KR20140041421A

KR20140041421A - 단일염기다형의 검출 방법

Info

Publication number: KR20140041421A
Application number: KR1020137020841A
Authority: KR
Inventors: 다쿠야 요타니; 에이지 기요토; 고지 우시자와
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2011-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2014-04-04
Also published as: US20150197795A1; US9447460B2; US20140147842A1; EP2664917A4; WO2012096329A1; EP2664917A1; JPWO2012096329A1; EP2664917B1; KR102047650B1; CN103348242B; JP6061381B2; CN103348242A

Abstract

본 발명은 신속하고 또한 간편한 단일염기다형의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 AS-PCR 법에 의해 증폭된 야생형과 변이형의 산물을 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석하는 단일염기다형의 검출 방법이다.

Description

단일염기다형의 검출 방법{METHOD FOR DETECTING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS}

본 발명은 신속하고 또한 간편한 단일염기다형의 검출 방법에 관한 것이다.

최근, 여러 가지 병이나 약의 부작용과의 관련이 밝혀진 단일염기다형 (SNP ; Single Nucleotide Polymorphism) 을 해석하는 기술이 개발되고 있고, 이들 개발에 있어서는, 단일염기다형을 간편하고 또한 단시간에 양호한 정밀도로 검출하는 것이 중요한 요소가 되고 있다.

단일염기다형을 해석하는 방법으로서 RFLP 법 (Restriction Fragmet Length Polymorphism) 이 알려져 있다. RFLP 법은, PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭 산물 중의 유전자 변이 부위를 인식하는 제한 효소가 존재하는 경우, 공통 배열 부위에 프라이머를 설정하고, 그 내측, 즉 PCR 증폭 산물 내에 다형성을 갖게 하여 증폭시키고, 얻어진 PCR 산물을 제한 효소로 절단하고, 그 단편의 길이에 의해 다형의 유무를 판정하는 방법이다. 그러나, 제한 효소를 사용하기 때문에 분석 비용이 상승하거나 해석 전체의 시간이 길어지거나 하는 등의 과제가 있다. 또, 전기 영동에 의해 사슬 길이 차이를 검출하기 때문에, 작업이 번잡해지거나 해석 전체의 시간이 길어지거나 하는 등의 과제도 있다.

한편, 생화학 분야나 의학 분야 등에 있어서, 핵산, 단백질, 다당류와 같은 생체 고분자의 분리에는, 간편하고 또한 단시간에 양호한 정밀도로 검출할 수 있는 방법으로서 이온 교환 크로마토그래피가 이용되고 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하면, 전기 영동에 의한 측정에 필요로 되는 번잡한 작업이 완화된다. 비특허문헌 1 에는, 핵산 관련 화합물을 고속 액체 크로마토그래피로 분리하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 비특허문헌 1 에 개시된 방법에서도, 단일염기다형과 같은 접근하는 사슬 길이 차이를 갖는 핵산을 충분히 분리시키는 것이 어렵다는 문제가 있다.

「라이프 사이언스를 위한 고속 액체 크로마토그래피 기초와 실험」, 히로카와 서점, p.323

본 발명은 신속하고 또한 간편한 단일염기다형의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, AS-PCR 법에 의해 증폭된 야생형과 변이형의 산물을 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석하는 단일염기다형의 검출 방법이다.

이하에 본 발명을 상세하게 서술한다.

본 발명자들은, AS-PCR 법에 의해 증폭된 야생형과 변이형의 산물을 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석함으로써, 신속하고 또한 간편하게 단일염기다형을 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

AS-PCR (Allele Specific-PCR) 법은, 배열 특이적인 증폭 반응을 이용한 유전자다형 (특히 단일염기다형) 을 검출하는 방법이다. 구체적으로는, 검출하고자 하는 단일염기다형의 염기 배열이 프라이머의 3' 말단이 되도록 하여 PCR 을 실시한다. 표적 핵산의 배열과 프라이머가 완전히 상보 (相補) 인 경우, DNA 폴리메라아제에 의해 신장 반응이 일어난다. 한편, 표적 핵산의 배열과 프라이머가 불완전 상보인 경우에는, DNA 폴리메라아제의 신장 반응이 저해된다. 이와 같이, 단일염기다형의 야생형 또는 변이형의 염기 배열을 3' 말단에 갖는 2 종류의 프라이머를 사용하여, 증폭 반응의 결과에 기초하여 단일염기다형의 판정을 실시하는 방법이다. AS-PCR 법으로는, 「Nature, 324, p.163-166, 1986」에 개시되어 있는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 단일염기다형의 검출 방법에서는, 이온 교환 크로마토그래피를 사용한다.

이온 교환 크로마토그래피에 사용하는 용리액은, 하기 식 (1) 로 나타내는 구아니딘으로부터 유도되는 구아니딘염을 함유하는 것이 바람직하다.

[화학식 1]

구아니딘염으로는, 예를 들어, 구아니딘염산염, 구아니딘황산염, 구아니딘질산염, 구아니딘탄산염, 구아니딘인산염, 구아니딘티오시안산염, 구아니딘술파민산염, 아미노구아니딘염산염, 아미노구아니딘중탄산염 등을 들 수 있다. 그 중에서도 구아니딘염산염, 구아니딘황산염이 바람직하게 사용된다.

용리액에 있어서의 구아니딘염의 분석시의 농도는, 검출 대상 물질에 맞춰 적절히 조정하면 되는데, 2000 m㏖/ℓ 이하인 것이 바람직하다.

구체적으로는, 구아니딘염의 농도를 0 ∼ 2000 m㏖/ℓ 의 범위에서 그래디언트 용출시키는 방법을 들 수 있다. 따라서, 분석 개시시의 구아니딘염의 농도는 0 m㏖/ℓ 일 필요는 없고, 또 분석 종료시의 구아니딘염의 염 농도도 2000 m㏖/ℓ 일 필요는 없다.

그래디언트 용출 방법은 저압 그래디언트법이어도 되고, 고압 그래디언트법이어도 되지만, 고압 그래디언트법에 의한 정밀한 농도 조정을 실시하면서 용출시키는 방법이 바람직하다.

구아니딘염은 용리액에 단독으로 첨가해도 되고, 다른 염과 조합하여 첨가해도 된다. 구아니딘염에 조합하여 사용할 수 있는 염으로는, 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨 등의 할로겐화물과 알칼리 금속으로 이루어지는 염이나, 염화칼슘, 브롬화칼슘, 염화마그네슘, 브롬화마그네슘 등의 할로겐화물과 알칼리 토금속으로 이루어지는 염이나, 과염소산나트륨, 과염소산칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산암모늄, 질산나트륨, 질산칼륨 등의 무기산염 등을 들 수 있다. 또, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 숙신산나트륨, 숙신산칼륨 등의 유기산염을 사용해도 된다.

용리액에 사용하는 완충액으로는, 공지된 완충액류나 유기 용매류를 사용할 수 있고, 구체적으로는 예를 들어, 트리스염산 완충액, 트리스와 EDTA 로 이루어지는 TE 완충액, 트리스와 아세트산과 EDTA 로 이루어지는 TAE 완충액, 트리스와 붕산과 EDTA 로 이루어지는 TBA 완충액 등을 들 수 있다.

용리액의 pH 는 특별히 제한되지 않고, 아니온 교환에 의해 핵산 사슬을 분리시킬 수 있는 범위이면 된다.

이온 교환 크로마토그래피에 사용하는 충전제로는, 기재 입자의 적어도 표면에 카티온성기가 도입되어 있는 것이 바람직하고, 기재 입자의 적어도 표면에 강카티온성기와 약아니온성기를 갖는 것이 보다 바람직하다.

본 명세서에 있어서 「강카티온성기」란, pH 가 1 내지 14 의 넓은 범위에서 해리되는 카티온성기를 의미한다. 즉, 강카티온성기는, 수용액의 pH 에 영향을 받지 않아 해리된 (카티온화된) 상태를 유지할 수 있다.

강카티온성기로는 4 급 암모늄기를 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들어, 트리메틸암모늄기, 트리에틸암모늄기, 디메틸에틸암모늄기 등의 트리알킬암모늄기 등을 들 수 있다.

또, 강카티온성기의 카운터 이온으로는, 예를 들어, 염화물 이온, 브롬화물 이온, 요오드화물 이온 등의 할로겐화물 이온을 들 수 있다.

강카티온성기량은 특별히 한정되지 않지만, 충전제의 건조 중량당의 바람직한 하한은 1 μeq/g, 바람직한 상한은 500 μeq/g 이다. 강카티온성기량이 1 μeq/g 미만이면, 충전제의 유지력이 약해져 분리 성능이 나빠지는 경우가 있다. 강카티온성기량이 500 μeq/g 을 초과하면, 충전제의 유지력이 지나치게 강해져 검출 대상 물질을 용이하게 용출시키지 못하여, 분석 시간이 길어지거나 하는 문제가 발생하는 경우가 있다.

본 명세서에 있어서 「약아니온성기」란, pKa 가 3 이상인 아니온성기를 의미한다. 즉, 상기 약아니온성기는, 수용액의 pH 에 의한 영향을 받아 해리 상태가 변화한다. pH 가 3 보다 높아지면 카르복실기의 프로톤은 해리되고, 마이너스의 전하를 갖는 비율이 증가한다. 반대로, pH 가 3 보다 낮아지면, 카르복실기의 프로톤이 결합된 비해리 상태의 비율이 증가한다.

상기 약아니온성기로는, 예를 들어, 카르복실기, 인산기 등을 들 수 있다. 그 중에서도 카르복실기인 것이 바람직하다.

카르복실기를 기재 입자의 적어도 표면에 도입하는 방법으로는, 예를 들어, 카르복실기를 갖는 단량체를 공중합하는 방법, 단량체 중의 에스테르부를 가수 분해하는 방법, 오존수 처리에 의해 카르복실기를 형성하는 방법, 오존 가스에 의해 카르복실기를 형성하는 방법, 플라스마 처리에 의해 카르복실기를 형성하는 방법, 카르복실기를 갖는 실란 커플링제를 반응시키는 방법, 에폭시기를 갖는 단량체를 공중합시켜 에폭시기의 개환에 의해 카르복실기를 형성하는 방법 등, 공지된 방법을 사용할 수 있다. 그 중에서도 기재 입자가 소수성의 구조 부분, 특히 탄소-탄소의 이중 결합을 갖는 것인 경우, 오존수 처리에 의해 카르복실기를 형성하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

오존수 처리에 의해 카르복실기를 형성하는 방법에 대해 설명한다.

오존은 이중 결합과의 반응성이 높고, 이중 결합과 반응한 오존은 중간체인 오조나이드를 형성하고, 그 후 카르복실기 등이 형성된다.

오존수란 오존 가스가 물에 용해된 것을 의미한다.

오존수를 사용함으로써, 오존수 중에 입자를 분산시키는 것만으로 입자 표면을 간편하게 산화시킬 수 있다. 그 결과, 기재 입자에 있어서의 소수성의 구조 부분이 산화되고, 카르복실기, 수산기, 알데히드기, 케토기 등의 친수성기가 형성되는 것으로 생각된다.

오존에는 강력한 산화 작용이 있는데, 오존수를 사용하여 처리함으로써, 오존 가스를 사용하여 처리하는 것보다 입자 표면을 균일하게 산화시킬 수 있고, 보다 균일하게 카르복실기가 형성되므로 바람직하다.

오존수에 있어서의 용존 오존의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 20 ppm 이다. 용존 오존의 농도가 20 ppm 미만이면, 카르복실기를 형성하는 데에 장시간을 필요로 하거나, 카르복실기의 형성이 불충분해져 검출 대상 물질의 비특이 흡착 등을 충분히 억제할 수 없거나 한다. 용존 오존의 농도의 보다 바람직한 하한은 50 ppm 이다.

오존수는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 2001-330969호 등에 기재되어 있는 바와 같이, 원료수와 오존 가스를, 기체만을 투과시키고 액체의 투과를 저지하는 오존 가스 투과막을 개재하여 접촉시키는 방법 등에 의해 조제할 수 있다.

알칼리 조건하에 있어서는, 기재 입자의 표면에 도입된 카르복실기는 거의 해리된 상태에 있고, 핵산 염기 중의 근소한 카티온과의 사이에 약한 카티온 교환 상호 작용이 발생하는 것으로 생각된다.

또, 오존수에 의해 처리함으로써, 카르복실기 외에 수산기, 알데히드기, 케토기 등의 친수성기가 형성되고, 이들 친수성기의 존재에 의해 충전제의 표면과 핵산 사이에 작용하는 소수성 상호 작용이 약해지는 것으로 생각된다.

따라서, 적어도 표면에 강카티온성기와 약아니온성기를 갖는 충전제를 사용한 경우, 주된 상호 작용인 충전제 표면과 핵산 사이에 작용하는 아니온 교환 상호 작용에 추가하여, 상기 서술한 바와 같이 약한 카티온 교환 상호 작용이 작용하거나, 소수성 상호 작용이 약해지거나 함으로써 분리 성능이 향상되는 것으로 생각된다.

기재 입자의 적어도 표면에 도입되는 약아니온성기량은, 강카티온성기량 이하이면 특별히 한정되지 않는다.

기재 입자로는, 예를 들어, 중합성 단량체 등을 사용하여 얻어지는 합성 고분자 미립자, 실리카계 등의 무기 미립자 등을 사용할 수 있지만, 유기 합성 고분자로 이루어지는 소수성 가교 중합체 입자와, 그 소수성 가교 중합체 입자의 표면에 공중합된 이온 교환기를 갖는 친수성 중합체로 이루어지는 층으로 이루어지는 것인 것이 바람직하다.

소수성 가교 중합체는, 1 종의 소수성 가교성 단량체를 단독 중합하여 얻어지는 소수성 가교 중합체, 2 종 이상의 소수성 가교성 단량체를 공중합하여 얻어지는 소수성 가교 중합체, 적어도 1 종의 소수성 가교성 단량체와 적어도 1 종의 소수성 비가교성 단량체를 공중합하여 얻어지는 소수성 가교 중합체 중 어느 것이어도 된다.

소수성 가교성 단량체로는, 단량체 1 분자 중에 비닐기를 2 개 이상 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트 등의 디(메트)아크릴산에스테르나, 테트라메틸올메탄트리(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판트리(메트)아크릴레이트, 테트라메틸올메탄테트라(메트)아크릴레이트 등의 트리(메트)아크릴산에스테르 또는 테트라(메트)아크릴산에스테르나, 디비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 디비닐자일렌, 디비닐나프탈렌 등의 방향족계 화합물 등을 들 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 「(메트)아크릴」이란, 「아크릴 또는 메타크릴」을 의미하고, 「(메트)아크릴레이트」란, 「아크릴레이트 또는 메타크릴레이트」를 의미한다.

소수성 비가교성 단량체로는, 소수성의 성질을 갖는 비가교성의 중합성 유기 단량체이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 메틸(메트)아크릴레이트, 에틸(메트)아크릴레이트, 프로필(메트)아크릴레이트, 이소프로필(메트)아크릴레이트, 부틸(메트)아크릴레이트, t-부틸(메트)아크릴레이트 등의 (메트)아크릴산에스테르나, 스티렌, 메틸스티렌 등의 스티렌계 단량체 등을 들 수 있다.

소수성 가교 중합체가 소수성 가교성 단량체와 소수성 비가교성 단량체의 공중합으로 이루어지는 경우, 소수성 가교 중합체에 있어서의 소수성 가교성 단량체에서 유래하는 세그먼트의 함유 비율의 바람직한 하한은 10 중량％, 보다 바람직한 하한은 20 중량％ 이다.

이온 교환기를 갖는 친수성 중합체는, 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체로 구성되는 것이고, 1 종 이상의 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체에서 유래하는 세그먼트를 함유하면 된다. 즉, 이온 교환기를 갖는 친수성 중합체를 제조하는 방법으로는, 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체 단독으로 중합시키는 방법, 이온 교환기를 갖는 친수성 단량체와 이온 교환기를 갖지 않는 친수성 단량체를 공중합시키는 방법 등을 들 수 있다.

이온 교환기를 갖는 친수성 단량체로는, 강카티온성기를 갖는 것인 것이 바람직하고, 4 급 암모늄기를 갖는 것인 것이 보다 바람직하다. 구체적으로는 예를 들어, 메타크릴산에틸트리메틸암모늄클로라이드, 메타크릴산에틸트리에틸암모늄클로라이드, 메타크릴산에틸디메틸에틸암모늄클로라이드, 아크릴산에틸트리메틸암모늄클로라이드, 아크릴산에틸트리에틸암모늄클로라이드, 아크릴산에틸디메틸에틸암모늄클로라이드, 아크릴아미드에틸트리메틸암모늄클로라이드, 아크릴아미드에틸트리에틸암모늄클로라이드, 아크릴아미드에틸디메틸에틸암모늄클로라이드 등을 들 수 있다.

충전제의 평균 입자 직경은 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 하한은 0.1 ㎛, 바람직한 상한은 20 ㎛ 이다. 충전제의 평균 입자 직경이 0.1 ㎛ 미만이면, 칼럼의 내압이 높아져 분리 불량을 일으키는 경우가 있다. 충전제의 평균 입자 직경이 20 ㎛ 를 초과하면, 칼럼 내의 데드 볼륨이 지나치게 커져 분리 불량을 일으키는 경우가 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 평균 입자 직경은 체적 평균 입자 직경을 나타내고, 입도 분포 측정 장치 (AccuSizer780/Particle Sizing Systems 사 제조) 를 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 단일염기다형의 검출 방법에 있어서, AS-PCR 법에 의해 증폭되는 산물의 크기는 200 bp 이하인 것이 바람직하다. AS-PCR 법에 의해 증폭되는 산물의 크기가 200 bp 를 초과하면, PCR 의 증폭 시간이나 이온 교환 크로마토그래피에 있어서의 분석 시간이 길어지거나, 충분한 분리 성능이 얻어지지 않거나 하는 경우가 있다. AS-PCR 법에 의해 증폭되는 산물의 크기는 100 bp 이하인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 단일염기다형의 검출 방법에 있어서, AS-PCR 법에 의해 증폭되는 야생형과 변이형의 산물의 크기의 차이 (사슬 길이 차이) 는 10 bp 이하인 것이 바람직하다. 증폭되는 야생형과 변이형의 산물의 크기의 차이가 10 bp 를 초과하도록 AS 프라이머를 설계해도, 비특이 증폭 반응 등에 의해 원하는 증폭 산물이 얻어지지 않는 경우가 있다.

본 발명에 의하면, 신속하고 또한 간편한 단일염기다형의 검출 방법을 제공할 수 있다.

도 1 은 실시예 1에 있어서, 아니온 교환 칼럼 1 을 사용하여 UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp 와 변이형 79 bp 를 분리 검출하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 2 는 실시예 1 에 있어서, 아니온 교환 칼럼 2 를 사용하여 UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp 와 변이형 79 bp 를 분리 검출하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 3 은 참고예 1 에 있어서, 아니온 교환 칼럼 1 을 사용하여 UGT1A1*6 영역의 야생형 271 bp 와 변이형 274 bp 를 분리 검출하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 4 는 참고예 1 에 있어서, 아니온 교환 칼럼 2 를 사용하여 UGT1A1*6 영역의 야생형 271 bp 와 변이형 274 bp 를 분리 검출하여 얻어진 크로마토그램이다.
도 5 는 참고예 2 에 있어서, 아니온 교환 칼럼 1 을 사용하여 UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp 와 변이형 79 bp 를 분리 검출하여 얻어진 크로마토그램이다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에만 한정되지 않는다.

(아니온 교환 칼럼의 준비)

(아니온 교환 칼럼 1)

교반기가 장착된 반응기 중에서, 3 중량％ 폴리비닐알코올 (닛폰 합성 화학사 제조) 수용액 2000 ㎖ 에 테트라에틸렌글리콜디메타크릴레이트 (신나카무라 화학 공업사 제조) 300 g, 트리에틸렌글리콜디메타크릴레이트 (신나카무라 화학 공업사 제조) 100 g 및 과산화벤조일 (키시다 화학사 제조) 1.0 g 의 혼합물을 첨가하였다. 교반하면서 가열하고, 질소 분위기하에서 80 ℃ 에서 1 시간 중합하였다. 다음으로, 강카티온성의 이온 교환기 (4 급 암모늄기) 를 갖는 단량체로서 메타크릴산에틸트리메틸암모늄클로라이드 (와코 쥰야쿠 공업사 제조) 100 g 을 이온 교환수에 용해시켜 얻어진 용액을 상기 반응기 중에 추가로 첨가하였다. 이어서, 교반하면서 질소 분위기하에서 80 ℃ 에서 2 시간 중합하여 중합체 조성물을 얻었다. 얻어진 중합체 조성물을 물 및 아세톤으로 세정함으로써, 기재 입자의 표면에 4 급 암모늄기를 갖는 친수성의 피복 중합체 입자를 얻었다.

얻어진 피복 중합체 입자 10 g 을 용존 오존 농도 100 ppm 의 오존수 300 ㎖ 에 침지하고, 30 분간 교반하였다. 교반 종료 후, 원심 분리기 (히타치 제작소사 제조, 「Himac CR20G」) 를 사용하여 원심 분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2 회 반복하고, 피복 중합체 입자에 오존수 처리를 실시하여 4 급 암모늄기와 카르복실기가 공존하는 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 얻었다.

또한, 오존수는, 내경 15 ㎝ × 길이 20 ㎝ 의 원기둥형을 갖는 외투 내에 퍼플루오로알콕시 수지로 이루어지는 내경 0.5 ㎜ × 두께 0.04 ㎜ × 길이 350 ㎝ 의 중공관상의 오존 가스 투과막 400 개 수용된 오존 용해 모듈을 포함하는 오존수 제조 시스템 (세키스이 화학 공업사 제조) 을 사용하여 조제하였다.

얻어진 이온 교환 크로마토그래피용 충전제에 대해, 입도 분포계 (Particle Sizing Systems 사 제조, 「Accusizer780」) 를 사용하여 측정한 결과, 평균 입자 직경은 10 ㎛ 였다.

얻어진 이온 교환 크로마토그래피용 충전제를 사용하여 이하의 칼럼 (아니온 교환 칼럼 1) 을 준비하였다.

칼럼 사이즈 : 내경 4.6 ㎜ × 길이 20 ㎜

이온 교환기 : 4 급 암모늄기

(아니온 교환 칼럼 2)

시판되고 있는 칼럼으로서 이하의 칼럼을 준비하였다.

품명 : TSK-gel DNA-STAT (토소사 제조)

칼럼 사이즈 : 내경 4.6 ㎜ × 길이 100 ㎜

이온 교환기 : 4 급 암모늄기

(실시예 1)

실시예 1 에서는, UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp 와 변이형 79 bp 의 분리 검출을 실시하였다.

(AS-PCR 증폭)

이하에 나타내는 AS-PCR 조건에 의해 야생형과 변이형의 증폭 산물을 얻었다.

(1) 시약

AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen 사 제조, Lot.760816)

10 × AccuPrime PCR Buffer I

AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity (5 U/㎕)

UGT1A1*6 primer (Operon Biotechnologies 사 제조)

Forward (야생형) (10 p㏖/㎕) : 5'-(cgcctcgttgtacatcagagcgg)-3' (배열 번호 1)

Forward (변이형) (10 p㏖/㎕) : 5'-(ctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3" (배열 번호 2)

Reverse (10 p㏖/㎕) : 5'-(cacatcctccctttggaatggca)-3" (배열 번호 3)

Nuclease-free Water (not DEPC-treated) (Ambion 사 제조, Lot.0803015)

UGT1A1 유전자 야생형 배열 삽입 플라스미드 (1 × 10⁶ 카피/㎕)

UGT1A1 유전자 변이형 배열 삽입 플라스미드 (1 × 10⁶ 카피/㎕)

(2) 조제

5 ㎕ 의 10 × AccuPrime PCR Buffer I, 1 ㎕ 의 Forward primer, 1 ㎕ 의 Reverse primer 에 총량이 49 ㎕ 가 되도록 Nuclease-free Water 로 조정한 용액에 1 ㎕ 의 UGT1A1 유전자 배열 삽입 플라스미드를 첨가하여 반응 용액으로 하였다.

(3) 반응

C1000 (바이오·래드 래버러토리즈사 제조) 을 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 온도 사이클은 이하에 나타내는 바와 같다.

94 ℃, 30 초로 템플릿을 열변성시키고, 94 ℃ 를 15 초, 62 ℃ 를 15 초, 68 ℃ 를 30 초의 증폭 사이클을 40 사이클 실시하고, 마지막으로 68 ℃, 5 분으로 보온하였다. 샘플은 사용할 때까지 4 ℃ 에서 보존하였다.

AS-PCR 증폭 후, 전기 영동 (어드밴스사 제조, 「Mupid-ex」) 으로 80 bp 부근에 증폭 산물에서 유래하는 밴드를 확인하였다. 증폭 산물의 크기는, 20 bp DNA Ladder 마커 (다카라 바이오사 제조) 를 사용하여 확인하였다.

(HPLC 분석)

준비한 아니온 교환 칼럼을 사용하여, 이하의 조건으로 AS-PCR 증폭 산물을 분리 검출하였다.

시스템 : LC-20A 시리즈 (시마즈 제작소사 제조)

용리액 : 용리액 A 25 m㏖/ℓ 트리스염산 완충액 (pH 7.5)

용리액 B 25 m㏖/ℓ 트리스염산 완충액 (pH 7.5) ＋ 1 ㏖/ℓ 구아니딘염산염

분석 시간 : 아니온 교환 칼럼 1 을 사용하였을 때의 분석 시간은 10 분

아니온 교환 칼럼 2 를 사용하였을 때의 분석 시간은 20 분

용출법 : 이하에 나타내는 그래디언트 조건에 의해 용리액 B 의 혼합 비율을 직선적으로 증가시켰다.

아니온 교환 칼럼 1 을 사용하였을 때의 조건

0 분 (용리액 B 40 ％) → 10 분 (용리액 B 50 ％)

아니온 교환 칼럼 2 를 사용하였을 때의 조건

0 분 (용리액 B 70 ％) → 20 분 (용리액 B 90 ％)

검체 : UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp

UGT1A1*6 영역의 변이형 79 bp

유속 : 0.5 ㎖/min (아니온 교환 칼럼 1 을 사용하였을 때)

1.0 ㎖/min (아니온 교환 칼럼 2 를 사용하였을 때)

검출 파장 : 260 ㎚

시료 주입량 : 10 ㎕

(참고예 1)

참고예 1 에서는, UGT1A1*6 영역의 야생형 271 bp 와 변이형 274 bp 의 분리 검출을 실시하였다.

(AS-PCR 증폭)

(1) 시약

AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen 사 제조, Lot.760816)

10 × AccuPrime PCR Buffer I

AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity (5 U/㎕)

UGT1A1*6 primer (Operon Biotechnologies 사 제조)

Reverse (10 p㏖/㎕) : 5'-(gaaagggtccgtcagcatgac)-3" (배열 번호 4)

Nuclease-free Water (not DEPC-treated) (Ambion 사 제조, Lot.0803015)

(2) 조제

5 ㎕ 의 10 × AccuPrime PCR Buffer I, 1 ㎕ 의 Forward primer, 1 ㎕ 의 Reverse primer 에 총량이 49 ㎕ 가 되도록 Nuclease-free Water 로 조제한 용액에 1 ㎕ 의 UGT1A1 유전자 배열 삽입 플라스미드를 첨가하여 반응 용액으로 하였다.

(3) 반응

AS-PCR 증폭 후, 전기 영동 (어드밴스사 제조, 「Mupid-ex」) 으로 270 bp 부근 (200 bp 와 300 bp 사이) 에 증폭 산물에서 유래하는 밴드를 확인하였다. 증폭 산물의 크기는, 20 bp DNA Ladder 마커 (다카라 바이오사 제조) 를 사용하여 확인하였다.

(HPLC 분석)

시스템 : LC-20A 시리즈 (시마즈 제작소사 제조)

용리액 : 용리액 A 25 m㏖/ℓ 트리스염산 완충액 (pH 7.5)

아니온 교환 칼럼 2 를 사용하였을 때의 분석 시간은 20 분

아니온 교환 칼럼 1 을 사용하였을 때의 조건

0 분 (용리액 B 60 ％) → 10 분 (용리액 B 80 ％)

아니온 교환 칼럼 2 를 사용하였을 때의 조건

0 분 (용리액 B 80 ％) → 20 분 (용리액 B 100 ％)

검체 : UGT1A1*6 영역의 야생형 271 bp

UGT1A1*6 영역의 변이형 274 bp

유속 : 0.5 ㎖/min (아니온 교환 칼럼 1 을 사용하였을 때)

1.0 ㎖/min (아니온 교환 칼럼 2 를 사용하였을 때)

검출 파장 : 260 ㎚

시료 주입량 : 10 ㎕

(비교예 1)

비교예 1 에서는, UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp 와 변이형 96 bp 의 분리 검출을 시도하였다.

(1) 시약

AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen 사 제조, Lot.760816)

10 × AccuPrime PCR Buffer I

AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity (5 U/㎕)

UGT1A1*6 primer (Operon Biotechnologies 사 제조)

Forward (변이형) (10 p㏖/㎕) : 5'-(atagttgtcctagcacctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3" (배열 번호 5)

Reverse (10 p㏖/㎕) : 5'-(cacatcctccctttggaatggca)-3" (배열 번호 3)

Nuclease-free Water (not DEPC-treated) (Ambion 사 제조, Lot.0803015)

(2) 조제

(3) 반응

AS-PCR 증폭 후, 전기 영동 (어드밴스사 제조, 「Mupid-ex」) 으로 증폭 산물의 확인을 실시한 결과, 비특이 증폭으로 생각되는 다수의 밴드가 확인되었다. 이것은, AS-PCR 증폭을 정상적으로 실시할 수 없었던 것을 의미한다. 그 때문에, HPLC 분석은 실시하지 않았다.

(참고예 2)

참고예 2 에서는, UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp 와 변이형 79 bp 의 분리 검출을 실시하였다.

용리액 B 에 첨가하는 염을 구아니딘염산염 대신에 염화나트륨으로 한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 아니온 교환 칼럼 2 를 사용하여 HPLC 분석을 실시하였다.

실시예 1 에 있어서, UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp 와 변이형 79 bp 를 분리 검출하여 얻어진 크로마토그램을 도 1 (아니온 교환 칼럼 1 을 사용한 경우) 과 도 2 (아니온 교환 칼럼 2 를 사용한 경우) 에 나타낸다. 도 1, 2 의 결과로부터, 양 칼럼 모두 AS-PCR 로 증폭된 UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp 와 변이형 79 bp 를 양호하게 분리 검출할 수 있었다. 특히, 아니온 교환 칼럼 1 을 사용한 경우에는, 단시간에 거의 완전하게 분리 검출할 수 있었다.

참고예 1 에 있어서, UGT1A1*6 영역의 야생형 271 bp 와 변이형 274 bp 를 분리 검출하여 얻어진 크로마토그램을 도 3 (아니온 교환 칼럼 1 을 사용한 경우) 과 도 4 (아니온 교환 칼럼 2 를 사용한 경우) 에 나타낸다. 도 3, 4 의 결과로부터, 실시예 1 과는 대조적으로 AS-PCR 로 증폭된 UGT1A1*6 영역의 야생형 271 bp 와 변이형 274 bp 를 분리시킬 수 없었다. 이것은, AS-PCR 증폭 산물의 사이즈에 대해, 야생형과 변이형의 사슬 길이 차이가 작았기 때문인 것으로 생각된다.

참고예 2 에 있어서, 아니온 교환 칼럼 2 를 사용하여 UGT1A1*6 영역의 야생형 76 bp 와 변이형 79 bp 를 분리 검출하여 얻어진 크로마토그램을 도 5 에 나타낸다. 용리액 B 에 구아니딘염산염 대신에 염화나트륨을 첨가하면, 야생형 76 bp 와 변이형 79 bp 를 분리시킬 수 없었다.

산업상 이용가능성

Claims

AS-PCR 법에 의해 증폭된 야생형과 변이형의 산물을 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석하는 것을 특징으로 하는 단일염기다형의 검출 방법.
제 1 항에 있어서,
AS-PCR 법에 의해 증폭된 산물의 크기가 200 bp 이하이고, 또한 야생형과 변이형의 사슬 길이 차이가 10 bp 이하인 것을 특징으로 하는 단일염기다형의 검출 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
이온 교환 크로마토그래피에 있어서, 하기 식 (1) 로 나타나는 구아니딘으로부터 유도되는 구아니딘염을 함유하는 용리액을 사용하는 것을 특징으로 하는 단일염기다형의 검출 방법.
[화학식 1]
제 3 항에 있어서,
구아니딘염은 구아니딘염산염 또는 구아니딘황산염인 것을 특징으로 하는 단일염기다형의 검출 방법.