DE3706285A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von nucleinsaeure-molekuelen und reagenziensatz hierfuer - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung von nucleinsaeure-molekuelen und reagenziensatz hierfuer

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nucleinsäure-Molekülen, insbesondere von amplifizierten Genen und/oder entsprechenden mRNA-Molekülen nach dem "sandwich"- oder "solution"-Hybridisierungs-Prinzip sowie den dafür benötigten Reagenziensatz.
Die Kopienzahl einzelner Gene im Genom ist in der Regel konstant. In einigen Fällen gibt es nur ein Gen, in anderen Fällen mehrere Gene pro haploidem Genom. Unter bestimmten Umständen kann sich jedoch die Kopienzahl ändern. Es wurde z. B. gefunden, daß die Amplifizierung von bestimmten Genen mit der Entwicklung von Krebs verknüpft ist. Es ist auch bekannt, daß äußere Faktoren, z. B. Arzneistoffe und Metalle, eine Amplifizierung von bestimmten Genen hervorrufen. Für die Entwicklung einer Krankheit spielt die fehlerhafte oder erhöhte Expressionsrate eines Gens und somit die Menge der mRNA in der Zelle eine wichtige Rolle. Eine erhöhte Anzahl von einigen Chromosomen ist der Grund für bestimmte Erbkrankheiten oder andere Störungen, dagegen ist für die Ausbildung anderer Erbkrankheiten nur die Verdoppelung eines rezessiven Gens notwendig. In all diesen Fällen ist es wichtig, die Zahl der vorhandenen Chromosomen oder Gene zu bestimmen.
Die Anzahl von bestimmten DNA-Molekülen, z. B. der Grad der Amplifizierung von bestimmten Genen, wird gegenwärtig folgendermaßen bestimmt: Die zu untersuchende DNA wird extrahiert, mit Hilfe von Restriktionsenzymen gespalten und die entstandenen Nucleotid-Fragmente werden entsprechend ihrer Länge in einer Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Anschließend wird die einzelsträngige DNA auf ein Nitrocellulosefilter transferiert, fixiert und gegen eine radioaktiv markierte DNA hybridisiert. Als Hybridisierungsprobe werden das zu untersuchende Gen oder Teilbereiche davon verwendet. Die Ergebnisse werden durch Autoradiographie dargestellt; vgl. Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), 503-517. In jeder parallelen Analyse wird die gleiche Menge an zellulärer DNA eingesetzt. Die Intensitäten der Hybridisierungsbanden werden verglichen, und daraus werden die Verhältnisse zwischen den Kopienzahlen der Gene, die in den Testproben untersucht werden, abgeleitet. Die Methode führt nur zu Näherungswerten. Ebenso wird die Menge an RNA mit der "Northern-blotting"- oder "dot-blotting"- Methode nur abgeschätzt. Alle diese Methoden erlauben keine genauen quantitativen Aussagen; vgl. Thomas, Methods in Enzyml., Bd. 100 (1983), 255-266.
Die bekannten Methoden, wie die "Southern"- und "Northern- blotting"-Methode, sind langsam und schwer durchzuführen. Da sie nur Näherungswerte liefern, ist ihr diagnostischer Wert in jenen Fällen zweifelhaft, in denen es wichtig ist, die Anzahl bestimmter Nucleinsäure-Moleküle pro gegebener Einheit, z. B. pro Zelle, zu kennen. Die "sandwich"- oder "solution"-Hybridisierungs-Methoden, die in der US-PS 44 86 539 und der GB-OS 21 69 403 beschrieben sind, sind dagegen quantitativ; vgl. Virtanen et al., Lancet 1 (1983), 381-383.
Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine genaue, schnelle und quantitative Methode zur Bestimmung von Nucleinsäure-Molekülen zu entwickeln, die rascher und einfacher durchzuführen ist als die bekannten Methoden. Diese Methode soll sich sowohl zur Krebs- wie auch zur pränatalen Diagnostik eignen. Sie soll sich ferner zum Nachweis von Stoffen eignen, die eine Gen-Amplifikation hervorrufen, ferner zum Nachweis der Entwicklung einer Arzneistoff-Resistenz und zur Bestimmung des Expressionswertes von mRNA. Das Verfahren der Erfindung erfordert eine Standard-Nucleinsäure mit konstanter Kopienzahl. Es eignet sich zur Bestimmung der Anzahl von Nucleinsäure-Molekülen pro Einheit, z. B. einer Zelle, eines Zellkerns, Ribosoms oder Chromosoms.
Erfindungsgemäß sind zumindest zwei Bestimmungen erforderlich. Die eine Bestimmung betrifft das Nucleinsäure-Molekül, das in mehreren Kopien vorliegen kann, und als Test-Nucleinsäure bezeichnet wird. Die andere Bestimmung betrifft das konstitutive Nucleinsäure-Molekül, das vorzugsweise in konstanter Kopienzahl vorliegt, und als Standard-Nucleinsäure bezeichnet wird. Im erfindungsgemäßen Verfahren kennzeichnet ein Nucleinsäure-Molekül eine bestimmte Nucleotid-Sequenz von 10 bis 12 Nucleotiden oder ein Gen, das mehrere tausend Nucleotide besitzt. Es kennzeichnet aber auch eine mRNA oder eine Nucleotid-Sequenz, die beträchtlich länger ist als ein einzelnes Gen.
Die Bestimmung der Test- und Standard-Nucleinsäuren wird entweder nach der üblichen "sandwich"-Hybridisierungs-Methode, wie sie z. B. in der US-PS 44 86 539 beschrieben ist, oder nach der "solution"-Hybridisierungs-Methode durchgeführt, die in der GB-OS 21 69 403 beschrieben ist. Die Erfindung betrifft ferner einen Reagenziensatz, der die Nucleinsäure- Proben enthält. Die Nucleinsäure-Proben bestehen dabei zumindest aus einem Paar von Test-Nucleinsäuren und einem Paar von Standard-Nucleinsäuren.
Die Nucleinsäure-Proben, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, werden durch DNA-Rekombinationstechnik aus Nucleinsäuren hergestellt, die genügend homologe Bereiche zu den Test- und Standard-Nucleinsäuren besitzen. Genügend homologe Nucleinsäuren können sowohl synthetisch als auch halbsynthetisch hergestellt werden.
Die Test- und Standard-Nucleinsäuren können unmittelbar aus Zellen isoliert und durch verschiedene Hybridisierungs-Techniken identifiziert werden. Solche Test- und Standard-Nucleinsäuren sind jedoch auch käuflich und von verschiedenen Gen- Bibliotheken zu beziehen. Test- und Standard-Nucleinsäuren können entweder DNA- oder RNA-Moleküle sein.
Proben-Paare, die für die "sandwich"- oder "solution"-Hybridisierungs- Methode geeignet sind, werden mittels der DNA- Rekombinationstechnik aus Nucleinsäuren hergestellt, die genügend homologe Bereiche zu den Test- und Standard-Nucleinsäuren besitzen. Die Nucleinsäuren werden dazu mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten. Von den erhaltenen Restriktionsfragmenten werden mindestens zwei, die in dem ungespaltenen Nucleinsäure-Molekül relativ nahe beieinanderliegen, in mindestens zwei geeignete Vektoren kloniert. Das eine Fragment, die "Detektor"-Probe, wird mit einem geeigneten, erkennbaren Marker gekoppelt, während das andere Fragment, die "capturing"-Probe, entweder an einen geeigneten Carrier oder an eine passende Substanz gebunden wird. Diese Substanz ist z. B. komplementär zu einer weiteren Substanz, so daß sich Affinitäts-Paare ausbilden, und mit Hilfe dieser Paare die entstandenen Hybride von der Hybridisierungs- Mischung abgetrennt werden können.
Die Test- und Standard-Proben-Paare können zusammen in einem geeigneten Reagenziensatz vorliegen, in dem beide, die Test- und Standard-Probenpaare entweder nur aus DNA oder RNA bestehen. Auch ist es möglich, daß das Test-Probenpaar als DNA und das Standard-Probenpaar als RNA oder umgekehrt vorliegen. Die Vor- und Weiterbehandlung der Proben vor der Hybridisierung und die Hybridisierungsbedingungen selbst werden daher so gewählt, daß sie den in dem Test eingesetzten Proben- Paaren entsprechen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet zur Bestimmung der Zahl von Nucleinsäure-Molekülen aus homogenisiertem Zellmaterial. Das Verfahren kann natürlich auch benutzt werden, um gereinigte oder reine Nucleinsäuren zu bestimmen. Es sollte jedoch vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die am besten geeignete Vorbehandlung der Nucleinsäure-Probe ausgewählt werden.
Es ist möglich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowohl DNA- als auch RNA-Bestimmungen durchzuführen. Desoxyribonucleinsäuren werden gegebenenfalls denaturiert, um Einzelstränge zu erhalten. Einzelsträngige mRNA-Moleküle, die möglicherweise den Hybridisierungs-Test stören, können hydrolysiert werden, z. B. durch Kochen unter alkalischen Bedingungen. Die Probe wird für Ribonucleinsäure-Bestimmungen nicht denaturiert, da doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure nicht die Bestimmung von RNA stört. Es ist natürlich auch möglich, die DNA mit Desoxyribonucleasen zu zerstören oder die DNA chemisch oder mechanisch so zu verändern, daß sie nicht mehr in die Hybridisierungs-Reaktion eingreifen kann. Deshalb muß bei DNA- und RNA-Bestimmungen eine geeignete Methode für die Weiterbehandlung der Probe gewählt werden, oder alternativ muß diese Weiterbehandlung weggelassen werden. Die Wahl einer geeigneten Methode für die Weiterbehandlung ist natürlich abhängig von jener Methode, die für die einleitende Behandlung der Nucleinsäure-Probe verwendet wurde. Zahlreiche Methoden sind in der Literatur für die Vor- und Weiterbehandlung der Nucleinsäure-Proben beschrieben worden, so daß in jedem Fall die am besten geeignete Methode ausgewählt werden kann. Bestimmungen, in denen sowohl die Test- als auch die Standard-Nucleinsäuren entweder als DNA oder RNA vorliegen, können in einer nichtgetrennten Probe durchgeführt werden. Bestimmungen, in denen die Test-Nucleinsäuren als DNA und die Standard-Nucleinsäuren als RNA oder umgekehrt vorliegen, müssen in einer getrennten Probe durchgeführt werden, da für die Weiterbehandlung verschiedene Methoden notwendig sind. Die Probe kann natürlich getrennt werden, selbst wenn die Test- und Standard-Nucleinsäuren vom gleichen Nucleinsäure- Typ sind.
Der Hybridisierungs-Test selbst wird durchgeführt, in dem die nichtgetrennte Probenlösung gleichzeitig in Kontakt gebracht wird mit zumindest einem Test-Probenpaar und einem Standard-Probenpaar. Wurde die Probenlösung allerdings getrennt, so wird sie getrennt in Kontakt gebracht mit zumindest einem Test-Probenpaar und einem Standard-Probenpaar. In diesen Fällen wird die Mengenbestimmung der Test-Nucleinsäuren in einem Reaktionsgefäß und die Mengenbestimmung der Standard-Nucleinsäure in einem anderen Reaktionsgefäß durchgeführt.
Unabhängig davon, ob die Probe geteilt oder ungeteilt ist, kann die Hybridisierung unter den günstigsten Bedingungen jedesmal stattfinden. Nach Ablauf der Hybridisierungs- Reaktion werden die entstandenen Test- und Standard-Hybride von der Hybridisierungsmischung abgetrennt. Dann werden die Test- und Standard-Hybride an einen Carrier oder an eine geeignete Substanz gebunden bzw. gekoppelt. Diese Substanz ist komplementär zu einer weiteren Substanz, so daß sich Affinitäts- Paare ausbilden, die dann isoliert werden können. Der an den Test- und Standard-Hybriden gebundene Marker wird dann gemessen, und die Ergebnisse werden mit jenen der Standardkurven verglichen. Auf diese Weise kann die Anzahl der zu untersuchenden Nucleinsäure-Moleküle pro gewählte Einheit bestimmt werden. Das Verfahren der Erfindung besitzt praktischen diagnostischen Wert, besonders in der Erkennung einiger Arten von Krebs. Im kleinen Lungenzell-Karzinom ist das c-myc-Gen oft amplifiziert und sein Expressionslevel bedeutend höher als im normalen Gewebe. Im Falle von Tumoren des Nervengewebes findet man ein amplifiziertes N-myc-Gen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch dazu verwendet werden, um die mutagene oder karzinogene Wirkung von bestimmten Stoffen oder die Entwicklung von Arzneistoff-Resistenzen aufzuzeigen. Es ist bekannt, daß ein äußerer Selektionsdruck zu einer erhöhten Expression eines bestimmten Gens führen kann. Bei der Behandlung von Krebs entwickeln Zellen eine Resistenz gegen den eingesetzten Arzneistoff, indem sie jenes Gen amplifizieren, dessen Expressionsprodukt den Arzneistoff inaktiviert. Ein solcher Fall liegt bei Methotrexat vor, das die Amplifizierung des Dihydrofolat-Reduktase-Gens (DHFR) induziert. Ein weiteres Beispiels ist die Amplifizierung des Metallothionein-Gens unter dem Einfluß von Cadmium.
Der Expressionslevel eines Gens ist wichtig hinsichtlich des Phänotyps und der Funktion der Zelle. Dies kann durch die Mengenbestimmung der mRNA untersucht werden, da die mRNA- Menge mit der Menge des Translationsproduktes korreliert. Das Transkriptionsprodukt eines Onkogens bestimmt den Umfang, in dem es letztlich exprimiert wird.
Der Expressionslevel eines Onkogens variiert in Abhängigkeit vom Zelltyp, der Zelldifferenzierung und der Entwicklungsphase der Zelle. Zum Beispiel wird in einer bestimmten Phase der fötalen Entwicklung das c-myc-Onkogen rasch abgeschrieben, während dies in einer anderen Phase sehr langsam geschieht. Der Grad der Amplifizierung korreliert oft mit dem Expressionslevel des Gens, obwohl der Expressionslevel auch deutlich ohne Amplifizierung des Gens zunehmen kann. In solchen Fällen wird die Rolle eines Onkogens am besten dadurch bestimmt, daß nicht die Gen-Kopienzahl, sondern der Expressionslevel gemessen wird. In einigen Fällen kann die quantitative Bestimmung der mRNA einfacher und nützlicher sein, als die Mengenbestimmung des Gens selbst. Als ein Beispiel kann man hier das c-myc-Onkogen anführen, das ein labiles Protein ist und das bei Hitze schnell verklumpt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch dazu benutzt werden, um numerische Abnormalitäten der Chromosomen, wie das "Down- Syndrom" zu erkennen. Ebenso kann das erfindungsgemäße Verfahren zur pränatalen Diagnose benutzt werden, um festzustellen, ob der Fötus anormal ist, ob er z. B. homozygot für ein rezessives Gen ist.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1   Quantitative Bestimmung eines amplifizierten Onkogens a) Nucleinsäure-Proben und ihre Herstellung Standard-Proben Zell-Standard-Nucleinsäure
Das c-Ki-ras I Gen ist in allen humanen Zellen vorhanden. Die Proben-Paare für die "sandwich"-Hybridisierung wurden hergestellt, indem das 3,8 kb Hind III-Fragment des c-Ki-ras I Gens subkloniert wurde. Die Restriktionskarte des Hind III-Fragments wurde von Chang et al., PNAS 79 (1982), 4848-4852 veröffentlicht. Das Fragment liegt kloniert in pBR 322 vor (ATCC 41 032). Es kann von der ATCC- Kultursammlung bezogen werden.
Weitere Behandlung der Zell-Standard-Nucleinsäure
Der vorstehend beschriebene pBR 322 Klon wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl II und Hind III gespalten und die entstandenen Fragmente wurden aus dem Agarose-Gel isoliert. Gereinigte Fragmente, die in dem ungespaltenen DNA-Molekül relativ nahe beieinanderliegen, wurden in zwei geeigneten Vektoren zur Herstellung von "Detektor"- und "capturing"- Proben subkloniert.
Standard "Detektor"-Probe
Ein 1,1 kb großes Bgl II-Bgl II-Fragment wurde in der Bam HI Restriktionsstelle von pBR 322 subkloniert. Das entstandene Plasmid wurde in einer Nicktranslation durch 125J-dCTP radioaktiv markiert.
Standard "capturing"-Probe
Das etwa 0,5 kb große Bgl II-Hind III-Fragment wurde in die Restriktionsstellen Bam HI und Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 10 und mp 11 ligiert. Die entstandenen DNA-Moleküle wurden an ein Nitrocellulosefilter gebunden (150 ng DNA/1 cm).
Test-Proben Test-Nucleinsäure
Von einem klonierten c-myc Gen, das man beispielsweise von der ATCC Kultursammlung (ATCC 41 010) beziehen kann, wurde ein Probenpaar für die "sandwich"-Hybridisierung hergestellt. Die Restriktionskarte des Gens wurde von Watt et al., PNAS 80 (1983), 6307-6311, beschrieben.
Weitere Behandlung der Test-Nucleinsäure
Das c-myc-Gen wurde durch die Restriktionsenzyme Hind III, XbaI und PstI gespalten und die erhaltenen Fragmente wurden aus dem Agarosegel isoliert, gereinigt und zur Herstellung von "Detektor"- und "capturing"-Proben in geeignete Vektoren subkloniert.
Test "Detektor"-Probe
Die einzelsträngigen Enden des 3,7 kb großen Hind III- XbaI-Fragments aus dem c-myc-Gen wurden durch die Behandlung mit DNA-Polymerase wieder doppelsträngig gemacht. An das entstandene stumpfendige DNA-Fragment wurden mit Hilfe der T4-DNA-Ligase Hind III-Linker geknüpft. Nach einer Extraktion mit Phenol wurde das DNA-Fragment mit Hind III nachgeschnitten und schließlich in die Hind III Stelle von pBR 322 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde in einer Nicktranslation durch 125J-dCTP radioaktiv markiert.
Test "capturing"-Probe
Das 1,1 kb große XbaI-PstI-Fragment des c-myc Gens wurde in die XbaI und PstI Restriktionsstellen der Phagen-Vektoren M 13 mp 10 und mp 11 ligiert. Die entstandenen DNA- Moleküle wurden an ein Nitrocellulosefilter gebunden (150 ng DNA/1 cm).
b) Bestimmung der Standardkurve
Die Probe, die zur Bestimmung der Standardkurve verwendet wurde, bestand aus einem durch alkalische Bedingungen denaturierten pBR 322 Klon, der als Insert das c-myc Gen trug. Die "sandwich"-Hybridisierungs-Lösung, der die Test- Proben zugegeben wurden, bestand aus 4 × SSC, 1 × Denhardt- Lösung, 200 µg/ml Hering-Sperma-DNA und 0,2% SDS. Die Hybridisierungs-Reaktion erfolgte bei 65°C während eines Zeitraums von 17 bis 19 Stunden. Anschließend wurden die Filter bei 50°C in 0,1 × SSC, 0,2% SDS gewaschen. Der an den "sandwich"-Hybriden gebundene Marker (Radioaktivität) wurde in einem Gamma-Zähler bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
Tabelle I
c) Bestimmung der Zahl der Gene
Die Proben enthalten Zellen von (1) einer menschlichen Plazenta und (2) Colo 320 Zellen, die man von der ATCC- Kultursammlung (ATCC-CCC220) beziehen kann. Die DNA wurde von beiden Proben isoliert und gleiche Mengen davon wurden unter alkalischen Bedingungen durch Kochen denaturiert und anschließend den beiden Test-Ansätzen zugegeben. Durch die alkalische Denaturierung wird die in der Probe vorhandene RNA hydrolysiert.
Der Test wurde durchgeführt, indem zu jeder Probe die beiden c-myc und c-Ki-ras I-Filter und die beiden (radioaktiv) markierten Nucleinsäuren zugegeben wurden. Damit konnten für jede Probe die Standard- und Test-DNAs gemessen werden. Aufgrund der c-Ki-rasI-Bestimmungen wurde deutlich, daß jeder Test-Ansatz die gleiche Menge an DNA enthält. So kann man folgern, daß das c-myc Gen in Colo 320 Zellen in 16- bis 20-fach höheren Kopienzahlen vorliegt als in dem normalen Gewebe. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Tabelle II
Beispiel 2   Quantitative Bestimmung eines amplifizierten Gens a) Nucleinsäure-Proben und ihre Herstellung Standard-Proben Zell-Standard-Nucleinsäure
Als Kontroll-DNA wurden jene Sequenzen des Maus-Metallothionein Gens (MT Gen) verwendet, die den Promotor- und den direkt anschließenden "upstream"-Bereich umspannen. Die Struktur des MT Gens wurde durch Pavlakis und Hamer, PNAS 80 (1983), 397-401, beschrieben. Das Referenz-Nucleinsäure- Fragment liegt kloniert in dem pBPV-MMTneo (342-12) Vektor vor (ATCC 37 224) und kann von der ATCC Kultursammlung bezogen werden.
Weitere Behandlung der Zell-Standard-Nucleinsäure
Das vorstehend beschriebene MT Gen wurde zur Subklonierung in dem Plasmid pAT 153 mit den Restriktionsenzymen KpnI, BglII und Eco RI gespalten. Die KpnI-Enden wurden durch einen Linker in Hind III-Enden überführt.
Standard "Detektor"-Probe
Das 1,2 kb große Eco RI-KpnI (Hind III)-Fragment, das aus dem "upstream"-Bereich des Metallthionein-Gen Promotors stammt, wurde in die Restriktionsstellen Eco RI und Hind III des Plasmids pAT 153 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde in einer Nicktranslation durch 32P-dNTP's radioaktiv markiert.
Standard "capturing"-Probe
Das 0,8 kb große KpnI-Bgl II-Fragment, das den Promotor und den direkt anschließenden "upstream"-Bereich des Metallothionein- Gens umfaßt, wurde in den Restriktionsstellen KpnI und Bam HI der Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 kloniert. Die entstandenen DNA-Moleküle wurden an ein Nitrocellulosefilter gebunden.
Test-Proben Test-Nucleinsäure
Zur Herstellung des Probenpaares für die "sandwich"-Hybridisierung wurde das käufliche Plasmid pMTVdhfr (Bethesda Research Laboratories, Produkt-Nr. 5369 SS) verwendet. Die Struktur dieses Plasmids wurde von Lee et al., Nature 294 (1981), 228-232 beschrieben.
Weitere Behandlung der Test-Nucleinsäure
Das pMTVdhfr-Plasmid, das die cDNA des Dihydrofolat-Reduktase Gens (DHFR) besitzt, wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III und Bgl II gespalten.
Test "Detektor"-Probe
Das 0,75 kb große Hind III-Bgl II-Fragment, das den Bereich des DHFR-Gens in dem Plasmid pMTVdhfr umfaßt, wurde in die Restriktionsstellen Hind III und Bgl II des Vektors pAT 153 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde in einer Nicktranslation durch 32P-dNTP's radioaktiv markiert.
Test "capturing"-Probe
Ein 1,4 kb großes Hind III-Fragment aus dem MMTV-Genbereich des Plasmids pMTVdhfr wurde in den Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 kloniert.
b) Bestimmung der Standardkurve
Die Probe, die zur Bestimmung der Standardkurve verwendet wurde, war gereinigte DNA des pMTVdhfr Plasmids. Der Test wurde so durchgeführt, wie er im Beispiel 1 b) beschrieben wurde, allerdings wurde abweichend dazu ein Flüssigkeits- Szintillations-Zähler zur Bestimmung der Radioaktivität benutzt. Die enstandene Standardkurve ist in Tabelle III wiedergegeben.
Tabelle III
c) Bestimmung der Anzahl von Genen
Maus-Fibroblast-Zellen (NIH 3T3; ATCC Nr. CRL 1658), die mit verschiedenen Mengen von DHFR-cDNA transfiziert worden waren, wurden in Zellkultur-Platten gehalten und als Proben verwendet. Die Zellen wurden durch SDS lysiert und ihre DNA geschert, indem sie durch eine feine Nadel einer Spritze für subkutane Injektion gedrückt wurde. Eine 250 µl Probe mit etwa 106 Zellen wurde von dem Homogenat genommen und mit 50 µl Natronlauge versetzt. Die Probe wurde gekocht und mit Essigsäure und der Hybridisierungsmischung neutralisiert. Das Gesamtvolumen belief sich auf 0,5 ml. Die gesamten, vorstehend beschriebenen Proben wurden gleichzeitig in die Hybridisierungs-Reaktion eingesetzt. Als "background"-Kontrolle wurde ein "leeres" Nitrocellulosefilter zugesetzt. Die Hybridisierung, der Waschvorgang und die Bestimmung der Radioaktivität wurde gemäß Beispiel 1 b) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß für die Radioaktivität-Messung ein Flüssigkeits-Szintillations- Zähler benutzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.
Tabelle IV
Das Metallothionein-Gen (MT Gen) ist ein interner Marker, der die Anzahl der Zellen in einer Probe mißt. Die Ergebnisse zeigen, daß in diesem Test 106 Zellen ein MT-spezifisches Signal von 165 + 20 cpm ergeben. Die DHFR-Proben messen die Menge der DHFR-cDNA. Die Anzahl der Zellen wurde von dem MT-spezifischen Signal hergeleitet. Es war so möglich, die Zahl der DHFR-cDNA-Kopien in den verschiedenen Zellinien, wie in Tabelle IV gezeigt, zu bestimmen.
Beispiel 3   Quantitative Bestimmung der mRNA a) Nucleinsäure-Proben und ihre Herstellung
Benutzt man die in Beispiel 2 beschriebenen Test-Proben, so ist es auch möglich, die Menge der mRNA, die von der DHFR-cDNA abgeschrieben wird, zu messen. Das pMTVdhfr- Plasmid ist so konstruiert, daß die Transkription des DHFR-Gens an dem MMTV-Promotor beginnt. Die entstandenen mRNAs besitzen eine Länge von etwa 1,0 kb. Davon stammen etwa 0,25 kb von dem MMTV Promotorbereich und der Rest von der DHFR-cDNA ab; vgl. Lee et al., Nature 294 (1981), 228-232.
Standard-Proben
Als Zell-Standard-Nucleinsäure, Standard-"Detektor"- und Standard- "capturing"-Probe wurden jene verwendet, die in Beispiel 2 beschrieben sind.
Test-Proben
Als Test-Nucleinsäure, Test-"Detektor"- und Test-"capturing"- Probe wurden ebenfalls jene verwendet, die in Beispiel 2 beschrieben sind.
b) Bestimmung der Standardkurve
Zur Bestimmung der Standardkurve wurde jene Probe verwendet, die infolge der in vitro Transkription des Dihydrofolat- Reduktase-Gens die entsprechende mRNA besitzt. Die für die Transkription verwendete DNA wurde hergestellt, indem das 1,4 kb Hind III-Fragment des MMTV Promotors aus dem Plasmid pMTVdhfr zusammen mit dem 0,75 kb Hind III- Bgl II-Fragment (DHFR-cDNA) in den Restriktionsstellen Hind III und Bam HI des Plasmids pSP64 (Promega Biotec) subkloniert wurden. Die Proben-RNA wurde in wäßriger 0,2% SDS-Lösung aufbewahrt. Der "sandwich"-Hybridisierungs- Test wurde in der Weise durchgeführt, wie er in den Beispielen 1 b) und 2 b) beschrieben wurde, lediglich die Denaturierung wurde weggelassen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.
Tabelle V
c) Bestimmung der Anzahl von mNRA-Molekülen
Die Anzahl der mRNA-Moleküle, die durch Transkription des DHFR-Gens entstanden, wurde in der in Beispiel 2 beschriebenen Zellinie bestimmt.
Die Zellen wurden durch SDS lysiert und ihre DNA leicht geschert, indem sie durch eine feine Nadel einer Spritze für subkutane Injektion gedrückt wurde. Eine 250 µl Probe mit etwa 5 × 106 Zellen wurde von dem Homogenat genommen. Das Homogenat wurde dann ohne Denaturierung in den "sandwich"-Hybridisierungs-Test eingesetzt. Die "sandwich"- Hybridisierung wurde durchgeführt, wie in Beispiel 2 c) und 1 b) beschrieben, mit der Ausnahme, daß lediglich die DHFR-Proben der Hybridisierungs-Lösung zugesetzt wurden. In einer Parallelprobe von 250 µl Homogenat wurde die Zellzahl bestimmt, indem die in Beispiel 2 c) beschriebene Metallothionein-Probe verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt.
Tabelle VI
Die Ergebnisse zeigen, daß pro Zelle der Linie I nur etwa 100 mRNA-Moleküle von den DHFR-Genen abgeschrieben werden, daß aber pro Zelle der Linie II etwa 500 dieser mRNA- Moleküle gebildet werden.
Beispiel 4   Bestimmung der Anzahl der amplifizierten Gene durch "solution"- Hybridisierung a) Nucleinsäure-Proben und ihre Herstellung Standard-Proben
Als Zell-Standard-Nucleinsäure, Standard-"Detektor"- und Standard- "capturing"-Probe wurden jene verwendet, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Das 1,2 kb große Eco RI-KpnI (Hind III)- Fragment im Plasmid pAT 153 wurde in einer Nicktranslation durch 125JdCTP radioaktiv markiert. Die 0,8 kb großen KpnI-Bgl II-Fragmente in den Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 wurden mit Biotin unter Verwendung des PhotoprobeTM- Reagens (Vector Laboratories, CA, USA, Produkt- Nr. SP-1000) modifiziert.
Test-Proben
Als Test-Nucleinsäure, Test-"Detektor"- und Test-"capturing"- Probe wurden jene verwendet, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Das 0,75 kb große Hind III-Bgl II-Fragment im Plasmid pAT 153 wurde in einer Nicktranslation durch 125JdCTP radioaktiv markiert. Die 1,4 kb großen Hind III-Fragmente in den Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 wurden mit PhotoprobeTM biotinyliert.
b) Bestimmung der Standardkurven
Eine Zell-Standardkurve wurde mit einer bekannten Menge an Zellen hergestellt. Das Hybridisierungs-Signal wurde mit den Standard-Proben gemessen, die das MT-Gen erkennen. Eine Test-Nucleinsäure-Standardkurve wurde mit dem Plasmid pMTVdhfr und den Test-Proben hergestellt, die dieses Plasmid erkennen. Hybridisierungen wurden während 90 Minuten bei 70°C in einer 200 µl Lösung durchgeführt (0,6 M NaCl, 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, 1 mM EDTA, 4% Polyäthylenglykol 6000). Nach der Umsetzung wurden 50 µl Streptavidin- Agarose (Bethesda Research Laboratories, Maryland, USA, Produkt-Nr. 5942SA) 1 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 1 mM EDTA bis zu einem Endvolumen von 500 µl zugegeben. Die Hybride wurden während 15 Minuten bei 37°C an der Streptavidin-Agarose gesammelt. Sodann wurde die Agarose einmal während 5 Minuten mit der gepufferten 1 M NaCl- Lösung bei 37°C und zweimal während 2 Minuten mit 15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat bei 55°C gewaschen. Die Menge an gebundenen Hybriden wurde durch Messung der Agarose in einem Gamma-Zähler bestimmt; vgl. Syvänen et al., Nucleic Acids Res., 14 (1986), 5037-5048. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII und VIII zusammengefaßt.
Tabelle VII
Tabelle VIII
c) Bestimmung der Anzahl von Genen
Proben der in Beispiel 2 beschriebenen Zellinie wurden in ähnlicher Weise behandelt, das Probenvolumen, entsprechend etwa 2 × 106 Zellen, betrug 125 µl. Die Bestimmung der Anzahl der Zellen und der Zahl der Test-Nucleinsäure- Moleküle wurde in getrennten Gefäßen durchgeführt. Es wurde die Zell-Probe, die entsprechenden "Detektor"- und "capturing"-Proben und die Komponenten des Hybridisierungsgemisches bis zu einem Endvolumen von 200 µl zugegeben. Kontroll-Tests ohne Zell-Standard oder Test-DNA wurden ebenfalls durchgeführt. Die Hybridisierung, das Sammeln der Hybriden, das Waschen und die Messung erfolgte gemäß Beispiel 4 b). Die Ergebnisse werden von Standardkurven abgelesen, die gemäß Beispiel 4 b) parallel hergestellt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefaßt.
Tabelle IX

Claims (13)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nucleinsäure- Molekülen nach dem "sandwich"- oder "solution"-Hybridisierungs- Prinzip, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl von gegebenen Nucleinsäure-Molekülen pro gegebene Einheit dadurch bestimmt wird, daß die Anzahl von Test-Nucleinsäure-Molekülen, die in mehreren Kopien in der Einheit vorliegen können, mit der Anzahl von ausgewählten Standard-Nucleinsäure-Molekülen, die vorzugsweise eine konstante Kopienzahl in der gleichen Einheit besitzen, verglichen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Probe vorhandenen Nucleinsäuren
  • a) falls nötig in eine Form überführt werden, in der sie in die Hybridisierungs-Reaktion eingesetzt werden können,
  • b) Nucleinsäuren, die möglicherweise die Hybridisierungs- Reaktion stören, falls nötig in eine Form überführt werden, in der sie den Hybridisierungs-Test nicht stören können,
  • c) in Kontakt gebracht werden, entweder ungeteilt oder falls nötig geteilt, mit mindestens einem Test-Probenpaar, das genügend homolog ist zu der Nucleinsäure, die möglicherweise in mehreren Kopien vorliegt, sowie mit mindestens einem ausgewählten und geeigneten Standard-Probenpaar, das genügend homolog zu der Nucleinsäure ist, und vorzugsweise in konstanter Kopienzahl vorliegt, wobei die "Detektor"-Proben des Test-Probenpaares und des Standard- Probenpaares markiert sind mit einem feststellbaren Marker und wobei die "capturing"-Proben an einen Carrier oder eine Substanz gekoppelt sind, die eine Isolierung der entstandenen Hybride ermöglicht,
  • d) und nach der Hybridisierungs-Reaktion die Test- und Standard-Hybride falls nötig abgetrennt werden und der gebundene Marker gemessen wird, und die Anzahl der Nucleinsäure- Moleküle pro gegebene Einheit durch Vergleich der Anzahl der Test- und Standard-Nucleinsäuren miteinander bestimmt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Test- und Standard-Nucleinsäuren Desoxyribonucleinsäuren sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Test-Nucleinsäure eine Ribonucleinsäure und die Standard-Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Test- und Standard-Nucleinsäuren Ribonucleinsäuren sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Test-Nucleinsäure eine Desoxyribonucleinsäure und die Standard-Nucleinsäure eine Ribonucleinsäure ist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die "Detektor"-Probe des Standard-Probenpaares - ein rekombinantes Plasmid mit einem 1,1 kb großen Bgl II-Bgl II Fragment aus dem Hind III-Fragment des menschlichen c-Ki-ras I-Gens, wobei das Hind III-Fragment in dem Plasmid pBR 322 kloniert wurde und das Bgl II- Bgl II-Fragment in der Bam HI-Restriktionsstelle des Plasmids pBR 322 subkloniert wurde - und die "capturing"- Proben - rekombinante Phagen mit einem 0,5 kb großen Bgl III-Hind III-Fragment aus dem Hind III-Fragment des menschlichen c-Ki-ras I-Gens, wobei das Hind III-Fragment in dem Plasmid pBR 322 kloniert wurde und das Bgl II-Hind III- Fragment in den Restriktionsstellen Bam HI und Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 10 und M 13 mp 11 subkloniert wurde - entweder einzeln oder zusammen mit dem Test-Probenpaar mit einer ungeteilten oder falls nötig einer geteilten Nucleinsäure-Probe in Kontakt gebracht werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die "Detektor"-Probe des Standard-Probenpaares - ein rekombinantes Plasmid mit einem 1,2 kb großen Eco RI-KpnI (Hind III) Fragment der "upstream"-Region des Promotor- Bereichs aus dem Maus-Metallothionein-Gen, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Eco RI und Hind III des Plasmids pAT 153 subkloniert wurde - und die "capturing"- Proben - rekombinante Phagen mit einem 0,8 kb großen KpnI- Bgl II-Fragment aus dem Promotor- und dem angrenzenden "upstream"-Bereich des Metallothionein-Gens, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Kpn I und Bam HI der Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 subkloniert wurde - entweder einzeln oder zusammen mit dem Test-Probenpaar mit einer ungeteilten oder falls nötig mit einer geteilten Nucleinsäure-Probe in Kontakt gebracht werden.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 6, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Amplifikation des c-myc Onkogens und/oder der Anzahl der diesem Gen entsprechenden mRNA-Moleküle, die "Detektor"-Probe des Test- Probenpaares - ein rekombinantes Plasmid mit einem 3,7 kb großen Hind III-XbaI-Fragment aus dem c-myc-Gen, wobei das Fragment in der Hind III-Restriktionsstelle des Plasmids pBR 322 subkloniert wurde - und die "capturing"-Proben - rekombinante Phagen mit einem 1,1 kb großen XbaI-PstI Fragment aus dem c-myc Gen, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen XbaI und PstI der Phagenvektoren M 13 mp 10 und M 13 mp 11 subkloniert wurde - entweder einzeln oder zusammen mit dem Standard-Probenpaar mit einer ungeteilten oder falls nötig mit einer geteilten Nucleinsäure- Probe in Kontakt gebracht werden.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 6, 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Amplifikation des Dihydrofolat-Reduktase Gens (DHFR-Gen) und/oder der Anzahl der diesem Gen entsprechenden mRNA-Moleküle, die "Detektor"- Probe des Test-Probenpaares - ein rekombinantes Plasmid mit einem 0,75 kb langen, für das DHFR Gen kodierenden und aus dem Plasmid pMTVdhfr stammenden Hind III-Bgl II- Fragment, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Hind III und Bam HI des Plasmids pAT 158 subkloniert wurde - und die "capturing"-Proben - rekombinante Phagen mit einem 1,4 kb großen Hind III-Fragment des MMTV Genbereichs aus dem Plasmid pMTVdhfr, wobei das Fragment in der Restriktionsstelle Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 subkloniert wurde - entweder einzeln oder zusammen mit dem Standard-Probenpaar mit einer ungeteilten oder falls nötig mit einer geteilten Nucleinsäure- Probe in Kontakt gebracht werden.
11. Reagenziensatz für die quantitative Bestimmung von Nucleinsäure- Molekülen, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens ein Test-Probenpaar und mindestens ein Standard- Probenpaar enthält, wobei die "Detektor"-Proben des Tests- Probenpaares und des Standard-Probenpaares mit einem Marker gekoppelt sind, und die "capturing"-Proben an einen Carrier oder an eine Substanz gekoppelt wurden, wodurch die Isolierung von "sandwich"-Hybriden ermöglicht wird.
12. Reagenziensatz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die "Detektor"-Probe des Test-Probenpaares, die für die Bestimmung der Amplifikation des c-myc Onkogens und/ oder der Anzahl der diesem Gen entsprechenden mRNA-Moleküle verwendet wurde, ein rekombinantes Plasmid mit einem 3,7 kb großen Hind III-XbaI-Fragment aus dem c-myc-Gen ist, wobei das Fragment in der Restriktionsstelle Hind III des Plasmids pBR 322 subkloniert wurde, und die "capturing"- Proben rekombinante Phagen mit einem 1,1 kb großen XbaI- PstI-Fragment aus dem c-myc Gen sind, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen XbaI und PstI der Phagenvektoren M 13 mp 10 und M 13 mp 11 subkloniert wurde, und die "Detektor"-Probe des Standard-Probenpaares ein 1,1 kb großes BglII-BglII-Fragment aus dem Hind III Fragment des menschlichen c-Ki-ras I-Gens ist, wobei das Hind III Fragment, das in dem Plasmid pBR 322 kloniert wurde und das BglII-BglII-Fragment, das in der Restriktionsstelle Bam HI des Plasmids pBR 322 subkloniert wurde, und die "capturing"-Proben rekombinante Phagen mit einem 0,5 kb großen BglII-Hind III-Fragment aus dem Hind III-Fragment des menschlichen c-Ki-rasI-Gens sind, wobei das Hind III- Fragment in dem Plasmid pBR 322 kloniert wurde und das BglII-HindIII-Fragment in den Restriktionsstellen Bam HI und Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 10 und M 13 mp 11 subkloniert wurde.
13. Reagenziensatz nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die "Detektor"-Probe des Test-Probenpaares, die für die Bestimmung der Amplifikation des Dihydrofolat-Reduktase- Gens (DHFR-Gen) und/oder der Anzahl der diesem Gen entsprechenden mRNA-Moleküle verwendet wird, ein rekombinantes Plasmid mit einem 0,75 kb langen, für das DHFR- Gen kodierenden und aus dem Plasmid pMTVdhfr stammenden Hind III-Bgl II-Fragment ist, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Hind III und Bam HI des Plasmids pAT 153 subkloniert wurde, und die "capturing"-Proben rekombinante Phagen mit einem 1,4 kb großen Hind III- Fragment des MMTV Genbereichs aus dem Plasmid pMTVdhfr sind, wobei das Fragment in der Restriktionsstelle Hind III der Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 subkloniert wurde, und die "Detektor"-Probe des Standard-Probenpaares ein rekombinantes Plasmid mit einem 1,2 kb großen Eco RI- Kpn I (Hind III) Fragment der "upstream"-Region des Promotorbereichs aus dem Maus-Metallothionein Gen ist, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Eco RI und Hind III des Plasmids pAT 153 subkloniert wurde, und die "capturing"- Proben rekombinante Phagen mit einem 0,8 kb großen Kpn I- Bgl II-Fragment aus dem Promotor- und dem angrenzenden "upstream"-Bereich des Metallothionein Gens sind, wobei das Fragment in den Restriktionsstellen Kpn I und Bam HI der Phagenvektoren M 13 mp 18 und M 13 mp 19 subkloniert wurde.
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