DK174784B1 - Kvantificering af nukleinsyremolekyler og reagenssæt dertil - Google Patents
Kvantificering af nukleinsyremolekyler og reagenssæt dertil Download PDFInfo
- Publication number
- DK174784B1 DK174784B1 DK198700993A DK99387A DK174784B1 DK 174784 B1 DK174784 B1 DK 174784B1 DK 198700993 A DK198700993 A DK 198700993A DK 99387 A DK99387 A DK 99387A DK 174784 B1 DK174784 B1 DK 174784B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- fragment
- hindiii
- gene
- nucleic acid
- test
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
DK 174784 B1
Den foreliggende opfindelsen angår kvantificering af visse nukleinsyremolekyler, navnlig graden af forøgelse {amplification) af gener og/eller tilsvarende mes-senger-RNA molekyler under anvendelse af sandwich- el-5 ler opløsnings-hybridiseringsmetoden, samt et reagenssæt anvendt hertil.
Antallet af kopier af enkelte gener i genomet er som regel konstant. I nogle tilfælde er der kun ét gen pr. haploidt genom og i andre flere. Under visse omstæn-10 digheder kan antallet af kopier ændre sig. Forøgelsen af visse gener har fx vist sig at være forbundet med udvikling af kræft. Det er også kendt at ydre faktorer såsom farmaceutiske midler og metaller etc. bevirker at visse gener multipliceres. Til udvikling af en sygdom er det 15 forkerte eller forøgede ekspressionsniveau for et gen, fx et oncogen, dvs. mængden af messenger-RNA i cellen, af meget stor betydning. Forøget antal af nogle kromosomer er grund til visse arvelige sygdomme og andre forstyrrelser, mens nogle arvelige sygdomme kun behøver du-20 plikering af ét recessivt gen. I alle sådanne tilfælde er det vigtigt at bestemme antallet af tilstedeværende kromosomer eller gener.
Antallet af visse DNA-molekyler, fx graden af forøgelse af visse gener, bestemmes for tiden ved ned-25 brydning (digesting) af det ekstraheredes DNA som skal undersøges ved hjælp af restriktionsenzymer, og ved fra-skillelse af nukleotidfragmenterne i overensstemmelse med længden ved agarose-gelelektroforese. Derefter overføres det enkelt-strengede DNA og fæstnes til et nitro-30 cellulosefilter hvor hybridisering finder sted under anvendelse af det til undersøgelse værende gen eller en del af genet som sonde. Resultaterne fås ved autora-diografering (Southern, J. Mol. Biol. 98, pp. 503-517, 1975). Ved hver parallel analyse er mængden af cellulært 35 DNA den samme.
Intensiteterne af hybridiseringsbåndene, dvs. signalerne, sammenlignes og forholdene mellem kopiantal- 2 DK 174784 B1 lene af de til undersøgelse værende gener i testprøverne udledes. Metoden giver kun tilnærmede resultater. Ligeledes måles RNA ved hjælp af Northern-pletnings- eller prik-pletningsmetoder. Disse metoder er kvantitativt me-5 get unøjagtige (Thomas, Methods in Enzymol., 100, pp.
255-266, 1983).
Kendte metoder såsom Southern- og Northern-plet-ningsmetoderne er langsomme og vanskelige at gennemføre. Eftersom de kun giver tilnærmede resultater er deres 10 diagnostiske værdi tvivlsom i tilfælde,hvor det er betydningsfuldt at kende antallet af visse nukleinsyre-molekyler pr. given enhed såsom en celle.
Sandwich- eller opløsnings-hybridiseringsmetoder-ne, beskrevet i US patentskrift nr. 4.486.539 og i bri-15 tisk offentliggjort patentansøgning nr. 2.169.403 er kvantitative (Virtanen et al.. Lancet, J_, side 381-383, 1983). Desuden fordrer fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse en standard-nukleinsyre hvis kopiantal er konstant og udgør bestemmelse af antallet af 20 relevante nukleinsyremolekyler pr. given enhed såsom en celle, en kerne, et ribosom eller et kromosom.
Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en nøjagtig og hurtig kvantitativ fremgangsmåde til bestemmelse af nukleinsyremolekyler, en 25 fremgangsmåde der også er hurtigere og simplere at gennemføre end den der bruges for tiden. Den kan bruges til kræft- og prenataldiagnose, til detektering af midler som bevirker genformering og til påvisning af udvikling af fx lægemiddelresistens såvel som til bestemmelse af 30 ekspressions-niveauet for messenger-RNA.
Der behøves mindst to bestemmelser ved den foreliggende opfindelse. Den ene bestemmer nukleinsyremole-kylet, der kan være til stede i et antal kopier, test-nukleinsyre. Den anden bestemmer de konstitutive nuklein-35 syremolekyle som med fordel er til stede i konstant antal, standard-nukleinsyre. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen menes der med et nukleinsyremolekyle en given 3 DK 174784 B1 nukleosidsekvens på 10-12 nukleotider eller et gen som indeholder flere tusinde nukleotider. Det kan også betyde et messenger-RNA eller en nukleotidsekvens som er betydelig længere end et enkelt gen, dvs. en ampiicon.
5 Bestemmelsen af test- og standard-nukleinsyre gennemføres under anvendelse af den i øvrigt normale sandwich-hybridiseringsmetode som fx er beskrevet i US patentskrift nr. 4.486.539, eller en opløsnings-hybridi-seringsmetode som er beskrevet i offentliggjorte briti-10 ske patentansøgning nr. 2.169.403. Opfindelsen angår også et reagenssæt som indeholder nukleinsyrereagenser bestående af mindst ét testsondepar og mindst ét standardsondepar .
De reagenser, eller sonder, der bruges ved frem-15 gangsmåden fremstilles under anvendelse af rekombinant- DNA-teknikker ud fra nukleinsyrer som er tilstrækkelig ' homologe med test- og standard-nukleinsyrerne. Tilstrækkeligt homologe nukleinsyrer kan også fremstilles syntetisk eller halvsyntetisk.
20 Test- og standard-nukleinsyrerne kan isoleres di rekte fra celler og identificeres ved forskellige hybri-diseringsteknikker. Sådanne test- og standard-nuklein-syrer er imidlertid også kommercielt tilgængelige fra forskellige genbanker. Test- og standard-nukleinsyrerne 25 kan være enten DNA eller RNA.
Sådanne par som egner sig til sandwich- eller op-løsnings-hybridiseringsmetoder fremstilles ud fra nukleinsyrer som er tilstrækkeligt homologe med test- og standard-nukleinsyrerne med rekombinant-DNA-teknikker. De re-30 levante nukleinsyrer nedbrydes (digested) ved hjælp af passende restriktionsenzymer; mindst to af de resultaterende restriktionsfragmenter, som befinder sig forholdsvis nær ved hinanden, klones til mindst to egnede vektorer.
Det ene af fragmenterne, detektorsonden, mærkes med en 35 egnet, detekterbar markering og den anden, fangersonden, fæstnes enten til en passende bærer, eller der fæstnes et stof dertil som muliggør adskillelse af den resulte- 4 DK 174784 B1 rende hybrid fra hybridiseringsblandingen ved hjælp af et yderligere stof såsom den komplementære komponent af et affinitetspar.
Test- og standard-sondeparrene kan samles til pas-5 sende reagenssæt hvor test- og standard-sondeparrene begge er DNA eller RNA, eller hvor test-sondeparret er DNA og standard-sondeparret RNA eller omvendt. Forbehandlingen og den videre behandling af prøverne forud for hy-bridiseringen og hybridiseringsbetingelserne må derefter 10 stemme med disse andre par der bruges ved testen.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særlig velegnet til bestemmelse af antallet af nukleinsyremoleky-ler direkte ud fra cellehomogenater. Fremgangsmåden kan naturligvis også bruges til bestemmelse af rensede el-15 ler rene nukleinsyrer. Før man gennemfører fremgangsmåden ifølge opfindelsen bør man imidlertid vælge den mest hensigtsmæssige forbehandling af nukleinsyreprøven.
Det er muligt at udføre både DNA- og RNA-bestem-melser ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
20 Deoxyribonukleinsyrer denatureres til opnåelse af enkelt strenge om nødvendigt. Enkeltstrengede messenger-RNA molekyler som potentielt måtte forstyrre hybridiserings-testen kan hydrolyseres, fx ved kogning med alkali. Prøven denatureres ikke i forbindelse med ribonukleinsyre-25 bestemmelser eftersom den dobbeltstrengede deoxyribonu-kleinsyre ikke indgriber i RNA-bestemmelsen. Det er naturligvis muligt at nedbryde DNA med deoxyribonuklease eller ændre det enten kemisk eller mekanisk så det ikke kan deltage i hybridiseringsreaktionen. Man må derfor i 30 forbindelse med DNA- og RNA-bestemmelser vælge en passende fremgangsmåde til yderligere behandling af prøven, eller man kan udlade denne yderligere behandling. Valget af en passende fremgangsmåde til viderebehandling afhænger naturligvis af den fremgangsmåde der bruges 35 til den preliminære behandling af nukleinsyreprøven. Der er beskrevet talrige fremgangsmåder til forbehandling og viderebehandling af nukleinsyreprøver i litteraturen, og 5 DK 174784 B1 herud fra kan man i hvert enkelt tilfælde vælge den mest hensigtsmæssige fremgangsmåde.
Bestemmelser hvor både test- og standard-nuklein-syrerne er enten DNA eller RNA kan udføres ved anvendel-5 se af en udelt prøve. Bestemmelser hvor test-nukleinsyrer-ne er DNA og standard-nukleinsyrerne RNA eller omvendt, må udføres ved hjælp af en delt prøve eftersom forskellige fremgangsmåder til viderebehandlingen er nødvendige. Prøven kan naturligvis deles selv om test- og standard-nu-10 kleinsyrerne er af samme nukleinsyretype.
Hybridiseringstesten selv udføres ved at man bringer den udelte prøveopløsning i kontakt samtidig med mindst ét test-sondepar og ét standard-sondepar. Hvis prøveopløsningen er delt, bringes den særskilt i kon-15 takt med mindst ét test-sondepar og ét standard-sondepar.
I sådanne tilfælde bestemmes mængden af test-nukleinsyre i en reaktionsbeholder og mængden af standard-nuklein-syre i den anden.
Uanset om prøven deles eller ej, lader man hybri-20 diseringen finde sted under de mest fordelagtige betingelser og tidsrum i hvert enkelt tilfælde. Når reaktionen eller reaktionerne har fundet sted, skilles de resulterende test- og standard-hybrider fra hybridiserings-blandingen eller -blandingerne ved hjælp af bæreren og 25 vaskes, eller ved hjælp af et isoleringsmiddel såsom et komplementært medlem af et affinitetspar. Den markør som er knyttet til test- og standard-hybriderne måles og resultatet sammenlignes med standardkurver. På denne måde kan man bestemme antallet af til undersøgelse væ-30 rende nukleinsyremolekyler pr. valgt enhed.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har praktisk diagnostisk værdi, navnlig ved konstatering af nogle typer kræft. I småcellede lungekarcinomer er c-myc-genet ofte multipliceret og dets ekspressionsniveau betydeligt 35 højere end i normalt væv. I tilfælde af neuroblastom er N-myc-genet multipliceret.
6 DK 174784 B1
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan også bruges til påvisning af mutagene eller karcinogene virkninger af visse midler eller udvikling af lægemiddelresistens. Det er kendt at ydre selektionstryk kan resulte-5 rer i forøget ekspression af et givet gen. Ved behandling af kræft udvikler celler resistens mod et givet lægemiddel ved multiplicering af genet, hvis ekspressionsprodukt inaktiverer lægemidlet. Et sådant tilfælde er methotrexat, der inducerer formering af genet for dihy-10 drofulatreduktase (DHFR). Et yderligere eksempel er formering af genet for metallothionin under indflydelse af cadmium.
Ekspressionsniveauet af et gen er betydningsfuldt ud fra synspunktet af cellens fenotype og funktion.
15 Dette kan undersøges ved måling af mængden af messenger-RNA, der er korreleret med den mængde protein der podes af den. Transskriptionsproduktet af et oncogen bestemmer den måde på hvilken den endeligt vil blive udtrykt ( expressed).
20 Ekspressionsniveauerne fra oncogen varierer i af hængighed af celletypen, differentieringsniveauet og cellens udviklingsfase. Fx kopieres på et vist stadium af fosterudviklingen c-myc-oncogenet hurtigt, mens udviklingen på et andet stadium er meget langsom. Graden af 25 multiplicering eller formering (amplification) er ofte korreleret med ekspressionsniveauet for genet, om end sidstnævnte kan forøges signifikant uden førstnævnte. I sådanne tilfælde bestemmes et oncogens rolle bedst ved måling af dets ekspressionsniveau fremfor antallet af 30 kopier. I nogle tilfælde kan kvantitativ bestemmelse af messenger-RNA være simplere og lettere at håndterer end kvantificering af genproduktets celle. Som eksempel kan nævnes c-myc-oncogenet, et labilt protein som let koaguleres af varme.
35 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan også bru ges til identificering af nummeriske kromosomale abnor-maliteter som Downs syndrom. Ved prænatal diagnostise- 7 DK 174784 B1 ring er det også muligt at bestemme om fosteret er defekt, dvs. homozygot med hensyn til et eller andet recessivt gen.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen og de nuklein-5 syrereagenser der bruges ved fremgangsmåden vil blive beskrevet mere udførligt i det følgende.
Eksempel 1 1 o Kvantificering af et multipliceret (amplified) oncogen a) Nukle i nsy rereagenser_02_ fremstil li n2_der;a.f
STANDARD SONDER
CeIle-standardnukleinsyre. c-Ki-rasI-genet er til stede i alle menneskeceller. Sondeparrene til sandwich-15 hybridisering blev fremstillet ved subkloning af Hindlll-fragmentet af c-Ki-rasI-genet, hvis længde er 3,8 kb, og -hvis restriktionskort er beskrevet af Chang et al., i PNAS 79_, side 4848-4852, 1982. Fragmentet er til rådighed, fx klonet ind i pBR322-plasmidet (ATCC 41032) og 20 kan erhverves fx fra ATCC-kultursamlingen.
Yderligere behandling af celle-standardnuklein-syre. Den ovenfor beskrevne pBR322 klon blev behandlet med Bglll og Hindlll restriktionsenzymer og de resulte-25 rende fragmenter isoleredes fra agarosegelen; rensede fragmenter lokaliseret tæt ved hinanden blev subklonet ind i to egnede vektorer til fremstilling af detektor og fangersonderne.
30 Standard-dektorsonde. Et Bglll-BgIII fragment med en længde på ca. 1,1 kb blev subklonet ind på BamHI restriktionsenzymstedet på pBR322-plasmidet og mærket ved 1 25 indsnit-translatering med I-mærket dCTP.
35 Standard-fangersonde. Bglll-Hindlll-fragmentet på ca. 0,5 kb indsattes i M13 mp10 og mpl1 fag-vektorer mellem restriktionsstederne for BamHI-og Hindlll-restrik- tionsenzymerne og fæstnedes til et nitrocellulosefilter (150 ng DNA/dia 1 cm).
8
DK 174784 W
TESTSONDER
5
Test-nukleinsyre. Et sondepar til sandwich-hybri-disering fremstillet ud fra et klonet c-myc gen som fx kan fås fra ATCC-kultursamlingen (ATCC 41010). Genets restriktionskort er beskrevet af Watt et al., PNAS 80, 10 side 6307-6311, 1983.
Yderligere behandling af test-nukleinsyren. c-myc-genet behandledes med Hindlll, Xbal og PstI restriktionsenzymer og fragmenterne isoleredes fra agarosegelen, ren-15 sedes og subklonedes ind i passende vektorer for at fremstille detektor- og fangersonderne.
Test-detektorsonde. De enkeltstrengede ender af Hindlll-Xbal-restriktionsfragmentet af c-myc-genet, med 20 en længde på 3,7 kb, blev gjort dobbeltstrenget ved hjælp af DNA-polymerase. Hindlll-koblerne blev indsat ved hjælp af T4-DNA ligase i de resulterende butendede-DNA-fragmenter; efter fenolekstraktion blev DNA behandlet med Hindlll-restriktionsenzymet. DNA-fragmentet blev der-25 efter klonet ind i pBR322-plasmidet på restriktionstedet for Hindlll-restriktionsenzymet og mærket ved indsnits- 125 translatering med I-mærket dCTP.
Test-fangersonde. X-bal-Pstl-fragmentet på 1,1 kb 30 fra c-myc-genet klonedes ind i M13 mp1Q og mp11 fag-kloningsvektorer mellem restriktionsstederne for Xbal og PstI restriktionsenzymerne og fæstnedes til nitrocellulosefilteret (150 ng DNA/dia 1 cm).
35 b) §§§^Ξίϋ!££^§®_?^§£§ηά3Γά1ςηΓνθη
Den prøve der brugtes til bestemmelse af standardkurven bestod af en alkalidenatureret pBR322 klon af c- 9 DK 174784 B1 myc-genet. Den sandwich-hybridiseringsopløsning til hvilken ovennævnte testsonde blev sat bestod af 4 x SSC, 1 x Denhardt opløsning, 200 yg/ml sildesperma-DNA og 0,2% SDS. Hybridisering fandt sted ved 65°C i 17-19 timer, 5 hvorefter filtrene vaskedes i vaskeopløsningen (0,1 x SSC 0,2% SDS) ved 50°C. Den markør der var knyttet til sandwichhybriderne blev derefter talt i en gammatæller.
Tabel 1 10 '
Prøve, c-myc_ molekyler/test c-myc-filter 0 40 106 75 15 5 x 106 190 107 340 108 2200 C) Bestemmelse af antal qener 20
Prøverne omfattede 1) celler fra et menneskes placenta og 2) Colo 320 celler, der kan fås fx fra ATCC kultursamlingen (ATCC-CCC220). DNA blev isoleret fra begge prøver, og der sattes samme mængde celle-DNA, denatu-25 reret ved kogning i alkali, til begge prøver. Denaturering med alkali hydrolyserede al RNA som var til stede i prøven.
Testen udvalgtes ved at man til hver af prøverne satte både c-myc og c-Ki-rasI filtrene og de to mærkede 30 reagenser, hvilket gjorde det muligt at måle både standarden og test-DNA for hver prøves vedkommende. På basis af c-Ki-rasI bestemmelser viste hver test sig at indeholde samme mængde DNA, og det kan heraf udledes at c-myc-genet i Colo 320 celler er til stede i et omkring 35 16-20 højere kopiantal end i den normale situation. Re sultaterne fremgår af tabel 2.
Tabel 2 10 DK 174784 B1
Prøve c-Ki-rasI-filter c-myc filter cpm* cpm* antal - - 5 Human placentalceller 486 340 10
Colo 320 celler 432 3205 1,6 x 10® * Den aflæsning der er opnået fra blindfilteret er subtraheret fra aflæsningerne.
^ Eksempel 2
Kvantificering af multipliceret gen a) NukleinsYrereagenser_og_fremstilling_deraf
STANDARD SONDER
1 5
Cellestandard-nukleinsyre. Kontrol-nukleinsyren blev udtaget fra promoterområdet af metallothionin-genet fra mus, dvs. MT-genet, og den DNA der var umiddelbart ovenfor den. Strukturen af MT-genet er beskrevet af Pav-lakis og Hamer, PNAS 8JD, side 397-401 , 1983. Reference- 20 nukleinsyrefragmentet er tilgængeligt, fx klonet ind i pBPV-MMTneo (432-12) vektoren (ATCC 37224) og kan fx fås fra ATCC-kultursamlingen.
Yderligere behandling af cellestandard-nukleinsyre.
2 5
Det ovenfor beskrevne MT-gen behandledes med Kpnl, Bglll og EcorRI restriktionsenzymer til subkloning ind i pAT153 plasmid. KpnI-enden blev omdannet til en Hindlll-ende med en kobler.
Standarddetektorsonde. EcoRI-Kpnl-(Hindlll)-fragmentet med en størrelse på ca. 1,2 kb og lokaliseret ovenfor (upstream of) promotorområdet af metallothionin-genet blev klonet til pATI53-plasmidet mellem restriktionsstederne for EcoRI-og Hindlll-restriktionsenzymer- 35 32 ne og mærket ved indsnits-translatenng med P-mærket nukleosidtrifosfater.
11 DK 174784 B1
Standard-fangersonde. Det 0,8 kb KpnI-BgIII fragment omfattende promotorområdet af metallothionin-genet og området ovenfor det blev klonet ind i Ml 3 mp18 og M13 mp19 fag-vektorer mellem restriktionsstederne for 5 Kpnl og BamHI restriktionsenzymer og fæstnet til nitrocellulosefilteret .
TESTSONDER
10 Test-nukleinsyre. Sondeparrene for sandwich-hy- bridiseringstesten blev fremstillet ved hjælp af det i handlen gående pMTVdhfr plasmid (Bethesda Research Laboratories, produkt nr. 5369SS), hvis struktur er beskrevet af Lee et al., i Nature 294, side 228-232, 1981.
15
Yderligere behandling af test-nukleinsyren. ' pMTVdhfr-plasmidet indeholder cDNA fra dihydrofolatre-duktasegenet (DHFR) behandledes med Hindlll og Bglll restriktionsenzymer .
20
Test-detektorsonde. HindIII-BglII-fragmentet, der måler 0,75 kb og svarer til det område der koder for DHFR-genet i pMTVdhf-plasmidet blev indsat i plasmid pAT153-vektoren mellem restriktionsstederne for Hindlll 25 og BamHI restriktionsenzymerne og mærkedes ved indsnits- 32 translatering med P-roaerket nukleosidtrif osf ater.
Test-fangersonde. Et Hindlll fragment med en størrelse på 1,4 kb, taget fra MMTV-genområdet i pMTVdhfr-30 plasmidet klonedes ind i M13 mp18 og M13 mp19 fag-vektorerne .
b) §®§temmelse_af_standardkurven
Den prøve der brugtes til testen var renset DNA 3 5 fra pMTVdhfr-plasmidet. Selve testen udførtes som beskrevet i eksempel Ib, med den forskel at der brugtes en væ-ske-scintillationstæller til tællingen. Den resulterende standardkurve fremgår af tabel 3.
12 DK 174784 B1
Tabel 3 5 Prøve_ cmp_ molekyler/test DHRF-filter 0 17 1 06 45 3 x 106 79 10 7 υ 1θ' 210
Cellelinier stammende fra musefibroblastcellen NIH 3T3, hvilken cellelinie kan erhverves fra ATCC-kul-15 tursamlingen og hvis nummer er CRL 1658, der var blevet transficeret med forskellige mængder cDNA svarende til mRNA i DHFR-genet, blev podet på cellekulturplader og brugtes som prøven. Cellerne blev lyseret ved hjælp af natriumdodecylsulfat og deres DNA blev fraskåret ved 20 presning fra en sprøjte gennem en fin injektionsnål. En prøve på 250 μΐ svarende til 10° celler, blev udtaget fra homogenisatet og der tilsattes 50 μΐ NaOH. Prøven kogtes og neutraliseredes med eddikesyre og hybridise-ringsblandingen. Det samlede rumfang var 0,5 ml. Alle de 25 ovenfor beskrevne sonder blev tilsat samtidig og der tilsattes et såkaldt blindfilter som baggrundskontrol. Hybridiserng, vask og markørtælling blev udført som i eksempel Ib, dog med den forskel at der brugtes en væ-skescintillationstæller til tællingen. Resultaterne frem-30 går af tabel 4.
35
Tabel 4 13 DK 174784 B1
Celle MT Antal cel- _DHFR
cpm* ler i prø- cpm* antal mole- antal 5 ven kyler i prø- kopier _ven_
Kontrolcelle {ingen DHFR- , cDNA) 182 1,05 x 10 21 < 10° 1Q Linie I 138 0,9 x 106 80 3 x 106 3
Linie II 210 1 ,25 x 106 732 5 x 107_40 * cpm: den aflæsning der gives af blindfilteret er fratrukket.
15 MT-genet er en intern markør som måler antallet af celler som er til stede i en prøve. Resultaterne vi-ser at 10 -celler ved denne test gav et MT-specifikt signal på 165 + 20 cpm. DHFR-reagenserne måler mængden af DHFR-cDNA. Antallet af celler blev udledet af det MT-20 specifikke signal. Det var således muligt at bestemme antallet af DHFR-cDNA kopier i forskellige cellelinier som det fremgår af tabel 4,
Eksempel 3 25
Kvantificering af messenger-RNA
a) Nukleinsyrerea2enser_og_fremstilling_deraf
Under anvendelse af de i eksempel 2 beskrevne testsonder er det også muligt at måle den mængde mRNA 30 som er afledet af DHFR-cDNA. Strukturen af pMTVdhfr- plasmidet er en sådan,at transkription af DHFR-genet begynder ved MMTV-promotoren. De resulterende messengers har en længde på ca. 1,0 kb. Heraf stammer ca. 0,25 kb fra MMTV-promotorområdet og resten af DHFR-cDNA (Lee et 35 al., Nature 2£4, side 228-232, 1981.
14 DK 174784 B1
STANDARD-SONDER
Cellestandardnukleinsyre, standarddetektor og standardfangersonde var som beskrevet i eksempel 2.
5
TEST-SONDER
Test-nukleinsyren, testdetektoren og test-fanger-sonden var som beskrevet i eksempel 2.
10 b) Bestemmelse af standardkurven
Den prøve der brugtes til bestemmelse af standardkurven bestod af messenger-RNA svarende til dihydrofo- latreduktase-genet, frembragt ved transkription in vi-1 5 tro. Den DNA der behøves til transknptionen var fremstillet ved subkloning af 1,4 kb HindIII-fragmentet af MMTV-promotoren fra pMTVdhfr-plasmidet og 0,75 kb HindIII-BglII-fragmentet (DHFR-cDNA) ved siden af hinanden ind i pSP64-plasmidet (Progema Biotec) mellem re- 20 striktionsstederne for Hindlll og BanHI restriktionsenzymer. Prøven af RNA blev opbevaret i 0,2% SDS vandig opløsning.
Sandwich-hybridiseringsforsøget udførtes som beskrevet i eksempel Ib og 2b, men denaturering blev ude- 25 1 ladt.
Tabel 5
Prøve cmp 30 molekyler/test DHFR-filter 0 20 5 x 106 65 107 130 5 x 107 390 J D β 10B 653 15 DK 174784 B1 c) Bestemrnelse_af _antallet_af _messenger-RNA_rTiolekyler
Det antal messenger-RNA molekyler som svarer til DHFR-genet blev bestemt fra de i eksempel 2 beskrevne cellelinier.
5 Cellerne blev analyseret ved hjælp af natriumdo- decylsulfat og deres DNA blev afskåret svagt ved presning af en sprøjte gennem en fin injektionsnål. En prøve på 250 μΐ af homogenisatet blev udtaget, svarende til ca. 5x10^ celler. Homogenisatet blev derefter sat til 10 sandwich-hybridiseringstesten uden denaturering. Sandwich-hybridisering fandt sted som beskrevet i eksemplerne 2c og Ib, dog med den forskel at der kun sattes DHFR-sonder til hybridiseringsopløsningen. I en parallel prøve med 250 μΐ homogenisat bestemtes celleantallet ved hjælp af 15 MT-sonden som beskrevet i eksempel 2c.
Resultaterne fremgår af tabel 6.
Tabel 6 20 Celle MT Celleantal _DHFR_ cpm* i prøven cpm* antal mole- .antal pr..
kyler i prøven celle
Linie I 380 3,5 x 106 1465 3,45 x 108 100
Linie II 430 4,2 x 106 4800 2 x 109 500 25 ---- * cmp: Den aflæsning der opnås med blindfilteret er fratrukket.
Resultaterne viste at cellelinie I pr. celle pro-30 ducerede ca. 100 messenger-RNA molekyler ud fra DHFR- generne og cellelinie II producerede ca. 500 messenger-RNA molekyler fra DHFR-generne.
35 16 DK 174784 B1
Eksempel 4
Kvantificering af opformeret gen ved opløsnings-hybri- disering_ a ) Nukleinsyrereagenser_og_fremstillingderaf
5 STANDARD-SONDER
Cellestandard-nukleinsyren, standarddetektoren og standardf angersonden var som beskrevet i eksempel 2.
Det 1,2 kb EcoRI-Kpnl-(Hindlll) fragment i pATl53 blev 125 mærket ved indskærings-translatering med I-mærket 10 deoxycytidin. De 0,8 kb Kpnl-Bglll-fragmenter i M13 mp18 og M13 mpl9 blev modificeret med biotin under anvendelse af "Photoprobe" reagenset (Vector Laboratories, CA, USA, produkt nr. SP-1000).
15 TESTSONDER
Test-nukleinsyren, test-detektoren og test-fan-gersonden var som beskrevet i eksempel 2. Det 0,75 kb Hindlll-Bglll fragment i pAT153 blev mærket med I-mærket deoxycytidin. De 1,4 kb Hindlll-fragmenter i M13 20 mp18 og Ml 3 mp19 blev biotinyleret ved hjælp af "Photo-probe" som ovenfor.
b) §§§temmelse_af_standardkurverne
Der fremstilledes en cellestandardkurve ved hjælp 25 af en kendt mængde celler, ud fra hvilken hybridiserings-signalet måltes under anvendelse af standardsonderne som genkender MT-genet. Der fremstilledes en test-nuklein-syre-standardkurve ved pMTVdhfr-plasmidet og de testsonder som genkender dette plasmid. Der udførtes hybridise-ringer i 200 μΐ af en opløsning bestående af 0,6 M NaCl, 20 mM fosfatpuffer, pH 7,5, 1 mM EDTA, 4% polyætylengly-kol (PEG 6000) i 1,5 time ved 70°C. Efter reaktionen tilsattes der 50 μΐ streptavidin-agarose (Betheseda Research Laboratories, Maryland, USA, produkt nr. 5942SA), og 1 M NaCl, 10 mM natriumfosfat, pH 7,5, 1 mM EDTA til et slutrumfang på 500 μΐ. Hybriderne opsamledes på strep- 17 DK 174784 B1 tavidin-agarosen ved 37°C i 15 minutter. Agarosen vaskedes én gang i 5 minutter med den pufrede 1 M NaCl-opløs-ning ved 37°C og to gange i 2 minuter med 15 mM NaCl, 1,5 niM natriumcitrat ved 55°C. Mængden af bundne hydrider 5 bestemtes ved måling af agarosen i en gammatæller (Sy-vånen et al., Nucleic Acids Res. J_4, 5037-5048, 1986). Resultaterne fremgår af tabellerne 7 og 8.
Tabel 7 10 _
Prøve_ cpm_ celler/test MT-sonder 0,8 x 106 162 1,6 x 106 216 15 3 x 106 298
Tabel 8 20 Prøve_ cpm_ molekyler/test DHFR-sonder 106 148 5 x 106 394 5 x 107 2240 25 c) Bestemmelse_af_antal_gener
Prøver af de i eksempel 2 beskrevne cellelinier blev behandlet på lignende måde, dog således at rumfan-30 get pr. prøve svarende til 2 x 10^ celler var 125 μΐ.
Bestemmelserne af antal celler og antal test-nukleinsyre-molekyler udførtes i særskilte ampuller ved tilsætning af celleprøven, vedkommende detektor og fangersonder, og komponenterne af hybridiseringsblandingen til et slut-35 rumfang på 200 μΐ. Der indgik også kontrolbestemmelser uden cellestandard eller test-DNA. Hybridisering, opsamling af hybrider, vask og måling udførtes som beskre- 18 DK 174784 B1 vet i eksempel 4b. Resultaterne aflæstes fra standardkurver fremstillet i parallel som beskrevet i eksempel 4b. Resultaterne fremgår af tabel 9.
5 Tabel 9
Celle _J4T_ DHFR______ cpm* antal cel- cpm* antal mole- antal ler i prøven kyler i prøven kopier 10--
Kontrolcelle 253 2,3 x 106 73 < 105
Linie I 210 1,5 x 106 233 3,8 x 106 3
Linie II 237 2,1 x 106 3059 8,8 x 107 42 15 * cpm: Værdier fra kontrolbestemmelser uden cellestan dard eller test-nukleinsyre er fratrukket.
20 25 30 35
Claims (12)
1. Fremgangsmåde til kvantitav bestemmelse af nu- kleinsyremolekyler ved en sandwich- eller opløsnings-hybridiseringsmetode, kendetegnet ved at 5 antallet af givne nukleinsyremolekyler pr. biologisk given enhed som findes i den undersøgte organisme bestemmes ved sammenligning af antallet af test-nukleinsyremolekyler som er potentielt til stede i flere kopier i enheden, med antallet af valgte stan-10 dard-nukleinsyremolekyler som fordelagtigt er til stede i konstant antal pr. samme enhed, ved at nukle-insyrerne i prøven bringes i kontakt, enten udelt eller om nødvendigt delt, med mindst ét testsondepar som er tilstrækkelig homologt med den nukleinsyre som 15 bestemmes og med mindst ét udvalgt og hensigtsmæssigt standardsondepar som er tilstrækkeligt homologt med det nukleinsyremolekyle som fordelagtigt er til stede i et konstant antal, hvilket sondepar består af en dobbeltsonde og en fangersonde, idet detektorsonderne 20 i nævnte testsondepar og nævnte standardsondepar mærkes med en passende, detekterbar markør og fangersonderne er fæstnet til en passende bærer, eller et stof er fæstnet til nævnte fangersonder, hvilket tillader isolering af de resulterende hybrider, hvorpå testhy-25 briden og standardhybriden efter at hybridiserings-reaktionen eller -reaktionerne har fundet sted adskilles om nødvendigt og nævnte tilknyttede markør måles, idet antallet af nukleinsyremolekyler pr. given enhed findes ved sammenligning af antallet af 30 test-nukleinsyrer og standard-nukleinsyrer. DK 174784 B1
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kend e-t e g- n e t ved at test- og standard-nukleinsyren er desoxyribo-nukleinsyrer.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 ? kendete g- 5 net ved at test-nukleinsyren er en ribonukleinsyre og standard-nukleinsyren en desoxyribonukleinsyre.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 , k en d e t e g- n e t ved at test- og standardnukleinsyren er ribonukle-insyrer-
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 kendeteg net ved at test-nukleinsyren er desoxyribonukleinsyre og standard-nukleinsyren er ribonukleinsyre.
6. Fremgangsmåde ifølge kravene 1, 2 Qg 3 , k e n- detegnet ved at detektorsonden i standard-sonde- 15 parret - et rekombinant plasmid omfattende et 1,1 kb Bglll-Bglll fragment af HindIII-fragmentet af det humane c-Ki-Rasl gen, hvilket Hindlll fragment er klonet ind i pBR322-plasmidet og nævnte Bglll-BgIII fragment er subklonet ind i restriktionsstedet for BamHI-restriktionsenzymet i 20 pBR322~plasmidet - og fangersonderne - rekombinantfager omfattende et 0,5 kb Bglll-Hindlll fragment af Hindlll-fragmentet af det humane c-Ki-rasI gen, hvilket Hindlll fragment er klonet ind i pBR322-plasmidet og hvilket Bglll-Hindlll fragment er subklonet ind i Ml 3 mp10 og M13 mp11 25 fagvektorerne mellem restriktionsstederne for BamHI-og Hindlll-restriktionsenzymerne - enten hver for sig eller sammen med testsondeparret bringes i kontakt med en udelt eller om nødvendigt delt nukleinsyreprøve.
7, Fremgangsmåde ifølge krav 1,2 og 3, k e n d e-30 tegnet ved at detektorsonden i standardsondeparret - et rekombinant plasmid omfattende et 1,2 kb EcoRI-Kpnl (Hindlll) fragment fra ovenfor promoterområdet af muse-metallothionin-genet, hvilket fragment er subklonet ind i pATl53-plasmidet mellem restriktionsstederne for EcoRI-35 og Hindlll-restriktionsenzymerne - og fangersonderne - rekombinantf ager omfattende et 0,8 kb KpnI-BgIII -fragment fra promoterområdet af metallothionin-genet og området DK 174784 01 ovenfor det, hvilket fragment er subklonet ind i M13 mp18 og M13 mp19 fagvektorerne mellem restriktionsstederne for Kpnl- og BamHI-restriktionsenzymerne - enten hver for sig eller sammen med testsondeparret bringes i kontakt med en 5 udelt eller om nødvendigt delt nukleinsyreprøve.
8. Fremgangsmåde ifølge kravene 1, 2, 5, 6 °8 Λ kendetegnet ved at man for at bestemme graden af multiplicering af c-myc-oncogenet og/eller antallet af messenger-RNA molekyler svarende til dette gen bringer de-10 tektorsonden af testsondeparret - et rekombinant plasmid omfattende et 3,7 kb Hindlll-Xbal fragment fra c-myc-genet, hvilket fragment er subklonet ind i pBR322—plasmidet på restriktionsstedet for Hindlll-restriktionsenzymet - og fangersonderne - rekombinantfager omfattende et 1,1 kb 15 Xbal-Pstl fragment af c-myc-genet, hvilket fragment er subklonet ind i Ml 3 mp10 og M13 mpl1 vektorerne mellem re- ' striktionsstederne for Xbal og PstI restriktionsenzymerne - i kontakt, enten hver for sig eller sammen med standardsondeparret, med en udelt eller om nødvendigt delt nu-20 kleinsyreprøve.
9. Fremgangsmåde ifølge kravene 1, 2, 3, 6 og 7, kendetegnet ved at man for at bestemme graden af multiplicering af dihydrofolatreduktase- eller DHFR-genet og/eller antallet af messenger-RNA molekyler svaren-25 de til dette gen, bringer detektorsonden fra testsondeparret - et rekombinant plasmid omfattende et 0,75 kb Hindlll-Bglll fragment som koder for DHFR-genet i pMTVdhfr-plasmidet, hvilket fragment er subklonet ind i pAT153-plas-midvektoren mellem restriktionsstederne for Hindlll- og 30 BamHI-restriktionsenzymerne - og fangersonderne - rekombinantfager omfattende et 1,4 kb Hindlll-fragment i MMTV-genområdet i pMTVdhfr-plasmidet, hvilket fragment er subklonet ind i M13 mpl8 og Ml 3 mp19 fagvektorerne på restriktionsstedet for Hindlll-restriktionsenzymet - i kon-35 takt, enten hver for sig eller sammen med standardsondeparret, med en enten udelt- eller om nødvendigt delt nukleinsyreprøve. DK 174784 B1
10. Reagenssæt til kvantitativ bestemmelse af nu-kleinsyremolekyler efter fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved at sættet indeholder mindst ét testsondepar og mindst ét standardsondepar, idet detektorsonderne i både testsondeparret og stan- 5 'dardsondeparret er mærket med en passende markør og :fangersonderne er fæstnet til en egnet bærer, eller ; et stof er fæstnet til nævnte fangersonder, hvilket muliggør isolering af sandwich hybrider.
11. Reagenssæt ifølge krav 10, kendetegnet 10 ved at detektorsonden i det testsondepar, der bruges til bestemmelse af graden af multiplicering af c-myc-oncogenet og/eller antallet af messenger-RNA molekyler som svarer til dette gen, er et rekombinant plasmid omfattende 3,7 kb Hindlll-Xbal restriktionsfragment fra c-myc-genet, hvilket 15 fragment er subklonet ind i pBR322-plasmidet på restriktionsstedet for Hindlll-restriktionsenzymet, og at fangersonderne er rekombinantfager omfattende et 1,1 kb Xbal-Pstl fragment af c-myc-genet, hvilket fragment er subklonet ind i M13 mplO og M13 mp11 fagvektorerne mellem re-20 striktionsstederne for Xbal og PstI restriktionsenzymerne, hvorhos detektorsonden i standardsondeparret er et 1,1 kb Bglll-BgIII fragment af HindIII-fragmentet af det humane c-Ki-rasI gen, hvilket Hindlll fragment er klonet ind i pBR322-plasmidet og hvilket Bglll-BgIII fragment er sub-25 klonet ind i pBR322-plasmidet på restriktionsstedet for BamHI -restriktionsenzymet, og fangersonderne er rekombi-nantfager omfattende et 0,5 kb Bglll-Hindlll fragment af HindIII-fragmentet af c-Ki-rasI-genet, hvilket Hindlll-fragment er subklonet ind i pBR322-plasmidet i c-Ki-rasI-30 genet og hvilket Bglll-Hindlll fragment er subklonet ind i M13 mp10 og M13 mp11 fagvektorerne mellem restriktionsstederne for BamHI- og Hindlll-restriktionsenzymerne.
12. Reagenssæt ifølge krav 10. kendetegnet ved at detektorsonden i det testsondepar der bruges til 35 bestemmelse af graden af multiplicering af dihydrofolat- reduktase- eller DHFR-genet og/eller antallet af messenger-RNA molekyler svarende til dette gen er et rekombinant DK 174784 B1 plasmid omfattende et 0,75 kb Hindlll-BgIII fragment som koder for DHFR-genet i pMTVdhfr-plasmidet, hvilket fragment er subklonet ind i pAT153-plasmidvektoren mellem restriktionsstederne for Hindlll- og BamHI restriktionsen-5 zymerne, og at fangersonderne er rekombinantfager omfattende et 1,4 kb Hindlll fragment i MMTV-genområdet af pMTVdhfr-plasmidet, hvilket fragment er subklonet ind i M13 mp18 og M13 mp19 fagvektorer på restriktionsstedet for Hindlll-restriktionsenzymet, hvorhos detektorsonden i 10 standardsondeparret er et rekombinant plasmid omfattende et 1,2 kb EcoRI-Kpnl fragment fra ovenfor promoterområdet af musemetallothionin-genet, hvilket fragment er subklonet ind i pATl53-plasmidet mellem restriktionsstederne for EcoRl- og Hindlll-restriktionsenzymerne, mens fangerson-15 derne er rekombinantfager omfattende et 0,8 kb Kpnl-Bglll fragment af metallothionin-genet dannet af promoterområdet og området ovenfor det, hvilket fragment er subklonet ind i M13 mp18 og M13 mp19 fagvektorerne mellem restriktionsstederne for Kpnl-og BamHI- restriktionsenzymerne.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI860836 | 1986-02-27 | ||
| FI860836A FI76119C (fi) | 1986-02-27 | 1986-02-27 | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK99387D0 DK99387D0 (da) | 1987-02-26 |
| DK99387A DK99387A (da) | 1987-08-28 |
| DK174784B1 true DK174784B1 (da) | 2003-11-10 |
Family
ID=8522222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198700993A DK174784B1 (da) | 1986-02-27 | 1987-02-26 | Kvantificering af nukleinsyremolekyler og reagenssæt dertil |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62205800A (da) |
| KR (1) | KR870008033A (da) |
| AT (1) | AT393511B (da) |
| AU (1) | AU603562B2 (da) |
| BE (1) | BE1001168A4 (da) |
| CA (1) | CA1287558C (da) |
| CH (1) | CH675593A5 (da) |
| DD (1) | DD270383A5 (da) |
| DE (1) | DE3706285A1 (da) |
| DK (1) | DK174784B1 (da) |
| ES (1) | ES2061411A6 (da) |
| FI (1) | FI76119C (da) |
| FR (1) | FR2594849B1 (da) |
| GB (1) | GB2187283B (da) |
| HU (1) | HU201808B (da) |
| IE (1) | IE66904B1 (da) |
| IL (1) | IL81695A (da) |
| IS (1) | IS3197A7 (da) |
| IT (1) | IT1202581B (da) |
| LU (1) | LU86792A1 (da) |
| NL (1) | NL195097C (da) |
| NO (1) | NO175380C (da) |
| NZ (1) | NZ219421A (da) |
| PT (1) | PT84368B (da) |
| SE (1) | SE468816B (da) |
| ZA (1) | ZA871401B (da) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714380A (en) | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| EP0304845A3 (en) * | 1987-08-28 | 1991-03-06 | Profile Diagnostic Sciences Inc. | Method and kit for assaying gene expressions |
| EP0341904B1 (en) * | 1988-05-09 | 1995-03-29 | Temple University of the Commonwealth System of Higher Education | Method for predicting the effectiveness of antineoplastic therapy in individual patients |
| AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| AU5731790A (en) * | 1989-05-18 | 1990-12-18 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Rna probe for detecting c-fes mrna |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| DK138090D0 (da) * | 1990-06-06 | 1990-06-06 | Novo Nordisk As | Diagnostisk analysemetode |
| EP0534640B1 (en) * | 1991-09-23 | 1996-10-02 | Pfizer Inc. | Process for detecting specific mRNA and DNA in cells |
| US6300058B1 (en) | 1992-01-29 | 2001-10-09 | Hitachi Chemical Research Center, Inc. | Method for measuring messenger RNA |
| GB9210916D0 (en) * | 1992-05-21 | 1992-07-08 | Isis Innovation | Nucleic acid quantification |
| US5580971A (en) * | 1992-07-28 | 1996-12-03 | Hitachi Chemical Company, Ltd. | Fungal detection system based on rRNA probes |
| MX9300494A (es) * | 1992-07-28 | 1994-07-29 | Hitachi Chemical Co Ltd | Metodo para la deteccion genetica de organismos, agentes infecciosos o componentes de una celula u organismo en una muestra biologica. |
| ES2055661B1 (es) * | 1993-01-20 | 1995-03-01 | Univ Malaga | Determinacion de la expresion genica por captura especifica de arn y su cuantificacion directa por electroforesis capilar en zona libre. |
| GB9309966D0 (en) * | 1993-05-14 | 1993-06-30 | Nordion Int Inc | Detection of prostrate-specific antigen in breast tumors |
| GB9415489D0 (en) * | 1994-08-01 | 1994-09-21 | Nordion Int Inc | Detection of prostate-specific antigen in amniotic fluid |
| AT401062B (de) * | 1994-09-26 | 1996-06-25 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung von nukleinsäuren |
| JP5565781B2 (ja) * | 2010-03-31 | 2014-08-06 | 有限会社山口ティー・エル・オー | 核酸クロマトグラフ法を利用した肺炎原因菌の検出方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4442203A (en) * | 1981-06-30 | 1984-04-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Gene amplification assay for detecting tumor promoters |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| DE3382068D1 (de) * | 1982-03-15 | 1991-01-31 | Univ Columbia | Verfahren zum einbringen von klonierten amplifizierbaren genen in eukaryotische zellen und zur herstellung von proteinprodukten. |
| IE56509B1 (en) * | 1982-11-04 | 1991-08-28 | Univ California | Methods for oncogenic detection |
| FI71768C (fi) * | 1984-02-17 | 1987-02-09 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
| US4675283A (en) * | 1984-07-19 | 1987-06-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Detection and isolation of homologous, repeated and amplified nucleic acid sequences |
| FI72146C (fi) * | 1985-01-02 | 1987-04-13 | Orion Yhtymae Oy | Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror. |
| FR2583771B1 (fr) * | 1985-06-21 | 1988-12-09 | Centre Nat Rech Scient | Sequences d'adn d'archaebacteries homologues a l'oncogene v-myc, proteines codees par ces sequences, leurs procedes d'obtention et leurs applications immunologiques |
-
1986
- 1986-02-27 FI FI860836A patent/FI76119C/fi not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-02-25 JP JP62042442A patent/JPS62205800A/ja active Granted
- 1987-02-26 IE IE49687A patent/IE66904B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 AT AT431/87A patent/AT393511B/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 DK DK198700993A patent/DK174784B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 ES ES08700776A patent/ES2061411A6/es not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-26 NZ NZ219421A patent/NZ219421A/xx unknown
- 1987-02-26 LU LU86792A patent/LU86792A1/fr unknown
- 1987-02-26 KR KR870001680A patent/KR870008033A/ko not_active Application Discontinuation
- 1987-02-26 NL NL8700483A patent/NL195097C/nl not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 DE DE19873706285 patent/DE3706285A1/de active Granted
- 1987-02-26 IT IT19501/87A patent/IT1202581B/it active
- 1987-02-26 NO NO870794A patent/NO175380C/no unknown
- 1987-02-26 CH CH756/87A patent/CH675593A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 AU AU69275/87A patent/AU603562B2/en not_active Expired
- 1987-02-26 ZA ZA871401A patent/ZA871401B/xx unknown
- 1987-02-26 SE SE8700821A patent/SE468816B/sv not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 GB GB8704517A patent/GB2187283B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 BE BE8700177A patent/BE1001168A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 PT PT84368A patent/PT84368B/pt unknown
- 1987-02-26 FR FR878702541A patent/FR2594849B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 HU HU87750A patent/HU201808B/hu unknown
- 1987-02-26 IS IS3197A patent/IS3197A7/is unknown
- 1987-02-26 CA CA000530691A patent/CA1287558C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-27 IL IL81695A patent/IL81695A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-02-27 DD DD87300286A patent/DD270383A5/de unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK174784B1 (da) | Kvantificering af nukleinsyremolekyler og reagenssæt dertil | |
| Goto et al. | Chronic progressive external ophthalmoplegia: a correlative study of mitochondrial DNA deletions and their phenotypic expression in muscle biopsies | |
| US5741677A (en) | Methods for measuring telomere length | |
| De Lemos et al. | Differential molecular response of the transcripts B2A2 and B3A2 to imatinib mesylate in chronic myeloid leukemia | |
| KR102178922B1 (ko) | 당뇨병성 신증 진단을 위한 마이크로RNA let-7 또는 마이크로RNA-150 바이오마커 및 이의 용도 | |
| CN106399462A (zh) | 一种bcr-abl融合基因扩增试剂盒和检测试剂盒 | |
| CN105368924A (zh) | Idh1/2基因突变检测体系及其试剂盒 | |
| Saffroy et al. | Real‐time quantitation of bcr‐abl transcripts in haematological malignancies | |
| CN107119148B (zh) | 检测hiv-1 2-ltr dna的pcr引物组、探针及其试剂盒和检测方法 | |
| CN105441568A (zh) | 用于检测人类bcr-abl融合基因t315i突变的引物、探针及试剂盒 | |
| CN110387411A (zh) | 用于检测狼疮性肾炎或评估狼疮性肾炎风险的方法及其应用 | |
| CN104087672A (zh) | 一种多重实时荧光定量pcr技术快速检测人21号染色体数目的试剂盒 | |
| CN103555839B (zh) | 基于实时荧光pcr的尿沉渣细胞肾脏纤维化检测芯片 | |
| Kalkuhl et al. | p21Ras downstream effectors are increased in activity or expression in mouse liver tumors but do not differ betweenRas-mutated andRas-wild-type lesions | |
| KR101845957B1 (ko) | 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법 | |
| CN107674914A (zh) | 一步单管法定量rt‑pcr检测慢性髓系白血病bcr‑abl1基因的表达量 | |
| RU2752902C1 (ru) | Набор олигонуклеотидов и способ мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2 | |
| US11965879B2 (en) | Method for diagnosing and assessing endometriosis | |
| KR102546809B1 (ko) | 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법 | |
| US20210388448A1 (en) | Method of determining prognosis in patients with follicular lymphoma | |
| Baulina et al. | Analysis of miRNA Expression from the DLK1-DIO3 Locus in CD4+ and CD14+ Cells in Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis | |
| Nattrass et al. | The effect of telomere length variation on lifetime productivity traits in sheep | |
| CN116716392A (zh) | 基于宿主基因转录水平进行脓毒症诊断的数字pcr检测试剂盒 | |
| KR20220170036A (ko) | 막성사구체신염 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 | |
| CN115247208A (zh) | 一种IL-1β的实时荧光定量qRT-PCR检测方法和试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |