CH631467A5

CH631467A5 - Copolymeres statistiques reticules.

Info

Publication number: CH631467A5
Application number: CH54378A
Authority: CH
Inventors: Eric Brown; Egisto Boschetti; Monique Corgier; Joel Touet
Original assignee: Mar Pha Etu Expl Marques
Priority date: 1977-01-28
Filing date: 1978-01-18
Publication date: 1982-08-13
Also published as: NL183766C; NO780312L; ES466434A1; GB1594374A; DE2803421C3; SE7801052L; DK151038C; BE862843A; NL7800931A; US4192784A; IT7867156A0; NO782694L; DE2803421B2; IT1111602B; NO148674B; FR2378808B1; FR2378808A1; NO148674C; NO148072B; NO148072C

Description

La présente invention a pour objet de nouveaux copolymères statistiques réticulés tridimensionnels insolubles dans l'eau et l'utilisation desdits copolymères dans des gels aqeux.

La Chromatographie en phase liquide sur gel est une méthode courante de fractionnement et séparation des molécules en fonction de leur taille. Les molécules de taille supérieure aux plus gros pores du gel se déplacent avec la phase mobile liquide, alors que le molécules de taille plus petite pénètrent plus ou moins profondément dans les pores du gel, qui constitue la phase stationnaire, et sont donc plus ou moins retenues. Si donc on fait circuler sur une colonne remplie de gel une phase liquide dans laquelle on a injecté un échantillon contenant des molécules de tailles différentes, la vitesse de migration de ces molécules vers le bas de la colonne variera d'une molécule à l'autre et les molécules seront donc séparées.

Les principaux hydrogels actuellement utilisés comme support dans les techniques mentionnées ci-dessus sont d'une part les gels de Polysaccharides naturels éventuellement réticulés (gels d'agarose, gels de dextran connus sous la marque commerciale Sephadex) et d'autre part des gels de polymères synthétiques ou semisynthétiques comme, par exemple, les gels de Polyacrylamide ou les gels mixtes polyacrylamide-agarose. Ces supports ne sont pas exempts de défauts. Les gels de Polyacrylamide ou polyacrylamide-agarose sont chimiquement instables en milieu basique du fait de l'hydrolyse des groupes amide en groupes acide carboxylique, ce qui limite leur domaine d'emploi. Certains gels de dextran présentent des propriétés mécaniques médiocres, d'où l'impossibilité d'en faire des colonnes ayant un débit relativement élevé et constant. Enfin les gels d'agarose résistent mal à la chaleur et aux agents affaiblissant les liaisons hydrogène (urée, guanidine, etc.) et de plus, comme tous les gels d'origine naturelle, sont très sensibles à l'attaque par les bactéries ou certains enzymes.

A cause des défauts signalés ci-dessus, il a été proposé de remplacer les gels précédents par des gels de copolymères hydrophiles de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyI]-methacryl-amide et de N,N'-éthylène-bis-méthacrylamide ou N,N'-méthylène-bis-acrylamide (agent réticulant) (cf Tetra-hedron Letters No. 6, p. 357-358,1979). Mais l'obtention de gels homogènes, donc transparents, de tels copolymères est difficile car, lors de la polymérisation, il se forme, spécialement aux fortes concentrations en agent réticulant, des homopolymères de N,N'-éthylène-bis-méthacrylamide ou N,N'-méthylène-bis-acrylamide, qui forment des précipités blancs au sein du gel.

Or il a été trouvé, conformément à la présente invention, de nouveaux copolymères très hydrophiles qu'il est facile d'obtenir sous forme de gels aqueux homogènes et qui sont susceptibles de remplacer avantageusement, dans leurs appli5

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cations, aussi bien les gels hautement réticulés tels que les gels de dextran que les gels macroréticulés tels que les gels d'agarose.

Les copolymères statistiques selon l'invention réticulés tridimensionnels et insolubles dans l'eau sont caractérisés dans la revendication 1 précédente.

Les monomères a) sont des produits connus. Ils ont été décrits, avec leurs procédés de préparation, dans diverses publications (cf, par exemple, JEDLINSKI et PAPROTNY, ROCZNIKI Chemii, Ann. Soc. Chim. Polonorum, 1966,40, p. 1487-1493; Tetrahedron Letters No. 6,1975, p. 357-358).

Les monomères b), qui sont des agents réticulants, répondent de préférence à l'une des formules générales (I) ou (II) ci-dessous:

r °

o

R

H2C=C-(CH2)n-Ç-l|J-(CHX)m-N-C-(CH2)n-C=CH2 (I) R' R'

R O o R

I II II !

HhC=C-(CH2)n-ljf-C- (CHX)m-C-IjJ-(CH2)n-Ç=CH2 (II) R' R'

dans lesquelles R est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, R' est un atome d'hydrogène ou un groupe hydro-xyméthyle, X est un atome d'hydrogène ou un groupe OH, n et m sont des nombres entiers allant de 0 à 6, avec la restriction que X et R' ne peuvent être simultanément des atomes d'hydrogène.

Comme exemples de monomères b) on peut citer en particulier la N,N'-diallyl-tartradiamide, le glyoxal-bis-acryla-mide (ou N,N' -dihydroxyéthylène-bis-acrylamide) et la N,N'-méthylène-bis-hydroxyméthylacrylamide.

Comme exemples de composés c) on peut citer, entre autres, la N-[(N-acryloyl)glycyl]glycine, la N-[(N-méthacry-loyl)glycyl]glycine, l'acide N-acryloyls-aminocaproïque.

Bien que la présente invention concerne l'ensemble des copolymères ci-dessus définis, elle a plus particulièrement pour objet ceux de ces copolymères qui contiennent, sous forme copolymérisée, 50% à 98% en poids de monomères a), le complément à 100% étant constitué par un ou plusieurs monomères b), et tout spécialement ceux qui contiennent 50% à 98% en poids de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] acrylamide, le compléement à 100% étant constitué par un ou plusieurs monomères b).

Les copolymères hydrophiles réticulés selon l'invention peuvent être préparés, selon des procédés connus, par polymérisation radicalaire des divers monomères en solution aqueuse. La polymérisation est effectuée à une température de 0°C à 100°C, de préférence 40°C à 60°C, et en présence des initiateurs habituellement utilisés en polymérisation radicalaire. Comme tels on peut citer, par exemple, les systèmes red-ox comme N,N,N,'N' tétraméthyl éthylénediamine (TEMED) + persulfate alcalin ou diméthylaminopropioni-trile + persulfate alcalin, les peroxydes organiques comme le peroxyde de benzoyle, et l'azo-2,2'-bis-isobutyronitrile. La concentration totale en monomères [c'est-à-dire la concentration en monomères a) + b) + c)] des solutions aqueuses soumises à la polymérisation est le plus seuvent compoise entre 20 g/1 et 300 g/1 et le pourcentage en poids de monomère b) dans les monomères totaux est de 2% à 50%.

La polymérisation peut être une polymérisation en bloc ou en émulsion. Dans le cas de la polymérisation en bloc, la solution aqueuse contenant les divers monomères et l'initiateur est soumise à une polymérisation en phase homogène. Le bloc de gel aqueux obtenu est ensuite fractionné en grains, s par exemple par passage à travers les mailles d'un tamis.

La polymérisation en émulsion, qui est le mode de préparation préféré car elle fournit directement le gel aqueux sous forme de granules sphériques de taille déterminée, peut être effertuée comme suit:

io La solution aqueuse contenant les divers monomères est versée lentement dans une phase liquide organique, non miscible à l'eau, maintenue en agitation et contenant éventuellement un agent émulsifiant. La vitesse d'agitation est réglée de façon à obtenir une émulsion de la phase aqueuse dans la îs phase organique ayant la taillé de gouttelettes voulue. Le contrôle de cette taille, donc le réglage de l'agitation, est effectué par examen au microscope de prélèvements faits sur l'émulsion. Une fois réglé la vitesse d'agitation, on introduit dans l'émulsion l'initiateur, qui déclenche la polymérisation. 20 Cette dernière est poursuivie jusqu'à son terme en conservant les mêmes conditions d'agitation. Les perles de gel aqueux ainsi obtenues sont lavées avec un solvant ou un tensio-actif afin de les débarasser des traces de phase organique, puis avec de l'eau.

25 Comme phase organique liquide utilisable on peut citer, par exemple, les huiles végétales (huile de soja, huile d'arachide, huile de tournesol, etc.) ou minérales (huile de paraffine, huile de silicones), les produits de destination fractionnée du pétrole (benzène, toluène, etc.), les hydrocarbures 30 chlorés (tétrachlorure de carbone, chlorure de méthylène, etc. et les mélanges de ces divers composés. La phase organique liquide peut éventuellement contenir un agent émulsionnant comme les produits connus sous la dénomination commerciale «Spans» ou «Tweens», à la concentration de 0,1% à 4% 35 en volume.

Les perles de gel aqueux obtenues par le procédé de polymérisation en émulsion ont une diamètre de particules qui varie, suivant les conditions opératoires, de 10 |im à 600 |j.m.

Les gels aqueux obtenus par l'un des procédés exposés ci-40 dessus peuvent être conservés en suspension dans de l'eau ou dans une solution tampon aqueuse, en présence de traces d'un bactériostatique comme, par exemple, l'azothydrate de sodium. Une concentration de 0,02% en azothydrate de sodium suffit à assurer la conservation.

45 Les gels aqueux peuvent aussi être sèchés par les procédés conventionnels (lyophilisation, traitement par un solvant organique miscible à l'eau, etc.). On obtient ainsi les copolymères sous forme d'une poudre blanche, réhydratable au moment de l'emploi. La réhydratation s'effectue par simple so contact avec de l'eau ou une solution tampon aqueuse. Les poudres de copolymères représentent une forme très commode de stockage car elles occupent un volume très faible et peuvent être conservées indéfiniment, sans addition de conservateurs et bactériostatiques.

55 Les gels aqueux peuvent contenir 2% à 60% en poids de copolymère selon l'invention.

Les copolymères selon l'invention sont stables thermique-ment (ils résistent à des températures atteignant 120°C à 130°C) et insensibles à l'attaque bactérienne ou enzymatique. 60 En outre ils sont stables chimiquement en présence de solutions aqueuses nettement acides (pH 2) ou basique (pH 13), ce qui permet leur emploi dans un domaine de pH très étendu.

Les copolymères selon l'invention peuvent être utilisés avantageusement, à l'état de gels aqueux, comme supports 65 dans les techniques de Chromatographie de perméation opérant en milieu aqueux ou en milieu mixte H2O + solvant organique. Ils permettent de séparer, suivant leurs tailles, les composants des mélanges de substances macromoléculaires

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et notamment les composants des mélanges de protéines. Les propriétés des gels (rigidité, domaine de fractionnement) dépendent de la concentration totale en monomères de la solution aqueuse soumisé à la polymérisation, de la nature de l'agent réticulant (monomère b) et de son pourcentage dans les monomères totaux, et aussi des conditions de polymérisation. En faisant varier ces divers paramètres on obtient toute une gamme de gels aux caractéristiques diverses. Ces gels permettent la séparation de macromolécules dont le poids moléculaire va de 500 daltons jusqu'à plusieurs millions de dal-tons.

Les copolymères selon l'invention peuvent aussi être utilisés, sous forme de gels aqueux, en tant que support pour l'immobilisation ou la Chromatographie d'affinité des macromolécules biologiques telles que, par exemple, les protéines et en particulier les enzymes. A cet effet les copolymères sont au préalable activés, c'est-à-dire que les groupes alcool primaire du copolymère sont transformés, par réaction chimique avec des composés bi- ou polyfonctionnels, en groupes capables d'entraîner le greffage des macromolécules biologiques sur les support (par exemple des groupes imidocarbonate). Les copolymères selon l'invention sont activés selon des méthodes connues en soi (voir à ce sujet les brevets anglais 1.183.257 et 1.343.703, et le DOS 2.061.008). Comme exemples d'agents d'activation utilisables on peut citer le bromure de cyanogène en milieu alcalin, le glutaraldéhyde, les dérivés époxydés comme l'épichlorhydrine ou l'éther diglycidylique du butanediol-1,4, et les dérivés de la trichloro-1,3,5 tria-zine-2,4,6. Les copolymères selon l'invention se prêtent particulièrement bien à l'activation par le bromure de cyanogène.

L'immobilisation, c'est-à-dire le greffage, des protéines sur les gels aqueux de copolymère activé est effectuée selon des méthodes classiques, par exemple en agitant, durant plusieurs heures, les perles de gel activé dans un milieu tampon aqueux contenant la protéine à fixer. En fin d'opération, les perles de qel, qui ont fixé au moins partiellement la protéine, sont séparées et conservées dans un milieu tampon adéquant.

Comme exemples de protéines qui peuvent ainsi être immobilisées sous forme de combinaison avec des gels activés de copolymères selon l'invention on peut citer l'argi-nase, l'invertase, la glucose oxydase, l'uréase, la phosphatase alcaline, la trypsine et la chymotrypsine.

Les copolymères selon l'invention peuvent être asseciés à des produits macromoléculaires naturels solubles dans l'eau et gélifiables, tels que, par exemple, l'agar-agar, l'agarose ou la gélatine, afin d'obtenir des gels mixtes ayant des caractéristiques particulières. Ainsi, pour avoir des gels particulièrement durs, on associera un copolymère selon l'invention à l'agerose. Dans ces gels mixtes le rapport en poids produit macromoléculaire naturel gélifiable copolymère selon l'invention est ^ 2.

Pour préparer de tels gels mixtes on opère comme indiqué précédemment, sauf que l'on introduit au départ dans la solution aqueuse des monomères la quantité voulue de produit macromolêculaire naturel gélifiable, cette quantité correspondant à une concentration comprise en général entre 0,5 et 6% en poids dans la solution aqueuse. Le produit macromoléculaire naturel se gélifie à l'intérieur des mailles du copolymère lorsqu'on refroidit le milieu réactionnel après la polymérisation.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter.

Exemple 1

Préparation d'un copolymère N-[tris(hydroxymé-thyl)méthyl]acrylamide| N,N'-diallyl-tartradiamide sous forme de gel aqueux, par polymérisation en bloc.

Dans 100 ml d'eau déminéralisée, contenus dans un récipient placé au bain-marie à 50°C, on dissout 10 g de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl]acrylamideet 1 g de N,N'-diallyl-tartradiamide. La solution est ensuite filtrée, dégazéifiée sous vide et replacée au bain-marie à 50°C. La solution est agitée doucement à l'aide d'un agitateur magnétique et on y introduit 150 mg de persulfate d'ammonium et 0,16 ml de TEMED. Au bout de quelques minutes on observe un léger échauffement du milieu réactionnel, suivi par la prise en masse de la solution. On obtient ainsi un bloc de gel aqueux rigide et transparent. Ce bloc est fragmenté en grains par passage sur un tamis ayant des mailles de 100 p,m. Les grains sont lavés et conservés dans la solution tampon choisie.

Le gel homogène ainsi obtenu peut être utilisé comme support en Chromatographie de perméation. Son domaine de fractionnement s'étend de 2500 daltons à 300 000 daltons.

Le gel peut aussi être utilisé, après activation, pour immobiliser les macromolécules biologiques.

Exemples 2 à 4

On opère comme à l'exemple 1 mais en employant, pour 100 ml d'eau déminéralisée, les quantités suivantes de monomères:

N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl]

N,N ' -diallyl-tartra-

diamide

Exemple 2

5g

1g

Exemple 2

10g

0,5 g

Exemple 4

20 g

1g

On obtient des gels transparents homogènes, de caractéristiques variées. Le gel de l'exemple 2 est peu compact, celui de l'exemple 3 est compact et celui de l'exemple 4 est très dur.

Ces gels sont utilisables comme support en Chromatographie de perméation ou pour l'immobilisation des macromolécules biologiques. Les domaines de fractionnement des gels des exemples 3 et 4 sont respectivement:

2500 daltons à 300 000 daltons (exemple 3)

1000 daltons à 100 000 daltons (exemple 4)

Exemple 5

Préparation d'un copolymère N-[tris(hydroxymé-thyl)méthyl] acrylamide | glyoxal-bis-acrylamide sous forme de perles de gel aqueux.

Dans un réacteur de 700 ml, on introduit 350 ml d'huile de paraffine et 2 ml de l'agent émulsifiant connu sous la dénomination commerciale «Span-85». On agite mécaniquement le mélange et le chauffe à 55°C. Par ailleurs on dissout, dans 200 ml d'eau chauffée à 55°C, 40 g de N-[tris(hydroxymé-thyl)méthyl] acrylamide et 4 g de glyoxal-bis-acrylamide et ajoute à cette solution 300 mg de persulfate d'ammonium. La solution ainsi obtenue est versée dans l'huile de paraffine agitée. Le vitesse d'agitation est réglée de façon à obtenir une émulsion stable dont les gouttelettes ont un diamètre d'environ 100 um. Au bout de 10 minutes d'agitation, on introduit dans l'émulsion 0,32 ml de TEMED et on poursuit l'agitation pendant encore 30 minutes.

On refroidit alors le milieu réactionnel par addition d'eau glacée, arrête l'agitation et laisse reposer le mélange quelques heures. La phase huileuse surnageante est éliminée par succion et les perles de gel obtenues, d'un diamètre d'environ

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100 um, sont récupérées par décantation. Ces perles sont lavées à l'aide d'une solution aqueuse de Trition X-100 à 0,1 %, pour éliminer les restes d'huile, puis avec de l'eau déminéralisée jusqu'à élimination totale du détergent. Les perles peuvent être conservées dans l'eau ou dans une solution tampon appropriée.

Le gel aqueux transparent homogène ainsi obtenu est très dur. Il a un domaine de fractionnement qui s'étend de 1500 à 50000 daltons. Il est particulièrement indiqueé pour les opérations de dessalage sur colonne des solutions de protéines.

Exemples 6à8 On opère comme à l'exemple 5 mais en employant, pour 200 ml d'eau, les quantités suivantes de monomères:

N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl]

glyoxal-bis-

acrylamide acrylamide

Exemple 6

10g

1g

Exemple 7

20 g

2g

Exemple 8

40 g

2g

On obtient des gels transparents homogènes, utilisables comme support en Chromatographie de perméation ou pour l'immobilisation des macromolécules biologiques. Le domaine de fractionnement du gel de l'exemple 7 est:

2500 daltons à 300 000 daltons

Exemple 9

Cet exemple est donné à titre comparatif.

Si, dans les exemples 1,2,5,6 et 7 précédents, on remplace la N,N'-diaIlyl-tartradiamide et le glyoxal-bis-acrylamide par la N,N'-méthylène-bis-acrylamide, on obtient des gels aqueux qui ne sont pas transparents, donc qui sont hétérogènes.

Exemple 10

Préparation d'un gel mixte contenant de l'agarose et un copolymère N-[tris(hydroxyméthyl)méthyI]acrylamide | glyoxal-bis-acrylamide.

On conduit la polymérisation comme à l'exemple 5, sauf que l'huile de paraffine est remplacée par l'huile de soja, que l'on emploie 7 ml de «Span 85» au lieu de 2 ml, et que la solution aqueuse versée dans l'huile contient, pour 200 ml d'eau, 30 g de N-[tris(hydroxyméthyI)méthyl] acrylamide, 3 g de glyoxal-bis-acrylamide, 4 g d'agarose et 300 mg de persulfate d'ammonium.

Une fois le polymérisation terminée on abaisse la température de l'émulsion progressivement jusqu'à 40°C puis refroidit brutalement l'émulsion par addition d'eau glacée. La phase huileuse surnageante est éliminée par succion et les perles de gel mixte obtenues sont séparées, lavées à l'aide d'une solution aqueuse à 0,2% de laurylsulfate de sodium, puis avec de l'eau déminéralisée. Ces perles sont conservées en suspension dans de l'eau à 4°C contenant des traces d'un bactériostatique tel que l'azothydrate de sodium.

Le gel aqueux ainsi obtenu est particulièrement dur et convient très bien pour la Chromatographie à débit élevé. Ce gel n'est pas thermostable et doit être utilisé à des températures inférieures à 37°C.

Exemple 11

Préparation d'un copolymère N-[tris(hydroxymé-thyl)méthyl]acrylamide | glyocxal-bis-acrylamide sous forme sèche.

Les perles de gel aqueux obtenues dans les exemples 5 à 8

sont placées avec de l'eau dans un récipient pourvu à sa base d'une sortie à laquelle a été adapté un filtre. Les perles sont maintenues en suspension par agitation magnétique continue. On introduit de manière continue de l'alcool éthy-lique à la partie supérieure du récipient, le débit d'introduction étant réglé de manière à être égal au débit de sortie de l'eau à la base du récipient. Les perles en suspension vont donc se trouver en contact avec un milieu de plus en plus riche en éthanol. L'eau va être ainsi chassée progressivement de l'intérieur des perles et remplacée par l'éthanol. Lorsque l'opération est achevée, on remplace à son tour l'éthanol par l'acétone, puis l'acétone par l'éther éthylique en suivant la même méthode. On obtient finalement un gel imbibé d'éther que l'on sèche sous courant d'air en quelques minutes.

On obtient ainsi, pour 100 ml de gel de départ, environ 5 à 20 g de copolymère, sous forme d'une poudre fine constituée de petites sphères. Cette poudre se réhydrate immédiatement par simple contact avec de l'eau et les particules reprennent leur forme initiale. Le comportement en chomatographie du gel séché et réhydraté ne diffère pas de celui du gel aqueux de départ.

Exemple 12

Application à l'immobilisation des enzymes.

Dans une fiole conique de 20 ml, on place 5 ml des perles de gel aqueux obtenues à l'exemple 7 et 15 ml d'eau déminéralisée. On agite et ajoute 4 ml d'une solution aqueuse de bromure de cyanogène à 50 mg/ml. On continue à agiter en maintenant le pH à 11 par addition de soude N. Après stabilisation du pH, on agite encore pendant 30 minutes, filtre les perles, les lave rapidement avec 100 ml d'une solution aqueuse 0,1 M de biscarbonate de sodium, puis avec une solution M de chlorure de sodium. Les perles de gel activé ainsi obtenues sont utilisées ensuite pour la fixation de l'argi-nase.

Le gel activé est placé dans 10 ml d'un milieu tampon maléate| Mn Ch5x 10~2M, pH 7,2, contenant 10 mg d'arginase à 15 unités/mg. On agite la suspension sur une balan-celle pendant 24 h à 4°C. Puis on filtre les perles, les lave avec 25 ml d'une solution M de chlorure de sodium et 25 ml d'eau déminéralisée. Le dérivé gel activé - arginase ainsi obtenu est conservé en suspension dans un tampon maléate |

Mn Ch5x 10-2M, pH 7,2.

La quantité d'enzyme fixée sur le gel activé est déterminée indirectement en dosant l'enzyme restant dans le filtrat par la méthode classique au réactif de FOLIN (cf LO WRY et coll. J. Biol. Chem., 1951,193,265). L'activité enzymatique du dérivé gel activé - arginase est déterminée par la méthode d'hydrolyse de l'arginine (J. J. Hagan et R. D. Dallam, Anal. Biochem. 1968,22,518).

Les résultats obtenus dans deux essais similaires sont donnés dans le tableau suivant:

Essai mg d'arginase fixée % d'arginase fixée

% d'activité résiduelle de

par ml de gel sur le gel activé

l'arginase fixée

1

1,3

65 %

36%

2

1,47

73,5%

37%

Le pourcentage d'activité résiduelle, qui traduit l'activité enzymatique du dérivé, est défini par la formule

100 •— Ms

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dans laquelle M3 représente la masse d'enzyme fixée et Mi la masse d'enzyme natif ayant même activité que la masse d'enzyme fixée.

Exemple 13

Préparation d'un copolymère N-[tri(hydroxymé-thyl)méthyl] acrylarnide| N,N'-dihydroxyéthylène-bis-acry-lamide | acide acrylamido-6-hexanoïque (ou acide N-acryloyl e-aminocaproïque) sous forme de perles de gel aqueux.

On opère comme à l'exemple 5, en remplaçant dans la solution aqueuse les 40 g de N-[tris(hydroxymé-thyl)méthyl]acrylamid et les 4 g de glyoxal-bis-acrylamide par 35,6 g de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] acrylamide, 4,0 g de N,N'-dihydroxyéthylène-bis-acrylamide et 0,4 g d'acide acrylamido-6-hexanoïque. La solution aqueuse est amenée à pH 6 et on poursuit comme à l'exemple 5.

On obtient ainsi sous forme de perles ayant un diamètre compris entre 30 et 250 |im, un gel aqueux contenant 6 à 20 microéquivalents (jieq) COOH parmi de gel.

Exemple 14

s Préparation d'un copolymère N-[tris(hydroxymé-thyl)méthyl]méthacrylamide | N,N' dihydroxyéthylène-bis-acrylamide | N-[N-méthacryloyl)glycyljglycine sous forme de perles de gel aqueux.

On opère come à l'exemple 5, en remplaçant dans la solu-10 tion aqueuse les 40 g de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] acrylamide et les 4 g de glyoxal-bis-acrylamide par 10,6 g de N-[tris(hydroxyméthyl)méthyl] méthacrylamide, 1,2 g de N,N'-dihydroxyéthylène-bis-acrylamide et 0,2 g de N-[N-méthacryloyl)glycyl] glycine.

îs On obtient ainsi, sous forme de perles ayant un diamètre compris entre 30 et 250 jxm, un gel aqueux contenant 6 a 20 ueq COOH par ml de gel.

B

Claims

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1. Copolymères statistiques réticulés tridimensionnels, insolubles dans l'eau, caractérisés en ce qu'ils contiennent, sous forme copolymérisée - relatif au poids total des copolymères a) 25% à 98% en poids de N-[tris(hydroxyméthyl)-méthyl] acrylamide ou de N-[tris(hydroxyméthyl)-méthyl] méthacry-lamide, ou d'un mélange de ces deux composés,

b) 2% à 50% en poids d'un ou plusieurs monomères possédant plusieurs doubles liaisons éthyléniques polymérisables et un ou plusieurs groupes hydroxy, et exempts de groupes NHzouCOOHet c) en plus, jusqu'à 50% en poids d'un ou plusieurs monomères possédant une double liaison éthylénique polyméri-sable et un ou plusieurs groupes amino ou carboxylique.

2. Copolymères tels que définis dans la revendication 1, caractérisés en ce que les monomères b) répondent à l'une des formules:

H2C=C-(CH2)n-C-IjI-(CHX)m-N-C-(CH2)n-Ç=CH2 (I) r R' R' R

H2C»Ç-(CH2)n-ljJ-C- (CHX)m-C-I|-(CH2)n-<j:=CH2 (II) RR' R' R

dans lesquelles R est un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, R' est un atome d'hydrogène ou un groupe hydro-xyméthyle, X est un atome d'hydrogène ou un groupe OH, n et m sont des nombres entiers allant de 0 à 6, X et R' ne pouvant être simultanément des atomes d'hydrogène.

2

REVENDICATIONS

3. Copolymères tels que définis dans une des revendications 1 à 2, caractérisés en ce qu'ils contiennent, sous forme copolymérisé, 50% à 98% en poids de monomères a), le complément à 100% étant constitué par un ou plusieurs monomères b).

4. Copolymères tels que définis dans la revendication 3, caractérisés en ce que le monomère a) est la N-[tris-(hydroxy-méthyl)méthyl] acrylamide.

5. Copolymères tels que définis dans une des revendications 3 ou 4, caractérisés en ce que le monomère b) est la N,N'-diallyltartradiamide.

6. Copolymères tels que définis dans une des revendications 3 ou 4, caractérisés en ce que le monomère b) est le glyoxal-bis-acrylamide.

7. Copolymères tels que définis dans une des revendications 3 ou 4, caractérisés en ce que le monomère b) est la N,N'-méthylène-bis-hydroxyméthylacrylamide.

8. Utilisation des copolymères selon la revendication 1 dans des gels aqueux, caractérisée en ce que les gels contiennent 2% à 60% en poids d'un copolymère tel que défini dans une des revendications 1 ou 2.

9. Utilisation telle que définie dans la revendication 8, caractérisée en ce que les gels sont sous la forme de perles ayant un diamètre de 10 |im à 600 (im.

10. Utilisation telle que définie dans les revendications 8 et 9, caractérisée en ce que les copolymères sont utilisés dans les gels avec en plus un produit macromoléculaire naturel géli-fiable, le rapport en poids produit macromoléculaire naturel gélifiable copolymère dans le gel étant inférieur ou égal à 2.

11. Utilisation telle que définie dans la revendication 10, caractérisée en ce que le produit macromoléculaire naturel gélifiable est l'agarose, l'agar-agar ou la gélatine.