FR2594849A1 - Quantification de molecules d'acide nucleique et trousse de reactifs utilisee - Google Patents

Abstract

L'invention est relative à la quantification de certaines molécules d'acide nucléique, en particulier du degré d'amplification des gènes et/ou des molécules d'ARN messager correspondants, avec la méthode d'hybridation en solution ou sandwich, et à la trousse de réactifs utilisée. On effectue la détermination en comparant le nombre de molécules d'acide nucléique d'essai potentiellement présentes dans plusieurs copies dans une unité donnée, au nombre de molécules d'acide nucléique standard choisi avantageusement présentes en nombre constant dans une même unité.

Description

La présente invention est relative à la quanti-

fication de certaines molécules d'acide nucléique, en parti-

culier du degré d'amplification des gènes et/ou des molécules

d'ARN messager correspondant, au moyen de la méthode d'hybri-

dation-sandwich ou en solution, et à la trousse de réactifs

mise en oeuvre.

Le nombre de copies de gènes individuels dans le génome est généralement constant. Dans certains cas, il n'y

a qu'un cène par génome haploïde et plusieurs dans d'autres.

Dans certaines circonstances, le nombre de copies peut changer.

On a trouvé par exemple, que l'amplification de certains gènes est associée au développement du cancer. On sait aussi que des facteurs extérieurs, comme des produits pharmaceutiques et des métaux, etc.., provoquent l'amplification de certains aènes. Le taux d'expression défectueux ou augmenté d'un gène, comne un oncoqène, c'est-à-dire la quantité d'ARN messager

dans la cellule revêt une importance majeure pour le dévelop-

pement d'une maladie. Un nombre accrû de certains chromosomes est la cause de certaines maladies héréditaires ou d'autres

troubles, tandis que certaines maladies héréditaires ne requiè-

rent que la duplication d'un gène récessif. Dans tous les cas,

il est important de déterminer le nombre de gènes ou de chromo-

somes présents.

Le nombre de certaines molécules d'ADN, par exemple le deqré d'amplification de qgènes donnés, est couramment déterminé par digestion de l'ADN extrait à étudier avec des

enzvmes de restriction et séparation des fragments de nucleo-

tide en fonction de leur longueur, par électrophorèse sur gel d'aaarose. L'ADN à brin unique est ensuite transféré et fixé sur un filtre de nitrocellulose, o l'hybridation a lieu avec le gène à étudier ou une partie du gène en tant que sonde. Les résultats sont obtenus par autoradiographie (Southern, J. Mol. Biol. 98, pp. 503-517, 1975). Dans chaque analyse parallèle, la quantité d'ADN cellulaire est la même. Les intensités des bandes d'hybridation, c'est-à-dire les signaux, sont comparées et les rapports entre les taux de réplication des gènes étudiés

dans les échantillons d'essai, sont obtenus par déduction.

La méthode ne fournit que des résultats approximatifs. De même, l'ARN est mesuré avec les méthodes de fixation sur papier-filtre (blotting) de Northern ou par points. Ces mé- thodes sont très imprécises quantitativement (Thomas, Methods

in Enzymol., 100, pp. 255-266, 1983).

Des méthodes connues, comme les méthodes de fixation sur papier-filtre de Southern et de Northern, sont lentes et difficiles à réaliser. Comme elles ne fournissent que des

résultats approximatifs, leur intérêt diagnostique est dou-

teux dans les cas o il est important de conna!tre le nombre de certaines molécules d'acide nucléique par unité donnée, telle qu'une cellule Les méthodes d'hybridation-sandwich ou en solution, décrites dans le Brevet US N 4 486 539 et dans la Demande de Brevet britannique N GB 2 169 403 sont quantitatives (Virtanen et coll., Lancet 1, pp. 381-383, 1983). De plus, la méthode de la présente invention nécessite un acide nucléique standard dont le taux de réplication est constant et permet la déterminaticn du nombre de molécules d'acide nucléique correspondant par unité donnée, comme une cellule, un noyau,

un ribosome ou un chromosome.

La présente invention a pour but de produire une méthode quantitative précise et rapide de détermination des molécules d'acide nucléique, qui est aussi plus rapide et plus simple à mener que les méthodes utilisées couramment. Elle peut être utilisée pour des diagnostics de cancer et prénataux, pour détecter des aqents qui provoquent une amplification des cènes et pour mettre en évidence le développement par exemple d'une résistance à un médicament, ainsi que pour déterminer

le taux d'expression d'ARN messaqer.

Il faut procéder à au moins deux déterminations dans la présente invention. On détermine la molécule d'acide nucléique qui peut être présente dans plusieurs copies, à savoir l'acide

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nucléique d'essai. Par ailleurs, on détermine la molécule d'acide nucléique constitutif avantageusement présente en

nombre constant, l'acide nucléiaue étalon dit "standard".

Dans la méthode selon la présente invention, une molécule d'acide nucléique représente une certaine séquence de nucl&o- tides de 10 à 12 nucléotides ou un gène contenant plusieurs milliers de nucléotides. Elle peut aussi signifier un ARN messager ou une séquence de nucléotides beaucoup plus longue

qu'un simple gène, c'est-à-dire un amplicone.

La détermination des acides nucléiques d'essai et standard est faite selon une méthode d'hybridation-sandwich par ailleurs normale, décrite par exemple dans le Brevet US N 4 486 539 ou une méthode d'hybridation en solution décrite

dans la Demande de brevet britannique N GB 2 169 403. L'in-

vention concerne aussi une trousse de réactifs contenant des réactifs d'acide nucléique, comprenant au moins une paire de

sondes d'essai et au moins une paire de sondes standards.

Les réactifs ou sondes, utilisés dans cette méthode, sont préparés par des techniques d'ADN recombinant, à partir d'acides nucléiques suffisamment homologues des acides

nucléiques d'essai et standard. Des acides nucléiques suffi-

samment homologues peuvent aussi être préparés, par voie

synthétique ou semi-synthétique.

Les acides nucléiques d'essai et standard peuvent être directement isolés à partir des cellules et identifiés par diverses techniques d'hybridation. Ces acides nucléiques

d'essai et standard sont cependant aussi disponibles industriel-

lement et chez diverses banques de gènes. Des acides nucléiques

d'essai et standard peuvent être des ADN ou des ARN.

Des paires de sondes convenables pour la méthode

d'hybridation-sandwich ou en solution, sont préparées à par-

tir d'acides nucléiques suffisamment homologues des acides

nucléiques d'essai et standard par des techniques d'ADN recom-

binant. Les acides nucléiques correspondants sont digérés par des enzymes de restriction convenables; deux au moins des fragments de restriction résultants situés relativement près les uns des autres sont clones dans au moins deux

vecteurs convenables. L'un des fragments, la sonde de détec-

tion, est marquée avec un marqueur détectable convenable et l'autre, la sonde de capture, est fixée à un support convena- ble ou bien une substance est fixée à celle-ci, laquelle

substance permet la séparation de l'hybride résultant à par-

tir du mélange d'hybridation au moyen d'une autre substance,

comme le composant complémentaire d'une paire d'affinité.

Les paires de sondes d'essai et standard peuvent être asemblées dans des trousses de réactifs convenables, dans lesquelles les paires de sondes d'essai et standard sont toutes deux un ADN ou un ARN, ou bien la paire de sondes d'essai est formée d'ADN et la paire de sondes standards d'

ARN, ou vice-versa. Le prétraitement et le traitement supplé-

mentaire des échantillons avant l'hybridation et les condi-

tions d'hybridation doivent donc convenir aux paires de son-

des utilisées dans le test.

La méthode de la présente invention convient parti-

culièrement pour déterminer le nombre de molécules d'acide

nucléique directement à partir des homogénates cellulaires.

La méthode peut évidemment aussi être utilisée pour la déter-

mination d'acides nucléiques purifiés ou purs. Cependant, avant d'effectuer la méthode de l'invention, on doit choisir le prétraitement le plus convenable de l'échantillon d'acide nucléique.

Il est possible d'effectuer à la fois des détermi-

nations d'ADN et d'ARN selon la méthode de l'invention. Les acides désoxyribonucléiques sont dénaturés pour obtenir des brins uniques si cela est nécessaire. Des molécules d'ARN messager à brin unique perturbant potentiellement le test

- d'hybridation, peuvent être hydrolysées, par exemple par ébul-

lition alcaline. L'échantillon n'est pas dénaturé dans le cas des déterminations d'acide ribonucléique, puisque l'acide désoxyribonucléique à double brin n'interfère pas avec la détermination d'ARN. Il est bien sar possible de briser

l'ADN avec une désoxyribonucléase ou de la modifier chimique-

ment ou mécaniquement de telle sorte qu'il ne puisse pas

participer à la réaction d'hybridation. A propos des détermi-

nations d'ADN et d'ARN, une méthode convenable pour un trai- tement supplémentaire de l'échantillon doit donc être choisie ou, dans une variante, un tel traitement peut être omis. Le

choix d'une méthode convenable pour le traitement supplémen-

taire dépend bien sar de la méthode utilisée pour le traite-

ment préliminaire de l'échantillon d'acide nucléique. De

nombreuses méthodes de prétraitement et de traitement supplé-

mentaire des échantillons d'acide nucléique ont été décrites dans la littérature, si bien qu'il est possible de choisir

la méthode la plus convenable dans chaque cas.

Des déterminations dans lesquelles les acides nuclé-

iques à la fois d'essai et standard, sont soit des ADN, soit des ARN, peuvent être réalisées avec un échantillon qui n'est pas divisé. Des déterminations dans lesquelles les acides

nucléiques d'essai sont des ADN et les acides nucléiques stan-

dards sont des ARN ou vice-versa, doivent être effectuées

avec un échantillon divisé, dans la mesure o il est néces-

saire de procéder à différentes méthodes pour le traitement supplémentaire. L'échantillon peut évidemment être divisé, même si les acides nucléiques d'essai et standard sont du même

type d'acide nucléique.

Le test d'hybridation lui-même est réalisé par mise de la solution d'échantillon non-divisée, simultanément en contact avec au moins une paire de sondes d'essai, et une paire de sondes standards. Si la solution de l'échantillon a été divisée, elle est mise séparément en contact avec au

moins une paire de sondes d'essai et une paire de sondes stan-

dards. Dans ces cas, la quantité d'acide nucléique d'essai

est déterminée dans un réacteur et la quantité d'acide nuclé-

ique standard dans un autre.

Que l'échantillon soit divisé ou non, on laisse l'hybridation avoir lieu dans les conditions et pendant le temps les plus avantageux dans chaque cas. Lorsque le ou les

réactions ont eu lieu, les hybrides d'essai et standard résul-

tants sont séparés du ou des mélanges d'hybridation par le support et lavés, ou par un agent d'isolation comme le membre complémentaire d'une paire d'affinité. Le marqueur attaché aux hybrides d'essai et standard est mesuré et le résultat est comparé à des courbes d'étalonnage.De cette façon, le nombre de molécules d'acide nucléique à étudier peut être déterminé

par unité choisie.

La méthode de l'invention a un intérêt diagnostique pratique en particulier dans la détection de certains types de cancer. Dans le carcinome du poumon à petites cellules, le cène c-myc est souvent amplifié et son taux d'expression considérablement supérieur à celui qui est observé dans un tissu normal. Dans les cas de neuroblastomes, le gène N-myc

est amplifié.

La méthode de la présente inventicn peut aussi être utilisée pour mettre en évidence les effets mutagènes ou carcinogènes de certains agents, ou le développement de la

résistance à un médicament. On sait qu'une pression de sélec-

tion externe peut aboutir à l'expression accrue d'un certain aène. Dans le traitement du cancer, des cellules développent une résistance à un médicament donné par amplification du gène dont le produit d'expression inactive le médicament. Un tel cas est celui du méthotrexate qui induit une amplification du gene pour la dihydrofolate reductase (DHFR). Un autre exemple est celui de l'amplification du gène pour la métallothionine

sous l'influence du cadmium.

Le taux d'expression d'un gène est important du

point de vue du phénotype et du fonctionnement de la cellule.

On peut l'étudier en mesurant la quantité d'ARN messager qui

est en relation avec la quantité de protéine codée par celui-

ci. Le produit de transcription d'un oncogène détermine la

manière avec laquelle il sera finalement exprimé.

Les taux d'expression d'un oncogène varient en fonction du type de cellule, du taux de différenciation et de la phase de développement de la cellule. Par exemple, à un certain stade du développement foetal, l'oncogène c-myc est rapidement répliqué, tandis qu'à un autre stade, cela est très lent. Le degré d'amplification est souvent en corrélation avec

le taux d'expression du gène, bien que ce dernier puisse aug-

menter notablement sans que le premier n'augmente. Dans ces cas, le rôle d'un oncogène est mieux déterminé par la mesure

de son taux d'expression plutôt que du nombre de replication.

Dans certains cas, une détermination quantitative de l'ARN

messager peut être plus simple et plus commode que la quanti-

fication du gène lui-même. On peut mentionner à titre d'exemple, l'oncogène c-myc, une protéine labile facilement coagulée par

la chaleur.

La méthode de l'invention peut aussi être utilisée pour identifier des anomalies chromosomiques numériques comme le syndrome de Down. Dans des diagnostics prénataux, il est

aussi possible de déterminer si le foetus est anormal, c'est-à-

dire homozyaote pour un certain gène récessif.

La méthode de l'invention et les réactifs d'acide nucléique utilisés dans la méthode, sont davantage décrits ci-après.

Exemple 1

Quantification d'un oncogène amplifié.

a) Réactifs d'acide nucléique et leur préparation.

Sondes standards: Acide nucléique standard de cellule: Le gène c-Ki-rasI est présent dans toutes les cellules humaines. Les paires de sondes pour l'hybridation-sandwich ont été préparées par sous-clonage du fragment Hind III du gène c-Ki-rasI, qui a une longueur de 3,8 kb et dont la carte de restriction a été décrite par Chang et coll., PNAS 79, pp. 4848-52, 1982. Le fragment est disponible, par exemple cloné dans le plasmide pBR 322 (ATCC

41032) et peut être obtenu par exemple à partir de la collec-

tion de cultures ATCC.

-Traitement supplémentaire de l'acide nucléique standard de cellule. Le clone pBR 322 décrit plus haut a été traité avec les enzymes de restriction BglII et Hind III et les frag- ments résultants ont été isolés à partir du gel d'agarose; des fragments purifies situés dans un proche voisinage, ont

été sous-clonés dans deux vecteurs convenables pour la prépa-

ration des sondes de détection et de capture.

- Sonde de détection standard. Un fragment BglII-BglII mesurant environ 1, 1 kb de long a été sous-cloné dans le site de l'enzyme de restriction BamHI du plasmide pBR 322 et marqué

par nick-translation avec du dCTP marqué avec de 1'125I.

- Sonde de capture standard. Le fragment BglII - HindIII d'en-

viron 0,5 kb, a été inséré dans les vecteurs constitués par les phagres M13 mplO et mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction BamHI et HindIII et fixé à un

filtre de nitrocellulose (150 ng d'ADN/dia-1 cm).

Sondes d'essai.

- Acide nucléique d'essai. Une paire de sondes pour l'hybrida-

tion-sandwich a été préparée à partir d'un gène c-myc cloné qui peut être obtenu par exemple à partir de la collection de cultures ATCC (ATCC 41010) . La carte de restriction du gène

a été décrite par Watt et coll., PNAS 80, pp. 6307-6311, 1983).

- Traitement suDDlémentaire de l'acide nucléique d'essai.

Le qène c-myc a été traité avec les enzymes de restriction HindIII, XbaI et PstI et les fragments isolés à partir du gel

d'agarose, purifiés et sous-clonés dans des vecteurs conve-

nables, pour préparer les sondes de détection et de capture.

- Sonde de détection d'essai: les queues à brin unique du fragment de restriction HindIII-XbaI du gène c-myc, mesurant

3,7 kb de long, ont été rendues à double brin par l'ADN poly-

mérase. Les linkers HindIII ont été insérés par la T4-ADN-

liqase dans les fragments d'ADN à extrémités collantesrésul-

tants; après extraction par du phénol, l'ADN a été traité avec l'enzyme de restriction HindIII. Le fragment d'ADN a été ensuite cloné dans le plasmide pBR 322 au site de restriction

de l'enzyme de restriction HindIII et marqué par nick-

translation avec du dCTP marqué avec de 1'125,I.

- Sonde de capture d'essai: le fragment XbaI-PstI de 1,1 kb

du cane c-myc a été cloné dans les vecteurs de clonage cons-

titués par les phages M13 nmp0lO et mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction XbaI et PstI et fixé à

un filtre de nitrocellulose (150 ng d'ADN/dia. 1 cm).

b) Détermination de la courbe d'étalonnage.

L'échantillon utilisé pour la détermination de la courbe d'étalonnage consistait en un clone pBR 322 dénaturé

par un alcalin, du gène c-myc. La solution d'hybridation-

sandwich à laquelle ont été ajoutées les sondes d'essai ci-

dessus, consistait en 4 x SSC, 1 x solution de Denhardt,

ug/ml d'ADN de sperme de hareng et 0,2 % de SDS. L'hybri-

dation a eu lieu à 65 C pendant 17-19 heures, puis les filtres ont été lavés dans la solution de lavage (0,1 x SSC, 0,2 % de SDS) à 50 C. Le marqueur attaché aux hybrides-sandwich a été

ensuite compté dans un compteur gamma.

Tableau I

Echantillon cpm molécules/essai filtre c-myc

0 40

o106 75 x 106 190

107 340

108 2200

c) Détermination du nombre de gènes

Les échantillons comprenaient 1) des cellules pro-

venant d'un placenta humain et 2) des cellules colo 320, qui peuvent être obtenues par exemple à partir de la collection de cultures ATCC (ATCCCCC220). L'ADN a été isolé à partir des deux échantillons et la même quantité d'ADN de cellule, dénaturé par un alcalin à l'ébullition, a été ajoutée aux essais. La dénaturation alcaline a hydrolysétout l'ARN présent dans l'échantillon.

On a effectué l'essai en ajoutant à chaque échan-

tillon à la fois les filtres c-myc et c-Ki-rasI et les deux réactifs marqués, ce qui a permis de mesurer à la fois l'ADN d'essai et standard pour chaque échantillon. En fonction des

déterminations c-Ki-rasI, on a trouvé que chaque essai conte-

nait la même quantité d'ADN et on a pu-en déduire que le gène c-mvc dans les cellules colo 320 est présent selon un taux de replication 16 à 20 fois supérieur à celui qui est observé dans la situation normale. Les résultats sont indiqués dans

le Tableau II.

Tableau II

Echantillon filtre c-Ki-rasI Filtre c-myc cpm* cpm* nombre Cellules placentaires 7 humaines 486 340 10 Cellules colo 320 432 3205 1,6 x 108 la lecture obtenue pour le filtre à blanc a été soustraite

des lectures.

Exemple 2

Quantification de gène amplifié.

a) Réactifs d'acide nucléique et leur préparation.

Sondes standards.

- Acide nucléique standard de cellule: l'acide nucléique témo: a été pris dans la région du promoteur du gène métallothionine

chez la souris, c'est-à-dire le gène MT avec l'ADN immédia-

tement en amont de celui-ci. La structure du gène MT a été

décrite par Pavlakis and Hamer, PNAS 80, pp. 397-401, 1983.

Le fraqment d'acide nucléique de référence est disponible, par exemple, cloné dans le vecteur pBPV-MMneo(442-12) (ATCC 37224) et peut être obtenu par exemple à partir de la

collection de cultures ATCC.

- Traitement supplémentaire de l'acide nucléique standard de cellule. Le gène MT décrit plus haut a été traité avec les

enzymes de restriction KpnI, BglII et EcoRI pour le sous-

clonaqe dans le plasmide pAT153. La queue KpnI a été convertie

en queue Hind III avec un linker.

- Sonde de détection standard. Le fragment EcoRI-KpnI- ìndIII)

mesurant environ 1,2 kb et situé en amont de la région promo-

trice du gène métallothionine, a été cloné dans le plasmide

pATI53 entre les sites de restriction des enzymes de restric-

tion EcoRI et HindIII, et m a r q u é p a r nick-

translation avec des nucléosides triphosphates maraués avec

du 32p.

- Sonde de capture standard. Le fragment KpnI-BglII de 0,8 kb comprenant la région du promoteur du gène métallothionine et la récion en amont de celle-ci, a été cloné dans les vecteurs constitués par les phages M13 mpl8 et M13 mpl9 entre les sites de restriction des enzymes de restriction KpnI et BamHI et fixé

à un filtre de nitrocellulose.

Sondes d'essai.

- Acide nucléique d'essai. La paire de sondes pour le test d'hybridationsandwich a été préparée avec le plasmide pMTVdhfr disponible industriellement (Bethesda Research Laboratories, produit N 5369SS) dont la structure est décrite par Lee et

coll., Nature 294, pp. 228-232, 1981.

Traitement supplémentaire de l'acide nucléique d'essai.

Le plasmide pMTVdhfr contenant l'ADNc du gène pour la dihydro-

folate réductase (DHFR) a été traité avec les enzymes de

restriction HindIII et BglIi.

- Sonde de détection d'essai. Le fragment HindIII- BglII mesurant 0,75 kb et correspondant à la région codant pour le cène DHFR du plasmide pMTVdhfr a été inséré dans le vecteur constitué par le plasmide pAT153 entre les sites de restriction des enzymes de restriction HindIII et BamHI

et marqué par nick-translation avec des nucléoside-

triphosphates marqués avec du 32p.

- Sonde de capture d'essai.Un fragment HindIII mesurant

1,4 kb provenant de la région du gène MMTV du plasmide pMTV-

dhfr, a été cloné dans les vecteurs constitués par les phages

M13 mpl8 et M13 mpl9.

b) Détermination de la courbe d'étalonnage L'échantillon utilisé pour l'essai était de l'ADN purifié provenant du plasmide pMTVdhfr. L'essai lui-même a été effectué selon la procédure de l'Exemple lb, sauf qu'un compteur à scintillation liquide a été utilisé pour le comptag La courbe standard résultante est indiquée dans le Tableau III

Tableau III

Echantillon cpm molécules/essai Filtre DHFR

0 17

o106 45 3 x 106 79

107 210

c) Détermination du nombre de gènes Des lignées cellulaires provenant de cellule de fibroblaste de

souris NIH 3r3 (Collection de culture ATCC, CRL 1658), qui ont été trans-

fectées avec différentes quantités d'ADNc correspondant à l'ARNm du

gène DHFR, ont été cultivées sur des plaques de culture cel-

lulaire et utilisées comme échantillon. Les cellules ont été lysées avec du dodécylsulfate de sodium et leur ADN a été

cisaillé par compression à travers une fine aiguille hypoder-

mique depuis une seringue. Un échantillon de 250 pl correspon-

dant à environ 106 cellules a été prélevé de l'homoaénat et P1 de NaOH ont été ajoutés. L'échantillon a été chauffé à

ébullition et neutralisé avec de l'acide acétique et le mélan-

ge d'hybridation. Le volume total était de 0,5 ml. Toutes les sondes décrites plus haut ont été ajoutées simultanément et un filtre dit à blanc a été ajouté en tant que témoin de fond. L'hybridation, le lavage et le comptage du marqueur ont été

réalisés selon la procédure de l'Exemple lb, sauf qu'un comp-

teur à scintillation liquide a été utilisé pour le comptage.

Les résultats sont donnés dans le Tableau IV.

Tableau IV Cellule N de cel-i DHFR MT 0d lules dans pm*I N0 de molécules Nd - i dans l'échantillon COps lon Cellule témoin

(pas de DHFR-

ADNc) 182 1,05x106 21 < 106 Liqnée I 138 0,9 x106 80 3 x 106 3 Lianée II 210 1,25x106 732 5 x 107 40

cpm: la lecture obtenue avec le filtre à blanc a été soustraite.

Le gêne MT est un marqueur interne qui mesure le nombre de cellules présentes dans un échantillon. Les résultats montrent que dans ce test, 10 cellules ont donné un signal spécifique de MT de 165 + 20 cpm. Les réactifs DHFR mesurent la quantité de DHFR-ADNc. Le nombre de cellules a été déduit à partir du signal spécifique de MT. Il a été donc possible

de déterminer le nombre de copies de DHFR-ADNc dans différen-

tes lignées cellulaires, comme cela est montré dans le Tableau

IV.

Exemple 3

Quantification d'ARN messager.

a) Réactifs d'acide nucléique et leur préparation.

Il est aussi possible de mesurer la quantité d'ARNm dérivé de l'ADNc de DHFR avec les sondes d'essai décrites dans l'Exemple 2. La structure du plasmide pMTVdhfr est telle

* que la transcription du gène DHFR commence au promoteur MMTV.

Les messagers résultants ont une longueur d'environ 1,0 kb, dont environ 0,25 kb sont dérivés de la région promotrice MMTV et le reste de l'ADNc de DHFR (Lee et coll., Nature 294

pp. 228-232, 19811.

Sondes standards.

L'acide nucléique standard'de cellule, la sonde de détection standard et la sonde de capture standard étaient

tels que décrits dans l'Exemple 2.

Sondes d'essai.

L'acide nucléique d'essai, la sonde de détection d'essai et la sonde de capture d'essai étaient tels que décrits

dans l'Exemple 2.

b) Détermination de la courbe d'étalonnage.

L'échantillon utilisé pour la détermination de la courbe d'étalonnage consistait en ARN messager correspondant au qgne pour la dihydrofolate réductase produite par une transcription in vitro. L'ADN requis pour la transcription a été préparé par sous-clonage du fraqgmnent HindIII de 1,4 kb du promoteur MMTV du plasmide pMTVdhfr et du fragment HindIII BalII de 0,75 kb (ADNc de DHFR) voisins dans le plasmide pSP64 (Promeaa Biotec) entre les sites de restriction des enzymes de restriction HindIII et BamHI. L'ARN servant d'écha:

tillon a été stocké dans une solution aqueuse à 0,2 % de SDS.

Le test d'hybridation-sandwich a été conduit de la façon qui est décrite dans les Exemples lb et 2b, mais la

dénaturation a été omise.

Tableau V

Echantillon cpm molécules/essai filtre DHFR

0 20

x 106 65

107 130

x 107 390

108 653

c) Détermination du nombre de molécules d'ARN messager Le nombre de molécules d'ARN messager correspondant

au gène DHFR, a été déterminé à partir des lignées cellulai-

res décrites dans l'Exemple 2.

Les cellules ont été lysées avec du dodécylsulfate

de sodium et leur ADN a été cisaillé légèrement par compres-

sion à travers une fine aiguille hypodermique à partir d'une

seringue. Un échantillon de 250 pi du produit d'homogénéisa-

tion a été prélevé, correspondant à environ 5.106 cellules.

L'homoaénat a été ensuite ajouté au test d'hybridation-

sandwich sans dénaturation. L'hybridation-sandwich a eu lieu selon la procédure des Exemples 2c et lb, sauf que les seules sondes DHFR ont été ajoutées à la solution d'hybridation. On

a déterminé le nombre de cellules dans un échantillon paral-

lèle de 250 p1 d'homogénate avec la sonde MT telle que décrite dans l'Exemple 2c. Les résultats sont fournis dans le Tableau VI.Tableau VI

Nombre de cel-DHFR Cellule cpM lules dans 1' Nmbre de molé-- Nombre Pméchantillon cOm cules dans 1' I par échantillon cellule Lignée I 380 3, 5 x 10 1465 3,45 x 108 100 Lignée II 430 4,2 x 10 4800 2 x 109 500 1 0

cpm: la lecture obtenue avec le filtre à blanc a été sous-

traite. Les résultats ont montré que la lignée cellulaire I a produit par cellule environ 100 molécules d'ARNm à partir des qènes DHFR et que la lignée cellulaire II a produit

environ 500 molécules d'ARNm à partir des gènes DHFR.

Exemple 4

Quantification des gènes amplifiés par hybridation de la solution a) Reactifs d'acide nucleique et leur préparation

Sondes standards.

L'acide nucléique standard de cellule, la sonde de détection standard et la sonde de capture standard ont été

les mêmes que dans l'Example 2. Le fragment de 1,2 kb EcoRI-

KpnI-(HindIII) dans le plasmide pAT153 a étémarqué par nick-

translation avec de la déoxycytidine marquée à 1'125I. Les fragments de 0, 8 kb KpnI-BglII dans les plages M13 mpl8 et M13 mpl9 ont été modifiés par la biotine en utilisant le réactif PhotoprobeTM (Laboratoires Vector, CA, USA, produit

n SP-1000).

Sondes d'essai.

L'acide nucléique d'essai, la sonde de détection d'essai et la sonde de capture d'essai sont les mêmes que dans l'Exemple 2. Le fragment de 0,75 kb HindIII-BglII dans le plasmide pAT153 a été marqué avec de la déoxycytidine marquée à 1'125I. Les fragments de 1,4 kb HindIII dans les plages M13 mpl8 et M13 mpl9 ont été biotynilés en utilisant

le réactif PhotoprobeTM comme ci-dessus.

b) Détermination des courbes d'étalonnage Une courbe d'étalonnage de cellule a été préparée

en utilisant une quantité connue de cellules, à partir des-

quelles le signal d'hybridation a été mesuré en utilisant les

sondes standards reconnaissant le gène MT. Une courbe d'éta-

lonnage de l'acide nucléique d'essai a été préparée avec le plasmide pMTVdhfr et les sondes d'essai reconnaissant ce plasmide. Les hybridations ont été effectuées dans 200 1l d'une solution comprenant 0,6 M de NaCl, 20 mM de tampon

phosphate, à pH 7,5, 1 mM d'EDTA et 4 % de polyéthylène-

glycol (PEG 6000) pendant une heure et demie à 70 C. Après la réaction, 50 g1 d'agarose-streptavidine (Betheseda Research Laboratories, Maryland, USA, produit n 5942SA), et 1 M de NaCl, 10 mM de phosphate de sodium, à pH 7,5, 1 mM d'EDTA ont été ajoutés jusqu'à un volume final de

500 g1. Les hybrides ont été recueillis sur l'agarose-

streptavidine à 37 C pendant 15 minutes. L'agarose a été lavée une fois pendant 5 minutes avec la solution tamponnée avec 1 M de NaCl à 37 C et deux fois pendant 2 minutes avec

mM de NaCl, 1,5 mM de citrate de sodium à 55 C. La quan-

tité d'hybrides liés a été déterminée en mesurant l'agarose dans un compteur gamma (Syvânen et Coll., Nucleic Acids Res. 14, 5037-5048, 1986). Les résultats sont indiqués dans les

Tableaux VII et VIII.

TABLEAU VII

Echantillon cpm cellules/essai sondes MT 0,8 x 106 162 1,6 x 106 216 3 x 106 298

TABLEAU VIII

Echantillon cpm molécules/essai sondes DHFR

106 148

x 106 394 x 107 2240 c) Détermination du nombre de gènes Des échantillons de lignées cellulaires décrits dans l'Exemple 2 ont été traités de manière similaire, sauf que le volume par échantillon correspondant approximativement à 2 x 106 cellules était de 125 il. Les déterminations du nombre de cellules et du nombre de molécules d'acide

nucléique d'essai ont été effectuées dans des fioles diffé-

rentes en ajoutant l'échantillon de cellule, les sondes de

détection et de capture appropriées, et les composés du mé-

lange d'hybridation jusqu'à un volume final de 200 il. Les essais de contrôle sans l'étalonnage de cellule ou d'ADN d'essai ont été inclus. L'hybridation, la collection des hybrides, le lavage et la mesure ont été faits comme décrit dans l'Exemple 4b. Les résultats ont été lus à partir des courbes d'étalonnage en parallèle avec ce qui est décrit dans l'Exemple 4b. Les résultats sont indiqués dans le

Tableau IX.

TABLEAU IX

Cellule MT DHFR cpm No des cellu- cpm No desmolé- No. les dans l'é- cules dans des chantillon l'échantillon copies Cellule témoin 253 2,3 x 106 73 < 105 Lignée I 210 1,5 x 106 233 3,8 x 106 3 Lignée II 237 2,1 x 106 3059 8,8 x 107 42 * cpm: Les valeurs des essais témoins sans étalonnage de

cellule ou d'acide nucléique d'essai ont été déduites.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Méthode quantitative pour la détermination des

molécules d'acide nucléique par une méthode d'hybridation-

sandwich ou en solution, caractérisée en ce que le nombre de molécules d'acide nucléique donné par unité donnée est déter-

miné par comparaison du nombre des molécules d'acide nuclé-

ique d'essai potentiellement présentes dans plusieurs

copies dans l'unité, au nombre de molécules d'acide nuclé-

ique standard choisi avantageusement présentes en nombre

constant dans la môme unité.

2. Méthode suivant la revendication 1, caractéri-

sée en ce que les acides nucléiques présents dans l'échantil-

lon: a) sont mis si nécessaire sous une forme dans laquelle ils peuvent participer à la réaction d'hybridation; b) de quelconquesacides nucléiques perturbant éventuellement la réaction d'hybridation sont mis si nécessaire sous une forme dans laquelle ils ne peuvent pas interférer avec le test d'hybridation;

c) sont mis en contact, soit non-divisés, soit après division obli-

qatoire, avec au moins.une paire de sondes d'essai suffisamment homoloques de l'acide nucléique éventuellement présent dans plusieurs copies et avec au moins une paire de sondes standards choisies et convenables suffisamment homologues de la molécule d'acide nucléique avantageusement présent en nombre constant; les sondes de détection de cette paire de sondes d'essai et de cette paire de sondes standards sont marquées avec un marqueur détectable convenable et les sondes de capture ont été fixées à un support convenable o une substance a été fixée

aux sondes de capture, laquelle permet l'isolation des hybri-

des résultants; d) après réalisation de la ou des réactions d'hybridation, l'hybride d'essai et l'hybride standard sont séparés lorsque cela est nécessaire et le marqueur attaché est mesuré; le nombre de molécules d'acide nucléique par unité donnée est

obtenu par comparaison des nombres de molécules d'acide nuclé-

ique d'essai et standard.

3. Méthode suivant les revendications 1 et 2, carac-

térisée en ce que les acides nucléiques standard et d'essai sont des acides démxyribonucléiques.

4. Méthode suivant les revendications 1 et-2,

caractérisée en ce que l'acide nucléique d'essai est un acide ribonucléique et l'acide nucléique standard est un acide désoxyribonucléique.

5. Méthode suivant les revendications 1 et 2, carac-

térisée en ce que les acides nucléiques d'essai et standard

sont des acides ribonucléiques.

6. Méthode suivant les revendications 1 et 2, carac-

tériséeen ce que l'acide nucléique d'essai est un acide désoxyribonucléique et l'acide nucléique standard est un acide ribonucléique.

7. Méthode suivant les revendications 1, 2, 3 et 4,

caractérisée en ce que la sonde de détection de la paire de sondes standards - un plasmide recombinant comprenant un fragment BglII -BglII de 1,2 kb du fragment HindIII du gène humain c-Ki-rasI, ce fragment HindIII étant cloné dans

le plasmide pBR322 et ce fragment BglII -BglII étant sous-

cloné dans le site de restriction de l'enzyme de restriction BamHI du plasmide pBR322 - et les sondes de capture - des phases recombinants comprenant un fragment BglIIzHindIII de 0,5 kb du fragment HindIII du gène humain c-Ki-rasI, ce fraqment HindIII étant cloné dans le plasmide pBR322 et le fragment BglII -HindIII étant souscloné dans les vecteurs constitués par les phages M13 mplO et M13 mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction BamHI et HindIII - sont mises en contact, soit individuellement, soit avec la paire de sondes d'essai, avec un échantillon d'acide

nucléique non divisé ou divisé lorsque cela est nécessaire.

8. Méthode suivant les revendications 1, 2, 3 et

4, caractérisée en ce que la sonde de détection de la paire de sondes standards - un plasmide recombinant comprenant un fragment EcoRIKpnI(HindIII de 1,2 kb en amont de'la réqion promotrice du gène métallothionine de la souris, lequel fragment a étésous-cloné dans le plasmide pAT153 entre les sites de restriction des enzymes de restriction EcoRI

et HindIII - et les sondes de capture - des phages recombi-

nants comprenant un fragment KpnI-BglII de 0,8 kb provenant de la région promotrice du gène métallothionine et de la réqion en amont de celle-ci, lequel fragment a été sous-cloné dans les vecteurs constitués par les phages M13 mp18 etM13 mp19 entre les sites de restriction des enzymes de restriction KpnI et BamPI - sont misesen contact, soit individuellement, soit avec la paire de sondes d'essai avec un échantillon

d'acide nucléique non-divisé ou divisé, si cela est nécessaire.

9. Méthode suivant les revendications 1, 2, 3, 6,

7 et 8, caractérisée en ce que pour déterminer le degré d'am-

plification de l'oncogène c-myc et/ou le nombre de molécules

d'ARN messager correspondant à ce gène, la sonde de détec-

tion de la paire de sondes d'essai - un plasmide recombinant comprenant un fragment HindIII -XbaI de 3,7 kb du gène c-myc, ce fragment étant souscloné dans le plasmide pBR322 au site de restriction de l'enzyme de restriction HindIII - et les sondes de capture - des phages recombinants comprenant un fragment XbaI-PstI de 1,1 kb du gène c-myc, lequel fragment a été sous-cloné dans les vecteurs M13 mplO et M13 mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction XbaI et PstI - sont mises en contact, soit individuellement soit avec la paire de sondes standards, avec un échantillon d'acide

nucléique non-divisé ou divisé, si cela est nécessaire.

10. Méthode suivant les revendications 1,2, 3, 6,

7 et 8, caractérisée en ce que pour déterminer le degré d'ampli-

fication de la dihydrofolate réductase ou du gène DHFR et/ou le nombre de molécules d'ARN messager correspondant à ce gène,

la sonde de détection de la paire de sondes d'essai - un plas-

mide recombinant comprenant un fragment HindIII -BglI de 0,75 kb codant pour le gène DHFR du plasmide pMTidhfr, lequel fragment a été sous-cloné dans le vecteur constitué par le plasiide pAT153 entre les sites de restriction des enzymes de

restriction HindIII et BamHI - et les sondes de capture -

des phages recombinants comprenant un fragment HindIII de 1,4 kb de la région du gène MMTV du plasmide pMTVdhfr, lequel fragment a été souscloné dans les vecteurs constitués par les phaces M13 mp18 et M13 mpl9 au site de restriction de l'enzyme de restriction HindIII - sont mises en contact, soit individuellement, soit avec la paire de sondes standards, avec un échantillon d'acide nucléique non-divisé ou divisé si

cela est nécessaire.

11. Trousse de réactifs pour la détermination quantitative de molécules d'acide nucléique, caractérisée en ce que la trousse contient au moins une paire de sondes d'essai

et au moins une paire de sondes standards, les sondes de détec-

tion à la fois de la paire de sondes d'essai et de la paire

de sondes standards étant marquées avec un marqueur conve-

nable et les sondes de capture ayant été fixées à un support convenable ou bien une substance ayant été fixée aux sondes

de captures, permettant l'isolation des hybrides sandwich.

12. Trousse de réactifs suivant la revendication 11, caractérisée en ce que la sonde de détection de la paire de sondes d'essai utilisée pour la détermination du degré

d'amplification de l'oncogène c-myc et/ou du nombre de molé-

cules d'ARN messager correspondant à ce gène, est un plasmide recombinant comprenant un fragment de restriction HindII XbaI de 3,7 kb du gène c-mvc, lequel fragment a été sous-cloné dans le plasmide pBR322 au site de restriction de l'enzyme de restriction HindIII, et les sondes de capture sont des phages recombinants comprenant un fragment XbaI-PstI de 1,1 kb du gène c-myc, lequel fragment a été sous-cloné dans les vecteurs constitués par les phages M13 mplO et M13 mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction XbaI et PstI, et la sonde de détection de la paire de sondes standards est un fragment BglII-BglII de 1,1 kb du fragment HindIII du gène humain c-Ki-rasI, ce fragment HindIII ayant été cloné dans le plasmide pBR322 et le fragment BglII-BglII ayant été sous-cloné dans le plasmide pBR322 au site de restriction de l'enzyme de restriction BamHI, et les sondes de capture sont des phages recombinants comprenant un fragment BglII-HindIII

de 0,5 kb du fragment HindIII du gène c-Ki-rasI, ce frag-

ment HindIII ayant été sous-cloné dans le plasmide pBR322 du gène c-KirasI, et ce fragment BglII-HindIII ayant été sous-cloné dans les vecteurs constitués par les phages M13 mplO et M13 mpll entre les sites de restriction des enzymes

de restriction BamHI et HindIIT.

13. Trousse de réactifs suivant la revendication 11, caractérisée en ce que la sonde de détection de la paire de sondes d'essai utilisée pour la détermination du degré d'amplification de la dihydrofolate réductase ou du gène DHFR et/ou du nombre de molécules d'ARN messager correspondant à ce aène, est un plasmide recombinant comprenant un fragment

HindIII-BglII de 0,75 kb codant pour le gène DHFR du plas-

mide pMTVdhfr, lequel fragment a été sous-cloné dans le vec-

teur constitué par le plasmide pAT153 entre les sites de restric-

tion des enzymes de restriction HindIII et BamHI, et les sondes de capture sont des phages recombinants comprenant un fragment HindIII de 1, 4 kb de la région du gène MMTV du plasmide pMTVdhfr, lequel fragment a été sous-cloné dans les 2.5 vecteurs constitués par les phages M13 mp18 et M13 mpl9 au site de restriction de l'enzyme de restriction HindIII, et la sonde de détection de la paire de sondes standards est un plasmide recombinant comprenant un fragment EcoRI-KpnI

de 1,2 kb provenant de la région en amont de la région promo-

trice du gène métallothionine de la souris, lequel fragment a été souscloné dans le plasmide pAT153 entre les sites de restriction des enzymes de restriction EcoRI et HindIII, et les sondes de capture sont des phages recombinants comprenant un fragment KpnI-BglII de 0,8 kb du gène métallothionine formé par la région promotrice et la région en amont de

celle-ci, lequel fragment a été sous-cloné dans les vec-

teurs constitués par les phages M13 mpl8 et M13 mpl9 entre les sites de restriction des enzymes de restriction KpnI et BamHI.