CH675593A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nucleinsäure-Molekülen, insbesondere von amplifizierten Genen und/oder entsprechenden mRNA-Molekülen nach dem "sandwich"-oder "solution"-Hybridisierungs-Prinzip sowie den dafür benötigten Reagenziensatz. 



  Die Kopienzahl einzelner Gene im Genom ist in der Regel konstant. In einigen Fällen gibt es nur ein Gen, in anderen Fällen mehrere Gene pro haploidem Genom. Unter bestimmten Umständen kann sich jedoch die Kopienzahl ändern. Es wurde z.B. gefunden, dass die Amplifizierung von bestimmten Genen mit der Entwicklung von Krebs verknüpft ist. Es ist auch bekannt, dass äussere Faktoren, z.B. Arzneistoffe und Metalle, eine Amplifizierung von bestimmten Genen hervorrufen. Für die Entwicklung einer Krankheit spielt die fehlerhafte oder erhöhte Expressionsrate eines Gens und somit  die Menge der mRNA in der Zelle eine wichtige Rolle. Eine erhöhte Anzahl von einigen Chromosomen ist der Grund für bestimmte Erbkrankheiten oder andere Störungen, dagegen ist für die Ausbildung anderer Erbkrankheiten nur die Verdoppelung eines rezessiven Gens notwendig.

  In all diesen Fällen ist es wichtig, die Zahl der vorhandenen Chromosomen oder Gene zu bestimmen. 



  Die Anzahl von bestimmten DNA-Molekülen, z.B. der Grad der Amplifizierung von bestimmten Genen, wird gegenwärtig folgendermassen bestimmt: Die zu untersuchende DNA wird extrahiert, mit Hilfe von Restriktionsenzymen gespalten und die entstandenen Nucleotid-Fragmente werden entsprechend ihrer Länge in einer Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Anschliessend wird die einzelsträngige DNA auf ein Nitrocellulosefilter transferiert, fixiert und gegen eine radioaktiv markierte DNA hybridisiert. Als Hybridisierungsprobe werden das zu untersuchende Gen oder Teilbereiche davon verwendet. Die Ergebnisse werden durch Autoradiographie dargestellt; vgl. Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), 503-517. In jeder parallelen Analyse wird die gleiche Menge an zellulärer DNA eingesetzt.

  Die Intensitäten der Hybridisierungsbanden werden verglichen, und daraus werden die Verhältnisse zwischen den Kopienzahlen  der Gene, die in den Testproben untersucht werden, abgeleitet. Die Methode führt nur zu Näherungswerten. Ebenso wird die Menge an RNA mit der "Northern-blotting"- oder "dot-blotting"-Methode nur abgeschätzt. Alle diese Methoden erlauben keine genauen quantitativen Aussagen; vgl. Thomas, Methods in Enzyml., Bd. 100 (1983), 255-266. 



  Die bekannten Methoden, wie die "Southern"- und "Northern-blotting"-Methode, sind langsam und schwer durchzuführen. Da sie nur Näherungswerte liefern, ist ihr diagnostischer Wert in jenen Fällen zweifelhaft, in denen es wichtig ist, die Anzahl bestimmter Nucleinsäure-Moleküle pro gegebener Einheit, z.B. pro Zelle, zu kennen. Die "sandwich"- oder  "solution"-Hybridisierungs-Methoden, die in der US-PS 4 486 539 und der GB-OS 2 169 403 beschrieben sind, sind dagegen quantitativ; vgl. Virtanen et al., Lancet 1 (1983), 381-383. 



  Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine genaue, schnelle und quantitative Methode zur Bestimmung von Nucleinsäure-Molekülen zu entwickeln, die rascher und einfacher durchzuführen ist als die bekannten Methoden. Diese Methode soll sich sowohl zur Krebs- wie auch zur pränatalen Diagnostik eignen. Sie soll sich ferner zum Nachweis von Stoffen eignen, die eine Gen-Amplifikation hervorrufen, ferner zum Nachweis der Entwicklung einer Arzneistoff-Resistenz und zur Bestimmung des Expressionswertes von mRNA. Das Verfahren der Erfindung erfordert eine Standard-Nucleinsäure mit konstanter Kopienzahl. Es eignet sich zur Bestimmung der Anzahl von Nucleinsäure-Molekülen pro Einheit, z.B. einer Zelle, eines Zellkerns, Ribosoms oder Chromosoms. 



  Das erfindungsgemässe Verfahren ist im Patentanspruch 1 und ein Reagenziensatz zur Durchführung des Verfahrens ist im Patentanspuch 12 definiert. 



  Die Bestimmung der Test- und Standard-Nucleinsäuren wird entweder nach der üblichen "sandwich"-Hybridisierungs-Methode, wie sie z.B. in der US-PS 4 486 539 beschrieben ist, oder nach der "solution"-Hybridisierungs-Methode durchgeführt, die in der GB-OS 2 169 403 beschrieben ist. Die Erfindung betrifft ferner einen Reagenziensatz, der die Nucleinsäure-Proben enthält. Die Nucleinsäure-Proben bestehen dabei zumindest aus einem Paar von Test-Nucleinsäuren und einem Paar von Standard-Nucleinsäuren. 



  Die Nucleinsäure-Proben, die im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, werden durch DNA-Rekombinationstechnik aus Nucleinsäuren hergestellt, die genügend homologe Bereiche zu den Test- und Standard-Nucleinsäuren besitzen. Genügend homologe Nucleinsäuren können sowohl synthetisch als auch halbsynthetisch hergestellt werden. 



  Die Test- und Standard-Nucleinsäuren können unmittelbar aus Zellen isoliert und durch verschiedene Hybridisierungs-Techniken identifiziert werden. Solche Test- und Standard-Nucleinsäuren sind jedoch auch käuflich und von verschiedenen Gen-Bibliotheken zu beziehen. Test- und Standard-Nucleinsäuren können entweder DNA- oder RNA-Moleküle sein. 



  Proben-Paare, die für die "sandwich"- oder "solution"-Hybridisierungs-Methode geeignet sind, werden mittels der DNA-Rekombinationstechnik aus Nucleinsäuren hergestellt, die genügend homologe Bereiche zu den Test- und Standard-Nucleinsäuren besitzen. Die Nucleinsäuren werden dazu mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten. Von den erhaltenen Restriktionsfragmenten werden mindestens zwei, die in dem ungespaltenen Nucleinsäure-Molekül relativ nahe beieinanderliegen, in mindestens zwei geeignete Vektoren kloniert. Das eine Fragment, die "Detektor"-Probe, wird mit einem geeigneten, erkennbaren Marker gekoppelt, während das andere Fragment, die "capturing"-Probe, entweder an einen geeigneten Carrier oder an eine passende Substanz gebunden wird.

  Diese Substanz ist z.B. komplementär zu einer weiteren Substanz, so dass sich Affinitäts-Paare ausbilden, und mit Hilfe dieser Paare die entstandenen Hybride von der Hybridisierungs-Mischung abgetrennt werden können. 



  Die Test- und Standard-Proben-Paare können zusammen in einem geeigneten Reagenziensatz vorliegen, in dem beide, die Test- und Standard-Probenpaare entweder nur aus DNA oder RNA bestehen. Auch ist es möglich, dass das Test-Probenpaar als DNA  und das Standard-Probenpaar als RNA oder umgekehrt vorliegen. Die Vor- und Weiterbehandlung der Proben vor der Hybridisierung und die Hybridisierungsbedingungen selbst werden daher so gewählt, dass sie den in dem Test eingesetzten Proben-Paaren entsprechen. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist besonders geeignet zur Bestimmung der Zahl von Nucleinsäure-Molekülen aus homogenisiertem Zellmaterial. Das Verfahren kann natürlich auch benutzt werden, um gereinigte oder reine Nucleinsäuren zu bestimmen. Es sollte jedoch vor der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens die am besten geeignete Vorbehandlung der Nucleinsäure-Probe ausgewählt werden. 



  Es ist möglich, mit dem erfindungsgemässen Verfahren sowohl DNA- als auch RNA-Bestimmungen durchzuführen. Desoxyribonucleinsäuren werden gegebenenfalls denaturiert, um Einzelstränge zu erhalten. Einzelsträngige mRNA-Moleküle, die möglicherweise den Hybridisierungs-Test stören, können hydrolysiert werden, z.B. durch Kochen unter alkalischen Bedingungen. Die Probe wird für Ribonucleinsäure-Bestimmungen nicht denaturiert, da doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure nicht die Bestimmung von RNA stört. Es ist natürlich auch möglich, die DNA mit Desoxyribonucleasen zu zerstören oder die DNA chemisch oder mechanisch so zu verändern, dass sie nicht mehr in die Hybridisierungs-Reaktion eingreifen kann. Deshalb muss bei DNA- und RNA-Bestimmungen eine geeignete Methode für die Weiterbehandlung der Probe gewählt werden, oder alternativ muss diese Weiterbehandlung weggelassen werden.

  Die Wahl einer geeigneten Methode für die Weiterbehandlung ist natürlich abhängig von jener Methode, die für die einleitende Behandlung der Nucleinsäure-Probe verwendet wurde. Zahlreiche Methoden sind in der Literatur für die Vor- und Weiterbehandlung der Nucleinsäure-Proben beschrieben worden, so dass in jedem Fall die am besten geeignete Methode ausgewählt werden kann. Bestimmungen, in denen sowohl die Test- als auch die  Standard-Nucleinsäuren entweder als DNA oder RNA vorliegen, können in einer nichtgetrennten Probe durchgeführt werden. Bestimmungen, in denen die Test-Nucleinsäuren als DNA und die Standard-Nucleinsäuren als RNA oder umgekehrt vorliegen, müssen in einer getrennten Probe durchgeführt werden, da für die Weiterbehandlung verschiedene Methoden notwendig sind.

  Die Probe kann natürlich getrennt werden, selbst wenn die Test- und Standard-Nucleinsäuren vom gleichen Nucleinsäure-Typ sind. 



  Der Hybridisierungs-Test selbst wird durchgeführt, in dem die nichtgetrennte Probenlösung gleichzeitig in Kontakt gebracht wird mit zumindest einem Test-Probenpaar und einem Standard-Probenpaar. Wurde die Probenlösung allerdings getrennt, so wird sie getrennt in Kontakt gebracht mit zumindest einem Test-Probenpaar und einem Standard-Probenpaar. In diesen Fällen wird die Mengenbestimmung der Test-Nucleinsäuren in einem Reaktionsgefäss und die Mengenbestimmung der Standard-Nucleinsäure in einem anderen Reaktionsgefäss durchgeführt. 



  Unabhängig davon, ob die Probe geteilt oder ungeteilt ist, kann die Hybridisierung unter den günstigsten Bedingungen jedesmal stattfinden. Nach Ablauf der Hybridisierungs-Reaktion werden die entstandenen Test- und Standard-Hybride von der Hybridisierungsmischung abgetrennt. Dann werden die Test- und Standard-Hybride an einen Carrier oder an eine geeignete Substanz gebunden bzw. gekoppelt. Diese Substanz ist komplementär zu einer weiteren Substanz, so dass sich Affinitäts-Paare ausbilden, die dann isoliert werden könren. Der an den Test- und Standard-Hybriden gebundene Marker wird dann gemessen, und die Ergebnisse werden mit jenen der Standardkurven verglichen. Auf diese Weise kann die Anzahl der zu untersuchenden Nucleinsäure-Moleküle pro gewählte Einheit bestimmt werden.

  Das Verfahren der Erfindung besitzt praktischen diagnostischen Wert, besonders in der Erkennung einiger  Arten von Krebs. Im kleinen Lungenzell-Karzinom ist das c-myc-Gen oft amplifiziert und sein Expressionslevel bedeutend höher als im normalen Gewebe. Im Falle von Tumoren des Nervengewebes findet man ein amplifiziertes N-myc-Gen. 



  Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch dazu verwendet werden, um die mutagene oder karzinogene Wirkung von bestimmten Stoffen oder die Entwicklung von Arzneistoff-Resistenzen aufzuzeigen. Es ist bekannt, dass ein äusserer Selektionsdruck zu einer erhöhten Expression eines bestimmten Gens führen kann. Bei der Behandlung von Krebs entwickeln Zellen eine Resistenz gegen den eingesetzten Arzneistoff, indem sie jenes Gen amplifizieren, dessen Expressionsprodukt den Arzneistoff inaktiviert. Ein solcher Fall liegt bei Methotrexat vor, das die Amplifizierung des Dihydrofolat-Reduktase-Gens (DHFR) induziert. Ein weiteres Beispiel ist die Amplifizierung des Metallothionein-Gens unter dem Einfluss von Cadmium. 



  Der Expressionslevel eines Gens ist wichtig hinsichtlich des Phänotyps und der Funktion der Zelle. Dies kann durch die Mengenbestimmung der mRNA untersucht werden, da die mRNA-Menge mit der Menge des Translationsproduktes korreliert. Das Transkriptionsprodukt eines Onkogens bestimmt den Umfang, in dem es letztlich exprimiert wird. 



  Der Expressionslevel eines Onkogens variiert in Abhängigkeit vom Zelltyp, der Zelldifferenzierung und der Entwicklungsphase der Zelle. Zum Beispiel wird in einer bestimmten Phase der fötalen Entwicklung das c-myc-Onkogen rasch abgeschrieben, während dies in einer anderen Phase sehr langsam geschieht. Der Grad der Amplifizierung korreliert oft mit dem Expressionslevel des Gens, obwohl der Expressionslevel auch deutlich ohne Amplifizierung des Gens zunehmen kann. In solchen Fällen wird die Rolle eines Onkogens am besten dadurch bestimmt, dass nicht die Gen-Kopienzahl, sondern der Expressionslevel gemessen wird. In einigen Fällen kann die  quantitative Bestimmung der mRNA einfacher und nützlicher sein, als die Mengenbestimmung des Gens selbst. Als ein Beispiel kann man hier das c-myc-Onkogen anführen, das ein labiles Protein ist und das bei Hitze schnell verklumpt. 



  Das erfindungsgemässe Verfaren kann auch dazu benutzt werden, um numerische Abnormalitäten der Chromosomen, wie das "Down-Syndrom" zu erkennen. Ebenso kann das erfindungsgemässe Verfahren zur pränatalen Diagnose benutzt werden, um festzustellen, ob der Fötus anormal ist, ob er z.B. homozygot für ein rezessives Gen ist. 



   Die Beispiele erläutern die Erfindung. 


 Beispiel 1 
 


 Quantitative Bestimmung eines amplifizierten Onkogens 
 


 a) Nucleinsäure-Proben und ihre Herstellung  Standard-Proben 
 


 Zell-Standard-Nucleinsäure 
 



  Das cKi-ras I Gen ist in allen humanen Zellen vorhanden. Die Proben-Paare für die "sandwich"-Hybridisierung wurden hergestellt, indem das 3,8 kb Hind III-Fragment des c-Ki-ras I Gens subkloniert wurde. Die Restriktionskarte des Hind III-Fragments wurde von Chang et al., PNAS 79 (1982), 4848-4852 veröffentlicht. Das Fragment liegt kloniert in pBR 322 vor (ATCC 41 032). Es kann von der ATCC- Kultursammlung bezogen werden. 


 Weitere Behandlung der Zell-Standard-Nucleinsäure 
 



  Der vorstehend beschriebene pBR 322 Klon wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl II und Hind III gespalten und die entstandenen Fragmente wurden aus dem Agarose-Gel isoliert. Gereinigte Fragmente, die in dem ungespaltenen DNA-Molekül relativ nahe beieinanderliegen, wurden in zwei geeigneten  Vektoren zur Herstellung von "Detektor"- und "capturing"-Proben subkloniert. 


 Standard "Detektor"-Probe 
 



  Ein 1,1 kb grosses Bgl II-Bgl II-Fragment wurde in der Bam HI Restriktionsstelle von pBR 322 subkloniert. Das entstandene Plasmid wurde in einer Nicktranslation durch <1><2><5>J-dCTP radioaktiv markiert. 


 Standard "capturing"-Probe 
 



  Das etwa 0,5 kb grosse Bgl II-Hind III-Fragment wurde in die Restriktionsstellen Bam HI und Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 10 und mp 11 ligiert. Die entstandenen DNA-Moleküle wurden an ein Nitrocellulosefilter gebunden (150 ng DNA/1 cm). 


 Test-Proben 
 


 Test-Nucleinsäure 
 



  Von einem klonierten c-myc Gen, das man beispielsweise von der ATCC Kultursammlung (ATCC 41 010) beziehen kann, wurde ein Probenpaar für die "sandwich"-Hybridisierung hergestellt. Die Restriktionskarte des Gens wurde von Watt et al., PNAS 80 (1983), 6307-6311, beschrieben. 


 Weitere Behandlung der Test-Nucleinsäure 
 



  Das c-myc-Gen wurde durch die Restriktionsenzyme Hind III, XbaI und PstI gespalten und die erhaltenen Fragmente wurden aus dem Agarosegel isoliert, gereinigt und zur Herstellung von "Detektor"- und "capturing"-Proben in geeignete Vektoren subkloniert. 


 Test "Detektor"-Probe 
 



  Die einzelsträngigen Enden des 3,7 kb grossen Hind III-XbaI-Fragments aus dem c-myc-Gen wurden durch die Behandlung mit DNA-Polymerase wieder doppelsträngig gemacht. An das entstandene stumpfendige DNA-Fragment wurden mit Hilfe  der T4-DNA-Ligase Hind III-Linker geknüpft. Nach einer Extraktion mit Phenol wurde das DNA-Fragment mit Hind III nachgeschnitten und schliesslich in die Hind III Stelle von pBR 322 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde in einer Nicktranslation durch <1><2><5>J-dCTP radioaktiv markiert. 


 Test "capturing"-Probe 
 



  Das 1,1 kb grosse XbaI-PstI-Fragment des c-myc Gens wurde in die XbaI und PstI Restriktionsstellen der Phagen-Vektoren M 13 mp 10 und mp 11 ligiert. Die entstandenen DNA- Moleküle wurden an ein Nitrocellulosefilter gebunden (150 ng DNA/1 cm). 


 b) Bestimmung der Standardkurve 
 



  Die Probe, die zur Bestimmung der Standardkurve verwendet wurde, bestand aus einem durch alkalische Bedingungen der naturierten pBR 322 Klon, der als Insert das c-myc Gen trug. Die "sandwich"-Hybridisierungs-Lösung, der die Test-Proben zugegeben wurden, bestand aus 4 x SSC, 1 x Denhardt-Lösung, 200  mu g/ml Hering-Sperma-DNA und 0,2% SDS. Die Hybridisierungs-Reaktion erfolgte bei 65 DEG C während eines Zeitraums von 17 bis 19 Stunden. Anschliessend wurden die Filter bei 50 DEG C in 0,1 x SSC, 0,2% SDS gewaschen. Der an den "sandwich"-Hybriden gebundene Marker (Radioaktivität) wurde in einem Gamma-Zähler bestimmt.

  Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Tabelle I 
<tb>Head Col 01 AL=L: Probe
Moleküle/Test 
<tb>Head Col 02 AL=L: cpm
c-myc-Filter 
<tb> <SEP>0 <SEP>40 
<tb> <SEP>10<6> <SEP>75 
<tb> <SEP>5 x 10<6> <SEP>190 
<tb> <SEP>10<7> <SEP>340 
<tb> <SEP>10<8> <SEP>2200 
<tb></TABLE> 


 c) Bestimmung der Zahl der Gene 
 



  Die Proben enthalten Zellen von (1) einer menschlichen Plazenta und (2) Colo 320 Zellen, die man von der ATCC-Kultursammlung (ATCC-CCL220) beziehen kann. Die DNA wurde von beiden Proben isoliert und gleiche Mengen davon wurden unter alkalischen Bedingungen durch Kochen denaturiert und anschliessend den beiden Test-Ansätzen zugegeben. Durch die alkalische Denaturierung wird die in der Probe vorhandene RNA hydrolysiert. 



  Der Test wurde durchgeführt, indem zu jeder Probe die beiden c-myc und c-Ki-rasI-Filter und die beiden (radioaktiv) markierten Nucleinsäuren zugegeben wurden. Damit konnten für jede Probe die Standard- und Test-DNAs gemessen werden. Aufgrund der c-Ki-rasI-Bestimmungen wurde deutlich, dass jeder Test-Ansatz die gleiche Menge an DNA enthält. So kann man folgern, dass das c-myc Gen in Colo 320 Zellen in 16- bis 20-fach höheren Kopienzahlen vorliegt als in dem normalen Gewebe.

  Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=4 
<tb>Title: Tabelle II 
<tb>Head Col 01 AL=L: Probe 
<tb>Head Col 02 AL=L: c-Ki-rasI Filter 
<tb>Head Col 03 to 04 AL=L: c-myc-Filter 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>cpm*: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>cpm*: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Anzahl: 
<tb> <SEP>Menschliche Plazenta-Zellen <SEP>486 <SEP>340 <SEP>10<7> 
<tb> <SEP>Colo 320 Zellen <SEP>432 <SEP>3205 <SEP>1.6 x 10<8> 
 Anm.: *) cpm-Werte des leeren Nitrocellulosefilters ("background", Hintergrund) wurden subtrahiert.
  
<tb></TABLE> 


 Beispiel 2 
 


 Quantitative Bestimmung eines amplifizierten Gens 
 


 a) Nucleinsäure-Proben und ihre Herstellung 
 


 Standard-Proben 
 


 Zell-Standard-Nucleinsäure 
 



  Als Kontroll-DNA wurden jene Sequenzen des Maus-Metallothionein Gens (MT Gen) verwendet, die den Promotor- und den direkt anschliessenden "upstream"-Bereich umspannen. Die Struktur des MT Gens wurde durch Pavlakis und Hamer, PNAS 80 (1983), 397-401, beschrieben. Das Referenz-Nucleinsäure-Fragment liegt kloniert in dem pBPV-MMTneo (342-12) Vektor vor (ATCC 37 224) und kann von der ATCC Kultursammlung bezogen werden. 


 Weitere Behandlung der Zell-Standard-Nucleinsäure 
 



   Das vorstehend beschriebene MT Gen wurde zur Subklonierung in dem Plasmid pAT 153 mit den Restriktionsenzymen KpnI, BglII urd Eco RI gespalten. Die KpnI-Enden wurden durch einen Linker in Hind III-Enden überführt. 


 Standard "Detektor"-Probe 
 



  Das 1,2 kb grosse Eco RI-KpnI (Hind III)-Fragment, das aus dem "upstream"-Bereich des Metallothionein-Gen Promotors stammt, wurde in die Restriktionsstellen Eco RI und Hind III des Plasmids pAT 153 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde in einer Nicktranslation durch <3><2>P-dNTP's radioaktiv markiert. 


 Standard "capturing"-Probe 
 



  Das 0,8 kb grosse KpnI-Bgl II-Fragment, das den Promotor und den direkt anschliessenden "upstream"-Bereich des Metallothionein-Gens umfasst, wurde in den Restriktionsstellen  KpnI und Bam HI der Phagenvektoren M13 mp 18 und M 13 mp 19  kloniert. Die entstandenen DNA-Moleküle wurden an ein Nitrocellulosefilter gebunden. 


 Test-Proben 
 


 Test-Nucleinsäure 
 



  Zur Herstellung des Probenpaares für die "sandwich"-Hybridisierung wurde das käufliche Plasmid pMTVdhfr (Bethesda Research Laboratories, Produkt-Nr. 5369 SS) verwendet. Die Struktur dieses Plasmids wurde von Lee et al., Nature 294 (1981), 228-232 beschrieben. 


 Weitere Behandlung der Test-Nucleinsäure 
 



  Das pMTVdhfr-Plasmid, das die cDNA des Dihydrofolat-Reduktase Gens (DHFR) besitzt, wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III und Bgl II gespalten. 


 Test "Detekor"-Probe 
 



  Das 0,75 kb grosse Hind III-Bgl II-Fragment, das den Bereich des DHFR-Gens in dem Plasmid pMTVdhfr umfasst, wurde in die Restriktionsstellen Hind III und Bgl II des Vektors pAT 153 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde in einer Nicktranslation durch <3><2>P-dNTP's radioaktiv markiert. 


 Test "capturing"-Probe 
 



  Ein 1,4 kb grosses Hind III-Fragment aus dem MMTV-Genbereich des Plasmids pMTVdhfr wurde in den Phagenvektoren M 13 mp 18  und M 13 mp 19 kloniert. 


 b) Bestimmung der Standardkurve 
 



  Die Probe, die zur Bestimmung der Standardkurve verwendet wurde, war gereinigte DNA des pMTVdhfr Plasmids. Der Test wurde so durchgeführt, wie er im Beispiel 1 b) beschrieben wurde, allerdings wurde abweichend dazu ein Flüssigkeits-Szintillations-Zähler zur Bestimmung der Radioaktivität benutzt. Die entstandene Standardkurve ist in Tabelle III wiedergegeben. 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Tabelle III 
<tb>Head Col 01 AL=L: Probe
Moleküle/Test 
<tb>Head Col 02 AL=L: cpm
DHFR-Filter 
<tb> <SEP>0 <SEP>17 
<tb> <SEP>10<6> <SEP>45 
<tb> <SEP>3 x 10<6> <SEP>79 
<tb> <SEP>10<7> <SEP>210 
<tb></TABLE> 


 c) Bestimmung der Anzahl von Genen 
 



  Maus-Fibroblast-Zellen (NIH 3T3; ATCC Nr. CRL 1658), die mit verschiedenen Mengen von DHFR-cDNA transfiziert worden waren, wurden auf Zellkultur-Platten gehalten und als Proben verwendet. Die Zellen wurden durch SDS lysiert und ihre DNA geschert, indem sie durch eine feine Nadel einer Spritze für subkutane Injektion gedrückt wurde. Eine 250  mu l Probe mit etwa 10<6> Zellen wurde von dem Homogenat genommen und mit 50  mu l Natronlauge versetzt. Die Probe wurde gekocht und mit Essigsäure und der Hybridisierungsmischung neutralisiert. Das Gesamtvolumen belief sich auf 0,5 ml. Die gesamten, vorstehend beschriebenen Proben wurden gleichzeitig in die Hybridisierungs-Reaktion eingesetzt. Als "background"-Kontrolle wurde ein "leeres" Nitrocellulosefilter zugesetzt.

  Die Hybridisierung, der Waschvorgang und die Bestimmung der Radioaktivität wurde gemäss Beispiel 1 b) durchgeführt, mit der Ausnahme, dass für die Radioaktivität-Messung ein Flüssigkeits-Szintilations-Zähler benutzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Title: Tabelle IV 
<tb>Head Col 01 AL=L: Zelle 
<tb>Head Col 02 AL=L: MT 
<tb>Head Col 03 AL=L: Anzahl der Zellen in der Probe 
<tb>Head Col 04 to 06 AL=L:

  DHFR 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>cpm*: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>cpm*: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>Zahl der Moleküle in der Probe: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>Zahl der Kopien: 
<tb> <SEP>Kontrollzelle
(keine DHFR-cDNA) <SEP>182 <SEP>1.05 x 10<6> <SEP>21 <SEP>&lt 10<6> <SEP>- 
<tb> <SEP>Linie I <SEP>138 <SEP>0.9 x 10<6> <SEP>80 <SEP>3 x 10<6> <SEP>3 
<tb> <SEP>Linie II <SEP>210 <SEP>1.25 x 10<6> <SEP>732 <SEP>5 x 10<7> <SEP>40 
 Anm.: *) cpm-Werte des leeren Nitrocellulosefilters ("background") wurden subtrahiert.
  
<tb></TABLE> 



  Das Metallothionein-Gen (MT Gen) ist ein interner Marker, der die Anzahl der Zellen in einer Probe misst. Die Ergebnisse zeigen, dass in diesem Test 10<6> Zellen ein MT-spezifisches Signal von 165 + 20 cpm ergeben. Die DHFR-Proben messen die Menge der DHFR-cDNA. Die Anzahl der Zellen wurde von dem MT-spezifischen Signal hergeleitet. Es war so möglich, die Zahl der DHFR-cDNA-Kopien in den verschiedenen Zellinien, wie in Tabelle IV gezeigt, zu bestimmen. 


 Beispiel 3 
 


 Quantitative Bestimmung der mRNA 
 


  a) Nucleinsäure-Proben und ihre Herstellung 
 



  Benutzt man die in Beispiel 2 beschriebenen Test-Proben, so ist es auch möglich, die Menge der mRNA, die von der DHFR-cDNA abgeschrieben wird, zu messen. Das pMTVdhfr-Plasmid ist so konstruiert, dass die Transkription des DHFR-Gens an dem MMTV-Promotor beginnt. Die entstandenen mRNAs besitzen eine Länge von etwa 1,0 kb. Davon stammen etwa 0,25 kb von dem MMTV Promotorbereich und der Rest  von der DHFR-cDNA ab; vgl. Lee et al., Nature 294 (1981), 228-232. 


 Standard-Proben 
 



  Als Zell-Standard-Nucleinsäure, Standard-"Detektor"- und Standard "capturing"-Probe wurden jene verwendet, die in Beispiel 2 beschrieben sind. 


 Test-Proben 
 



  Als Test-Nucleinsäure, Test-"Detektor"- und Test-"capturing"-Probe wurden ebenfalls jene verwendet, die in Beispiel 2 beschrieben sind. 


 b) Bestimmung der Standardkurve 
 



  Zur Bestimmung der Standardkurve wurde jene Probe verwendet, die infolge der in vitro Transkription des Dihydrofolat-Reduktase-Gens die entsprechende mRNA besitzt. Die für die Transkription verwendete DNA wurde hergestellt, indem das 1,4 kb Hind III-Fragment des MMTV Promotors aus dem Plasmid pMTVdhfr zusammen mit dem 0,75 kb Hind III-Bgl II-Fragment (DHFR-cDNA) in den Restriktionsstellen Hind III und Bam HI des Plasmids pSP64 (Promega Biotec) subkloniert wurden. Die Proben-RNA wurde in wässriger 0,2% SDS-Lösung aufbewahrt. Der "sandwich"-Hybridisierungs-Test wurde in der Weise durchgeführt, wie er in den Beispielen 1 b) und 2 b) beschrieben wurde, lediglich die Denaturierung wurde weggelassen.

   Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Tabelle V 
<tb>Head Col 01 AL=L: Probe
Moleküle/Test 
<tb>Head Col 02 AL=L: cpm
DHFR-Filter 
<tb> <SEP>0 <SEP>20 
<tb> <SEP>5 x 10<6> <SEP>65 
<tb> <SEP>10<7> <SEP>130 
<tb> <SEP>5 x 10<7> <SEP>390 
<tb> <SEP>10<8> <SEP>635 
<tb></TABLE> 


 c) Bestimmung der Anzahl von mNRA-Molekülen 
 



  Die Anzahl der mRNA-Moleküle, die durch Transkription des DHFR-Gens entstanden, wurde in der in Beispiel 2 beschriebenen Zellinie bestimmt. 



  Die Zellen wurden durch SDS lysiert und ihre DNA leicht geschert, indem sie durch eine feine Nadel einer Spritze für subkutane Injektion gedrückt wurde. Eine 250  mu l Probe mit etwa 5 x 10<6> Zellen wurde von dem Homogenat genommen. Das Homogenat wurde dann ohne Denaturierung in den "sandwich"-Hybridisierungs-Test eingesetzt. Die "sandwich"-Hybridisierung wurde durchgeführt, wie in Beispiel 2 c) und 1 b) beschrieben, mit der Ausnahme, dass lediglich die DHFR-Proben der Hybridisierungs-Lösung zugesetzt wurden. In einer Parallelprobe von 250  mu l Homogenat wurde die Zellzahl bestimmt, indem die in Beisplel 2 c) beschriebene Metallothionein-Probe verwendet wurde.

  Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Title: Tabelle VI 
<tb>Head Col 01 AL=L: Zelle 
<tb>Head Col 02 AL=L: MT 
<tb>Head Col 03 AL=L: Zellzahl in der Probe 
<tb>Head Col 04 to 06 AL=L: DHFR 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>cpm*: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>cpm*: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>Zahl der Moleküle in der Probe: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>Anzahl pro Zelle: 
<tb> <SEP>Linie I <SEP>380 <SEP>3.5 x 10<6> <SEP>1465 <SEP>3.45 x 10<8> <SEP>100 
<tb> <SEP>Linie II <SEP>430 <SEP>4.2 x 10<6> <SEP>4800 <SEP>2 x 10<9> <SEP>500 
 Anm.: *) cpm-Werte des leeren Nitrocellulosefilters ("background") wurden subtrahiert.
  
<tb></TABLE> 



  Die Ergebnisse zeigen, dass pro Zelle der Linie I nur etwa 100 mRNA-Moleküle von den DHFR-Genen abgeschrieben werden,  dass aber pro Zelle der Linie II etwa 500 dieser mRNA-Moleküle gebildet werden. 


 Beispiel 4 
 


 Bestimmung der Anzahl der amplifizierten Gene durch "solution"-Hybridisierung 
 


 a) Nucleinsäure-Proben und ihre Herstellung 
 


 Standard-Proben 
 



  Als Zell-Standard-Nucleinsäure, Standard-"Detektor"- und Standard-"capturing"-Probe wurden jene verwendet, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Das 1,2 kb grosse Eco RI-KpnI (Hind III)-Fragment im Plasmid pAT 153 wurde in einer Nicktranslation durch <1><2><5>JdCTP radioaktiv markiert. Die 0,8 kb grossen KpnI-Bgl II-Fragmente in den Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 wurden mit Biotin unter Verwendung des Photoprobe <TM>-Reagens (Vector Laboratories, CA, USA, Produkt-Nr. SP-1000) modifiziert. 


 Test-Proben 
 



  Als Test-Nucleinsäure, Test-"Detektor"- und Test-"capturing"-Probe wurden jene verwendet, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Das 0,75 kb grosse Hind III-Bgl II-Fragment im Plasmid pAT 153 wurde in einer Nicktranslation durch <1><2><5>JdCTP radioaktiv markiert. Die 1,4 kb grossen Hind III-Fragmente in den Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 wurden mit Photoprobe <TM> biotinyliert. 


 b) Bestimmung der Standardkurven 
 



  Eine Zell-Standardkurve wurde mit einer bekannten Menge an Zellen hergestellt. Das Hybridisierungs-Signal wurde mit den Standard-Proben gemessen, die das MT-Gen erkennen. Eine Test-Nucleinsäure-Standardkurve wurde mit dem Plasmid pMTVdhfr und den Test-Proben hergestellt, die dieses Plasmid erkennen. Hybridisierungen wurden während 90 Minuten bei 70 DEG C in einer 200  mu l Lösung durchgeführt (0,6 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 1 mM EDTA, 4% Polyäthylenglykol 6000). Nach der Umsetzung wurden 50  mu l Streptavidin-Agarose (Bethesda Research Laboratories, Maryland, USA, Produkt-Nr. 5942SA) 1 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 1mM EDTA bis zu einem Endvolumen von 500  mu l zugegeben. Die Hybride wurden während 15 Minuten bei 37 DEG C an der Streptavidin-Agarose gesammelt.

  Sodann wurde die Agarose einmal während 5 Minuten mit der gepufferten 1 M NaCl-Lösung bei 37 DEG C und zweimal während 2 Minuten mit 15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat bei 55 DEG C gewaschen. Die Menge an gebundenen Hybriden wurde durch Messung der Agarose in einem Gamma-Zähler bestimmt; vgl. Syvänen et al., Nucleic Acids Res., 14 (1986), 5037-5048.

  Die Ergebnisse sind in Tabelle VII und VIII zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Tabelle VII 
<tb>Head Col 01 AL=L: Probe
Zellen/Test 
<tb>Head Col 02 AL=L: cpm
MT-Proben 
<tb> <SEP>0,8 x 10<6> <SEP>162 
<tb> <SEP>1,6 x 10<6> <SEP>216 
<tb> <SEP>3 x 10<6> <SEP>298 
<tb></TABLE> 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Tabelle VIII 
<tb>Head Col 01 AL=L: Probe
Moleküle/Test 
<tb>Head Col 02 AL=L: cpm
DHFR-Proben 
<tb> <SEP>106 <SEP>148 
<tb> <SEP>5 x 10<6> <SEP>394 
<tb> <SEP>5 x 10<7> <SEP>2240 
<tb></TABLE> 


 c) Bestimmung der Anzahl von Genen 
 



  Proben der in Beispiel 2 beschriebenen Zellinie wurden in ähnlicher Weise behandelt, das Probenvolumen, entsprechend etwa 2 x 10<6> Zellen, betrug 125  mu l. Die Bestimmung der Anzahl der Zellen und der Zahl der Test-Nucleinsäure-Moleküle wurde in getrennten Gefässen durchgeführt. Es wurde die Zell-Probe, die entsprechenden "Detektor" und "capturing"-Proben und die Komponenten des Hybridisierungsgemisches bis zu einem Endvolumen von 200  mu l zugegeben. Kontroll-Tests ohne Zell-Standard oder Test-DNA wurden ebenfalls durchgeführt. Die Hybridisierung, das Sammeln der Hybriden, das Waschen und die Messung erfolgte gemäss Beispiel 4 b). Die Ergebnisse werden von Standardkurven abgelesen, die gemäss Beispiel 4 b) parallel hergestellt wurden.

   Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefasst. 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Title: Tabelle IX 
<tb>Head Col 01 AL=L: Zellen 
<tb>Head Col 02 to 03 AL=L: MT 
<tb>Head Col 04 to 06 AL=L: DHFR 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>cpm*: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Zahl der Zellen in der Probe: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>cpm*: 
<tb>SubHead Col 05 AL=L>Zahl der Moleküle in der Probe: 
<tb>SubHead Col 06 AL=L>Zahl der Kopien: 
<tb> <SEP>Kontrollzellen <SEP>253 <SEP>2.3 x 10<6> <SEP>73 <SEP>&lt 105 <SEP>- 
<tb> <SEP>Linie I <SEP>210 <SEP>1.5 x 10<6> <SEP>233 <SEP>3.8 x 10<6> <SEP>3 
<tb> <SEP>Linie II <SEP>237 <SEP>2.1 x 10<6> <SEP>3059 <SEP>8.8 x 10<7> <SEP>42 
 Anm.: *) cpm-Werte von Kontroll-Tests ohne Zell-Standard oder Test-Nucleinsäure wurden subtrahiert.
  
<tb></TABLE> 

Claims (14)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nucleinsäure-Moleküle nach der "sandwich"- oder "solution"-Hybridisierungs-Methode, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl von gegebenen Nucleinsäure-Molekülen pro gegebene Einheit dadurch bestimmt wird, dass die Anzahl von Test-Nucleinsäure-Molekülen, die in mehreren Kopien in der Einheit vorliegen können, mit der Anzahl von ausgewählten Standard-Nucleinsäure-Molekülen verglichen wird.

2.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren a) falls nötig in eine Form überführt werden, in der sie in die Hybridisierungs-Reaktion eingesetzt werden können, b) Nucleinsäuren, die möglicherweise die Hybridisierungs-Reaktion stören, falls nötig in eine Form überführt werden, in der sie den Hybridisierungs-Test nicht stören können, c) in Kontakt gebracht werden, entweder ungeteilt oder falls nötig geteilt, mit mindestens einem Test-Probenpaar, das genügend homolog ist zu der Nucleinsäure, die möglicherweise in mehreren Kopien vorliegt, sowie mit mindestens einem ausgewählten und geeigneten Standard-Probenpaar, das genügend homolog zu der Nucleinsäure ist, und vorzugsweise in konstanter Kopienzahl vorliegt,

wobei die "Detektor"-Proben des Test-Probenpaares und des Standard-Probenpaares markiert sind mit einem feststellbaren Marker und wobei die "capturing"-Proben an einen Carrier oder eine Substanz gekoppelt sind, die eine Isolierung der entstandenen Hybride ermöglicht, d) und nach der Hybridisierungs-Reaktion die Test- und Standard-Hybride falls nötig abgetrennt werden und der gebundene Marker gemessen wird, und die Anzahl der Nucleinsäure-Moleküle pro gegebene Einheit durch Vergleich der Anzahl der Test- und Standard-Nucleinsäuren miteinander bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Test- und Standard-Nucleinsäuren Desoxyribonucleinsäuren sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Test-Nucleinsäure eine Ribonucleinsäure und die Standard-Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure ist.

5.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Test- und Standard-Nucleinsäuren Ribonucleinsäuren sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Test-Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure und die Standard-Nucleinsäure eine Ribonucleinsäure ist.

7.

Verfahren nach einem der Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die "Detektor"-Probe des Standard-Probenpaares - ein rekombinantes Plasmid mit einem 1,1 kb grossen Bgl II - Bgl II Fragment aus dem Hind III-Fragment des menschlichen c-Ki-ras I-Gens, wobei das Hind III-Fragment in dem Plasmid pBR 322 kloniert wurde und das Bgl II- Bgl II-Fragment in der Bam HI-Restriktionsstelle des Plasmids pBR 322 subkloniert wurde - und die "capturing"-Proben - rekombinante Phagen mit einem 0,5 kb grossenBgl II-Hind III-Fragment aus dem Hind III-Fragment des menschlichen C-Ki-ras I-Gens,

wobei das Hind III-Fragment in dem Plasmid pBR 322 kloniert wurde und das Bgl II-Hind III-Fragment in den Restriktionsstellen Bam HI und Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 10 und M 13 mp 11 subkloniert wurde - entweder einzeln oder zusammen mit dem Test-Probenpaar mit einer ungeteilten oder falls nötig einer geteilten Nucleinsäure-Probe in Kontakt gebracht werden.

8.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die "Detektor"-Probe des Standard-Probenpaares - ein rekombinantes Plasmid mit einem 1,2 kb grossen Eco RI-KpnI (Hind III) Fragment der "upstream"-Region des Promotor-Bereichs aus dem Maus-Metallothionein-Gen, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Eco RI und Hind III des Plasmids pAT 153 subkloniert wurde - und die "capturing"-Proben - rekombinante Phagen mit einem 0,8 kb grossen KpnI-Bgl II-Fragment aus dem Promotor- und dem angrenzenden "upstream"-Bereich des Metallothionein Gens, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Kpn I und Bam HI der Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 subkloniert wurde - entweder einzeln oder zusammen mit dem Test-Probenpaar mit einer ungeteilten oder falls nötig mit einer geteilten Nucleinsäure-Probe in Kontakt gebracht werden.

9.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 6, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Amplifikation des c-myc Onkogens und/oder der Anzahl der diesem Gen entsprechenden mRNA-Moleküle, die "Detektor"-Probe des Test-Probenpaares - ein rekombinantes Plasmid mit einem 3,7 kb grossen Hind III-XbaI-Fragment aus dem c-myc-Gen, wobei das Fragment in der Hind III-Restriktionsstelle des Plasmids pBR 322 subkloniert wurde - und die "capturing"-Proben - rekombinante Phagen mit einem 1,1 kb grossen XbaI-PstI Fragment aus dem c-myc Gen, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen XbaI und PstI der Phagenvektoren M 13 mp 10 und M 13 mp 11 subkloniert wurde - entweder einzeln oder zusammen mit dem Standard-Probenpaar mit einer ungeteilten oder falls nötig mit einer geteilten Nucleinsäure-Probe in Kontakt gebracht werden.

10.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 6, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Amplifikation des Dihydrofolat-Reduktase Gens (DHFR-Gen) und/oder der Anzahl der diesem Gen entsprechenden mRNA-Moleküle, die "Detektor"-Probe des Test-Probenpaares - ein rekombinantes Plasmid mit einem 0,75 kb langen, für das DHFR Gen kodierenden und aus dem Plasmid pMTVdhfr stammenden Hind III-Bgl II-Fragment, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Hind III und Bam HI des Plasmids pAT 158 subkloniert wurde - und die "capturing"-Proben - rekombinante Phagen mit einem 1,4 kb grossen Hind III-Fragment des MMTV Genbereichs aus dem Plasmid pMTVdhfr,

wobei das Fragment in der Restriktionsstelle Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 subkloniert wurde - entweder einzeln oder zusammen mit dem Standard-Probenpaar mit einer ungeteilten oder falls nötig mit einer geteilten Nucleinsäure-Probe in Kontakt gebracht werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählten Standard-Nucleinsäure-Moleküle eine konstante Kopienzahl in der gleichen Einheit aufweisen.

12.

Reagenziensatz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein Test-Probenpaar und mindestens ein Standard-Probenpaar enthält, wobei die "Detektor"-Proben des Tests-Probenpaares und des Standard-Probenpaares mit einem Marker gekoppelt sind, und die "capturing"-Proben an einen Carrier oder an eine Substanz gekoppelt sind, wodurch die Isolierung von "sandwich"-Hybriden ermöglicht wird.

13.

Reagenziensatz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die "Detektor"-Probe des Test-Probenpaares zur Bestimmung der Amplifikation des c-myc Onkogens und/oder der Anzahl der diesem Gen entsprechenden mRNA-Moleküle ein rekombinantes Plasmid mit einem 3,7 kb grossen Hind III-XbaI- Fragment des c-myc-Gens ist, wobei das Fragment in der Restriktionsstelle Hind III des Plasmids pBR 322 subkloniert ist, und die "capturing"-Proben rekombinante Phagen mit einem 1,1 kb grossen XbaI-PstI-Fragment den c-myc Gens sind, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen XbaI und PstI der Phagenvektoren M 13 mp 10 und M 13 mp 11 subkloniert ist, und die "Detektor"-Probe des Standard-Probenpaares ein 1,1 kb grosses BglII-BglII Fragment des Hind III Fragments des menschlichen c-Ki-ras I-Gens ist,

wobei das Hind III Fragment in dem Plasmid pBR 322 kloniert ist und das BglII-BglIl-Fragment in der Restriktionsstelle Bam HI des Plasmids pBR 322 subkloniert ist, und die "capturing"-Proben rekombinante Phagen mit einem 0,5 kb grossen BglII-Hind III-Fragment des Hind III-Fragments des menschlichen c-Ki-rasI-Gens sind, wobei das Hind III-Fragment in dem Plasmid pBR 322 kloniert ist und das BglII-HindIII-Fragment in den Restriktionsstellen Bam HI und Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 10 und M 13 mp 11 subkloniert ist.

14.

Reagenziensatz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die "Detektor"-Probe des Test-Probenpaares zur Bestimmung der Amplifikation des Dihydrofolat-Reduktase-Gens, DHFR-Gen abgekürzt, und/oder der Anzahl der diesem Gen entsprechenden mRNA-Moleküle ein rekombinantes Plasmid mit einem 0,75 kb langen, für das DHFR-Gen kodierenden Hind III-Bgl II-Fragment des Plasmids pMTVdhfr ist, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Hind III und Bam HI des Plasmids pAT 153 subkloniert ist, und die "capturing"-Proben rekombinante Phagen mit einem 1,4 kb grossen Hind III-Fragment des MMTV Genbereichs des Plasmids pMTVdhfr sind, wobei das Fragment in der Restriktionsstelle Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 subkloniert ist,

und die "Detektor"-Probe des Standard-Probenpaares ein rekombinantes Plasmid mit einem 1,2 kb grossen Eco RI-Kpn I (Hind III) Fragment der "upstream"-Region des Promotorbereichs des Maus-Metallothionein-Gens ist, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Eco RI und Hind III des Plasmids pAT 153 subkloniert ist, und die "capturing"-Proben rekombinante Phagen mit einem 0,8 kb grossen Kpn I-Bgl II-Fragment des Promotor- und des angrenzenden "upstream"-Bereichs des Metallothionein-Gens sind, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Kpn I und Bam HI der Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 subkloniert ist.