BE620906A

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Publication number: BE620906A
Authority: BE

Description

La présente invention concerne de l'héparine modi- fiée et cet relative à un procédé pour sa production.

Apres un repas gras, le sang humain devient laiteux à cause de la présence de particules de graisse émulsifises.

Cet état est appelé lipémie. Cet excès de graisse est normale- ment utilisé par combustion, par emmagasinage sous forme de dépits de graisse ou par incorporation générale dans les tis- sus du corps mais chez les artériosclérotiques, les diabéti- ques et dans une certaine mesure chez les personnes âgées, la lipémie tend à persister. Une telle lipémie persistante,ou hyperlipémie, est généralement associée à la présence d'une forte proportion de ss-lipoprotéines à haut ppide moléculaire.

On a proposé d'utiliser l'héparine et certains dé- rivés simples de l'héparine pour le traitement de l'hyperlipé- mie, étant donné que ces composés possèdent la propriété ca- ractéristique d'activer un enzyme du corps qui scinde le* ss-lipoprotéines ce qui provoque une clarification du sang* Un tel enzyme est normalement appelé, pour des raisons de simpli- cité, "un facteur de clarification**Malheureusement, l'hépa- rine et les substances antilipémiques citées possèdent égale- ment une forte activité anticoagulante et le danger existe, que, au cours d'une thérapie à long terme, des hémorragies épisodiques puissent se produire.

De plus, lorsque ces subs- tances sont administrées par voie aouscutannée ou intramus- culaire, le sang est capable de produire des "écohymoses" et

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même de e'extravaaar au point d'infection. U
L'héparine peut être dérivée d'un certain nombre de sources naturelles, par exemple lea poumons ou muqueuses, et des différences de composition peuvent être observées bien que les propriétés physiologiques de la matière provenant de
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diverses sources sont étroitement 81.lairea.

De plus,!'M- j tivité anticoagulante et antilipémique de l'héparine est aussi
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l'appenage d'un certain nombre de dérivés simples de i'hépari- ne formés #or momification des extrémités des chaînes réduc- triées, par exemple la cyanhydrine et les composés earboxy fore! més par hydrolyse de la cyanhydrine et aussi les composée hydroxy formes par la réduction des groupes réducteurs aldéhydi -
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quee, par exemple avec du borohydrure, ±tant donné que l'action physiologique de ces dérivés et que les d1versee formas d'h'!'" : parine sont toutes étroitement similaires, l'expression .

"héparine" sera utilisée dorénavant dans le prisent mémoire, ! et les revendications qui le terminent pour désigner aussi bien les dérivés simples décrits ci-dessus que les substances naturelles.
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La demanderesse a trouvé,"ue lori)que l'héparine est soumise à une scission glyoolique, des. substances sont formées qui possèdent une bonne activité antillpémique mais une aoti- vité anticoagulante réduite. Ces propriétés du produit ne sont pas changées de manière notable lorsque les groupe* aldéhyde formes au coure de la scission glycolique sont réduite. Le produit réduit est préféré pour l'objet de l'invention étant donné sa plus grande stabilité chimique .

Selon la présente invention, la demanderesse a trouvé un procédé de modification de l'héparine, afin d'abais- ser non activité anticoagulante sans diminution substantielle

de son activité antilipémique, procédé dans lequel l'héparine est soumise à une scission glycolique suivie, si on le désire, d'une réduction des groupes aldéhydiques ainsi formée, l'hépa- ; rine modifiée étant finalement isolée du mélange réactionnel;
La matière de départ de choix est l'héparine natu- relle dans laquelle les extrémités des chaîna:) réductrices demeu- rent inchangées.

L'héparine est un aminopolysaccharide sulfaté qui possède une unité tétrasaccharide récurrente constituée par des unités acide D-glucuronique et D-glucosamine alternées, les unités glycosamines étant sulfatées sur le groupe amino.

L'une des unités acide uronique dans l'unité de récurrence est sulfatée en position 2, tandis que l'autre unité acide unonique ne port, pas de groupe sulfaté, Les deux groupes sulfate res- tante, sont localisés sur les unités glucosamine . Il semble, pour cette raison, qu'étant donné qu'une unité acide glucuro- .nique liée en positions 1,4 possède normalement des groupes hy- droxyle sur les positions 2 et 3 seulement, une unité acide glucuronique du tétrasschraride possède des groupes hydroxy- les adjacente, tandis que les autres n'en possèdent pas.

Ceci est soutenu par la découverte que dans le traitement par du periodate de sodium coupe agent de scission glycolique, selon la présente invention, le produit résultant peut être dégradé pour donner un acide tétronique et environ 50 % de la quanti- ! té originelle d'acide glucuronique, indiquant en cela que seule) une unité uronique par unité tétrasaccharide a été attaquée.

Le produit résultant de la siscion glycolique de l'héparine, suivit' si on le désire, de la réduction des groupes aldéhydes ainsi formas, peut dont être caractérisé comme pos-

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aidant un rapport unités acide D-gluouronique/unitéa gluoofft-
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mine inférieur à 1,0, ceci étant dû à l'attaque sur les uni- tés acide uronique, et une teneur en D-gluoosamine, une te-
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nour en sulfate et un spectre infra-rouge similaire* à ceux de la matière au départ. Lorsqu'une scission glycolique nouai.
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blement complète a été effectuée, le rapport cité ci-aeaaua ' eat d'environ 0,5 La teneur de l'acide manique de la #Aiere est, en général, comprise entre 50 e et 100 % en poids de .t6.. parine.

La teneur en acide uronique de ra aaxitrre non rédui- te ne peut pas être déterminée par la méthode généralement ' ¯A utilisée mais il eut improbable qu'elle aolt change pp-t 3'f ; réduction. Des mesures de la teneur en acide urone4ue d<t l'e- parine oxydée sont pour cette raison normalement eifeotuéea en
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réduisant d'abord la matière par exemple avec du boronydrure. Le poids moléculaire des produits est similaire à celui de l'héparine bien qu'il n' est pas aisément déterminé, à. cause de 1* inhomogénéité* "3J "activité métachromatîque de la matière
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est aussi étroitement similaire à celle de l'héparine.
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Selon une autre caractéristique de la présolats.inven-1 tion, la demanderesse propose un aminopolyaaocharide, ayant
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un rapport des unités acide uronique inchangé aux unités D- glucosamine d'au moins 0,5 et inférieur à 1,0, le pourcentage
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des unités acide uronique inchangé dans la molécula étant d'mn moins 50 % .et inférieur a celui de l'héparine naturelle, cet aminopolyeaccharide ayant un poids moléculaire, une teneur en sulfate, une $gtivité métachromatique et un spectre infra-rou- ge sensiblement identiques à ceux de l'héparine naturelle et
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ayant une action antilipémique comparable à celle de l'héparine*
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mais une action anticoagulante plue faible que celle de 1114pa. rine.

Lorsque le rapport de* unité a acide uronique à glucosamine approche 0,5, l'activité anticoagulante se trouve diminuée jusqu'à 4-8 unitéo/mg, par exemple approximativement 6 unités mg, lorsqu'on la compare aux 100-150 unités mg normales pour l'héparine inchangée et une telle matière est préférée.

Bien que la demanderesse ne désire pas limiter le cadre de la présente invention à des considérations théoriques. les pro- duits dérivés de l'héparine par réduction, selon la présente .invention, semblant contenir des unités tétrassccharides récur- rentes de structure générale suivante:

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L'activité antilipémique des produite selon la présente inven- tion peut être estimée par l'injection dans des lapins, suivi. par l'incubation de plasma citrate préparé à partir de sang tiré du lapin après un intervalle donné, avec uns dilution appropriée d'une émulsion à 50 % d'huile de noix de coco. L'o- pacité de l'émulsion peut être déterminée à l'aide d'un spectro- photomètre à une longueur d'onde de 650-700 mu. L'activité anti- caillotante ou anticoagulante du produit peut être mesurée par les méthodes et dans les unités conventionnelles pour l'hépa- rine. De manière similaire,l'activité anticaillotiante peur être mesurée par l'observation du caillottement dans le plasma de mouton (Pritchard; J.

Pharm. and Pharmacol. 1956, 8, 523-529)*
Les produite suivant la présente invention qui sont préparée à partir de l'héparine ne sont pas, tout comme l'hé- parine elle-même, absorbés par le duodénum ou l'estomac et sont de préférence administrés par voie paronthérale en combinaison

avec un support ou véhicule inerte pharmaceutiquement accepta- . ble pour l'infection ou l'implantation. Des supporte ou véhiou- les appropriée comprennent l'eau apyrogène stérile, l'huile ou ! des émulsions huileuses 'contenant, si on le déaire,des agents d'émulsification ou de dispersion et des 'sels physiologiques.

Les produite sont bien tolérés et peuvent être administrés en . des 0.0-ses de l'ordre de 0,25-5 mg. par exemple 0,4 mg kg du poids du corps. Ils peuvent par exemple aussi être administrés en doses uniques comprises entre 10 et 500 mg.

Les produits suivant la présente invention peuvent être préparée comme indiqué ci-dessus, par traitement d'hépari- ne avec un agent de scission glycolique, suivi par la réduction des groupes aldéhyde ainsi formés. logent de scission glycoli- gue est aventegeunement un Rériednie, pas enemple un pdriednte de,,métal alcalin tel que le périodate de sodium ou de potassium* Le métapériodate de sodium est préféré, étant donné sa plue forte solubilité dans l'eau. La réaction de scission avec le périodate est de préférence effectuée à un pH légèrement acide, par exemple 'un pH de 4 ou de 5,

et cette réaction cet avanta- geusement effectuée à la température ambiante ou à une tempé- rature inférieure. Le solvant* est de préférence l'eau étant donné l'excellente solubilité des polysaccharides dans ce mi- lieu.

La demanderesse a trouvé qu'en plus de la réaction de scission glycolique, une suroxydation ge produit qui cet plus lente que la réaction de Mission susdite mais qui se dé- roule simultanément à la réaction de scissionet conduit à la production de matière à chaîne plus courte. Il est, pour cette raison, préférable de limiter l'absorption d'agents de scission glycolique à la quantité minimum nécessaire, par exemple, 3-4

moles par unité tétrasaccharide, afin d'obtenir un produit ayant une activité anticoagulante faible, pr exemple 4 à 8 unités tg.

Tout excès de périodate peut être; éliminé si on le désire, par traitement, par exemple, avec un glycol, par exem- ple de l'éthylène glycol, et la matière à chaîne courte et d'autres matières indésirables peuvent être facilement élimi- nées par dialyse.

La réduction des groupes aldéhyde peut être effec- tuée par exemple par hydrogénation cataly tique, en utilisant par exemple un catalyseur de platine, mais elle est de préfé- rence effectué)en utilisant un hydrure métallique comme agent réducteur, tel qu'un botohydrure de métal alcalin. La tempéra- ture réactionnelle préférée est de nouvel la température ambiante ou une température inférieure et la réaction est de préférence effectuée dans de l'eau comme milieu de réaction, les borohydrurea étant des agents réducteurs préférés, étant donné leur bonne solubilité dans les milieux aqueux.

La matière réduite peut contenir d'autres matières. dégradées et celles-ci sont avantageusement éliminées, par ex- emple, par dialyse, avant l'isolement du produit, par exemple, par congélation.

Les exemples illustratifs suivants feront mieux com- prendre l'invention sans toutefois la limiter à ceux-ci.

EXEMPLE 1.

(1) Héparine de poumons de bovidés utilisée comme matière de départ.

L'héparine utilisée s'est révélée absorber très ra- pidement l'humidité de l'air. Par conséquent, avant toute ana- lyse, on a laisse l'héparine s'équilibrer avec l'atmosphère.

,un* partis de l'échantillon a alors été analysée et une partit a été Biche* afin de trouver la teneur en humidité.

Analyse du sulfate.

L'analyse du sulfate sur des quantités 4,9 3 mg ayant
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une teneur en humidité d'environ 19 % par la téthodo epeotro- photométrique de Jones et Lethaae et &pr0j' digeetion avec de l'acide nitrique et du peroxyde, a donne pour résultat! 41, 5 % de sulfate, '
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!, Cea3 suppose que le N-aulfaie est converti en sulfata au coure de l'analyse/ ce résultat s'aecoeue avec les 4.r''' tenue par la méthode de la cendre sulfatée,
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le pourcentage de soufre est donc 3.3 8.' Détermination de 1 ' aeiide uronique.

En utilisant la méthode décrite par Barder, Poster# Siddiqui et Stauuyl on a trouvé que 98,5 de l'atide uronique attendus étalent présente, La quantité théorique a été calcu- lés en se basant sur l'hypothèse qu'il y a deux résidus acide
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glueuronique par unité tétrasacoharide et qui il y a cinq grou- pes sulfate dans la môme unité.

(2) Oxydation de 1. ' héparine .
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De l'héparine (2,87 gm - poids sec 2,34 su - humidité 18,3 xi) a été dissoute dans de l'eau, 50 cl de périodate de sodium 0,25M ont été ajoutes et le mélange a été dilué jusqu'à
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un voluatc de 500 ml dans un flacon gradué. La solution a été entréporde dans lfebeouriié à 25*04 es parties aliquotes 4e 5 XI ont été prises de temps en temps afin de déterminer la conson- mation de périodate. Au cours de$ premiers stade de 1 oxydation
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*1 nry a pas eu élaboration 4'anhydrite carbonique.

De mômes des parties aliquotes plue importante$ ont été prises et l'oxydation y a été arrêtée par l'addition d'un

excès d'éthylène glyool. Le mélange a été dialyse pendant tout! la nuit à contre-courant avec de l'eau Puis il a été séché par oongellation.
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EXEMPLE
La matière oxydée de l'exemple 1 a été réduite à l'at de de borohydrure de sodium à la température ambiante pendant
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toute la nuit,

l'excès de bofohydrure a été détruit à l'aide d'acide acétique et le mélange a à nouveau éti diayed et Ué I*r < - gellation. Cette matière réduite a été soumise à l'analyse. le tableau suivant donne les résultats analytiques obtenue à partir de deux parties aliquotes séparées.
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<tb>

Echantillon <SEP> Heures <SEP> après <SEP> Périodate <SEP> Teneur <SEP> en <SEP> acide
<tb> amorce <SEP> de <SEP> uronique <SEP> sous
<tb> l'oxydation <SEP> forme <SEP> de <SEP> pourcentage
<tb> de <SEP> }. <SEP> 'original <SEP>
<tb> dégage- <SEP> test <SEP> par <SEP> le
<tb> ment, <SEP> par <SEP> carbazol
<tb> le <SEP> CO2
<tb>

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<XMt-MMMtt-M M*-<MM<#t --T f 'I ]| I ' 'I 1 1 1 I I i . Il . I . I I #rr IIIM|. 1|1||IL|.¯
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<tb> 1 <SEP> 97 <SEP> 3,28 <SEP> 57,4 <SEP> 51,5 <SEP>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 179 <SEP> 4,3 <SEP> 57,4 <SEP> 54,7 <SEP> %
<tb>
La teneur en amino-sucre a été déterminée par une
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méthode Bison-Morgan modifiée et cette méthode a montré qu'il n'y a pas eu de perte apparente d'amino-sucre dans l'un quel- conque des échantillons.

Chaque échantillon a été hydrolyse et l'électrophorèse sur papier dans une solution tampon d'acétate a montré l'exixtanoe d'un composant acide qui avait la même mobilité que l'acide glucuronique et l'existence d'un autre composant acide qui avait la même mobilité que l'acide érythro- nique. De la glucosamine était également présente.

Les deux échantillons ont été testés afin de déter- miner leur activité de clarification par la méthode suivante. -
Une solution aqueuse du produit en question dans de l'eau sté- rile a été préparée et environ 100 unités méthadromatiques (Mac Intosh; Biochem J. 1941, 35, 776) ont été injectées par voie intraveineuse dans un lapin. Le lapin a été saigné immé- diatement avant l'injection et ensuite a certains intervalles, et, après citratation, le sang a été centrifugé et le plasma a été stocké à 4 C.

L'opacité d'un mélange de 1,5 ml de plasma et de 3,0 ml d'diol Schenley à une dilution de 1 1000 (une émulsion à 50 % d'huile de noix de coco) a été déterminée dans. un spectrophotomètre Unicam à une longueur 'onde de 650 mu avant ]L'incubation à 37 C et à certain intervalles par après* Il s'est révélé que chaque échantillon produisait du plasma ré- i duisant l'opacité de l'émulsion de plus de 50 % en une période de 6 heures.

La méthode mentionnée ci-dessus a été utilisée pour préparer de l'héparine de muqueuse modifiée, l'oxydation étant effectuée en utilisant du périodate à trois concentrations dif- férentes. L'essai anticoagulant, mesuré par le test du caillot- tement de plasma de mouton de Pritohard (J. Pharm and Pharma- col.; 1956, 8, 523-9), et l'activité méthacromatique sont montrés dans le tableau suivant:

TABLEAU.
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<tb>

Périodate <SEP> Potentiel
<tb>

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Temrs absorption -##########!#####"##"*'"
EMI11.3

<tb> (heures) <SEP> méthode <SEP> Méthode
<tb>

EMI11.4
caillottement métachromatique
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<tb> de <SEP> plasma <SEP> au <SEP> bleu <SEP> de
<tb> de <SEP> mouton <SEP> toluidine.
<tb>

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Héparine ae poumon 0,0038 j 97 3r3 6,6 80#0 Périodaie 0.025& - ) 179 493 4, 82,0 Héparine de muqueuse O,0030² ) 91 3985 - Périodate 0,027 = 135 4,5 3,2 8010 Héparine de truqueuse 0,0115 ) 21 2,5 - Periodate 0,125= 3 43 4.8 5.2 98,9 Héparine de muqueuse 0,0265 20 ',2 ériodate 0,25w 30 4,4 5,2 95, 4; 5.; 4.9 102.2

Claims

REVENDICATIFS. EMI12.1 1.- Procédé de Modification d'héparlnt pour abaîener son activité anticoagulante sans faire décroître sensiblement EMI12.2 son activité ant11ipémiqu8. caractérise en ce que l'héparine est soumise 4 une scission glycolique suivie, si on le désira d'une réduction des groupes aldéhyde ainsi formés, l'hépari- ne modifiée étant finalement isolée du mélange réactionnel* 2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérise en ce que l'héparine est de l'héparine naturelle, 3.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tiona 1 et 2, caractérisé en ce que la scission glycolique est EMI12.3 effectuée en faisant réagir l'héparine avec un p'r1ote./ 4s- ProCétiê Sttivant .a rerendlaa.tlori /' ",:

,f L 4.- Procédé suivant la revendication 3car<6ériaé en ce que le périodate est un périodate de métal alcalin.

5.- Procédé suivant la revendication 3, caractérisé. EMI12.4 en ce que le périodate est du mêtapërîodate de sodium.

6.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions à 5, 'caractérisé en ce que la scission glycolique est effectuée à un pH de 4-5.

7.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- ' ; tiona précédentes, caractérisé en ce que dans la réaction de scission glycolique ,la quantité d'agent de scission glycoli- : que consommée est approximativement de 3-4 moles par unité EMI12.5 tétrasacoharide de l'héparine.

8,- Procédé suivant l'une ou'l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'oxydation est'pour- suivie jusqu'à ce que la teneur en acide uronique tombe à en- viron 54 % de la teneur dand l'héparine apparentée servant de matière de départ. <Desc/Clms Page number 13>

9.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que l'oxydation est pour- suivie jusqu'à ue que l'activité anticoagulante de l'héparine EMI13.1 modil1ée tombe jusqu'à 4 à ,p unités/m&.

10. - Procède suivant l'une ou .L'autre des revendica- tione précédentes, caractérisé en ce que l'héparine modifiée eet isolée, après oxydation, par séchage par congélation* 1.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérise en ce que la réduction desdits groupes aldéhyde est effectuée à l'aide d'un hydrpre métalli- que comme agent réducteurs 12.- Procédé suivant la revendication 11, caracté- risé en oe que l'hydrure métallique est un borohydrure de mé- tal alcalin.

13.- Procéda suivant la revendication 12, caracté- risé en ce que le borohydrur6 est du borohydrure de sodium* 14.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que les réactions de scis- sion glycolique et de réduction ou l'une d'entre elles sont effectuées à la température ambiante ou à une température in- férieure .

15.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que les réactions de noie-' sion glycolique et de réduction ou l'une d'entre elles sont effectuées dans de l'eau comme milieu solvant.

16.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que lea impuretés indé- sirables sont éliminées par dialyse, <Desc/Clms Page number 14> 17.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendi- cations précédentescaractérisé en ce que le produit réduit désiré eat isolé de la solution par séchage par congélation** 18.- Procédé selon la revendication 1, en substance, tel que décrit ci-dessus, notamment dans l'un quelconque des EMI14.1 exemples prddddente.

z Héparine modifiée, lorsqu'elle est obtenue par le procédé selon l'une ou l'autre des revendications précéden- tees EMI14.2 20,- Aminopolyeaccharide, ayant un rapport unités acide uronique inchangé/ unités --g3.uattsasins d'au moins 0,5 et inférieur à 1,0, le pourcentage des unités acide uronique inchangé dans la molécule étant d'au moins 5COet inférieur à luc 14 te celui qui it PW40'A" 4an. 'h4p1n. na'¯r.11., Qat aia3.nopolyaaaahaxids ayant un poids aoléculaire, une teneur en sulfate, une activité met achromatique tt un spectre infra- rouge sensiblement Identiquesà ceux de l'héparine naturelle et ayant une activité antilipémique comparable à celle 'de l'héparine mais ayant une activité anticoagulante intérieure. EMI14.3

21.- Àminopolysaccharide selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il possède une activité anticoagulante de 4 à 8 unités anticoagulantwag.

22.- Aminopolysacoharide selon l'une ou l'autre dao revendications 20 et 21, en substance, tel que décrit ci-des- sus.

23.- Compositions pharmaceutiques contenant une ma- EMI14.4 tière ant.l3.pémique selon l'une ou l'autre des revendications 18 à 22, en combinaison avec un véhicule ou excipient pharma- ceutique parenthéralement acceptable. <Desc/Clms Page number 15>

24.- Compositions pharmaceutiques selon la revendi- cation 23, caractérisées en ce que le véhicule ou extipient est de l'eau apyrogène atérile, une huile ou une émulsion huileuse, stériles.

25.- Compositions pharmaceutiques suivant l'une ou l'autre des revendications 23 et 24, sous forme de dosée uni- taires, chaque dose unitaire susdite contenant de 10 à 300 mg de matière active.

26,- Compositions pharmaceutiques selon la reven- dication 20, en substance, telles que décrites ci-dessus, 27.- Tous et n'importa quel)} composés, compositions, procèdes et méthodes révélés ci-dessus.