opératoire de l'exemple 36, avec la différence que la solution tampon contient 100 mM de
chlorure de sodium. Le tableau 4 indique le partage résul-
tant des cellules de levure.
Les exemples 36-41 montrent que l'on peut contrô-
ler le partage des cellules de levure en faisant varier la teneur en sel. Le résultat est représenté sur les figures 6a-d. Exempe 42 Dans un bécher, on dissout dans une solution tampon de phosphate de sodium 10 mM, présentant un pH de 7,0 et contenant 10 mM de chlorure de sodium, 0,65 g d'hydroxypropyl-amidon présentant une masse moléculaire moyenne de 125 000 et un degré moyen de substitution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif glucose, ainsi que 0,25 g de polyéthylèneglycol présentant une masse moléculaire moyenne de 8000, la quantité totale de la solution étant de
4,75 g.
Tout en agitant, on ajoute 0,25 g de membranes synaptiques provenant de cervelle de veau. On poursuit l'agitation pendant un court moment. Lorsque l'on arrête
l'agitation, il se forme deux phases.
Le partage résultant des membranes est indiqué
dans la figure 7.
Exeple 43 On répète le mode opératoire de l'exemple 42, avec la différence que la solution tampon contient 25 mM de
chlorure de sodium.
Le partage résultant des membranes est indiqué
dans la figure 7.
Exemle 44 On répète le mode opératoire de l'exemple 42, avec la différence que la solution tampon contient 50 mM de chlorure de sodium. Le résultat du partage des membranes est indiqué dans la figure 7. On répète le mode opératoire de l'exemple 42, avec la différence que la solution tampon contient 100 mM de chlorure de sodium. Le résultat du partage des membranes est
indiqué dans la figure 7.
Les exemples 42-45 montrent que l'on peut faire passer les membranes de la phase supérieure à l'interface
en augmentant la teneur en sel.
Exmple! 46 Dans une solution tampon de phosphate de sodium
mM présentant un pH de 7,9, on dissout 4000 g d'hydroxy-
propyl-amidon, présentant une masse moléculaire moyenne de 000 et un degré moyen de substitution de 0,14 groupes hydroxypropyles par motif glucose, ainsi que 1520 g de polyéthylèneglycol présentant une masse moléculaire moyenne de 8000 et 4000 g d'extrait de muscle de porc contenant de la lactate-déhydrogénase (LDH); la quantité totale de la
solution est de 20 000 g.
On sépare le mélange obtenu en deux phases en utilisant un séparateur Alfa-Laval LAPX 202. On détermine
la quantité de lactate-déhydrogénase (LDH) dans chaque phase.
Le résultat est indiqué dans le tableau 5.
Exeple 47 On répète le mode opératoire de l'exemple 46, avec la différence que 1,5 % du polyéthylèneglycol comporte le ligand jaune Procion lié par liaison covalente. Ce ligand
présente une affinité pour la LDH.
Le résultat est indiqué dans le tableau 5.
Les exemples 46-47 montrent que, à grande échelle, on peut extraire l'enzyme LDH vers la phase supérieure en utilisant un ligand lié au polymère qui se trouve dans la phase
S supérieure.
L'invention ne se limite pas aux modes de réalisa-
tion indiqués, puisque l'on peut modifier ceux-ci de diffé-
rentes manières dans le cadre de l'invention.
2 5 9 1606
Tableau 1: VARIATION DU COEFFICIENT DE PARTAGE EN FONCTION
DU POIDS MOLECULAIRE DU POLYMERE DE LA PHASE
SUPERIEURE ET DE LA COMPOSITION IONIQUE DE LA SOLUTION.
Exemple Composition biphasique Tampon Coefficient de partage Ki _ Phase infér. jPhase super. j -galactosidas, Catalase HPS HPS HPS HPS HPS HPS HPS HPS Dextrane 500 Dextrane500 Dextrane 500 Dextrane500 Dextrane500 Dextrare 500 Dextrane 500 Dextrare 500
PEG 8000
PEG 20.000
PEG 8000
PEG 20.000
PEG 8000
PEG 20.000
PEG 8000
PEG 20.000
PEG 8000
PEG 20.000
PEG 800
PEG 20.000
PEG 8000
PEG 20.000
PEG 8000
PEG 20.000
A A B B A A B B A A B B A A B B 23,2 3,94 0,51 0,16 1,59 -3 0,44 0,2 1,50 0,45 0,39 0,16 0,78 0,16 0,09 0.2
_ 1 ______ _,_
Tampon A: tampon phosphate de sodium 10 mM, Tampon B: tampon phosphate de sodium 10 mM,
0,1 M de chlorure de sodium.
pH 7,0 pH 7,0 et j
VARIATION DU COEFFICIENT DE PARTAGE EN FONCTION
D'UN LIGAND, LE BLEU CIBACRON, LIE AU POLYMERE
DE LA PHASE SUPERIEURE, LE POLYETHYLENEGLYCOL.
Tableau 2:
Composition biphasique Coefficient de partage, Kf Exemple phosphofructoglucose-6-phosphat Phase infér. Phase super. kinase déhydrogénase
HPS PEG 8000 3,5 --
+ ligand
21 Dextrane500 PEG 8000 10,0 --
+ ligand
22 HPS PEG 8000 -- 2,4
+ ligand 23 Dextrane500 PEG 8000 -- 0,42 + ligand
24 HPS PEG 8000 0,14 --
Dextrane500O PEG 8000 0,06 --
26 HPS PEG 8000 -- 0,37
27 Dextrane500 PEG 8000 -- 0,10 Tableau 3: CAPACITE DE DIFFERENTS DERIVES DE L'AMIDON A
FORMER DES SYSTEMES BIPHASIQUES AVEC LE POLYETHYLENEGLYCOL.
Nature du dérivé Propriétés, dans un système avec le PEG Non ionigue: Dextrine, blanche Dextrine, jaune Mais Voxi (amylopectine) Acetate d' tamidon Hydroxypropyle, hydrolysé à l'acide oxydé Hydroxyéthyle, oxydé Cationiqgue: Ammonium quaternaire Réticulé: Hydrogénophosphate d'amidon acétylé Hydrogénophosphate
d'amidon hydroxy-
propylé Rétrogradation Haute teneur nécessaire, colorée Formation de gel Rétrogradation, sel nécessaire Système de phase instable à + 4 C Système de phase stable Système de phase instable à + 4 C Précipitation Précipitation Précipitation
Tableau 4:
PARTAGE DE CELLULES DE LEVURE DANS UN SYSTEME
BIPHASIQUE EN PRESENCE DE DIVERSES CONCENTRATIONS
DE CHLORURE DE SODIUM
Tableau 5: PARTAGE DE LDH DANS UN SYSTEME BIPHASIQUE A
GRANDE ECHELLE UTILISANT DE L'EXTRAIT DE MUSCLE
DE PORC.
Exemple NaCl (m M) Quantité de cellules de levure(%)
36_________ Phase supér. Interface Phase infér.
36 - 97 3 -
37 12,5 89 11 -
3 25 20 80 -
39 50 0,8 97,8 1,4
75 0,5 61 38,5
41 100 0,4 33 66,6
Exemple % ligand-PEG % LDH dans la phase su %LDH dans la phase inf.
46 - 1 99
47 1,5 87 _13
Claims (7)
1. Composition à utiliser dans un système biphasique ou multiphasique, pour l'extraction, la purification, la concentration et/ou la séparation de substances biologiques, caractérisée en ce qu'elle contient un hydroxyalkyl-amidon présentant un degré moyen de substitution supérieur à 0,02 groupes hydroxyalkyles par motif glucose, et une masse
moléculaire moyenne inférieure à 800 000.
2. Composition conforme à la revendication 1, carac-
térisée en ce que l'hydroxyalkyl-amidon présente une masse
moléculaire moyenne d'au plus 400 000.
3. Composition conforme à la revendication 1, carac-
térisée en ce que l'hydroxyalkyl-amidon présente une masse
moléculaire moyenne d'au plus 250 000.
4. Composition conforme à la revendication 1, carac-
térisée en ce qu'elle contient également au moins un poly-
mère choisi parmi le groupe constitué du polyéthylèneglycol, du polypropylèneglycol, du méthoxypolyéthylèneglycol, du poly(alcool vinylique), de la polyvinylpyrrolidone, de
l'hydroxyéthylcellulose, de la méthylcellulose, de l'éthyl-
hydroxyéthylcellulose, et du Ficoll.
5. Composition conforme à la revendication 1, carac-
térisée en ce qu'elle contient également au moins un ligand substitué.
6. Composition conforme à la revendication 5, carac-
térisée en ce que le ligand est substitué par ou lié à l'hydroxyalkylamidon et/ou au moins un polymère choisi
parmi le groupe constitué du polyéthylèneglycol, du poly-
propylèneglycol, du méthoxypolyéthylèneglycol, du poly(alcool vinylique), de la polyvinylpyrrolidine, de la méthylcellulose, de l'éthylhydroxyéthylcellulose, de l'hydroxyéthylcellulose,
et du Ficoll.
7. Utilisation d'une solution aqueuse d'un hydroxy-
alkyl-amidon présentant un degré moyen de substitution supérieur à 0,02 groupes hydroxyalkyles par motif glucose et une masse moléculaire moyenne inférieure à 800 000, dans un système biphasique ou multiphasique pour l'extraction, la purification, la concentration et/ou la séparation de
substances biologiques.
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