CN103348242B - 单核苷酸多态性的检测方法 - Google Patents

单核苷酸多态性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法。本发明为一种单核苷酸多态性的检测方法，其中，使用离子交换色谱法对通过AS‑PCR法扩增的野生型和变异型的产物进行分析。

Description

单核苷酸多态性的检测方法
技术领域
本发明涉及迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法。
背景技术
近年来，开发了分析已经明确与各种疾病、药的副作用相关的单核苷酸多态性(SNP；Single Nucleotide Polymorphism)的技术，在这些开发中，简便并且在短时间内精度良好地检测单核苷酸多态性成为重要的要素。
作为分析单核苷酸多态性的方法，已知有RFLP法(限制性片段长度多态性，Restriction Fragmet Length Polymorphism)。RFLP法为如下方法：在存在识别PCR(聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction)扩增产物中的基因变异部的限制性内切酶的情况下，在共有序列部位设定引物，在其内侧、即PCR扩增产物内具有多态性进行扩增，用限制性内切酶切断所得到的PCR扩增产物，根据该片段的长度判定多态的有无。但是，由于使用限制性内切酶，因此，存在分析成本提高、或分析整体的时间延长等课题。另外，通过电泳检测链长差，因此，也存在作业变烦杂、或分析整体的时间延长等课题。
另一方面，在生物化学领域或医学领域等中，在核酸、蛋白质、多糖类这样的生物体高分子的分离中，作为能够简便并且在短时间内精度良好地检测的方法，利用离子交换色谱法。使用离子交换色谱法时，缓和对于利用电泳的测定而言必须的烦杂的作业。非专利文献1中公开了通过高效液相色谱法分离核酸相关化合物的方法。但是，在非专利文献1中公开的方法中，存在难以充分地分离单核苷酸多态性这样的具有接近的链长差的核酸的问题。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：“ライフサイエンスのための高速液体クロマトグラフイ一基礎と実験(用于生命科学的高效液相色谱法 基础与实验)”、广川书店、p.323
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于，提供迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法。
用于解决课题的方法
本发明是使用离子交换色谱法对通过AS-PCR法扩增了的野生型与变异型的产物进行分析的单核苷酸多态性的检测方法。
以下，详细说明本发明。
本发明人发现，通过使用离子交换色谱法对通过AS-PCR法扩增了的野生型与变异型的产物进行分析，能够迅速并且简便地检测单核苷酸多态性，从而完成了本发明。
AS-PCR(等位基因特异性PCR，Allele Specific-PCR)法是检测利用了序列特异性的扩增反应的基因多态(特别是单核苷酸多态性)的方法。具体而言，使没有检测到的单核苷酸多态性的碱基序列成为引物的3’末端，进行PCR。在目标核酸的序列与引物完全互补的情况下，通过DNA聚合酶引起延长反应。另一方面，在目标核酸的序列与引物不完全互补的情况下，阻碍DNA聚合酶的延长反应。这样，是使用在3’末端具有单核苷酸多态性的野生型或变异型的碱基序列的2种引物，基于扩增反应的结果，进行单核苷酸多态性的判定的方法。作为AS-PCR法，可以使用“Nature，324，p.163-166，1986”中公开的方法。
本发明的单核苷酸多态性的检测方法中，使用离子交换色谱法。
用于离子交换色谱法的洗脱液，优选含有由下述式(1)所示的胍衍生的胍盐。
作为胍盐，例如可以列举胍盐酸盐、胍硫酸盐、胍硝酸盐、胍碳酸盐、胍磷酸酯、胍硫氰酸盐、胍氨基磺酸盐、氨基胍盐酸盐、氨基胍碳酸氢盐等。其中，优选使用胍盐酸盐、胍硫酸盐。
对于洗脱液中的胍盐的分析时的浓度而言，根据检测对象物质适当调节即可，但优选为2000mmol/L以下。具体而言，可以列举：使胍盐的浓度在0～2000mmol/L的范围内进行梯度溶出的方法。因此，分析开始时的胍盐的浓度无需为0mmol/L，另外，分析结束时的胍盐的盐浓度也无需为2000mmol/L。
梯度溶出的方法可以为低压梯度法也可以为高压梯度法，但优选在进行利用高压梯度法的精密的浓度调节的同时使其溶出的方法。
胍盐可以单独添加到洗脱液中，也可以与其他盐组合添加。作为能够与胍盐组合使用的盐，可以列举例如：由氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾等卤化物和碱金属构成的盐、由氯化钙、溴化钙、氯化镁、溴化镁等卤化物和碱土金属构成的盐、高氯酸钠、高氯酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机酸盐等。另外，也可以使用乙酸钠、乙酸钾、琥珀酸钠、琥珀酸钾等有机酸盐。
作为用于洗脱液的缓冲液，可以使用公知的缓冲液类、有机溶剂类，具体而言，可以列举例如：Tris盐酸缓冲液、由Tris和EDTA构成的TE缓冲液、由Tris和乙酸和EDTA构成的TAE缓冲液、由Tris和硼酸和EDTA构成的TBA缓冲液等。
洗脱液的pH没有特别限定，只要是通过阴离子交换能够分离核酸链的范围即可。
作为用于离子交换色谱法的填充剂，优选为在基材粒子的至少表面引入阳离子性基团的填充剂，更优选为在基材粒子的至少表面具有强阳离子性基团和弱阴离子性基团的填充剂。
本说明书中，“强阳离子性基团”是指在pH为1至14的宽范围内进行解离的阳离子性基团。即，强阳离子性基团不受水溶液的pH的影响而能够保持进行解离的(阳离子化的)状态。
作为强阳离子性基团，可以列举季铵基。具体而言，例如可以列举：三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基乙基铵基等三烷基铵基等。
另外，作为强阳离子性基团的抗衡离子，例如可以列举：氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子等卤化物离子。
强阳离子性基团量没有特别限定，填充剂的每单位干燥重量的优选的下限为1μeq/g，优选的上限为500μeq/g。强阳离子性基团量低于1μeq/g时，有时填充剂的保持力减弱，分离性能变差。强阳离子性基团量超过500μeq/g时，填充剂的保持力变得过强，不能使检测对象物质容易地溶出，有时产生分析时间延长等问题。
本说明书中，“弱阴离子性基团”是指pKa为3以上的阴离子性基团。即，上述弱阴离子性基团受水溶液的pH的影响，解离状态发生变化。pH高于3时，羧基的质子发生解离，具有负的电荷的比例增加。相反，pH低于3时，羧基的质子结合的非解离状态的比例增加。
作为上述弱阴离子性基团，例如可以列举：羧基、磷酸基等。其中，优选为羧基。
作为在基材粒子的至少表面引入羧基的方法，可以使用例如：将具有羧基的单体进行共聚的方法、将单体中的酯部水解的方法、通过臭氧水处理形成羧基的方法、通过臭氧气体形成羧基的方法、通过等离子体处理形成羧基的方法、使具有羧基的硅烷偶联剂反应的方法、使具有环氧基的单体共聚再通过环氧基的开环形成羧基的方法等公知的方法。其中，在基材粒子具有疏水性的结构部分、特别是具有碳-碳双键的情况下，优选使用通过臭氧水处理形成羧基的方法。
对通过臭氧水处理形成羧基的方法进行说明。
臭氧与双键的反应性高，与双键反应的臭氧，形成作为中间体的臭氧化物，然后，形成羧基等。
臭氧水是指臭氧气体溶解在水中而成的。
使用臭氧水，由此，仅通过使粒子分散在臭氧水中，就能够使粒子表面简便地氧化。其结果，基材粒子中的疏水性的结构部分被氧化，形成羧基、羟基、醛基、酮基等亲水性基团。
臭氧具有强力的氧化作用，通过使用臭氧水进行处理，比通过使用臭氧气体进行处理，能够使粒子表面更均匀地氧化，更均匀地形成羧基，因此优选。
臭氧水中的溶存臭氧的浓度没有特别限定，优选的下限为20ppm。溶存臭氧的浓度低于20ppm时，形成羧基需要长时间，或羧基的形成变得不充分，无法充分地抑制检测对象物质的非特异吸附等。溶存臭氧的浓度的更优选的下限为50ppm。
关于臭氧水，如例如日本特开2001-330969号公报等所记载，可以通过将原料水和臭氧气体隔着仅透过气体、阻止液体的透过的臭氧气体透过膜使其接触的方法等进行制备。
在碱性条件下，在基材粒子的表面引入的羧基处于基本解离的状态，在与核酸碱基中的少许阳离子之间产生弱阳离子交换相互作用。
另外认为，通过臭氧水进行处理，由此，除了羧基之外，还形成羟基、醛基、酮基等亲水性基团，通过这些亲水性基团的存在，在填充剂的表面与核酸之间发挥的疏水性相互作用减弱。
因此认为，使用在至少表面上具有强阳离子性基团和弱阴离子性基团的填充剂的情况下，除了主要的相互作用即在填充剂表面与核酸之间发挥的阴离子交换相互作用之外，如上所述，发挥弱的阳离子交换相互作用，或疏水性相互作用变弱，由此，分离性能提高。
在基材粒子的至少表面上引入的弱阴离子性基团量，只要是强阳离子性基团量以下，则没有特别限定。
作为基材粒子，可以使用例如使用聚合性单体等而得到的合成高分子微粒、二氧化硅系等无机微粒等，优选包括：由有机合成高分子构成的疏水性交联聚合物粒子、和由具有在该疏水性交联聚合物粒子的表面上共聚的离子交换基团的亲水性聚合物构成的层。
疏水性交联聚合物可以为如下聚合物中的任意一种，即：将1种疏水性交联性单体进行均聚而得到的疏水性交联聚合物、将2种以上疏水性交联性单体进行共聚而得到的疏水性交联聚合物、将至少1种疏水性交联性单体与至少1种疏水性非交联性单体进行共聚而得到的疏水性交联聚合物。
作为疏水性交联性单体，只要是在单体1分子中具有2个以上乙烯基的单体，则没有特别限定，例如可以列举：乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等二(甲基)丙烯酸酯，四羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四(甲基)丙烯酸酯等三(甲基)丙烯酸酯或四(甲基)丙烯酸酯，二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基萘等芳香族类化合物等。
需要说明的是，本说明书中，“(甲基)丙烯酰基”是指“丙烯酰基或甲基丙烯酰基”，“(甲基)丙烯酸酯”是指“丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯”。
作为疏水性非交联性单体，只要是具有疏水性的性质的非交联性的聚合性有机单体，则没有特别限定，例如可以列举：(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸异丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等(甲基)丙烯酸酯，苯乙烯、甲基苯乙烯等苯乙烯类单体等。
疏水性交联聚合物由疏水性交联性单体与疏水性非交联性单体的共聚构成的情况下，疏水性交联聚合物中的来自疏水性交联性单体的部分的含有比例的优选的下限为10重量％，更优选的下限为20重量％。
具有离子交换基团的亲水性聚合物由具有离子交换基团的亲水性单体构成，包含来自具有1种以上离子交换基团的亲水性单体的部分即可。即，作为制造具有离子交换基团的亲水性聚合物的方法，可以列举：使具有离子交换基团的亲水性单体均聚的方法、使具有离子交换基团的亲水性单体与不具有离子交换基团的亲水性单体共聚的方法等。
作为具有离子交换基团的亲水性单体，优选为具有强阳离子性基团的亲水性单体，更优选为具有季铵基的亲水性单体。具体而言，例如可以列举：甲基丙烯酸乙基三甲基铵氯化物、甲基丙烯酸乙基三乙基铵氯化物、甲基丙烯酸乙基二甲基乙基铵氯化物、丙烯酸乙基三甲基铵氯化物、丙烯酸乙基三乙基铵氯化物、丙烯酸乙基二甲基乙基铵氯化物、丙烯酰胺乙基三甲基铵氯化物、丙烯酰胺乙基三乙基铵氯化物、丙烯酰胺乙基二甲基乙基铵氯化物等。
填充剂的平均粒径没有特别限定，优选的下限为0.1μm，优选的上限为20μm。填充剂的平均粒径低于0.1μm时，色谱柱的内压增高，有时引起分离不良。填充剂的平均粒径超过20μm时，色谱柱内的死体积变得过大，有时引起分离不良。
需要说明的是，本说明书中，平均粒径表示体积平均粒径，可以使用粒度分布测定装置(AccuSizer780/Particle Sizing Systems公司制)进行测定。
在本发明的单核苷酸多态性的检测方法中，通过AS-PCR法扩增的产物的大小优选为200bp以下。通过AS-PCR法扩增的产物的大小超过200bp时，有时PCR的扩增时间、离子交换色谱法中的分析时间延长，或不能得到充分的分离性能。通过AS-PCR法扩增的产物的大小更优选为100bp以下。
在本发明的单核苷酸多态性的检测方法中，通过AS-PCR法扩增的野生型与变异型的产物的大小之差(链长差)优选为10bp以下。即使以被扩增的野生型与变异型的产物的大小之差超过10bp的方式设计AS引物，有时通过非特异扩增反应等也不能得到期望的扩增产物。
发明效果
根据本发明，可以提供迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法。
附图说明
图1是实施例1中使用阴离子交换色谱柱1分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp而得到的色谱图。
图2是在实施例1中使用阴离子交换色谱柱2分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp而得到的色谱图。
图3是在参考例1中使用阴离子交换色谱柱1分离检测UGT1A1*6区域的野生型271bp和变异型274bp而得到的色谱图。
图4是在参考例1中使用阴离子交换色谱柱2分离检测UGT1A1*6区域的野生型271bp和变异型274bp而得到的色谱图。
图5是在参考例2中使用阴离子交换色谱柱1分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp而得到的色谱图。
具体实施方式
以下，列举实施例，对本发明更详细地进行说明，但本发明不仅限定于这些实施例。
(阴离子交换色谱柱的准备)
(阴离子交换色谱柱1)
在带搅拌机的反应器中，在3重量％聚乙烯醇(日本合成化学公司制)水溶液2000mL中添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)300g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)100g、以及过氧化苯甲酰(キシダ化学公司制)1.0g的混合物。搅拌的同时进行加热，在氮气气氛下，80℃下聚合1小时。接着，作为具有强阳离子性的离子交换基团(季铵基)的单体，将甲基丙烯酸乙基三甲基铵氯化物(和光纯药工业公司制)100g在离子交换水中溶解，进一步将所得到的溶液添加到上述反应器中。接着，搅拌的同时，在氮气气氛下，80℃下聚合2小时，得到聚合物组合物。将所得到的聚合物组合物用水以及丙酮清洗，由此，得到在基材粒子的表面上具有季铵基的亲水性的包覆聚合物粒子。
将所得到的包覆聚合物粒子10g在溶存臭氧浓度100ppm的臭氧水300mL中浸渍，搅拌30分钟。搅拌结束后，使用离心分离机(日立制作所公司制、“Himac CR20G”)进行离心分离，除去上清液。重复该操作2次，对包覆聚合物粒子实施臭氧水处理，得到季铵基和羧基共存的离子交换色谱法用填充剂。
需要说明的是，关于臭氧水，使用在具有内径15cm×长度20cm的圆柱形的外套内包含收纳了由全氟烷氧基树脂构成的内径0.5mm×厚度0.04mm×长度350cm的中空管状的臭氧气体透过膜400根的臭氧溶解模块的臭氧水制造系统(积水化学工业公司制)进行制备。
关于所得到的离子交换色谱法用填充剂，使用粒度分布计(Particle SizingSystems公司制、“Accusizer780”)进行测定，结果平均粒径为10μm。
使用所得到的离子交换色谱法用填充剂，准备以下的色谱柱(阴离子交换色谱柱1)。
色谱柱尺寸：内径4.6mm×20mm
离子交换基团：季铵基
(阴离子交换色谱柱2)
作为市售的色谱柱，准备以下的色谱柱。
品名：TSK-gel DNA-STAT(东曹公司制)
色谱柱尺寸：内径4.6mm×长度100mm
离子交换基团：季铵基
(实施例1)
实施例1中，进行UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp的分离检测。
(AS-PCR扩增)
通过以下所示的AS-PCR条件得到野生型和变异型的扩增产物。
(1)试剂
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen公司制、Lot.760816)
10×AccuPrime PCR Buffer I
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(5U/μL)
UGT1A1*6 primer(Operon Biotechnologies公司制)
正向引物(野生型)(10pmol/μL)：5’-(cgcctcgttgtacatcagagcgg)-3’(序列号1)
正向引物(变异型)(10pmol/μL)：5’-(ctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3”(序列号2)
反向引物(10pmol/μL)：5’-(cacatcctccctttggaatggca)-3”(序列号3)
无核酸酶的水(非DEPC处理的)(Ambion公司制、Lot.0803015)
UGT1A1基因 野生型序列插入质粒(1×106拷贝/μL)
UGT1A1基因 变异型序列插入质粒(1×106拷贝/μL)
(2)制备
在5μL的10×AccuPrime PCR缓冲液I、1μL的正向引物、1μL的反向引物中以总量达到49μL的方式用无核酸酶的水调节而成的溶液中，添加1μL的UGT1A1基因序列插入质粒，得到反应溶液。
(3)反应
使用C1000(バイオ·ラツド ラボラトリ一ズ公司制)，进行PCR反应。温度循环如下所示。
在94℃、30秒下使模板热改性，将94℃下15秒、62℃下15秒、68℃下30秒的扩增循环进行40次循环，最后，在68℃保温5分钟。4℃下保存直到样品使用。
在AS-PCR扩增后，用电泳(Advance公司制、“Mupid-ex”)确认在80bp附近来自扩增产物的带。扩增产物的大小使用20bp DNA Ladder标记物(Takara-bio公司制)进行确认。
(HPLC分析)
使用准备的阴离子交换色谱柱，在以下的条件下分离检测AS-PCR扩增产物。
系统：LC-20A系列(岛沣制作所公司制)
洗脱液：洗脱液A 25mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH7.5)
洗脱液B 25mmol/L Tri s盐酸缓冲液(pH7.5)+1mol/L胍盐酸盐
分析时间：使用阴离子交换色谱柱1时的分析时间为10分钟
使用阴离子交换色谱柱2时的分析时间为20分钟
溶出法：通过以下所示的梯度条件，使洗脱液B的混合比率直线增加。
使用阴离子交换色谱柱1时的条件
0分钟(洗脱液B40％)→10分钟(洗脱液B50％)
使用阴离子交换色谱柱2时的条件
0分钟(洗脱液B70％)→20分钟(洗脱液B90％)
检体：UGT1A1*6区域的野生型76bp
UGT1A1*6区域的变异型79bp
流速：0.5mL/分钟(使用阴离子交换色谱柱1时)
1.0mL/分钟(使用阴离子交换色谱柱2时)
检测波长：260nm
试样注入量：10μL
(参考例1)
参考例1中，进行UGT1A1*6区域的野生型271bp和变异型274bp的分离检测。
(AS-PCR扩增)
通过以下所示的AS-PCR条件，得到野生型与变异型的扩增产物。
(1)试剂
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen公司制、Lot.760816)10×AccuPrime PCR Buffer I
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(5U/μL)
UGT1A1*6 primer(Operon Biotechnologies公司制)
正向引物(野生型)(10pmol/μL)：5’-(cgcctcgttgtacatcagagcgg)-3’(序列号1)
正向引物(变异型)(10pmol/μL)：5’-(ctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3”(序列号2)
反向引物(10pmol/μL)：5’-(gaaagggtccgtcagcatgac)-3”(序列号4)
无核酸酶的水(非DEPC处理的)(Ambion公司制、Lot.0803015)
UGT1A1基因 野生型序列插入质粒(1×106拷贝/μL)
UGT1A1基因 变异型序列插入质粒(1×106拷贝/μL)
(2)制备
在5μL的10×AccuPrime PCR缓冲液I、1μL的正向引物、1μL的反向引物中以总量达到49μL的方式用无核酸酶的水进行调节后的溶液中，添加1μL的UGT1A1基因序列插入质粒，得到反应溶液。
(3)反应
使用C1000(バイオ·ラツド ラボラトリ一ズ公司制)，进行PCR反应。温度循环如下所示。
在94℃、30秒下使模板热改性，将94℃下15秒、62℃下15秒、68℃下30秒的扩增循环进行40次循环，最后，在68℃保温5分钟。4℃下保存直到样品使用。
在AS-PCR扩增后，用电泳(Advance公司制、“Mupid-ex”)确认在270bp附近(200bp与300bp之间)来自扩增产物的带。扩增产物的大小使用20bp DNA Ladder标记物(Takara-bio公司制)进行确认。
(HPLC分析)
使用准备的阴离子交换色谱柱，在以下的条件下分离检测AS-PCR扩增产物。
系统：LC-20A系列(岛沣制作所公司制)
洗脱液：洗脱液A 25mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH7.5)
洗脱液B 25mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH7.5)+1mol/L胍盐酸盐
分析时间：使用阴离子交换色谱柱1时的分析时间为10分钟
使用阴离子交换色谱柱2时的分析时间为20分钟
溶出法：通过以下所示的梯度条件，使洗脱液B的混合比率直线增加。
使用阴离子交换色谱柱1时的条件
0分钟(洗脱液B60％)→10分钟(洗脱液B80％)
使用阴离子交换色谱柱2时的条件
0分钟(洗脱液B80％)→20分钟(洗脱液B100％)
检体：UGT1A1*6区域的野生型271bp
UGT1A1*6区域的变异型274bp
流速：0.5mL/分钟(使用阴离子交换色谱柱1时)
1.0mL/分钟(使用阴离子交换色谱柱2时)
检测波长：260nm
试样注入量：10μL
(比较例1)
比较例1中，尝试UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型96bp的分离检测。
(1)试剂
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen公司制、Lot.760816)
10×AccuPrime PCR缓冲液I
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(5U/μL)
UGT1A1*6 primer(Operon Biotechnologies公司制)
正向引物(野生型)(10pmol/μL)：5’-(cgcctcgttgtacatcagagcgg)-3’(序列号1)
正向引物(变异型)(10pmol/μL)：5’-(atagttgtcctagcacctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3”(序列号5)
反向引物(10pmol/μL)：5’-(cacatcctccctttggaatggca)-3”(序列号3)
无核酸酶的水(非DEPC处理的)(Ambion公司制、Lot.0803015)
UGT1A1基因 野生型序列插入质粒(1×106拷贝/μL)
UGT1A1基因 变异型序列插入质粒(1×106拷贝/μL)
(2)制备
在5μL的10×AccuPrime PCR缓冲液I、1μL的正向引物、1μL的反向引物中以总量达到49μL的方式用无核酸酶的水调节后的溶液中，添加1μL的UGT1A1基因序列插入质粒，得到反应溶液。
(3)反应
使用C1000(バイオ·ラツド ラボラトリ一ズ公司制)，进行PCR反应。温度循环如下所示。
在94℃、30秒下使模板热改性，将94℃下15秒、62℃下15秒、68℃下30秒的扩增循环进行40次循环，最后，在68℃保温5分钟。4℃下保存直到样品使用。
在AS-PCR扩增后，用电泳(Advance公司制、“Mupid-ex”)进行扩增产物的确认，结果，观察到可以认为是非特异扩增的多个带。这表示AS-PCR扩增没有正常进行。因此，没有实施HPLC分析。
(参考例2)
参考例2中，进行UGT1A1*6区域的野生型76bp与变异型79bp的分离检测。
除了将洗脱液B中添加的盐设定为氯化钠来代替胍盐酸盐之外，与实施例1同样操作，使用阴离子交换色谱柱2，进行HPLC分析。
实施例1中，将分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp与变异型79bp而得到的色谱图示于图1(使用阴离子交换色谱柱1的情况)和图2(使用阴离子交换色谱柱2的情况)。由图1、2的结果可知，两色谱柱均能够良好地分离检测通过AS-PCR扩增的UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp。特别是使用阴离子交换色谱柱1的情况下，能够在短时间内基本完全分离检测。
参考例1中，将分离检测UGT1A1*6区域的野生型271bp和变异型274bp而得到的色谱图示于图3(使用阴离子交换色谱柱1的情况)和图4(使用阴离子交换色谱柱2的情况)。由图3、4的结果可知，与实施例1对照，无法分离通过AS-PCR扩增的UGT1A1*6区域的野生型271bp与变异型274bp。这可以认为是由于，相对于AS-PCR扩增产物的尺寸，野生型与变异型的链长差小。
参考例2中，将使用阴离子交换色谱柱2分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp而得到的色谱图示于图5。在洗脱液B中添加氯化钠代替胍盐酸盐时，无法分离野生型76bp与变异型79bp。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法。

Claims (4)

1.一种单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，使用离子交换色谱法对通过AS-PCR法扩增了的野生型和变异型的产物，分离检测出野生型和变异型，
离子交换色谱法中，使用含有由下述式(1)所示的胍衍生的胍盐的洗脱液，应用于填充了填充剂的柱，所述填充剂包含在表面具有强阳离子性基团和弱阴离子性基团的基材粒子，
2.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性的检测方法，所述强阳离子性基团为季铵基。
3.根据权利要求1或2所述的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，通过AS-PCR法扩增了的产物的大小为200bp以下，并且野生型与变异型的链长差为10bp以下。
4.根据权利要求1或2所述的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，胍盐为胍盐酸盐或胍硫酸盐。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2012133834A1 (ja) * 2011-03-31 2014-07-28 積水メディカル株式会社 一塩基多型検出用の試料核酸、一塩基多型検出試料調製用のｐｃｒプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法
CN106062215B (zh) * 2014-02-28 2020-09-22 国立研究开发法人国立癌研究中心 肾细胞癌的预后判定方法
JP2019129706A (ja) * 2016-03-31 2019-08-08 積水メディカル株式会社 イオン交換クロマトグラフィーを用いた一塩基置換検出方法
WO2019022132A1 (ja) * 2017-07-26 2019-01-31 積水メディカル株式会社 変異遺伝子検出方法
CN111050903B (zh) * 2017-08-25 2023-02-28 积水医疗株式会社 甲基化dna分离和/或检测用色谱用填充剂
WO2019064483A1 (ja) * 2017-09-29 2019-04-04 積水メディカル株式会社 イオン交換クロマトグラフィーを用いた一塩基置換検出方法
CN114577936B (zh) * 2022-03-03 2024-06-04 中科谱研（北京）科技有限公司 一种胶囊中β-烟酰胺单核苷酸的分离检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004180637A (ja) * 2002-12-06 2004-07-02 Fuji Photo Film Co Ltd 核酸の分離精製装置
WO2007091125A2 (en) * 2005-12-30 2007-08-16 Institut Pasteur Differential amplification of mutant nucleic acids by pcr in a mixture of nucleic acids
WO2008039664A1 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Nucleic acid purification method using anion exchange
CN101899437A (zh) * 2010-04-15 2010-12-01 浙江大学 用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记及其用途

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6098988A (ja) 1983-11-01 1985-06-01 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｌｐｆ−ｈａの精製法
IL101356A (en) 1991-04-03 1996-08-04 Perkin Elmer Corp Solvents for the separation of nucleic acids by replacing anions
US5438128A (en) 1992-02-07 1995-08-01 Millipore Corporation Method for rapid purifiction of nucleic acids using layered ion-exchange membranes
DE59511013D1 (de) 1994-02-11 2005-09-22 Qiagen Gmbh Verfahren zur Trennung von Doppelstrang/Einzelstrangnukleinsäurestrukturen
SE9600590D0 (sv) 1996-02-19 1996-02-19 Pharmacia Biotech Ab Sätt för kromatografisk separation av peptider och nukleinsyra samt ny högaffin jonbytesmatris
US6265168B1 (en) * 1998-10-06 2001-07-24 Transgenomic, Inc. Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides
DE60040232D1 (de) * 1999-10-12 2008-10-23 Transgenomic Inc Nachweis von nukleinsäure-heteroduplex molekülen mittels anionen-austausch-chromatographie
JP2001330969A (ja) 2000-05-23 2001-11-30 Sekisui Chem Co Ltd フォトレジスト除去装置
WO2002018656A2 (en) 2000-08-30 2002-03-07 Avi Biopharma, Inc. Method for analysis of oligonucleotide analogs
CN1451762A (zh) 2002-04-12 2003-10-29 刘湘军 通过pcr产物不同长度测定snp
JP4228041B2 (ja) 2003-07-08 2009-02-25 東洋紡績株式会社 塩基多型の検出方法
JP4491276B2 (ja) 2004-05-17 2010-06-30 日本製粉株式会社 標的ｄｎａ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法及びキット
JP2006075126A (ja) 2004-09-13 2006-03-23 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 一塩基変異を検出する方法および検出用プローブ
JP2008538897A (ja) 2005-04-26 2008-11-13 サンド・アクチエンゲゼルシヤフト 融合タンパク質の自己タンパク質分解切断による組換えタンパク質の産生
CN1880480A (zh) 2006-04-12 2006-12-20 重庆医科大学 检测等位基因特异引物－pcr方法及其在检测克老素基因多态性中的应用
GB2443505B (en) * 2006-09-26 2008-12-31 Ge Healthcare Bio Sciences Nucleic acid purification method
CN101323852B (zh) 2007-06-11 2013-01-23 北京东胜创新生物科技有限公司 一种在自动化核酸提取工作站上进行基因组提取的试剂盒及方法
US20090053719A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-26 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of nucleic acids by digital pcr
CN101899511B (zh) 2010-07-09 2012-08-08 华中农业大学 应用as-pcr检测牛白细胞粘附缺陷的方法
CN104946626A (zh) 2011-01-12 2015-09-30 积水医疗株式会社 离子交换色谱法用洗脱液以及核酸链的分析方法
JPWO2012133834A1 (ja) 2011-03-31 2014-07-28 積水メディカル株式会社 一塩基多型検出用の試料核酸、一塩基多型検出試料調製用のｐｃｒプライマー及びイオン交換クロマトグラフィー分析に用いる一塩基多型検出用試料の調製方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004180637A (ja) * 2002-12-06 2004-07-02 Fuji Photo Film Co Ltd 核酸の分離精製装置
WO2007091125A2 (en) * 2005-12-30 2007-08-16 Institut Pasteur Differential amplification of mutant nucleic acids by pcr in a mixture of nucleic acids
WO2008039664A1 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Nucleic acid purification method using anion exchange
CN101899437A (zh) * 2010-04-15 2010-12-01 浙江大学 用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Allele-Specific PCR in SNP Genotyping;Muriel Gaudet等;《Methods in Molecular Biology》;20091231(第578期);第415-416页"Introduction"项第1-2段，第417页2.3节，第419页3.1节2段，5段 *

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