CN103314290B - 核酸链的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够在短时间并且以高性能进行核酸的PCR扩增产物、该PCR扩增产物的限制性内切酶片段、或核酸的限制性内切酶片段等目标核酸的分离检测的离子交换色谱法用洗脱液。另外，本发明提供基于使用了该洗脱液的离子交换色谱法的核酸链的分析方法。一种离子交换色谱法用洗脱液，其中，含有由下述式(1)所示的胍衍生的胍盐，

Description

核酸链的分离方法
技术领域
本发明涉及用于核酸的PCR扩增产物、该PCR扩增产物的限制性内切酶片段、或核酸的限制性内切酶片段等目标核酸的分离检测中的离子交换色谱法用洗脱液。另外，本发明涉及通过使用了该洗脱液的离子交换色谱法的核酸链的分析方法。
背景技术
离子交换色谱法是利用在柱填充剂的离子交换基团与测定对象物质中的离子之间发挥作用的静电相互作用来分离测定对象物质的方法。
特别是由于对核酸、蛋白质、多糖类这样的生物体高分子的分离优良，因此，在生物化学和医学等领域中被利用。
离子交换色谱法中具有利用阴离子交换的色谱法和利用阳离子交换的色谱法。阴离子交换使用阳离子性的柱填充剂，能够分离阴离子性的物质。相反，阳离子交换使用阴离子性的柱填充剂，能够分离阳离子性的物质。
作为阴离子交换柱填充剂的阳离子性的官能团，有二乙氨基乙基这样的弱阳离子性基团、季铵基这样的强阳离子性基团，这些具有阳离子性的官能团的阴离子交换柱填充剂已经被市售，在各种研究领域中使用。
核酸是由碱、糖、磷酸构成的核苷酸用磷酸酯键连接的生物体高分子，根据糖结构的不同，分类成脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
在使用离子交换色谱法分离核酸的PCR扩增产物、该PCR扩增产物的限制性内切酶片段、核酸的限制性内切酶片段等目标核酸的情况下，使用利用在该目标核酸分子中包含的磷酸的负电荷的阴离子交换液体色谱法，按链长能够分离检测该PCR扩增产物、核酸片段等目标核酸。
作为按链长分离核酸链的方法，广泛使用凝胶电泳法，但作业烦杂，或测定耗费时间等，有许多改善的余地。非专利文献1中公开了通过高效液相色谱法分离核酸相关化合物的方法，如果使用该方法，则不需要烦杂 的作业，能够短时间按链长分离检测核酸链。但是，存在难以充分地分离接近的链长差的问题，因此，要求进一步的分离性能的提高。
现有技术文献 
非专利文献 
非专利文献1：“ライフサイエンスのための高速液体クロマトグラフイ一基礎と実験(用于生命科学的高效液相色谱法基础与实验)”、广川书店、p.323
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于，提供能够在短时间并且以高分离性能进行核酸的PCR扩增产物、该PCR扩增产物的限制性内切酶片段、核酸的限制性内切酶片段等目标核酸的分离检测的离子交换色谱法用洗脱液。另外，本发明的目的在于，提供通过使用了该洗脱液的离子交换色谱法进行的核酸链的分析方法。
用于解决课题的方法
本发明是含有由下述式(1)所示的胍衍生的胍盐的离子交换色谱法用洗脱液。以下详细说明本发明。
本发明人发现，通过在用于离子交换色谱法的洗脱液中添加胍盐，能够提高核酸链不同的试剂的分离性能，从而完成了本发明。
本发明的离子交换色谱法用洗脱液含有由上述式(1)所示的胍衍生的胍盐。
作为上述胍盐，可以列举例如：胍盐酸盐、胍硫酸盐、胍硝酸盐、胍碳酸盐、胍磷酸酯、胍硫氰酸盐、胍氨基磺酸盐、氨基胍盐酸盐、氨基胍碳酸氢盐等。其中，优选使用胍盐酸盐、胍硫酸盐。
本发明的离子交换色谱法用洗脱液中的胍盐的分析时的浓度，根据分析对象物适当调节即可，但优选为2000mmol/L以下。
具体而言，可以列举：使胍盐的浓度在0～2000mmol/L的范围内进行梯度溶出的方法。因此，分析开始时的胍盐的浓度无需为0mmol/L，另外，分析结束时的胍盐的盐浓度也无需为2000mmol/L。
上述梯度溶出的方法可以为低压梯度法也可以为高压梯度法，但优选在进行利用高压梯度法的精密的浓度调节的同时使其溶出的方法。
上述胍盐可以单独添加到洗脱液中，也可以与其他盐组合添加。作为能够与上述胍盐组合使用的盐，可以列举例如：由氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾等卤化物和碱金属构成的盐、由氯化钙、溴化钙、氯化镁、溴化镁等卤化物和碱土金属构成的盐、高氯酸钠、高氯酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机酸盐等。另外，也可以使用乙酸钠、乙酸钾、琥珀酸钠、琥珀酸钾等有机酸盐。
作为用于本发明的离子交换色谱法用洗脱液的缓冲液，可以使用公知的缓冲液类和有机溶媒类，具体而言，可以列举例如：Tris盐酸缓冲液、由Tris和EDTA构成的TE缓冲液、由Tris和乙酸和EDTA构成的TAE缓冲液、由Tris和硼酸和EDTA构成的TBA缓冲液等。
上述洗脱液的pH没有特别限定，只要是通过阴离子交换能够分离核酸链的范围即可。
使用本发明的离子交换色谱法用洗脱液的核酸链的分析方法也是本发明之一。
用于本发明的核酸链的分析方法的色谱柱，只要是填充有阳离子性填充剂的阴离子交换柱即可，可以使用：市售品、使用在基材微粒的表面上具有强阳离子性基团团和弱阴离子性基团的填充剂的阴离子交换柱等。
作为能够采用本发明的核酸链的分析方法的目标核酸(检测对象)，可以列举：核酸的PCR扩增产物、该PCR扩增产物的限制性内切酶片段、或 核酸的限制性内切酶片段，可以例示：来自病毒或基因多态的疑似来自人的核酸、即用于判别病毒的存在和形态的来自病毒的核酸(DNA、RNA)、用于判别基因多态(单核苷酸多态性)的来自人的DNA。
上述DNA或上述RNA通过公知的方法进行提取、精制后，根据需要，通过PCR(聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction)法等扩增，将该扩增产物用于使用本发明的离子交换色谱法用洗脱液的离子交换色谱法。
病毒为RNA病毒等的情况下，相对于提取、精制后的RNA，进行RT-PCR(逆转录聚合酶链反应，Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)反应，可以得到PCR扩增产物。
另外，使用本发明的核酸链的分析方法来判别基因多态的情况下，作为PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism：限制性内切酶片段长多态)法，可以应用公知的技术。RFLP法为如下方法：在存在识别PCR扩增产物中的基因变异部的限制性内切酶的情况下，在共有序列部位设定引物，在其内侧、即PCR扩增产物内具有多态性进行扩增，用上述限制性内切酶切断所得到的PCR扩增产物，根据该片段的长度判定多态的有无。在发生基于限制性内切酶的切断的情况下和没有发生的情况下，产生的片段的数和尺寸均不同，因此，基于此，可知是否引起切断、进而目标位置的碱基为何种。
对于基于引物的扩增区域在引起利用限制性内切酶的切断的情况下所产生的2个片段而言，以分别通过使用本发明的离子交换色谱法用洗脱液的离子交换色谱法能够明确检测的尺寸、优选小的片段达到1bp以上、更优选达到20bp以上的方式进行设定。另外，产生的2个片段的尺寸之差，以通过本发明的核酸链的分析方法能够明确检测、优选达到1bp以上，更优选达到20bp以上的方式进行设定。扩增区域的尺寸的上限没有特别限制，但太大时，浪费PCR的时间和成本，另外，也不具有由此产生的优点，因此，优选为1000bp以下。引物的碱基长度只要是发挥各自的功能的长度即可，作为引物的碱基长度的例子，为15～30bp、优选为20～25bp。
利用上述PCR法的扩增可以通过1个阶段进行，但为了进一步提高敏感度，也可以在第1阶段的PCR中扩增更宽范围的区域，将所得到的PCR扩增产物作为模板，将其中包含的区域通过第2阶段的PCR进一步扩增(nested PCR)。此时，用于第2阶段的PCR的引物二者可以均与用于第一 阶段的PCR的引物不同，也可以使用仅一种不同的引物，另一种与第1阶段的PCR中使用的引物相同(hemi-nested PCR)。
上述PCR法自身是公知的，用于通过PCR法的分离检测的试剂盒也已经被市售，因此，能够容易地实施。用于PCR法的引物的设计、DNA的扩增的条件，可以参照Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.)，Volume2，Chapter8，pp.8.1-8.126，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Sping Harbor，2001。
发明效果
根据本发明，可以提供能够在短时间并且以高分离性能进行核酸的PCR扩增产物、该PCR扩增产物的限制性内切酶片段、核酸的限制性内切酶片段等目标核酸的分离检测的离子交换色谱法用洗脱液。另外，根据本发明，可以提供能够通过使用上述离子交换色谱法用洗脱液的离子交换色谱法在短时间精度良好地分析目标核酸的核酸链的分析方法。
附图说明
图1是使用实施例1的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱1得到的色谱图。
图2是使用实施例1的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图。
图3是使用实施例2的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图。
图4是使用比较例1的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱1得到的色谱图。
图5是使用比较例1的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图。
图6是使用比较例2的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱1得到的色谱图。
图7是使用比较例2的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图。
图8是使用比较例3的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图。
具体实施方式
以下，列举实施例，对本发明更详细地进行说明，但本发明不仅限定于这些实施例。
(实施例1、2以及比较例1～3)
在25mmol/L Tris盐酸缓冲液中添加表1所示的盐，使其浓度达到1000mmol/L，制备实施例1、2以及比较例1～3的离子交换色谱法用洗脱液。所得到的洗脱液的pH全部为7.5。
<评价>
(分离性能的确认)
使用以下的方法，使用实施例以及比较例中制备的离子交换色谱法用洗脱液，将分离检测目标核酸时的分离性能进行比较。
(阴离子交换色谱柱的准备)
(阴离子交换色谱柱1)
作为市售的色谱柱，准备以下的色谱柱(阴离子交换色谱柱1)。
品名：TSK-gel DNA-STAT(东曹株式会社制)
色谱柱尺寸：内径4.6mm×长度100mm
离子交换基团：季铵基
(阴离子交换色谱柱2)
在带搅拌机的反应器中，在3重量％聚乙烯醇(日本合成化学公司制)水溶液中添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)300g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)100g以及过氧化苯甲酰(キシダ化学公司制)1.0g的混合物。搅拌的同时进行加热，在氮气气氛下，80℃下聚合1小时。接着，作为具有强阳离子性的离子交换基团(季铵基)的单体，将甲基丙烯酸乙基三甲基氯化铵(和光纯药工业公司制)100g在离子交换水中溶解，再将所得到的溶液添加到上述反应器中。接着，搅拌的同时，得到在氮气气氛下、80℃下聚合2小时而成的聚合物组合物。将所得到的聚合物组合物用水以及丙酮进行清洗，由此，得到在基材微粒子的表面上具有离子交换基团的亲水性的包覆聚合物粒子。关于所得到的包覆聚合物粒子，使用粒度分布计(Particle Sizing Systems公司制、“Accusizer780”)进行测定，结果平均粒径为10μm。
将所得到的包覆聚合物粒子10g在溶存臭氧气体浓度100ppm的臭氧水300mL中浸渍，搅拌30分钟。搅拌结束后，使用离心分离机(日立制作所公司制、“Himac CR20G”)，进行离心分离，除去上清液。重复该操作2次，对包覆聚合物粒子实施臭氧水处理，得到季铵基和羧基共存的离子交换色谱法用填充剂。
需要说明的是，关于臭氧水，使用在具有内径15cm×长度20cm的圆柱形的外套内包含收纳有由全氟烷氧基树脂构成的内径0.5mm×厚度0.04mm×长度350cm的中空管状的臭氧气体透过膜400根的臭氧溶解模块的臭氧水制造系统(积水化学工业公司制)进行制备。
使用所得到的离子交换色谱法用填充剂，准备以下的色谱柱(阴离子交换色谱柱2)。
色谱柱尺寸：内径4.6mm×20mm
离子交换基团：季铵基
使用准备的阴离子交换色谱柱，在以下的条件下分离检测目标核酸。
系统：LC-20A系列(岛津制作所公司制)
洗脱液：A液25mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH7.5)、B液实施例以及比较例中制备的洗脱液
溶出法：根据表1所示的梯度条件，用0分钟至20分钟使B液的混合比率直线增加。
检体：20bpDNALadder标记物(宝生物公司制、包括20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、300、400、500bp的片段)
流速：0.5mL/分钟(阴离子交换色谱柱1)、1.0mL/分钟(阴离子交换色谱柱2)
检测波长：260nm
试剂注入量：10μL
将使用实施例1的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱1得到的色谱图示于图1，将使用实施例1的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图示于图2，将使用实施例2的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图示于图3，将使用比较例1的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱1得到的色谱图示于图4，将使用比较例1的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图示于图5，将使用比较例2的离子交换色谱法 用洗脱液和色谱柱1得到的色谱图示于图6，将使用比较例2的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图示于图7，将使用比较例3的离子交换色谱法用洗脱液和色谱柱2得到的色谱图示于图8。需要说明的是，图1～8的图中的数值为片段的碱基长(bp)的值。
根据图1～8，在使用实施例的离子交换色谱法用洗脱液的情况下，能够分离检体中包含的全部片段。因此可知，不依赖色谱柱的种类，分离性能均有效地得到提高。另一方面可知，在使用比较例的离子交换色谱法用洗脱液的情况下，根据色谱柱的种类和添加的盐的种类，虽然观察到些许不同，但140bp以下的片段的分离不充分。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供能够在短时间并且以高分离性能进行核酸的PCR扩增产物、该PCR扩增产物的限制性内切酶片段、核酸的限制性内切酶片段等目标核酸的分离检测的离子交换色谱法用洗脱液。另外，根据本发明，可以提供能够通过使用上述离子交换色谱法用洗脱液的离子交换色谱分析法在短时间精度良好地分析核酸链的分析方法。

Claims (3)

1.一种核酸链的分离方法，其按照链长将目标核酸中包含的核酸链进行分离，其具有：
将目标核酸导入至填充有阳离子性填充剂的阴离子交换柱中的工序，和
使用离子交换色谱用洗脱液将目标核酸从阴离子交换柱溶出，从而按照链长将核酸链分离的工序，
所述洗脱液含有由下述式(1)所示的胍衍生的胍盐，
2.根据权利要求1所述的核酸链的分离方法，其特征在于，胍盐为胍盐酸盐或胍硫酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的核酸链的分离方法，其特征在于，核酸链的尺寸为1bp以上且1000bp以下。
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