DE2803421A1

DE2803421A1 - Hydrophile copolymere, sie enthaltende gele und deren verwendung

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Publication number: DE2803421A1
Application number: DE19782803421
Authority: DE
Inventors: Egisto Boschetti; Eric Prof Brown; Monique Corgier; Joel Touet
Original assignee: MAR PHA ETU EXPL MARQUES
Current assignee: MAR PHA ETU EXPL MARQUES
Priority date: 1977-01-28
Filing date: 1978-01-26
Publication date: 1978-08-03
Also published as: JPS6352053B2; FR2378808A1; IT7867156A0; NO148674C; BE862843A; NO148072B; CH631467A5; FR2378808B1; NO148674B; SE7801052L; DK151038B; DE2803421B2; NO780312L; US4192784A; NO148072C; JPS5396090A; DE2803421C3; NL7800931A; SE438863B; NL183766C

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft hydrophile Copolymere, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung in Form von wäßrigen Gelen bei Trennverfahren, wie der Gelchromatographie in flüssiger Phase und bei Iiranobilisierungstechniken von natürlichen Substanzen, insbesondere Proteinen und noch bevorzugter Enzymen.

Die Flüssigphasen-Chromatographie auf Gelen ist eine gängige Methode zum Fraktionieren und Trennen von Molekülen in Abhängigkeit von ihrer Größe. Die Moleküle, deren Teilchengröße größer ist als die größten Poren des Gels bewegen sich mit der flüssigen mobilen Phase, während die Moleküle mit kleinerer Teilchengröße mehr oder weniger tief in die Poren des GeIs₇ das die stationäre Phase darstellt, eindringen und daher mehr oder weniger stark zurückgehalten werden. Wenn -man somit durch eine mit einem Gel gefüllte Säule eine flüssige Phase laufen läßt, in die man eine Probe eingebracht hat, die Moleküle unterschiedlicher Teilchengröße enthält, variiert die Wanderungsgeschwindigkeit dieser Moleküle am unteren Ende der Säule von einem Molekül zum anderen, so daß die Moleküle getrennt werden.

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Die derzeit überwiegend als Träger bei den erwähnten Trennmethoden verwendeten Hydrogele sind einerseits Gele von natürlichen Polysacchariden, die gegebenenfalls vernetzt sind (Agarosegele, Dextrangele, die unter der Handelsbezeichnung "Sephadex" bekannt sind) und andererseits Gele von synthetischen oder halbsynthetischen Polymeren, beispielsweise Polyacrylamidgele und gemischte Polyacrylamid/Agarose-Gele. Diese Trägermaterialien sind nicht frei von Nachteilen. Die Polyacrylamidgele oder Polyacrylamid/Agarose-Gele sind in basischem Medium instabil dadurch, daß die Amidgruppen zu Carbonsäuregruppen hydrolysiert werden, wodurch ihre Anwendung beschränkt wird. Gewisse Dextrangele besitzen unzureichende mechanische Eigenschaften oder sind nicht dazu geeignet, Säulen zu liefern, die einen relativ hohen und konstanten Durchsatz ermöglichen. Schließlich sind die Agarosegele wenig beständig gegen Wärme und gegen Mittel, die die Wasserstoffbrückenbindungen schwächen (wie Harnstoff, Guanidin etc.) und sind, wie sämtliche Gele natürlichen Ursprungs, sehr empfindlich gegen Angriffe durch Bakterien oder bestimmte Enzyme.

Wegen der oben angesprochenen Nachteile wurde bereits vorgeschlagen, die bisher bekannten Gele durch Gele aus hydrophilen Copolymeren aus N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/ -methacrylamid und Ν,Ν'-Äthylen-bis-methacrylamid oder

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Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid (Vernetzungsmittel) zu verwenden (siehe Tetrahedron Letters No. 6 (1975) 357 bis 358). Jedoch ist die Bildung homogener und damit transparenter Gele aus solchen Copolymeren schwierig, da sich bei der Polymerisation, insbesondere bei der Anwendung hoher Konzentrationen des Vernetzungsmittels,· Homopolymere aus N,N'-Äthylen-bis-methacrylainid oder Ν,Ν'-Methylen-bisacrylamid bilden, die in dem Gel weiße Niederschläge ergeben .

Es wurden nunmehr erfindungsgemäß neue sehr hydrophile Copolymeren gefunden, die leicht in homogene wäßrige Gele überführt werden können und die dazu geeignet sind, mit Vorteil sowohl die stark vernetzten Gele, wie die Dextrangele, als auch die makrovernetzten Gele, wie die Agarosegel®/ bei deren üblichen Verwendung zu ersetzen.

Gegenstand der Erfindung sind daher statistisch aufgebaute, dreidimensional vernetzte, wasserunlösliche Copolymere, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie in copolymerisierter Form

a) 25 bis 98 Gew.-% N-/ Tris(hydroxymethyi)-methylJ-acrylamid oder N-/Tris(hydroxymethyi)-methyl_/-methacrylamid oder einer Mischung aus diesen beiden Verbindungen,

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b) 20 bis 50 Gew.-% eines oder mehrerer Monomsrer„ die •mehrere polymerxsxerbare äthylenische Doppelbindungen und eine oder mehrere Hydroxylgruppen aufweisen und frei sind von NH₀- oder COOH-Gruppen„ und c) 0 bis 50 Gew.-% eines oder mehrerer Monomerer_r die eine polymerxsxerbare äthylenische Doppelbindung und eine oder mehrere Aminogruppen oder Carboxylgruppen aufweisen,

enthalten.

Die Monomeren a) sind bekannte Produkte. Sie sind zusammen mit Verfahren zu ihrer Herstellung in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben (siehe beispielsweise Jedlinski und Paprotny, Roczniki Chemii, Ann. Soc. Chinu Polonorum, 4 (1966) 1487-1493; Tetrahedron Letters No. β (1975) 357-358).

Die Monomeren b), die Vernetzungsmittel darstellen^ entsprechen vorzugsweise einer der beiden folgenden allgemeinen Formeln I und II

RO OR

I Il Il I

= C - (CH₀) - C-N- (CHX) -N-C- (CH₀) - C = CH₀ (I) δ η ι m ι ^n ζ

R¹ R¹

ROO R

I Ii Il I

C - (CH₂)_n - N - C - (CHK)_1n - C - N - (CH₂) _n - C = CH₃ (II)

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in denen

R ein Wasserstoffatoia oder eine Methylgruppe, R¹ ein Wasserstoffatom, oder eins Hydroxymethylgruppe, X ein Wasserstoffatoiü oder eine Hydroxylgruppe und η und ra ganze Zahlen mit Werten von ö bis 6 mit der

Maßgabe bedeuten, daß X und R¹ nicht gleichzeitig Wasserstoffatome darstellen.

Beispiele für Monomere b} sind insbesondere Ν,Ν'-Diallyltartradiamid, Glyoxal-bis-acrylaraid (oder N,K⁵-Dihydroxy-1Q äthylen-bis-acrylar.id) und N,N'-Methylen-bis-hydroxymethylacrylamid.

Beispiele für Monomere c} sind unter anderem N-/ (N-Äcryloyl)-glycyl__/-glycin, N-/ (N-Methacryloyl)-glycyl_/-glycin und N-Acryloyl-6 -aminocapronsäure, N-Acryloylglycin und Acrylamido-glykolsäure.

Obwohl die vorliegende Erfindung sämtliche oben definierten Copolymere ' betrifft, umfaßt sie als besonders bevorzugten Gegenstand jene Copolymere , die in copolymerisierter Form 50 bis 98 Gew.-% der Monomeren a) und als Rest auf 100 % eines oder mehrere Monomeren b) enthalten und insbesondere jene Copolymeren, die 50 bis 98 Gew.-% N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/-acrylamid und als Rest auf 100 % eines oder mehrere Monomeren b) enthalten.

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Die erfindungsgemäßen vernetzten, hydrophilen Copolymeren können nach an sich bekannten Verfahrensweisen durch radikalische Polymerisation der verschiedenen Monomeren in wäßriger Lösung hergestellt werden. Dabei wird die Polymerisation bei einer Temperatur von 0 bis 100⁰C und vorzugsweise von 4 0 bis 60⁰C in Gegenwart üblicher Initiatoren der radikalischen Polymerisation durchgeführt. Als Initiatoren dieser Art kann man beispielsweise Redox-Systeme, wie N₇N₇N¹ _/N'-Tetramethyl-äthylendiamin (TEMED) + ein Alkalimetallpersulfat oder Dimethylaminopropionitril + ein Alkalimetallpersulfat oder organische Peroxide wie Benzoylperoxid und Azo-2,2'-bis-isobutyronitril verwenden. Die Gesamtkonzentration der Monomeren (d.h. die Konzentration der Monomeren a) + b) + c)) in den wäßrigen Lösungen, die der Polymerisation unterzogen werden, liegt im allgemeinen bei 20 g/l bis 300 g/l, während der Gewichtsprozentsatz des Monomeren b), bezogen auf die gesamten Monomeren 2 bis 50 % beträgt.

Die Polymerisation kann eine Blockpolymerisation oder eine Emulsionspolymerisation sein. Im Fall der Blockpolymerisation unterwirft man die wäßrige Lösung, die die verschiedenen Monomeren und den Initiator enthält, einer Polymerisation in homogener Phase. Der erhaltene Block des wäßrigen Gels wird anschließend zu Körnchen zerkleinert, beispielsweise

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indem man ihn durch die Maschen eines Siebes hindurchtreibt.

Die Emulsionspolymerisation, die die bevorzugte Herstellungsmethode darstellt, da sie direkt das wäßrige Gel in Form sphärischer Körnchen bestimmter Teilchengröße liefert, kann wie folgt durchgeführt werden:

Man gießt die die verschiedenen Monomeren enthaltende wäßrige Lösung langsam in eine mit Wasser nicht mischbare organische flüssige Phase, die gerührt wird und gegebenenfalls ein Emulgiermittel enthält. Die Rührgeschwindigkeit wird derart eingestellt, daß man eine Emulsion der wäßrigen Phase in der organischen Phase mit der angestrebten Tröpfchengröße erhält. Die Einstellung dieser Tröpfchengröße und damit die Steuerung der Rührgeschwindigkeit erfolgt durch mikroskopische Untersuchung von Proben der Emulsion. Nachdem die Rührgeschwindigkeit eingestellt ist, bringt man den Initiator in die Emulsion ein, der dann die Polymerisation auslöst. Die Polymerisation wird unter Beibehaltung der gleichen Rührbedingungen bis zur Beendigung durchgeführt. Die in dieser Weise erhaltenen Perlen des wäßrigen Gels werden mit einem Lösungsmittel oder einem oberflächenaktiven Mittel gewaschen, um sie von Spuren der organischen Phase zu befreien, und werden dann anschließend mit Wasser gewaschen.

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Als flüssige organische Phase kann man beispielsweise
pflanzliche öle (Sojaöl, Erdnußöl, Sonnenblumenöl etc.)
oder Mineralöle (Paraffinöl, Siliconöle etc.), Produkte
der fraktionierten Destillation von Erdöl (Benzol, Toluol etc), chlorierte Kohlenwasserstoffe (Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid etc.) und Mischungen aus diesen verschiedenen Verbindungen verwenden. Die flüssige organische Phase kann gegebenenfalls ein Emulgiermittel in einer Konzentration von 0,1 bis 4 Vol.-% enthalten, beispielsweise die unter den Bezeichnungen " Span" oder "Tween" bekannten Produkte.

Die mit Hilfe des Emulsionspolymerisationsverfahrens erhaltenen Perlen des wäßrigen Gels besitzen einen Teilchendurchmesser, der in Abhängigkeit von den angewandten Verfahrensbedingungen zwischen 10 μπι und 600 μπι liegt.

Die unter Anwendung eines der oben beschriebenen Verfahren erhaltenen wäßrigen Gele können als Suspensionen in Wasser oder einer wäßrigen Pufferlösung urid in Gegenwart von
Spuren eines Bakteriostatikums, beispielsweise von Natriumazothydrat aufbewahrt werden. Für die Konservierung genügt eine Konzentration von Natriumazothydrat von 0,02 %.

Die wäßrigen Gele können auch mit Hilfe üblicher Verfahrensweisen getrocknet werden (beispielsweise durch Gefriertrocknen, durch Behandlung mit einem mit Wasser mischbaren

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organischen Lösungsmittel etc.). Man erhält in dieser Weise die Copolymeren in Form eines weißen Pulvers, das zum Zeitpunkt seiner Verwendung rehydratisiert werden kann. Die Rehydratation erfolgt lediglich durch den Kontakt mit Wasser oder einer wäßrigen Pufferlösung. Die pulverförmigen Copolymeren stellen eine sehr bequeme Lagerform dar, da sie ein sehr geringes Volumen einnehmen und ohne die Zugabe von Konservierungsmitteln und Bakteriostatika beliebig lange aufbewahrt werden können.

Die wäßrigen Gele können 2 bis 60 Gew.-% der erfindungsgemäßen Copolymeren und als Rest Rehydratationswasser enthalten .

Die erfindungsgemäßen Copolymeren sind thermisch stabil (wobei sie Temperaturen von bis zu 120 bis 130⁰C zu widerstehen vermögen) und gegen beakteriellen oder enzymatischen Angriff unempfindlich. Weiterhin sind sie in Gegenwart von deutlich sauren (pH-Wert = 2) oder deutlich basischen (pH-Wert =13) wäßrigen Lösungen chemisch stabil, so daß sie innerhalb eines sehr weiten pH-Bereiches verwendet werden können.

Die erfindungsgemäßen Copolymeren können mit Vorteil in Form der wäßrigen Gele als Trägermaterialien für Permeationschroma tographiemethoden in wäßrigem Medium oder in einem gemischten Medium aus Wasser und einem organischen Lösungs-

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mittel eingesetzt werden. Sie ermöglichen die Trennung ' der Bestandteile von Mischungen makromolekularer Substanzen und insbesondere von Bestandteilen von Proteinmischungen in Abhängigkeit von deren Größe. Die Eigenschäften der Gele (Steifigkeit, Fraktionierbereich etc.) hängen von der Gesamtkonzentration der Monomeren in der der Polymerisation unterworfenen wäßrigen Lösung, der Art des Vernetzungsmittels (des Monomeren b)) und dessen Prozentsatz in Bezug auf die gesamten Monomeren und auch von den Polymerisationsbedingungen ab. Durch Änderung dieser Parameter kann man eine Vielzahl von Gelen mit unterschiedlichen Eigenschaften bilden. Diese Gele ermöglichen die Trennung von Makromolekülen, deren Molekulargewicht sich von 500 Dalton bis zu mehreren Millionen Dalton erstreckt.

Die erfindungsgemäßen Copolymeren können auch in Form von wäßrigen Gelen als Trägermaterialien zur Immobilisierung oder zur Affinitätschromatographie von biologischen Makromolekülen, wie beispielsweise Proteinen urid insbesondere Enzymen verwendet werden. Hierzu werden die Copolymeren zuvor aktiviert, d.h. man wandelt die primären Hydroxylgruppen des Copolymeren durch chemische Reaktion mit bifunktionellen oder polyfunktioneilen Verbindungen in Gruppen um, die das Aufpfropfen der biologischen Makromoleküle auf das Trägermaterial ermöglichen (beispielsweise Imidocarbonatgruppen). Die erfindungsgemäßen Copolymeren werden unter

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ORIGINAL INSPECTED

Anwendung an sich bekannter Methoden aktiviert (siehe die GB-PSen 1 183 257 und 1 343 703 und die DE-OS 2 061 008). Beispiele für geeignete Aktivierungsmittel sind Bromcyan in alkalischem Medium, Glutaraldehyd, Epoxidderivate, wie Epichlorhydrin oder der Diglycidyläther von Butandiol-1,4 und Derivate von 1,3,5-Trichlor-2,4,6-Triazin. Die erfindungsgemäßen Copolymeren können besonders gut mit Bromcyan aktiviert werden.

Die Immobilisierung, d.h. das Aufpfropfen der Proteine auf .die wäßrigen Gele des aktivierten Copolymeren erfolgt unter Anwendung an sich bekannter Methoden, beispielsweise durch Verrühren von Perlen des aktivierten Gels während mehrerer Stunden in einem wäßrigen Puffermedium, das das zu bindende Protein enthält. Nach Beendigung dieses Vorgangs werden die Gelperlen, die das Protein mindestens zum Teil gebunden haben, abgetrennt und in einem geeigneten Puffermedium aufbewahrt.

Beispiele für Proteine, die in dieser Weise in Form einer Kombination mit den aktivierten Gelen der erfindungsgemäßen Copolymeren immobilisiert werden können, sind Arginase, Invertase, Glucoseoxydase, Urease, Alkaliphosphatase, Trypsin und Chymotrypsin.

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Die erfindungsgemäßen Copolymeren können mit natürlichen, wasserlöslichen und gelierbaren makromolekularen Produkten, wie beispielsweise Agar-Agar, Agarose oder Gelatine kombiniert werden, so daß man gemischte Gele mit bestimmten Eigenschaften erhält. So kann man zur Bildung von besonders harten Gelen ein erfindungsgemäßes Copolymeres mit Agarose kombinieren. In diesen gemischten Gelen ist das Gewichtsverhältnis von natürlichem, gelierbarem makromolekularem Produkt zu dem erfindungsgemäßen Copolymeren gleich 2 oder geringer.

Für die Herstellung solcher gemischter Gele geht man in der oben angegebenen Weise vor, mit dem Unterschied, daß man zu Beginn in die wäßrige Lösung der Monomeren die gewünschte Menge des natürlichen, gelierbaren makromolekularen Produkts einbringt, wobei diese Menge einer Konzentration entspricht, die im allgemeinen 0,5 bis 6 % der Lösung ausmacht. Das natürliche makromolekulare Produkt bildet in den Poren des Copolymeren ein Gel, wenn man das Reaktionsmedium nach der Polymerisation abkühlt.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung:

Beispiel 1:

Herstellung eines gelförmigen N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/^r-acrylamid/N,N^f-Diallyl-tartradiamid-Copolyineren durch Blockpolymerisation.

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In 100 ml entmineralisiertem Wasser, das in einem Behälter vorliegt, der in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 5O⁰C eintaucht, löst man 10g N-/ Tris(hydroxymethyI) methyl_/ -acrylamid und 1g N,N¹-Diallyl-tartradiamid. Anschließend filtriert man die Lösung, entgast sie im Vakuum und bringt sie erneut auf das Wasserbad mit einer Temperatur von 50⁰C. Dann rührt man die Lösung langsam mit Hilfe eines Magnetrührers und gibt 150 mg Ammoniumpersulfat und 0,16 ml TEMED zu. Nach Ablauf einiger Minuten beobachtet man ein leichtes Erhitzen des Reaktionsmediums, das von einer Verfestigung der Lösung gefolgt wird. Man erhält in dieser Weise einen steifen und transparenten Block aus dem wäßrigen Gel. Dieser Block wird durch Hindurchtreiben durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 100μπι zu Körnchen zerkleinert. Die Körnchen werden gewaschen und in der gewünschten Pufferlösung aufbewahrt.

Das in dieser Weise erhaltene homogene Gel kann als Trägermaterial für die Permeationschromatographie verwendet werden. Sein Fraktionierbereich erstreckt sich von 2 500 Dalton bis 300 000 Dalton.

Das Gel kann nach der Aktivierung auch zum Immobilisieren von biologischen Makromolekülen verwendet werden.

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Beispiele 2 bis 4

Man verfährt nach der Methode des Beispiels 1, verwendet jedoch pro 100ml des entmineralisierten Wassers die nachstehend angegebenen Monomerenmenge:

N-/ Tris(hydroxymethyl)- Ν,Ν'-Diallylmethyl_/ -acrylamid

_L 7 ·, jj tartradiamid

Beispiel 2 5g 1g

Beispiel 3 10 g 0,5 g

Beispiel 4 20 g 1g

Man erhält homogene transparente Gele mit unterschiedlichen Eigenschaften. Das Gel von Beispiel 2 ist wenig dicht, das des Beispiels 3 ist dicht, während das des Beispiels 4 sehr hart ist.

Diese Gele können als Trägermaterialien für die Permeations-Chromatographie und zum Immobilisieren von biologischen Makromolekülen verwendet werden. Die Fraktionierbereiche der Gele der Beispiele 3 und 4 sind: Beispiel 3: 2 500 Dalton bis 300 000 Dalton Beispiel 4: 1 000 Dalton bis 100 000 Dalton

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Beispiel 5

N-/ 1

Herstellung eines N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/ -acrylamid/Glyoxal-bis-acrylamid-eopolymeren in Form eines perlförmigen wäßrigen Gels.

Man beschickt einen 700 ml-Reaktor mit 350 ml Paraffinöl und 2 ml eines Emulgiermittels, das im Handel unter der Bezeichnung "Span-85" erhältlich ist. Man rührt diese Mischung mechanisch und erhitzt sie auf 55°C. Andererseits löst man 40g N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/-acrylamid und 4 g Glyoxal-bis-acrylamid in 200 ml auf 55°C erhitztem Wasser und gibt zu dieser Lösung 300 mg Ammoniumpersulfat. Die in dieser Weise erhaltene Lösung gießt man in das gerührte Paraffinöl. Die Rührgeschwindigkeit wird derart eingestellt,· daß man eine stabile Emulsion erhält, deren Tröpfchen einen Durchmesser von etwa 100 μΐη aufweisen. Nach einer Rührdauer von 10 Minuten versetzt man die Emulsion mit 0,32 ml TEMED und rührt während weiterer 30 Minuten.

Dann kühlt man das Reaktionsmedium durch Zugabe von eisgekühltem Wasser, beendet das Rühren und läßt die Mischung einige Stunden stehen. Die überstehende ölphase wird abgesaugt, worauf man durch Dekantieren Gelperlen mit einem Durchmesser von etwa 100 μπι erhält. Diese Perlen werden

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mit einer wäßrigen 0,1 prozentigen Lösung von Triton X-100 gewaschen, um die Reste des Öls zu entfernen und werden dann bis zur vollständigen Beseitigung des Detergens mit entmineralisxertem Wasser gewaschen. Die Perlen können in Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung aufbewahrt werden.

Das in dieser Weise erhaltene transparente, homogene wäßrige Gel ist sehr hart. Es besitzt einen Fraktionierbereich von 1 500 bis 50 000 Dalton. Es ist besonders geeignet zur Säulenentsalzung von Proteinlösungen.

Beispiele 6 bis 8

Man verfährt nach der Methode von Beispiel 5, verwendet jedoch pro 200 ml Wasser die folgenden Monomerenmenqen:

N-/ Tris(hydroxymethyl)- Glyoxal-bis-

7 acrylamid

-acrylamid

Beispiel 6 10 g 1g

Beispiel 7 20 g 2g

Beispiel 8 40 g 2g

Man erhält homogene transparente Gele, die als Trägermaterial für die Permeationschromatographie oder zum Immobilisieren von biologischen Makromolekülen verwendet werden können. Der Fraktionierbereich des Materials des

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Beispiels 7 erstreckt sich von 2 500 Dalton bis 300 000 Dalton.

Beispiel 9

Dieses Beispiel stellt ein Vergleichsbeispiel· dar.

Wenn man bei den Beispielen 1, 2, 5, 6 und 7 Ν,Ν'-Diallyltartradiamid bzw. Glyoxal-bis-acrylamid durch Ν,Ν'-methylenbis-acrylamid ersetzt, so erhält man wäßrige Gele, die nicht transparent und damit heterogen sind.

Beispiel 10

Herstellung eines gemischten Gels, das Agarose und ein N-/ Tris(hydroxymethyl)methyl_/-acrylamid/Glyoxal-bisacrylamid-Copolymeres enthält.

Man führt die Polymerisation nach der Verfahrensweise von Beispiel 5 durch, mit dem Unterschied, daß man das Paraffinöl durch Sojaöl ersetzt, an Stelle von 2 ml 7 ml "Span-85" verwendet und in das öl eine wäßrige Lösung gießt, die pro 200 ml Wasser 30 g N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/-acrylamid, 3g Glyoxal-bis-acrylamid, 4 g Agarose und 300 mg Ammoniumpersulfat enthält.

Nachdem die Polymerisation beendet ist, vermindert man die Temperatur der Emulsion nach und nach auf 40⁰C und kühlt die Emulsion dann rasch durch Zugabe von eisgekühltem Wassei

³⁹⁴·^Μ· 80383 1 /08 1 B

ab. Die überstehende ölphase wird abgesaugt, wonach man die erhaltenen Perlen des gemischten Gels abtrennt/ mit einer 0,2 prozentigen Natriumlaurylsulfatlosung und dann mit entmineralisiertem Wasser wäscht. Diese Perlen werden in Form einer Suspension in Wasser mit einer Temperatur von 4⁰C gelagert, das Spuren eines Bakteriostatikums, wie Natriumazothydrat enthält.

Das in dieser Weise erhaltene wäßrige Gel ist besonders hart und eignet sich für die Chromatographie mit hohem Durchsatz. Dieses Gel ist thermisch nicht stabil und muß bei Temperaturen unterhalb 37⁰C verwendet werden.

Beispiel 11

Herstellung eines N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/-acrylamid/Glyoxal-bis-acrylamid-Copolymeren in trockener Form.

Man bringt die gemäß den Beispielen 5 bis 8 erhaltenen Perlen des wäßrigen Gels zusammen mit Wasser in einen Behälter ein, der an seinem Boden einen Auslaß aufweist, an den ein Filter angebracht worden ist. Man hält die Perlen durch ständiges Rühren mit einem Magnetrührer in Suspension.

Dann gibt man kontinuierlich Äthylalkohol in den oberen Teil des Behälters ein, wobei die Zugabegeschwindigkeit derart eingestellt wird_r daß .sie gleich groß ist wie die Abziehgeschwindigkeit am unteren Ausgang des Behälters.

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Die suspendierten Perlen befinden sich somit in Kontakt mit einem Medium, das immer reicher an Äthanol wird. In dieser Weise wird das __ Wasser progressiv aus dem Inneren der Perlen vertrieben und durch Äthanol ersetzt. Nach dem Ersatz des Wasser verdrängt man in gleicher Weise das Äthanol durch Aceton und das Aceton durch Äthyläther. Schließlich erhält man ein mit Äther getränktes Gel, das man in einigen Minuten mit einem Luftstrom trocknet.

In diaser Weise erhält man pro 100 ml des als Ausgangsmaterial eingesetzten Gels etwa 5 bis 20 g des Copolymeren in Form eines feinen Pulvers, das in Form von kleinen Kügelchen vorliegt. Dieses Pulver wird in Kontakt mit Wasser augenblicklich rehydratisiert, wobei die Teilchen ihre ursprüngliche Form wieder annehmen. Das Verhalten des getrockneten und rehydratisierten Gels bei der Chromatographie unterscheidet sich nicht von dem des als Ausgangsmaterial eingesetzten wäßrigen Gels.

Beispiel 12

Anwendung der erfindungsgemäßen Gele für die Immobilisierung von Enzymen.

Man beschickt einen konischen 20ml-Behälter mit 5 ml der Perlen des wäßrigen Gels von Beispiel 7 und 15 ml entmineralisiertem Wasser. Man rührt und gibt 4 ml einer wäßrigen Bromcyanlösung mit einer Konzentration von 50 mg pro ml zu. Man setzt das Rühren fort, wobei man den pH-Wert

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durch Zugabe von 1n Natriumhydroxidlösung bei einem Wert von 11 hält. Nach dem Stabilisieren des pH-Wertes rührt man während weiterer 30 Minuten, filtriert die Perlen dann ab, wäscht sie schnell mit 100 ml einer Q_f1m wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und dann mit einer Im Natriumchloridlösung. Die in dieser Weise erhaltenen Perlen des aktivierten Gels werden anschließend zur Fixierung von Arginase verwendet.

—2 Man bringt das aktivierte Gel in 10 ml eines 5 χ 10 m Maleat/MnCl₂-Puffers mit einem pH-Wert von 7_f2 ein_? der 10 mg Arginase mit einer Aktivität von 15 Einheiten pro mg enthält» Man bewegt die Suspension während 24 Stunden bei 4⁰C auf einer Schütteleinrichtung= Dann filtriert man die Perlen ab, wäscht sie mit 25ml einer Im Natrium-Chloridlösung und mit 25ml entmineralisiertem Wasser. Das in dieser Weise erhaltene Derivat aus dem aktivierten Gel und der Arginase wird in Form einer Suspension in einem 5x10 m Maleat/MnCl₂-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 aufbewahrt.

Die Menge des an das aktivierte Gel gebundenen Enzyms wird indirekt bestimmt, indem man das in dem Filtrat noch vorhandene Enzym in klassischer Weise mit Hilfe des Polin-Reagenz (siehe Lowry et coil. J«BIoI= Chem» 193 (1951) 265) bestimmt. Die enzymatische J0"ti"/ität des Derivats

- 26 394.Mo

8n r» λ rs «ι /7 fr θ η. {ζ

aus dem aktivierten Gel und der Arginase wird durch die Arginin-Hydrolysemethode bestimmt. (J.J. Hagan und R.D. Dallam, Anal. Biochem. 22 (1968) 518).

Die bei 2 ähnlichen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

mg Arginase, die % Arginase, die Versuch pro ml Gel ge- an dem aktivierten

bunden ist Gel gebunden ist

% Itestaktivität der gebundenen Arginase

1 2

1/3

1,47

73,5 %

36 %

37 %

Der Prozentsatz der restlichen Aktivität* der die enzymatische Aktivität des Derivats widerspiegelt, ist als die folgende Formel

10Ox-

definiert, in der M-, für die Masse des gebundenen ^iVi3
Enzyms und M₁ für die Masse des nativen Enzyms, die die gleiche Aktivität wie die Masse des gebundenen Enzyms aufweist, stehen.

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Beispiel 13

Herstellung eines N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/-acrylamid/Ν,Ν' -Dihydroxyä thylen-bisacrylamid/6-· Acrylamid ohexansäure- (oder N-Acryloyi-£ -aminocapronsäure)-Copolymeren in Form von Perlen eines wäßrigen Gels.

Man arbeitet nach der Methode von Beispiel 5, ersetzt jedoch in der wäßrigen Lösung die 40g N-/ Tris{hydroxymethyl)-methy1_/-acrylamid und die 4g Glyoxal-bisacrylamid durch 35,6g N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/-acrylamid/ 4,0 g N,N¹-Dihydroxyäthylen-bisacrylamid und 0,4 g 6-Acrylamidohexansäure. Die wäßrige Lösung wird auf einen pH-Wert von 6 eingestellt, worauf man in der in Beispiel 5 beschriebenen Weise fortfährt.

Man erhält in dieser Weise ein wäßriges Gel, das 6 bis 20 Mikroäquivalente (jjJiq) und COCH-Gruppen pro ml des Gels enthält, in Form von Perlen mit einem Durchmesser zwischen 30 und 250 μΐη.

Beispiel 14

Herstellung eines N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/-methacrylamid/N/N'-Dihydroxyäthylen-bisacrylamid/N-/ (N-Methacryloyl) -glycyl^glycin-Copolymeren in Form von Perlen eines wäßrigen Gels.

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Man arbeitet nach der Methode von Beispiel 5, ersetzt jedoch in der wäßrigen Lösung die 40g N-/ Tris(hydroxyraethyl)-methyl_/ ^acrylamid und die 4g Glyoxal-bisacrylamid durch 10,6g N-/ Tris(hydroxymethyl)-methy1_/-methacrylamid, 1,2g Ν,Ν'-Dihydroxyäthylen-bisacrylamid und 0,2g N-/ (N-Methacryloyl)-glycyl_/-glycin.

In dieser Weise erhält man ein wäßriges Gel, das 6 bis 20 fJÄq COOH-Gruppen pro ml des Gels enthält, in Form von Perlen mit einem Durchmesser zwischen 30 und 250 μπι.

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Claims

DR. BERG DirL.-lNG. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR. DR. SANDMAIR

PATENTANWÄLTE

Postfach 860245, 8000 München 86

Anwaltsakte: 28 754 26. Januar 1978

MAR-PHA Societe d¹Etudes et d¹Exploitation

de Marques

75 115 Paris, Frankreich

Hydrophile Copolymere, sie enthaltende Gele und deren Verwendung

Patentansprüche

1. Statistisch aufgebaute, drei-dimensional vernetzte, wasserunlösliche Copolymere, dadurch gekennzeichnet, daß sie in copolymerisxerter Form

a) 25 bis 98 Gew.-% N-/ Tris (hydroxymethyl) -methyl J-acrylamid oder N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl_/-methacrylamid oder einer Mischung aus diesen beiden Verbindungen,

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b) 2 bis 50 Gew.-% eines oder mehrerer Monomerer, die mehrere polymerisxerbare äthylenische Doppelbindungen und eine oder mehrere Hydroxylgruppen aufweisen und frei sind von NH₀-Gruppen und COOH-Gruppen und

c) 0 bis 50 Gew.-% eines oder mehrerer Monomerer, die eine polymerisxerbare äthylenische Doppelbindung und eine oder mehrere Aminogruppen oder Carboxylgruppen aufweisen,

enthalten.

2. Copolymere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Monomeren b) einer der folgenden allgemeinen Formeln I und II

P, 0

Il Il

(I) HC = C - (CH ) -C-N-(CHX) - N - C - (CH₉) -C= CH A \ 2 η ι iri ί £* η ι 2t

111 ρ

R R¹ R' ^R

0 0

Jl H

(II) H₀C = C - (CH₀) -N - C- (CHX) - C - N - (CH₀) -C= CH₀ Ζ|2η| m j 2 η |

RR¹ R¹ R

entsprechen, in denen

R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxymethylgruppe, X ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe und η und m ganze Zahlen mit Werten von 0 bis 6 mit der

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Maßgabe bedeuten, daß X und R¹ nicht gleichzeitig Wasserstoffatome darstellen.

3. Copolymere nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß sie in copolymerisierter Form 50 bis 98 Gew.-% der Monomeren a) und als Rest bis zu 100 % eines oder mehrerer Monomeren b) enthalten.

4. Copolymere nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Monomeres a) N-/ Tris(hydroxymethyl)-methyl _/-acrylamid enthalten.

5. Copolymere nach den Ansprüchen 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , daß sie als Monomeres b) Ν,Ν'-Diallyl-tartradiamid enthalten.

6. Copolymere nach den Ansprüchen 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Monomeres b) Glyoxal-bisacrylamid enthalten.

7. Copolymere nach den Ansprüchen 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Monomeres b) N,N'-methylen-bis-hydroxymethylacrylamid enthalten.

8. Wäßrige Gele, dadurch gekennzeichnet, daß sie 2 bis 60 Gew.-% eines Copolymeren nach den Ansprüchen 1 bis 7 enthalten.

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9. Wäßrige Gele nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß sie in Form von Perlen mit einem Durchmesser von 10 bis 600 μκι vorliegen.

10. Wäßrige Gele nach den Ansprüchen 8 und 9 , dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein natürliches/ gelierbares makromolekulares Produkt enthalten, wobei das Gewichtsverhältnis von natürlichem, gelierbarem makromolekularem Produkt zu dem Copolymeren in dem Gel gleich oder weniger als 2 beträgt.

11. Wäßrige Gele nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie als natürliches, gelierbares makromolekulares Produkt Agarose, Agar-Agar oder Gelatine enthalten.

12. Aktivierte wäßrige Gele, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Umsetzen eines Gels nach den Ansprüchen 8 bis 11 mit einer bifunktionellen oder einer polyfunktionellen Verbindung erhältlich sind.

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13. Aktive wäßrige Gele nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß sie unter Verwendung von Bromcyan, Glutaraldehyd, Epichlorhydrin, des Diglycidyläthers von Butandiol-1,4 oder eines 1 _r3_r 5-Trichlor-2,4_/6-triazin-derivats hergestellt worden sind.

14. Kombinationen aus aktivierten wäßrigen Gelen und biologischen Makromolekülen, dadurch gekennzeichnet , daß sie als aktiviertes wäßriges Gel ein Gel nach den Ansprüchen 12 oder 13 enthalten .

15. Kombinationen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß sie als biologisches Makromolekül ein Protein enthalten.

16. Kombinationen nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß sie als Protein ein Enzym enthalten.

17. Verwendung der Gele nach den Ansprüchen 8 bis 11 für die Flüssigphasen-Gelchromatographie.

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