CN113631721A - 用于检测血浆中dna病原体的dna测序文库的制备 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种用于检测来自人类患者、动物或植物的样本中的病原体的基于不可预知的鸟枪核酸测序的方法。该方法包括将该样本脱宿主掉宿主来源的核酸分子，并且提供用于在事先不了解病原体的基因组序列的情况下进行病原体检测。

Description

用于检测血浆中DNA病原体的DNA测序文库的制备
继续申请案数据
本申请要求2019年12月4日提交的美国临时申请序列号62/943,459的权益，该美国临时申请以引用方式并入本文。
背景技术
目前，在来自人类患者、动物或植物的样本中的病原体的检测通常是通过基于抗体的方法、聚合酶链反应(PCR)或靶向核酸捕获之后是测序来完成。这些方法中的每一种方法都需要靶向试剂，例如抗体或DNA寡核苷酸，并且因此需要事先了解病原体。因此，这些方法可能无法检测先前未发现的或以其他方式被忽略的病原体。当然，在鉴定出所关注的病原体之后，可开发靶向方法。然而，由于可能需要新的检测试剂，因此任何临床检测或诊断测试都必须由监管机构重新批准，从而增加了使产品上市的成本和时间。
相比之下，在事先不了解病原体的基因组序列的情况下，不可预知的鸟枪核酸测序方法可检测病原体。利用这种不可预知的方法，核酸不是基于病原体的基因组序列进行富集、扩增或靶向的。因为病原体不是根据病原体的序列检测的，所以不同的病原体不需要不同的试剂。因此，对于样本制备和测序方案而言很少或没有监管更新是必需的，从而显著降低了临床产品的成本和上市时间。
通过不可预知的测序检测病原体是挑战性的，因为样本往往含有压倒性量的宿主核酸。由于宿主核酸的丰度，检测的灵敏度相当低。在没有附加富集的情况下，为了克服这种低灵敏度，需要大量测序。由于对样本中来自宿主和病原体两者的所有核酸都进行测序，所以大多数测序试剂不必要地进行对宿主基因组的测序。这种附加序列负担可使许多检测应用不可及。
为了提高检测灵敏度并降低与不可预知的鸟枪测序方法相关联的测序成本，需要改进的从样本中有效去除宿主DNA并因此富集病原体DNA的方法。
发明内容
本发明包括一种样本制备方法，该方法包括获得宿主生物样本，从宿主生物样本中去除完整细胞，以及从宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核酸分子以获得脱宿主的样本(dehosted sample)。在一些方面中，该方法还包括对脱宿主的样本中剩余的核酸分子进行测序。在一些方面中，该方法包括由脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库，并且在一些方面中进一步对该测序文库的核苷酸序列进行测序。在一些方面中，该方法还包括鉴定经测序的序列内的病原体序列。
本发明包括一种使从宿主生物获得的样本脱宿主的方法，该方法包括从宿主生物样本中去除完整细胞，以及从宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子以获得脱宿主的样本。在一些方面中，该方法还包括对脱宿主的样本中剩余的核酸分子进行测序。在一些方面中，该方法包括由脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库，并且在一些方面中进一步对该测序文库的核苷酸序列进行测序。在一些方面中，该方法还包括鉴定经测序的序列内的病原体序列。
本发明包括一种鉴定从宿主生物获得的样本中的病原体核苷酸序列的方法，该方法包括从宿主生物样本中去除完整细胞，从宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子以获得脱宿主的样本，由该脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库，对该测序文库的核苷酸序列进行测序，以及鉴定该经测序的序列内的病原体序列。
在本文所述的方法的一些方面中，测序文库是通过基于转座子的文库制备方法制备的。在一些方面中，基于转座子的文库制备方法包括NEXTERA转座子或基于NEXTERA珠粒的转座子。
在本文所述的方法的一些方面中，测序是通过高通量测序进行的。
在本文所述的方法的一些方面中，从宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子包括从宿主生物样本中去除小于600bp的核酸分子以获得脱宿主的样本。
在本文所述的方法的一些方面中，该方法包括通过离心从宿主生物样本中去除完整细胞。
在本文所述的方法的一些方面中，该方法包括通过将无细胞的核酸结合至官能化可控孔度玻璃(controlled pore glass,CPG)珠粒来从宿主生物样本中去除完整细胞。在一些方面中，官能化可控孔度玻璃(CPG)珠粒是用N-乙烯基吡咯烷酮(70％)和N-甲基-N'-乙烯基氯化咪唑鎓(30％)的共聚物官能化的。
在本文所述的方法的一些方面中，从宿主生物样本中去除小于1000bp的核苷酸分子包括在有利于捕获1000bp或更大的核苷酸分子的条件下的固相可逆固定(solid phasereversible immobilization,SPRI)珠粒。
在本文所述的方法的一些方面中，病原体序列包括病毒、细菌、真菌和/或寄生序列。
在本文所述的方法的一些方面中，病原体序列包括具有DNA基因组的病原体。
在本文所述的方法的一些方面中，宿主生物样本包括血液。
在本文所述的方法的一些方面中，宿主生物样本包括血浆。
在本文所述的方法的一些方面中，宿主包括真核生物。
在本文所述的方法的一些方面中，宿主包括动物或植物。
在本文所述的方法的一些方面中，宿主包括哺乳动物。
在本文所述的方法的一些方面中，宿主包括人类。
本发明的上述发明内容并非旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了例示性实施方案。在本申请全文的若干地方，通过示例的列表提供了指导，这些示例可以各种组合使用。在每种情况下，所引用的列表仅用作代表性的组，并且不应理解为排他性列表。
定义
术语“和/或”意指所列要素中的一个或全部，或所列要素中的任何两个或更多个的组合。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些益处的本发明的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案是不可用的，并且并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
如本文所用，术语“每个”当用于提及参考项目的集合时，旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目，除非文中另外明确指出。
术语“包括”及其变型在说明书和权利要求书中出现这些术语时不具有限制的含义。
应当理解，在本文以语言“包括”、“包含”或“含有”等描述实施方案的任何地方，还提供了以“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的其他类似实施方案。
除非另外指明，否则“一个”、“一种”、“该”和“至少一个”可互换使用，表示一个或多于一个。
同样在本文中，通过端点表述的数值范围包括该范围内所包含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所用的表示组分的量、分子量等的所有数字在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本发明寻求获得的期望性质而变化。至少，并非试图将等同原则限制在权利要求的范围之内，每个数值参数应至少根据所报告的有效数位的数目并通过应用惯常的四舍五入法来解释。
尽管阐述本发明的广义范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中所列出的数值被尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地包含一个范围，该范围必然是由存在于其相应测试测量中的标准偏差引起。
对于本文所公开的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以任何可行的顺序进行。并且，视情况而定，两个或更多个步骤的任何组合可同时进行。
除非另外指明，否则所有标题都是为了方便读者，而不应用于限制该标题后面的文本的含义。
本说明书通篇提及的“一个实施方案”、“实施方案”、“某些实施方案”或“一些实施方案”等意指结合该实施方案描述的特定特征、构型、组成或特性包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，本说明书通篇的多处出现的此类短语不一定指本公开的相同实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定特征、构型、组成或特性可以任何合适的方式组合。
附图说明
图1：通过大小选择性DNA捕获和基于转座子的文库制备来实现改善的对血浆中病原体的检测。
图2：血浆中λ病毒掺入(1000个拷贝/ml)的检测。通过采用优化的固相可逆固定(SPRI)大小选择和转座子浓度，病毒DNA的检测灵敏度提高了10倍。
图3：血浆DNA大小分布的电泳图，示出了血浆中约95％的DNA片段小于600bp。使用针对病毒的400bp插入序列长度、针对人的170bp插入序列长度估计的短读段，一个DNA bp的平均重量是650Da，一个RNA碱基的平均重量是340Da，每个NextSeq有400,000,000个读段。
图4：当在非常有利于捕获长DNA的条件下使用固相可逆固定(SPRI)珠粒去除84％的<600bp的DNA片段时血浆DNA大小分布的电泳图。使用针对病毒的400bp插入序列长度、针对人的170bp插入序列长度估计的短读段，一个DNA bp的平均重量是650Da，一个RNA碱基的平均重量是340Da，每个NextSeq有400,000,000个读段。
图5：基于转座子的方法尤其适用于从血浆DNA制备测序文库。
图6：测序实验表明当DNA片段小于1000bp时，文库生成效率显著下降。
具体实施方式
虽然DNA测序可用于检测病原体并诊断感染性疾病，但通过不可预知的鸟枪核酸测序检测病原体是挑战性的，因为样本包含大量压倒性量的宿主核酸。当对样本中的所有核酸进行测序时，测序产生绝大多数的宿主序列和少数的病原体序列。因此，所得的病原体检测灵敏度非常低。本发明提供了改进的进行样本制备和核酸测序以对从真核宿主获得的样本中的病原体进行检测的方法。
本文所述的方法包括使宿主来源的核酸样本脱宿主。此类脱宿主提供用于从样本中有效去除宿主来源的核酸，从而提供样本中病原体核酸的富集。然后可进行此类脱宿主的样本的文库制备和DNA测序，以鉴定病原体来源的核酸。在没有此类脱宿主的情况下，通过无偏测序进行的病原体检测具有低灵敏度，并且对于大多数临床和工业应用是不可行的。
目前，病原体的检测通常是通过基于抗体的方法、聚合酶链反应(PCR)或靶向核酸捕获之后是测序来完成。这些方法中的每一种方法都需要靶向试剂，例如抗体或DNA寡核苷酸，并且因此需要事先了解病原体。因此，这些方法可能无法检测先前未发现的或以其他方式被忽略的病原体。当然，在鉴定出所关注的病原体之后，可开发靶向方法。然而，由于可能需要新的检测试剂，因此任何临床检测或诊断测试都必须由监管机构重新批准，从而增加了使产品上市的成本和时间。
相比之下，在事先不了解病原体的基因组序列的情况下，不可预知的鸟枪核酸测序方法可检测病原体。利用这种不可预知的方法，核酸不是基于病原体的基因组序列进行富集、扩增或靶向的。因为病原体不是根据病原体的序列检测的，所以不同的病原体不需要不同的试剂。然而，通过不可预知的测序检测病原体是挑战性的，因为样本往往含有压倒性量的宿主核酸。因此，为了提高检测灵敏度并降低不可预知的鸟枪测序方法的测序成本，本发明的方法有效地从样本中去除了宿主DNA。
对于本文所述的方法，获得或提供样本。样本可以是生物样本，包括但不限于全血、血清、血浆、汗液、泪液、尿液、粪便、痰液、脑脊液、精子、淋巴、唾液、羊水、组织活检、细胞培养物、拭子、涂片或福尔马林固定的石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)样本。在一些实施方案中，生物样本是无细胞血浆样本。
在一些方面中，样本可以是环境样本，包括但不限于食物样本、水样本、土壤样本、或空气样本，包括但不限于拭子、涂片或其滤液。
样本可来自宿主生物。宿主生物可以是真核生物，诸如动物或植物。在一些实施方案中，宿主生物是哺乳动物，包括人宿主以及非人哺乳动物宿主。
对于本文所述的方法，可从样本中去除完整细胞。完整细胞可通过离心或其他细胞分离方法从样本中去除。如果使用离心，则可使用低离心力(例如，300xg)，使得从样本中去除宿主细胞，并且不从样本中去除不在宿主细胞内部的病原体，诸如支原体。
对于本文所述的方法，样本可以“脱宿主”掉宿主来源的核酸。此类脱宿主涉及真核宿主来源的核酸的去除，从而富集样本中非宿主的病原体来源的核酸。脱宿主可通过对较大DNA片段的大小选择来实现。在其天然状态下，真核细胞核DNA不作为游离直链存在。相反，它高度浓缩并包裹在组蛋白周围，以便贴合在细胞核内部并参与染色体的形成。组蛋白是与细胞核中的DNA缔合的碱性蛋白家族，其将DNA包装并排序成称为核小体的结构单元。组蛋白是真核生物中最高度保守的蛋白之一，强调了它们在细胞核生物学中的重要作用(参见例如，Henneman等人，2018,PLoS Genetics；14(9):e1007582)。组蛋白存在于真核细胞的细胞核中，但不存在于细菌或病毒基因组中。在真核生物中，八聚体组蛋白核心通过在其表面周围包裹约150bp的单位两次来压实DNA，从而形成核小体(Kornberg,1974,Science；184(4139):868–71)。由于真核细胞核DNA通过在组蛋白周围卷曲形成核小体而高度组织化，因此细胞核外的真核DNA的循环片段趋于具有约150bp的相当均一的长度。因此，从无细胞样本中去除较小片段或从无细胞样本中分离较大大小的片段可有效地提供已脱宿主掉真核宿主来源的核酸的样本。
如图3所示，存在于人血浆中的无细胞DNA由较短DNA片段主导，其中95％或更多的DNA片段小于600bp。由于几乎所有病原体基因组都大于1kb，因此可在测序之前通过选择性地耗竭这些短片段来使血浆脱宿主。
在从无细胞样本中去除较小核酸片段的情况下，可从样本去除长度为约1kb或更小、约800bp或更小、约600bp或更小、约500bp或更小、约400bp或更小、或约200bp或更小的片段。这些核酸片段可以是双链DNA片段、单链DNA分子、或RNA分子。在一些优选实施方案中，它们是双链DNA片段。
在从无细胞样本中分离/纯化较大大小的核酸片段的情况下，可从样本中分离或纯化约200bp或更大、约400bp或更大、约600bp或更大、约800bp或更大、或约1kb或更大的片段。这些核酸片段可以是双链DNA分子、单链DNA分子、或RNA分子。在一些优选实施方案中，它们是双链DNA片段。
许多可用技术中的任一种技术可用于富集较大的核酸片段，包括但不限于通过电泳之后是凝胶提取、色谱法或其他固相提取进行的大小选择。固相提取方法包括但不限于将核酸非特异性地和可逆地吸收至二氧化硅珠粒(Boom等人，1990,J Clin Microbiol；28(3):495-503)或羧基涂覆的顺磁性颗粒，诸如固相可逆固定(SPRI)磁珠(Beckman-Coulter’s Agencourt AMPure XP珠粒；参见DeAngelis等人，1995,Nucleic Acids Res；23(22):4742-3和美国专利5705628、6534262和5898071。
例如，从宿主生物样本中去除较小的核苷酸分子可通过在有利于捕获约200bp或更大、约400bp或更大、约600bp或更大、约800bp或更大、或约1kb或更大的核苷酸分子的条件下使用固相可逆固定(SPRI)珠粒来完成。可调节SPIR珠粒的体积与样本体积，以提供有利于捕获较长的非宿主核酸的条件。虽然为样本体积的约1.8倍(1.8X)的SPRI体积通常被用于缓冲液交换和清除常见的PCR产物，但是约0.5X的体积可用于选择性地捕获主要是大DNA片段，随后从人血浆DNA中去除多达84％的<600bp的宿主片段。
利用本文所述的方法，然后可从脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库。可使用许多已确立的用于制备测序文库的方法中的任一种方法。文库制备可与多种下一代测序平台中的任一种下一代测序平台一起使用，诸如例如通过合成平台
Figure BDA0003277419850000081
或离子半导体测序平台ION TORRENTTM进行测序。例如，可使用已建立的连接酶依赖性方法或基于转座子的方法(Head等人，2014,Biotechniques；56(2):61)并且许多用于通过这些方法制备测序文库的试剂盒可从多个供应商商购获得。
通过在称为“标签化”的单试管反应中使用转座酶同时片段化和标记DNA来制备DNA文库的基于转座子的方法尤其适用于血浆DNA中的病原体检测。首先，转座子方法比连接酶依赖性方法更快并且需要更少的方案步骤，从而导致更短的用于检测分析的周转时间。其次，当转座子用于用测序衔接子标记DNA时，从长DNA片段标记并成功制备测序文库优于从短片段标记并成功制备测序文库。因此，基于转座子的文库制备可优选地富集用于测序的较大非宿主DNA片段。因此，可通过使用基于转座子的文库制备来进一步增强脱宿主。基于转座子的标签化方法可以是基于溶液的(参见例如，Adey等人，2010,Genome Biol；11(12):R119)；Picelli等人，2014,Genome Res；24(12):2033；以及
Figure BDA0003277419850000082
DNALibrary Prep Reference Guide，文件号15027987v01，2016年1月，WO 2010/048605；US2012/0301925；和US 2013/0143774)或可利用直接缀合至珠粒的珠粒固定的转座体，诸如磁珠连接的转座体(bead linked transposome,BLT)(参见例如，Bruinsma等人，2018,BMCGenomics；19:722；和NEXTERATMDNA Flex Library Prep Kit,Illumina,2017；WO 2014/108810；以及US2018/0155709A1)。这在图5中示出。
利用本文所述的方法，然后对表示脱宿主的样本中剩余的核酸分子的测序文库进行测序。测序可通过多种已知方法中的任一种方法，包括但不限于多种高通量下一代测序平台中的任一种高通量下一代测序平台，包括但不限于合成测序、连接测序、纳米孔测序、桑格测序等。在一些实施方案中，使用以下方式执行测序：通过如Carnevali等人，2012,JComput Biol；9(3):279-92(doi:10.1089/cmb.2011.0201.Epub 2011年12月16日)所述的通过如美国专利申请公布号2007/0166705、美国专利申请公布号2006/0188901、美国专利号7,057,026、北京基因组研究所(BG)中所述的
Figure BDA0003277419850000091
商业化的合成方法进行测序，或通过如US 2009/0026082 A1；US 2009/0127589 A1；US 2010/0137143 A1；或US2010/0282617 A1中所述的离子半导体测序方法ION TORRENTTM进行测序，这些文献中的每一篇文献均以引用方式并入本文。
利用本文所述的方法，然后分析所得的序列信息，并且通过多种可用方法中的任一种可用方法鉴定病原体序列，该多种可用方法包括但不限于K聚体分析和与已知病原体的基因组数据库的比较。病原体包括例如病毒、细菌、真菌或寄生虫。在一些方面中，病原体具有DNA基因组，例如DNA病毒。在一些方面中，病原体具有RNA基因组，例如RNA病毒。
在本文所述的方法的相同应用中，可整合、删除和/或组合步骤。
虽然病原体诸如病毒可以非常低的浓度存在于原始样本中，但是通过本文所述的方法使样本脱宿主可去除99％的宿主DNA并提高灵敏度并将试剂成本降低多达100倍。
本公开包括试剂盒，该试剂盒用于在使真核宿主核酸样本脱宿主和/或鉴定从真核宿主生物获得的样本中的病原体核苷酸序列的方法中使用。试剂盒是包含至少一种用于特异性地使真核宿主核酸样本脱宿主和/或鉴定从真核宿主生物获得的样本中的病原体核苷酸序列的试剂的任何制造物(例如包装或容器)。试剂盒可包括使用说明。试剂盒可作为用于执行本公开的方法的单元来宣传、分销或销售。
在本文所述的方法的一种应用中，通过大小选择性DNA捕获和基于转座子的文库制备来实现改进的对血浆中病原体的检测(图1)。通过采用优化的SPRI大小选择和转座子浓度，病毒DNA的检测灵敏度提高了10倍。通过采用优化的SPRI大小选择和转座子浓度，病毒DNA的检测灵敏度可提高10倍(图2)。如图3所示，在人血浆中，大部分人DNA作为短的无细胞片段存在。人血浆中约95％的DNA片段的长度小于600个碱基对(bp)。由于几乎所有病原体基因组的长度大于1千碱基(kb)，因此本文所述的方法在对病原体DNA基因组进行测序和检测之前通过选择性地耗竭这些短片段的样本来使血浆脱宿主。
在一些方面中，捕获长DNA并有效去除较短的人DNA导致富集样本中的病原体DNA。如图4所示，在非常有利于捕获长DNA的条件下使用固相可逆固定(SPRI)珠粒去除了84％的<600bp的DNA片段。
虽然用于制备Illumina测序文库的任何方法可用于病原体检测应用，但是基于转座子的方法特别适用于血浆DNA。转座子方法比连接酶依赖性方法更快并且需要更少的方案步骤，从而导致更短的用于检测分析的周转时间。当溶液中的转座子(IlluminaNextera)用于用测序衔接子标记DNA时，长DNA片段的标记优于短片段。如图5所示，长片段具有较多的成功转座子标记机会，而短片段具有较少的成功标记机会。因此，NEXTEA或其他基于转座子的文库制备方法通过有利于较大的DNA片段而有效地使血浆DNA样本脱宿主。如图6所示，测序实验表明，当DNA片段<1000bp时，文库生成效率显著下降。
定义
如本文所用，术语“核酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括天然存在的核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的主链。类似结构可具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如存在于核糖核酸(RNA)中)。核酸可包含本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种。核酸可包括天然的或非天然的碱基。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基。可包含在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。除非另有明确说明，否则术语“模板”和“靶”当用于提及核酸时，旨在作为本文所示的方法或组合物的上下文中核酸的语义标识符并且不一定限制核酸的结构或功能。
如本文所用，“扩增”或“扩增反应”及其派生词通常是指核酸分子的至少一部分被复制或拷贝到至少一个另外的核酸分子中的任何动作或过程。另外的核酸分子任选地包含与靶核酸分子的至少一些部分基本上相同或基本上互补的序列。靶核酸分子可为单链或的双链的，并且另外的核酸分子可独立地为单链的或双链的。扩增任选地包括线性或指数复制核酸分子。在一些实施方案中，这种扩增可使用等温条件进行；在其他实施方案中，这种扩增可包括热循环。在一些实施方案中，扩增是多重扩增，其包括在单个扩增反应中同时扩增多个靶序列。在一些实施方案中，“扩增”包括单独或组合扩增基于DNA和RNA的核酸的至少一些部分。扩增反应可包括本领域普通技术人员已知的任何扩增过程。在一些实施方案中，扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)。
如本文所用，“扩增条件”及其派生词通常是指适于扩增一个或多个核酸序列的条件。这种扩增可以是线性的或指数的。在一些实施方案中，扩增条件可包括等温条件，或者另选地可包括热循环条件，或者等温条件和热循环条件的组合。在一些实施方案中，适用于扩增一个或多个核酸序列的条件包括聚合酶链反应(PCR)条件。通常，扩增条件是指足以扩增核酸(例如一个或多个靶序列)或扩增连接至一个或多个衔接子的靶序列(例如，衔接子连接的经扩增靶序列)的反应混合物。一般来讲，扩增条件包括用于扩增或用于核酸合成的催化剂，例如聚合酶；与待扩增核酸具有一定程度互补性的引物；以及核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)，从而一旦与核酸杂交就促进引物的延伸。扩增条件可能需要引物与核酸的杂交或退火、引物的延伸和其中延伸的引物与经历扩增的核酸序列分离的变性步骤。通常，但不是必须的，扩增条件可包括热循环；在一些实施方案中，扩增条件包括多个循环，其中重复退火、延伸和分离的步骤。通常，扩增条件包括阳离子诸如Mg++或Mn++，并且还可包括各种离子强度改性剂。
本文中术语“下一代测序(NGS)”是指允许对克隆扩增分子和单个核酸分子进行大规模平行测序的测序方法。NGS的非限制性实例包括边连接边测序和使用可逆染料终止子的边合成边测序。
如本文所用，术语“聚合酶链反应”(PCR)是指K.B.Mullis的美国专利号4,683,195和4,683,202的方法，其描述了用于在不进行克隆或纯化的情况下增加基因组DNA的混合物中所关注多核苷酸的区段的浓度的方法。该扩增所关注多核苷酸的方法包括将大量过量的两种寡核苷酸引物引入包含所需所关注多核苷酸的DNA混合物中，然后在存在DNA聚合酶的情况下进行一系列热循环。这两种引物与它们相应的所关注双链多核苷酸的链互补。首先将混合物在较高温度下变性，然后将引物与所关注多核苷酸分子内的互补序列退火。退火后，用聚合酶延伸引物以形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可重复多次(称为热循环)，以获得高浓度的期望的所关注多核苷酸的扩增片段。期望的所关注多核苷酸(扩增子)的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此，该长度是可控参数。由于重复该过程，该方法被称为“聚合酶链反应”(下文“PCR”)。因为所关注多核苷酸的期望扩增片段成为混合物中的主要核酸序列(就浓度而言)，所以认为它们是“PCR扩增的”。在上述方法的修改形式中，可使用多个不同的引物对(在一些情况下，每个所关注的靶核酸分子一个或多个引物对)PCR扩增靶核酸分子，从而形成多重PCR反应。
如本文所用，术语“引物”及其派生词通常是指可与所关注靶序列杂交的任何多核苷酸。通常，引物用作底物，核苷酸可以通过聚合酶聚合到该底物上；然而，在一些实施方案中，引物可掺入合成的核酸链中并提供另一引物可与之杂交的位点，以引发与合成的核酸分子互补的新链的合成。引物可包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些实施方案中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。这些术语应理解为包括由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物作为等同物，并且适用于单链(诸如有义或反义)和双链多核苷酸。如本文所用，该术语还涵盖cDNA，即由RNA模板例如通过逆转录酶的作用产生的互补DNA或拷贝DNA。该术语仅是指分子的主要结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。
如本文所用，术语“流通池”是指包括固体表面的室，一种或多种流体试剂可流过该固体表面。可容易地用于本公开的方法中的流通池以及相关流体系统和检测平台的示例描述于例如以下中：Bentley等人，Nature456:53-59(2008),WO 04/018497；US 7,057,026、WO 91/06678、WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和US 2008/0108082。
如本文所用，术语“扩增子”当用于提及核酸时，意指复制该核酸的产物，其中该产物具有与该核酸的核苷酸序列的至少一部分相同或互补的核苷酸序列。扩增子可通过使用核酸或其扩增子作为模板的多种扩增方法中的任一种扩增方法产生，该扩增方法包括例如PCR、滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)、连接延伸或连接酶链反应。扩增子可以是具有特定核苷酸序列的单拷贝(例如，PCR产物)或该核苷酸序列的多拷贝(例如，RCA的串联产物)的核酸分子。靶核酸的第一扩增子通常是互补拷贝。后续的扩增子是在生成第一扩增子后，由靶核酸或由第一扩增子形成的拷贝。后续的扩增子可具有与靶核酸基本上互补或与靶核酸基本上相同的序列。
如本文所用，术语“阵列”是指可根据相对位置彼此区分的一组位点。位于阵列的不同位点处的不同分子可根据位点在阵列中的位置而彼此区分。阵列的单个位点可包含一种或多种特定类型的分子。例如，位点可包含具有特定序列的单个靶核酸分子，或者位点可包含具有相同序列(和/或其互补序列)的若干核酸分子。阵列的位点可以是位于同一基板上的不同特征。示例性特征包括但不限于基板中的孔、基板中或基板上的小珠(或其他颗粒)、基板的突出部、基板上的脊或基板中的通道。阵列的位点可以是各自带有不同分子的单独的基板。可根据基板在与基板相关联的表面上的位置，或者根据基板在液体或凝胶中的位置，来识别附接到单独基板的不同分子。其中单独的基板位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中具有小珠的那些阵列。
如本文所用的术语“灵敏度”等于真阳性的数目除以真阳性和假阴性之和。
如本文所用的术语“特异性”等于真阴性的数目除以真阴性和假阳性之和。
如本文所用，在组合物、制品、核酸或细胞核的上下文中，“提供”意指制备组合物、制品、核酸或细胞核，购买组合物、制品、核酸或细胞核，或以其他方式获得化合物、组合物、制品或细胞核。
本发明在权利要求书中限定。然而，下文提供了非限制性实施方案的非穷举性列表。这些实施方案的特征中的任何一个或多个特征可与本文所述的另一个示例、实施方案或方面的任何一个或多个特征组合。
实施方案1是一种样本制备方法，该方法包括：获得宿主生物样本；从该宿主生物样本中去除完整细胞；从该宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核酸分子以获得脱宿主的样本。
实施方案2是一种使从宿主生物获得的样本脱宿主的方法，该方法包括：从该宿主生物样本中去除完整细胞；从该宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子以获得脱宿主的样本。
实施方案3是根据实施方案1或2所述的方法，该方法还包括对该脱宿主的样本中剩余的核酸分子进行测序。
实施方案4是根据实施方案1或2所述的方法，该方法还包括由该脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库。
实施方案5是根据实施方案4所述的方法，该方法还包括对该测序文库的核苷酸序列进行测序。
实施方案6是根据实施方案3或实施方案5所述的方法，该方法还包括鉴定该经测序的序列内的病原体序列。
实施方案7是一种鉴定从宿主生物获得的样本中的病原体核苷酸序列的方法，该方法包括：从该宿主生物样本中去除完整细胞；从该宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子以获得脱宿主的样本；由该脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库；对该测序文库的核苷酸序列进行测序；以及鉴定该经测序的序列内的病原体序列。
实施方案8是根据实施方案4或实施方案7所述的方法，其中该测序文库是通过基于转座子的文库制备方法制备的。
实施方案9是根据实施方案8所述的方法，其中该基于转座子的文库制备方法包括NEXTERA转座子或基于NEXTERA珠粒的转座子。
实施方案10是根据实施方案3、5、或7至9中任一项所述的方法，其中测序是通过高通量测序进行的。
实施方案11是根据实施方案1至10中任一项所述的方法，该方法包括从该宿主生物样本中去除小于600bp的核酸分子以获得该脱宿主的样本。
实施方案12是根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中从该宿主生物样本中去除完整细胞包括离心。
实施方案13是根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中从该宿主生物样本中去除完整细胞包括将无细胞的核酸结合至官能化可控孔度玻璃(CPG)珠粒。
实施方案14是根据实施方案13所述的方法，其中该官能化可控孔度玻璃(CPG)珠粒是用N-乙烯基吡咯烷酮(70％)和N-甲基-N'-乙烯基氯化咪唑鎓(30％)的共聚物官能化的。
实施方案15是根据实施方案1至14中任一项所述的方法，其中从该宿主生物样本中去除小于1000bp的核苷酸分子包括在有利于捕获1000bp或更大的核苷酸分子的条件下的固相可逆固定(SPRI)珠粒。
实施方案16是根据实施方案6至15中任一项所述的方法，其中该病原体序列包括病毒、细菌、真菌和/或寄生序列。
实施方案17是根据实施方案6至16中任一项所述的方法，其中该病原体序列包括具有DNA基因组的病原体。
实施方案18是根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中该宿主生物体样本包括血液。
实施方案19是根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中该宿主生物体样本包括血浆。
实施方案20是根据实施方案1至19中任一项所述的方法，其中该宿主包括真核生物。
实施方案21是根据实施方案1至20中任一项所述的方法，其中该宿主包括动物或植物。
实施方案22是根据实施方案1至20中任一项所述的方法，其中该宿主包括哺乳动物。
实施方案23是根据实施方案1至22中任一项所述的方法，其中该宿主包括人。
通过以下实施例说明本发明。应当理解，应当根据如本文所述的本发明的范围和实质广义地解释特定实施例、材料、量和程序。
实施例
实施例1
用于检测血浆中的DNA病原体的DNA测序文库的制备
该实施例详述了用于对血浆中具有DNA基因组的病原体(包括但不限于DNA病毒、细菌、真菌和寄生虫)进行序列检测的样本制备策略。通过大小选择性DNA捕获和基于转座子的文库制备来实现改善的对血浆中病原体的检测。样本制备方法的总体示意图示出于图1中。
如图3所示，在人血浆中，绝大多数的人DNA作为短的无细胞片段存在。这些DNA片段的95％或更多小于600bp。由于几乎所有病原体基因组都大于1kb，因此可在对病原体DNA基因组进行测序检测之前通过选择性地耗竭这些短片段来使血浆脱宿主。脱宿主是通过针对大DNA片段的大小选择而实现的，并且通过使用基于转座子的文库制备来进一步增强。通过捕获长DNA，可有效去除较短的人DNA并富集样本中的病原体DNA。
一种用于耗竭短片段的方法是在非常有利于捕获长DNA的条件下使用固相可逆固定(SPRI)珠粒。虽然为样本体积的1.8倍(1.8X)的SPRI体积通常被用于缓冲液交换和清除常见的PCR产物，但是发现0.5X的体积选择性地捕获主要是大DNA片段，随后从人血浆DNA中去除多达84％的<600bp的宿主片段。
使用该实施例，在非常有利于捕获长DNA的条件下使用SPRI珠粒去除了84％的<600bp的DNA片段。参见图4。
虽然任何确定的用于制备测序文库的方法都可用于病原体检测应用，但是基于转座子的方法特别适用于血浆DNA中的病原体检测。首先，转座子方法比连接酶依赖性方法更快并且需要更少的方案步骤，从而导致更短的用于检测分析的周转时间。其次，当溶液中的转座子(Illumina NEXTERA)用于用测序衔接子标记DNA时，长DNA片段的标记优于短片段。因此，基于转座子的文库制备可优选地从较大片段中选择DNA并对该DNA进行测序。长片段具有较多的成功转座子标记机会/短片段具有较少的成功标记机会。如图5所示，在采用溶液中的转座子(Illumina NEXTERA)的实验中，大于1kb的DNA片段的文库生成效率显著更高。NEXTERA或其他基于转座子的文库制备方法固有地有助于通过有利于较大的DNA片段而使血浆DNA样本脱宿主。如图6所示，测序实验表明，当DNA片段<1000bp时，文库生成效率显著下降。
为了检测血液中的病原体(具体地，具有DNA基因组的病原体)，首先制备血浆并通过离心或其他细胞分离方法去除细胞。如果使用离心，则使用低离心力(例如，300xg)，使得宿主细胞被去除并且病原体(不在细胞内的病原体，例如支原体)不被去除。从剩余血浆中提取无细胞DNA，该无细胞DNA还将包括病原体DNA。从该无细胞DNA中，使用大小选择或其他方法，富集DNA中的病原体DNA。然后通过转座子或其他分子生物学技术将该DNA转化成测序文库。然后对该文库进行测序，并鉴定病原体序列。
通过将优化的SPRI(0.5X)捕获与优化的转座子浓度(9nM NEXTERA转座子)组合，病原体检测灵敏度与标准方法相比提高了10倍。本发明的其他变型可进一步改善检测灵敏度、减少样本制备时间，并简化方案。在该方法的一个变型中，也可使用附接至实心珠粒的转座子(即，Illumina NEXTERA)。在该方法的另一个变型中，首先可通过使用结合无细胞DNA但不结合全细胞(例如，细菌和寄生虫)或病毒的官能化可控孔度玻璃(CPG)珠粒从血液或血浆中直接去除宿主DNA。此类珠粒的一个示例是用N-乙烯基吡咯烷酮(70％)和N-甲基-N'-乙烯基氯化咪唑鎓(30％)的共聚物官能化的CPG珠粒。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物的完整公开内容，以及以电子方式获得的材料(包括，例如，在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)以引用方式并入。在本申请的公开内容与以引用方式并入本文的任何文献的公开内容之间存在任何不一致性的情况下，应以本申请的公开内容为准。上述详细描述和实施例仅为了清楚地理解本发明而给出。不应将其理解为不必要的限制。本发明不限于所示和所述的确切细节，因为对本领域技术人员显而易见的变型将包括在由权利要求所限定的发明内。

Claims (23)

1.一种样本制备方法，包括：
获得宿主生物样本；
从所述宿主生物样本中去除完整细胞；
从所述宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核酸分子以获得脱宿主的样本。
2.一种使从宿主生物获得的样本脱宿主的方法，所述方法包括：
从所述宿主生物样本中去除完整细胞；
从所述宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子以获得脱宿主的样本。
3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括对所述脱宿主的样本中剩余的核酸分子进行测序。
4.根据权利要求1或2所述的方法，还包括由所述脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库。
5.根据权利要求4所述的方法，还包括对所述测序文库的核苷酸序列进行测序。
6.根据权利要求3或5所述的方法，还包括鉴定所述经测序的序列内的病原体序列。
7.一种鉴定从宿主生物获得的样本中的病原体核苷酸序列的方法，所述方法包括：
从所述宿主生物样本中去除完整细胞；
从所述宿主生物样本中去除小于1000个碱基对(bp)的核苷酸分子以获得脱宿主的样本；
由所述脱宿主的样本中剩余的核酸分子制备测序文库；
对所述测序文库的核苷酸序列进行测序；以及
鉴定所述经测序的序列内的病原体序列。
8.根据权利要求4或7所述的方法，其中所述测序文库是通过基于转座子的文库制备方法制备的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述基于转座子的文库制备方法包括NEXTERA转座子或基于NEXTERA珠粒的转座子。
10.根据权利要求3、5、或7至9中任一项所述的方法，其中测序是通过高通量测序进行的。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，包括从所述宿主生物样本中去除小于600bp的核酸分子以获得所述脱宿主的样本。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中从所述宿主生物样本中去除完整细胞包括离心。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中从所述宿主生物样本中去除完整细胞包括将无细胞的核酸结合至官能化可控孔度玻璃(CPG)珠粒。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述官能化可控孔度玻璃(CPG)珠粒是用N-乙烯基吡咯烷酮(70％)和N-甲基-N'-乙烯基氯化咪唑鎓(30％)的共聚物官能化的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中从所述宿主生物样本中去除小于1000bp的核苷酸分子包括在有利于捕获1000bp或更大的核苷酸分子的条件下的固相可逆固定(SPRI)珠粒。
16.根据权利要求6至15中任一项所述的方法，其中所述病原体序列包括病毒、细菌、真菌和/或寄生序列。
17.根据权利要求6至16中任一项所述的方法，其中所述病原体序列包括具有DNA基因组的病原体。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述宿主生物样本包括血液。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述宿主生物样本包括血浆。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述宿主包括真核生物。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述宿主包括动物或植物。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述宿主包括哺乳动物。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述宿主包括人。
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