JPS62205800A - 核酸分子の定量法およびそれに用いる試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ン法または溶液（ｓｏ　Ｉ　ｕｔ　ｔｏｎ）ハイブリダ
イゼーション法を用いたある核酸分子の定量法、とくに
遺伝子および／またはそれに対応するメツセンジャーＲ
ＮＡ分子の増幅の程度の定量法、およびそれに用いる試
薬に関する。

ゲノム中の個々の遺伝子のコピー数は通常一定である。

あるばあいには半数体ゲノムあたり１つの遺伝子のみ存
在し、他のばあいではいくつか存在することもある。あ
る状況下ではコピー数は変化することができる。ある遺
伝子の増幅は、たとえば、がん腫の発生と関連づけられ
ることが見出されている。また、医薬製剤（ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）や金属などのような外的因子が
ある遺伝子を増幅させることも知られている。病気の発
生にとっては、がん遺伝子のように遺伝子の不完全なま
たは高められた発現レベル、すなわち細胞中のメツセン
ジャーＲＮＡの量が非常に重要である。

ある遺伝的病気または他の障害は、ある染色体の数が増
加することに起因するものであるが、遺伝的病気の中に
は１つの劣性遺伝子の重複によってのみ生じるものもあ
る。そのような例のすべてにおいては、存在する染色体
または遺伝子の数を測定することが重要である。

あるＤＮＡ分子の数、たとえば一定の遺伝子の増幅の程
度は、現在のところ、検討されるべく抽出されたＤＮＡ
を制限酵素を用いて消化することによって、およびアガ
ロースゲル電気泳動法により長さにしたがってヌクレオ
チド断片を分離することによって測定されている。つぎ
に、−　本ｆｆｉ　ＤＮＡは、ニトロセルロースフィル
ターに移され固定され、そこで検討されるべき遺伝子ま
たはプローブとしてその遺伝子の一部を用いてハイブリ
ダイゼーシ・ランが行なわれる。その結果はオートラジ
オグラフィーによってえられる（サザン（３ｏｕｔｈｅ
ｒｎ）の「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ．）、９８巻、５０３〜５
１７頁（１９７５）Ｊ参照）。各々の並列して行なった
分析による細胞中のＤＮＡの量は同じである，。

ハイブリダイゼーションバンド （ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂａｎｄｓ）の強度、
すなわちシグナル（ｓｉｇｎａｌｓ）を比較し、テスト
サンプル中の検ｊ寸下の遺伝子のコピー数間の比が推定
される。

この方法はおおよその結果を与えるにすぎない。

同様に、ＲＮＡが、ノーサン−プロッティング法または
ドツト−ブロッティング法を用いて測定される。これら
の方法は、定量的に非常に不正確なものである（トーマ
ス（ＴｈａＩｌｌａｓ）の、「メソッズ・イン・エンザ
イモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ　、
）１００巻、２５５　〜２６６頁（１９８３）Ｊ参照）
。

サザンブロッティングおよびノーザンブロツティングの
ような知られた方法はその役を果すには時間がかか１．
困難なものである。それらはおおよその結果を与えるに
すぎないので、細胞のような一定のユニットあたりのあ
る核酸分子数を知ることが重要であるばあいにはそれら
の診断値（ｄｌａｇｎｏｓｔｆｃ　ｖａｌｕｅ）は疑わ
しいものである。

米国特許第４．４８１３．５３９号および英国特許出願
筒ＧＢ２　１８９　４０３号明細書に記載されたサンド
イッチハイブリダイゼーション法または溶液ハイブリダ
イゼーション法は定量的である（ヴイルタネン（Ｖｉｒ
ｔａｎｅｎ）らの、［ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）１巻
、３８１〜３８３頁（１９８３）Ｊ参照）。さらに、本
発明の方法においては、コピー数が一定であり細胞、核
、リポソームまたは染色体のような一定のユニットあた
りの関連した核酸分子数の測定を可能にする標準核酸を
必要とする。

本発明の目的は、現在用いられている方法より時間がか
からず簡便な核酸分子の正確かつ迅速な定量方法を提供
することにある。本発明は、メツセンジャーＲＮＡの発
現レベルの測定と同様にがんおよび出産前の診断（ｐｒ
ｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に、遺伝子を増
幅させる因子の検出およびたとえば薬剤耐性の発達を示
すために用いることができる。

本発明においては少なくとも２つのｆｉｔｌＪ定が必要
である。１つはいくつかのコピーで存在しているかもし
れない核酸分子、すなわち被験核酸を測定する。他の１
つは有利にも一定数で存在している構成（ｃｏｎｓｔｉ
ｔｕｔｌｖｅ）核酸分子、すなわち標準核酸を測定する
。本発明による方法において、核酸分子は１０〜１２個
のヌクレオチドを有するあるヌクレオチド配列または数
十個のヌクレオチドを含有する遺伝子を示す。また、そ
れはメツセンジャーＲＮＡまたは単一遺伝子すなわちア
ムプリコーン（ａｍｐｌ　１ｃｏｎｅ）よりかなり長い
ヌクレオチド配列をも意味しつる。

被験核酸および標準核酸の測定は、たとえば米国特許第
４．４８８，５３９号明細書に記載されている他の点で
は標準のサンドイッチハイブリダイゼーション法または
英国特許出願第 ＣＢ２１８９４０３号明細書に記載されている溶液ハイ
ブリダイゼーション法を用いて行なわれる。

本発明はまた、少なくとも１つの被験プローブペアー（
ｐａｆｒ）および少なくとも１つの標準プローブペアー
からなる核酸試薬を含有する試薬に関する。このような
試薬は試薬キット（ｒｅａｇｅｎｔｋｉｔ）として用い
るのが好ましい。

本発明の方法に用いる試薬またはプローブは、組換えＤ
ＮＡ技術を用いて、被験核酸および標準核酸に充分に相
同な核酸から調製される。また充分に相同な核酸は、合
成的および半合成的に調製することができる。

被験核酸および標準核酸は細胞から直接に単離され、種
々のハイブリダイゼーション技術によって同定されてよ
い。しかしながら、そのような被験核酸および標準核酸
は商業的にかつ種々の遺伝子バンク（ｇｅｎｅ　ｂａｎ
ｋｓ）から入手することが可能である。被験核酸および
標準核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよい。

サンドイッチハイブリダイゼーション法または溶液ハイ
ブリダイゼーション法に適したプローブペアーは、組換
えＤＮＡ技術によって被験核酸および標準核酸に充分に
相同な核酸から調製される。適当な制限酵素によって関
連する核酸を消化し、互いに比較的接近して位置するえ
られた制限酵素断片の少なくとも２つを少な（とも２つ
の適当なベクターにクローン化する。その断片の１つで
あるデテクタープローブ（ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｐｒｏｂ
ｅ）を適当な検出しうる標識で標識し、他の１つである
キャプチャリングプローブ（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ　ｐｒ
ｏｂｅ）を適当な担体に固定する（ａ［’ｌ’１ｘｅｄ
）か、またはアフィニティーペアー（ａ［’ｒｉｎｉｔ
ｙ　ｐａｉｒ）の相補的成分のような他の物質によって
ハイブリダイゼーション混合物からえられたハイブリッ
ドの分離を可能にする物質をキャプチャリングプローブ
に固定する。

被験プローブペアーおよび標準プローブペアーは、被験
プローブペアーおよび標準プローブペアーの両方がＤＮ
ＡあるいはＲＮＡであるか、被験プローブペアーがＤＮ
Ａであって標準プローブペアーがＲＮＡであるかまたは
その逆である適当な試薬として組み合わせることができ
る。したがってハイブリダイゼーションを行なう前のサ
ンプルの前処理（ｐｒｅｔ　ｒｅａｔｍｅｎｔ）および
二次処理（１’ｕｒｔｈｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）お
よびハイブリダイゼーションの条件は、測定テストに用
いたプローブペアーに従うべきである。

本発明の方法は、細胞ホモジエネートから直接的に核酸
分子数をΔｔ１定するのにとくに適している。もちろん
本発明の方法は精製されたまたは純粋な核酸の測定にも
用いることができる。

しかしながら、本発明の方法を行なう前に、核酸サンプ
ルのもっとも適当な前処理が選択されるべきである。

本発明の方法を用いて、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方の測
定を行なうことが可能である。デオキシリボ核酸は必要
であれば一本鎖をうるために変性させる。ハイブリダイ
ゼーションテストを妨げる可能性のある一本鎖メッセン
ジャー１？ＮＡ分子は、たとえばアルカリ煮沸によって
加水分解することができる。また、二本鎖デオキシリボ
核酸はＲＮＡ　１ｌ１１定を妨害しないので、サンプル
はリボ核酸の測定に関しては変性されない。もちろん、
デオキシリボヌクレアーゼでＤＮＡを分解すること、ま
たはＤＮＡを化学的かまたは機械的に変化させてＤＮＡ
がハイブリダイゼーション反応に関与しえないように変
えることが可能である。したがってＤＮＡおよびＲＮＡ
の測定に関しては、サンプルの二次処理のための適当な
方法を選択しなければならないか、あるいはこの二次処
理を省略してもよい。二次処理のための適当な方法の選
択は、もちろん、核酸サンプルの前処理に用いた方法に
左右される。核酸サンプルの前処理および二次処理のた
めの多数の方法が文献に記載されてお１．それらを用い
てそれぞれのばあいにもっとも適当な方法を選ぶことが
できる。

被験核酸および標準核酸の両方がＤＮＡかまたはＲＮＡ
であるばあいの測定は、分割されていないサンプルを用
いて行なうことができる。被験核酸がＤＮＡであり標準
核酸がＲＮＡであるかまたはその逆であるばあいの測定
は、二次処理のための異なる方法が必要であるので、分
割されたサンプルを用いて行なわなければならない。サ
ンプルはもちろん、たとえ被験核酸および標準核酸が同
じ核酸タイプであるばあいにも分割されてもよい。

ハイブリダイゼーションテスト自体は、分割されていな
いサンプル溶液を少なくとも１つの被験プローブペアー
と１つの標準プローブペアーとに同時に接触させること
によって行なわれる。もしサンプル溶液が分割されてい
るものであれば、そのサンプル溶液は少なくとも１つの
被験プローブペアーと１つの標準プローブペアーとに別
々に接触される。そのようなばあいには、被験核酸の量
は１つの反応容器内で測定され、標準核酸の量は他の容
器内で測定される。

サンプルが分割されているかいないかにかかわらず、ハ
イブリダイゼーションはそれぞれのばあいにおいてもっ
とも有利な条件および時間で行なわれる。いった・ん反
応が起これば、えられる被験ハイブリッドおよび標準ハ
イブリッドは担体によってハイブリダイゼーション混合
液から分離され洗浄されるか、またはアフィニティーペ
アーの相補的メンバーのような単離剤によって分離され
る。被験ハイブリッドおよび標準ハイブリッドに付加さ
れた標識は測定され、その結果は標準曲線と比較される
。このようにして検討されるべき核酸分子の数は選ばれ
たユニットあたりで測定することができる。

本発明の方法はとくにがんのある種の型の検出において
実用的な診断上の意義がある。小細胞肺がん腫（ｓｌｉ
ａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｌｎｏｏ＋ａ）
において、Ｃ−ｍ’／Ｃ遺伝子はしばしば増幅され、そ
の発現レベルは正常組織よりかなり高くなっている。神
経芽細胞腫のばあいはＮ−ｍｙｃ遺伝子が増幅される。

本発明の方法はまた、ある薬剤の変異原作用もしくは発
がん作用または薬剤耐性の発生を説明するために用いる
ことができる。選択の外的圧力がある種の遺伝子の発現
を高めることになることが知られている。がんの治療に
おいて、がん細胞は、遺伝子を増幅させることによって
投与された薬剤に対する抵抗性をあられし、その遺伝子
の発現産物は薬剤を不活化する。そのようなばあいの１
つがジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）に対する遺
伝子の増幅を誘導するメソトレキセートである。他の例
としてはカドミウムの影響下でのメタロチオニン （ｍｅｔａｌ　Ｉｏｔｈ＋ｏｎｉｎｓ）に対する遺伝子
の増幅がある。

遺伝子の発現レベルは細胞の表現型および機能の見地か
ら重要である。遺伝子の発現レベルは、メツセンジャー
ＲＮＡによってコードされた蛋白質の量と相互関係があ
るメツセンジャーＲＮＡの量を測定することによって調
べることができる。がん遺伝子の転写生成物によって究
極的にどのように発現されるのかが決定される。

がん遺伝子の発現レベルは細胞型、分化レベルおよび細
胞の発達期（ｐｈａｓｅ）によって左右され変化する。

たとえば、胎児の発育のある段階では、ｃ−＋ｎｙｃが
ん遺伝子は迅速にコピーされるが、他の段階ではたいへ
んゆっくりとコピーされる。遺伝子の発現レベルは増幅
なしに著しく増加するかもしれないが、増幅の程度はし
ばしば遺伝子の発現レベルと相関がある。そのようなば
あいには、がん遺伝子の役割はコピーの数よりむしろそ
の発現レベルを測定することによ′　ってもっともよく
決定される。いくつかのばあいには、メツセンジャーＲ
ＮＡの定量は遺伝子生成物自体の定量より簡便で便利で
ある。そのような例としてはｃ−ｍｙｃがん遺伝子、熱
によって容易に凝固する不安定な蛋白質をあげることが
できる。

本発明の方法は、ダウン症候群のような数字上の染色体
異常を確認するために用いることもできる。また、出産
前の診断においては、胎児に欠陥があるかどうか、すな
わちある劣性遺伝子に対して同形（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕ
ｓ）であるかどうかの決定をすることも可能である。

つぎに本発明の定量法およびそれに用いる核酸試薬を実
施例を用いてさらに詳しく説明するが、本発明はかかる
実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ 増幅されたかん遺伝子の定量 〈ω核酸試薬およびその調製 （１）標準プローブ （細胞標準核酸） ｃ−Ｋｌ−ｒａｓ　Ｉ遺伝子はすべてのヒト細胞に存在
する。サンドイッチハイブリダイゼーションのためのプ
ローブペアーは、ｃ−Ｋｌ−ｒａｓ　Ｉ遺伝子のｌｌ１
ｎｄＩＩＩ断片をサブクローン化し長さ３．８ｋｂを測
定することによって調製した。制限酵素地図はチャング
（ｃｈａｎｇ）らによって「プロシーディンゲスφオブ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐ
ＮＡＳ）７９巻、４８４８〜４８５２頁（１９８２）Ｊ
に記載されている。該断片は、たとえばプラスミドｐＢ
Ｒ３２２（ＡＴＣＣ４１０３２）にクローン化して入手
可能であ１．たとえばアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）からう　することができる
。

（細胞標準核酸の二次処理゛） 前記記載のｐＢＲ３２２クローンを制限酵素Ｂｇｌｎお
よびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、えられた断片をアガロー
スゲルから単離した。互いに近接して位置する精製され
た断片を、デテクタープローブおよびキャプチャリング
プローブ調製用として２つの適当なベクターにサブクロ
ーン化した。

（標準デテクタープローブ） 長さが約１．１ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断
片をプラスミドｐＢＲ３２２のＢａｒＡＨＩ制限酵素部
位にサブタローン化し、　　　■で標識されたｄＣＴＰ
を用いてニックトランスレーションによって標識した。

（標準キャプチャリングプローブ） Ｂｇｌ　Ｕ　−ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片約０．５ｋｂをＭ１
３ｍｐ１０およびＭ１３ｍｐＨファージベクターの制限
酵素１３ａｍＨＩおよび旧ｎｄＩ［［の制限酵素部位間
に挿入し、ついでそれを１５０ｎｇＤＮＡ／直径ＩＣｌ
１１でニトロセルロースフィルターに固定した。

ａ被験プローブ （被験核酸） サンドイッチハイブリダイゼーションのためのプローブ
ペアーを、たとえばＡＴＣＣからうることができる（Ａ
ＴＣＣ４１０１０）クローン化ｃ−＋＋＋ｙｃ遺伝子か
ら調製した。その遺伝子の制限酵素地図はワット（Ｗａ
ｔｔ）らの、「プロシーディンゲスψオブ・ザ・ナショ
ナルφアカデミ−・オブ・サイエンス８０巻、６３０７
〜６３１１頁（１９８３）Ｊに記載されている。

（被験核酸の二次処理） 前記ｃ−ｍｙｃ遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｂ
ａ　１およびＰｓｔ　Ｉで処理し、その断片をアガロー
スゲルから単離し、精製し、デテクタープローブおよび
キャプチャリングプローブを調製するために適当なベク
ターにサブクローン化した。

（被験デテクタープローブ） 前記ｃ−ｍｙｃ遺伝子のｌｌ１ｎｄＩＩＩ　−Ｘｂａ　
Ｉ制限酵素断片３．７ｋｂの一本鎖テール（ｔａｉｌｓ
）をＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖にした。Ｉ（ｉ
ｎｄｍリンカ−を、えられた平滑末端ＤＮＡ断片にＴ４
−ＤＮＡ−リガーゼを用いて挿入した。フェノール抽出
を行なったあと、ＤＮＡを制限酵素器ｎｄｎＩで処理し
た。

ついで、そのＤＮＡ断片を制限酵素器ｎｄＩＩ［の制限
酵素部位でプラスミドｐＢＲ３２２にクローン化し、１
２５工で標識されたｄＣＴＰを用いてニックトランスレ
ーションによって標識した。

（被験キャプチャリングプローブ） ｃ−ｍｙｃ遺伝子のＸｂａ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片１．
１ｋｂをＭ１３ｍｐ１０およびＭ１３ｍｐＨファージク
ローニングベクターの制限酵素Ｘｂａ　ＩおよびＰｓｔ
Ｉの制限酵素部位間にクローン化し、ついでそれを１５
０ｎｇＤＮＡ／直径１ｃｍでニトロセルロースフィルタ
ーに固定した。

（ｔｌ）標準曲線の測定 標準曲線の測定に用いたサンプルはｃ−ｍｙｃ遺伝子の
アルカリ変性ｐＩ３Ｒ３２２クローンからなっていた。

前記被験プローブを加えたサンドイッチハイブリダイゼ
ーション溶液は、４ＸＳＳＣ，１×デンハルト液、ニシ
ン精液（ｈｅｒｒｉｎｇ　５ｐｅｒｌＷ）ＤＮＡ　２０
０μｚ　／　ｍｌおよび０．２％ＳＤＳからなっていた
。ハイブリダイゼーションを６５℃で１７〜１９時間行
ない、ついでそのフィルターを５０℃で洗浄溶液（０，
Ｉ　Ｘ５ＳＣおよび０．２％ＳＤＳ　）中で洗浄した。

つぎにサンドイッチハイブリッドに付加された標識をガ
ンマカウンター中で計測した。

えられた標準曲線を第１表に示す。

第　　１　　表 （ｃ）遺伝子数のＷＪ定 サンプルは（１）ヒトの胎盤由来の細胞、および（２）
　ｔ：　トエばＡＴＣＣ力ら、ｔ　ラレ６　（ＡＴＣＣ
−ＣＣＣ２２０）ＧＯ＋０３２０細胞を用いた。ＤＮＡ
を両方のサンプルから単離し、アルカリ煮沸によって変
性された同量の細胞ＤＮＡを、サンプルとしてテストに
供した。アルカリ変性はサンプル中に存在するあらゆる
ＲＮＡを加水分解した。

テストはｃ−ｍｙｃフィルターおよびｃ−Ｋｌ−ｒａｓ
　Ｉフィルターと各サンプルについて標準ＤＮＡおよび
被験ＤＮＡの両方を測定することを可能にする２つの標
識した試薬を各サンプルに添加することによって行った
。ｃ−Ｋｌ−ｒａｓ、■の測定に基づいて、各サンプル
は同量のＤＮＡを含有することが見出され、Ｃｏ１ｏ３
２０細胞におけるｃ−ｍｙｃ遺伝子は正常な状態におけ
るよりも約１６〜２０倍高いコピー数で存在すると推定
されつる。その結果を第２表に示す。

第　　２　　表 （注）＊；ブランクフィルターからの読み取り値はおの
おのの読み取り値から減じ た。

実施例２ 増殖された遺伝子の定量 （ａｌ核酸試薬およびその調製 （１）標準プローブ （細胞標準核酸） 対照核酸はマウス中のメタロチオニンのプロモーター領
域、すなわちＭＴ遺伝子ＤＮＡは直近上流に存在する。

ＭＴ遺伝子の構造は、バブラキス（Ｐａｖｌａｋｉｓ）
およびハマー（Ｈａｍｅｒ）の、「プロシーディンゲス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス、８０巻、３９７〜４０１頁、（１９８３）年」に記
載されている。参照核酸断片は、たとえばベクター９Ｂ
ＰＶ−ＭＭｎｅｏ（４３２−１２）　（ＡＴＣＣ３７２
２４）にクローン化して利用可能であ１．たとえばＡＴ
ＣＣからうることができる。

（細胞標準核酸の二次処理） 前記ＭＴ遺伝子を、プラスミドｐＡＴ１５３中にサブク
ローン化するために制限酵素ＫｐｎＩ、　　ＢｇｌＩＩ
およびＥｃｏＲＩで処理した。Ｋｐｎ　Ｉテールをリン
カ−でＨｉｎｄＩＩＩテールに変換した。

（標準デテクタープローブ） メタロチオニン遺伝子のプロモーター領域の上流に位置
するＥｃｏＲＩ　−Ｋｐｎ　Ｉ　−（ＩｌｉｎｄｌＩ［
）約１．２ｋｂ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩの制限酵素部位間でプラスミドｐＡＴ１５３に
クローン化し、ついで３２Ｐで標識されたヌクレオシド
トリホスフェートを用いてニックトランスレーションに
よって標識した。

（標準キャプチャリングプローブ） メタロチオニン遺伝子のプロモーター領域およびその上
流領域からなる　Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片０．
８ｋｂを制限酵素Ｋｐｎ　ＩおよびＢａｍＨＩの制限酵
素部位間でファージベクターＭＨｍｐ１８およびＭ１３
ＩＩｐ１９にクローン化し、ついでニトロセルロースフ
ィルターに固定した。

（２Ｊ被験プローブ （被験核酸） サンドイッチハイブリダイゼーションテストのためのプ
ローブペアーを重版のプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒ　（
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ｍｙｃｔｈｅｓ
ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
社製、製品番号５３６９ＳＳ）を用いて調製した。該プ
ラスミドの構造は、シー（Ｌｅｅ）らの「ネーチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）２９４巻、２２８〜２３２頁（１９８１
）Ｊに記載されている。

（被験核酸の二次処理） ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子のｃＤＮ
Ａを含有するプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒを制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで処理した。

（被験デテクタープローブ） プラスミドｐＭＴＶｄｈｒｒのＤＨＦＲ遺伝子をコード
する領域に対応するｌｌ１ｎｄＩＩＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ
断片０．７５ｋｂを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａ
ＩＩＩＩ　Ｉの制限酵素部位間でプラスミドベクターｐ
ＡＴ１５３中に挿入し、ついでそれを３２Ｐで標識され
たヌクレオシドトリホスフェートを用いてニックトラン
スレーションすることによって標識した。

（被験キャプチャリングプローブ） プラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒのＭＭＴＶ遺伝子領域から
採られたｌｌｉｎｄｍ断片１．４ｋｂをＭ１３ｍｐ１８
およびＭ１３ｍｐ１９ファージベクファージベクター中
し、ついでそれを１５０ｎｌＮＡ／直径１ｃｍでニトロ
セルロースフィルターに固定した。

市漂準曲線の測定 テスト用のサンプルはプラスミドＩ）ＭＴＶｄｈｆｒか
らの精製ＤＮＡであった。テスト自体は、計測のために
液体シンチレーションカウンターを用いたほかは実施例
１曲に記載されたようにして行なった。えられた標準曲
線を第３表に示す。

第　　　　３　　　　表 （ｃ）遺伝子数の測定 Ｄ　ＩＩ　Ｆ　Ｒ遺伝子のｌｌＲＮＡに対応する種々の
量のｃＤＮＡにトランスフェクションされたものであっ
て、ＡＴＣＣから入手可能なマウス繊維芽細胞旧ｌｌ３
Ｔ３由来の株化細胞（ＡＴＣＣＣＲＬＬ８５８）を細胞
培養プレートで培養し、サンプルとして用いた。その細
胞をドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶解し、ついでそ
のＤＮＡを注射器から皮下注射針を通してしぼり出すこ
とによって切断した。約１０６個の細胞に相当するサン
プル２５０μｇをホモジェネートから採１．これにＮａ
０Ｉｌ　５０μｇを添加した。サンプルを煮沸し、酢酸
およびハイブリダイゼーション混合液で中和した。その
全量は０．５ｍｌであった。前記プローブすべてを同時
に加え、いわゆるブランクフィルターを基礎対照（ｂａ
ｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ）として加えた。計
測のために液体シンチレーションカウンターを用いたほ
かは実施例１（ｂ）と同様にしてハイブリダイゼーショ
ン、洗浄および標識計測を行なった。

その結果を第４表に示す。

［以下余白］ ＭＴ遺伝子は、サンプルに存在する細胞数を測定する内
部マーカー（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｍａｒｋｅｒ）である
〇えられた結果は、このテストにおいて１０６個の細胞
数が１６５　＋　２０ｃｐＩＩｌのＭＴ特異的シグナル
を与えたことを示している。

ＤＩＩＰＲ試薬はＤＨＦＲ−ｃＤＮＡの量を測定する。

細胞の数はＭＴ特異的シグナルから推定された。このよ
うに、種々の株化細胞におけるＤＨＦＲ−ｃＤＮＡコピ
ー数の測定は第４表に示すように可能である。

実施例３ メツセンジャーＲＮＡの定量 実施例２に記載した被験プローブを用いて、ＤｔｌＰＲ
−ｃＤＮＡ由来のｍＲＮＡの量を測定することも可能で
ある。プラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒの構造は、ＤＨＦＲ
遺伝子の転写がＭＭＴＶプロモーターで始まるようなも
のである。生じるメツセンジャーは長さが約１．ｏｋｂ
である。このうち、約０．２５ｋｂはプロモーターＭＭ
ＴＶ領域由来のものであ１．その残りはＤＩＩＰＲ−ｃ
ＤＮＡからのものである（リ−らの「ネイチャー、２９
４巻、２２８〜２３２頁（１９８１）Ｊ参照）。

（１）標準プローブ 細胞標準核酸、標準デテクタープローブおよび標準キャ
プチャリングプローブは実施例２に記載したのと同様で
あった。

（２）被験プローブ 被験核酸、被験デテクタープローブおよび被験キャプチ
ャリングプローブは実施例２に記載したのと同様であっ
た。

■標準曲線の測定 インビトロ転写によって調製されたジヒドロ葉酸リダク
ターゼに対応するメツセンジャーＲＮＡからなるサンプ
ルを標準曲線測定に用いた。

その転写に必要とされるＤＮＡをプラスミド１）ＭＴＶ
ｄｈｆ’ｒのＭＭＴＶプロモーターのＨｉｎｄＩＩＩ断
片Ｌ　、　４ｋｂおよび旧ｎｄＩ［Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ
断片（ＤＨＦＲ−ｃＤＮＡ）０．７５ｋｂを互いに隣接
させて制限酵素旧ｎｄＩ［ＩおよびＢａｍＨＩの制限酵
素部位間でプラスミドｐｓＰ６４中にサブクローン化す
ることによって調製した。

サンプルＲＮＡを０．２％ＳＤＳ水溶液に蓄えた。サン
ドイッチハイブリダイゼーションテストを、変性は行な
わなかったほかは実施例１曲および実施例２曲に記載し
たようにして行なった。えられた標準曲線を第５表に示
す。

第　　５　　表 （ｃ）メツセンジャーＲＮＡ分子数の測定ＤＨＦＲ遺伝
子に対応するメツセンジャーＲＮＡ分子の数を実施例２
に記載した株化細胞から測定した。

細胞をドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶解し、そのＤ
ＮＡを注射器から細い皮下注射針を通してしぼり出すこ
とによって切断した。約５×１０６個の細胞に相当する
ホモジェネートのサンプル２５０μｇを採った。ついで
ホモジエネートを変性することなく、サンドイッチハイ
ブリダイゼーションテストに伏した。サンドイッチハイ
ブリダイゼーションはＤＨＦＲプローブのみをハイブリ
ダイゼーション溶液に添加したほかは、実施例２〈Ｃ）
および実施例１（ｂ）に記載したのと同様に起った。ホ
モジエネート２５０μｇの並列して行なったテストサン
プルにおいて、細胞数をＭＴプローブを用いて、実施例
２（ｃ）に記載したようにして測定した。その結果を第
６表に示す。

［以下余白］ その結果は株化細胞ＩがＤＨＦＲ遺伝子から１細胞あた
り約１００個のメツセンジャーＲＮＡ分子を産生じ、株
化細胞■がＤＨＦＲ遺伝子から１細胞あたり約５００個
のメツセンジャーＲＮＡ分子を産生じたことを示してい
た。

実施例４ 溶液ハイブリダイゼーションによる増幅された遺伝子の
定量 （田核酸試薬およびその調製 （１）標準プローブ 細胞標準核酸、標準デテクタープローブおよび標準キャ
プチャリングプローブは実施例２と同様のものを用いた
。プラスミドｐＡＴ１５３のＥｃｏＲＩ　−Ｋｐｎ　Ｉ
　−（ｌＩｉｎｄＩＩ［）断片１．２ｋｂを、ニックト
ランスレーションにより　　１で標識したデオキシシチ
ジンで標識した。Ｍ１３　ｍｐ１８および８１３ｍ　ｐ
１９ファージベクターのＫｐｎ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断
片０．８ｋｂを、フォトプローブ　（Ｐｈｏｔｏｐｒｏ
ｂｃ”）Ｍ 試薬（ベクター・ラボラトリーズ（１／ｅｃｔｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒＩｅｓ）社製、カリフォルニア（ｃＡ）
、ＵＳＡ　Ｓ製品番号５Ｐ−１０００）を用いビオチン
で修飾した。

（２）被験プローブ 試験核酸、被験デテクタープローブおよび被験キャプチ
ャリングプローブは実施例２と同様のものを用いた。プ
ラスミドｐＡＴ１５３のＩｌｌｎｄｍ−ＢａｌＩＩ断片
０．７５ｋｂを　　■で標識したデオキシシチジンで標
識した。Ｍ１３ＩＩｌｐ１８およびＭＬ８ｍｐ１９ファ
ージベクターのｌ１１ｎｄＩ［Ｉ断片１．４ｋｂを前記
フォトプローブＴＭを用いてビオチン化 （ｂｌｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）　Ｌ、た。

■標準曲線の決定 知られた量の細胞を用いて細胞標準曲線を作成し、その
曲線からＭＴ−遺伝子を認識する標準プローブを用いて
ハイブリダイゼーションシグナルを測定した。プラスミ
ドｐＭＴＶｄｈｒｒおよびこのプラスミドを認識する被
験プローブを用いて被験核酸標準曲線を作成した。０．
８Ｍ　ＮａＣ２，２０ｍＭリン酸バッフｙ　−（１）１
１７．５）　、Ｉ　ＩＩＩＭ　ＥＤＴＡおよび４％ポリ
エチレングリコール（ＰＥ０８０００）からなる溶液２
００μΩ中で７０”Ｃで１．５時間ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。反応後、ストレプトアビジン−アガロ
ース（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社製、メリ
ーランド、ＵＳＡ　。

製品番号５９４２ＳＡ）　５０．［Ｚ　ｉｔおよびＩ　
Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５
）および１ｍＭ　ＥＤＴＡを最終容量５００μｇまで添
加した。ハイブリッドをストレプトアビジン−アガロー
ス上で３７℃で１５分間集めた。アガロースを３７℃（
７）　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ＆緩衝液で５分間で１度、つぎに
５５℃の　１５ｍＭ　ＮａＣ＆　。

１．５ｍＭクエン酸ナトリウムで２分間で２度洗浄した
。ガンマカウンター中でアガロースを測定することによ
って結合したハイブリッドの量を測定した（シベネン（
Ｓｙｖｍｎｅｎ）らの「ヌクレイツク・アシッズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）　Ｊ　Ｌ
４巻、５０３７〜５０４１１１頁（１９８８）参照）。

結果を第７表および第８表に示す。

［以下余白］ 第　　７　　表 第　　８　　表 （ｃ）遺伝子数のｎ１定 およそ２　Ｘ　１０６細胞に相当するサンプルあたりの
容量が１２５μｇであったほかは、同様の方法にしたが
って実施例２に記載した株化細胞のサンプルを処理した
。細胞数および被験核酸分子数の測定を、細胞サンプル
、適当なデテクタープローブおよびキャプチャリングプ
ローブ、およびハイブリダイゼーション混合物の成分を
最終容ｆｆｉ　２００μｇまで添加することによって別
々のバイアル中で行なった。細胞標準ＤＮＡまたは細胞
被験ＤＮＡを用いない対照アッセイも行なった。ハイブ
リダイゼーション、ハイブリッドの収集、洗浄および測
定を実施例４（ｂ）に記載したようにして行なった。実
施例４曲に記載したように平行して作成された標準曲線
から結果を読みとった。えられた結果を第９表に示す。

〔以下余白コ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　一定のユニットあたりの一定の核酸分子数を、該ユ
   ニット中にいくつかのコピーで存在する可能性のある被
   験核酸分子数を該ユニットあたり有利にも一定数で存在
   する選ばれた標準核酸分子数と比較することによって測
   定することを特徴とするサンドイッチハイブリダイゼー
   ションまたは溶液ハイブリダイゼーションによる核酸分
   子の定量法。 ２（ａ）サンプルに存在する核酸が、必要であれば、該
   核酸がハイブリダイゼーション反応に関与しうる形にさ
   れたものであり、 （ｂ）ハイブリダイゼーション反応を、妨げるいかなる
   核酸も必要であれば、ハイブリダイゼーションテストを
   妨げえない形に翻訳されたものであり、 （ｃ）サンプル中に存在する核酸が、分割されることな
   くまたは必要なときには分割されて、いくつかのコピー
   で存在する可能性のある核酸分子に充分に相同な少なく
   とも１つの被験プローブペアー、および有利にも一定数
   で存在する核酸分子に充分に相同な少なくとも１つの選
   ばれた適当な標準プローブペアーと接触され；該被験プ
   ローブペアーおよび該標準プローブペアーのデテクター
   プローブが適当な検定可能な標識で標識されており、該
   被験プローブペアーおよび該標準プローブペアーのキャ
   プチャリングプローブが適当な担体に固定されているか
   、またはえられたハイブリッドの単離を可能にする物質
   が該キャプチャリングプローブに固定されており、 （ｄ）ハイブリダイゼーション反応が行なわれたのち、
   被験ハイブリッドおよび標準ハイブリッドが必要なとき
   に分離され、該付加された標識が測定され；一定のユニ
   ットあたりの核酸分子数が被験核酸数および標準核酸数
   を比較することによってえられる特許請求の範囲第１項
   記載の定量法。 ３　被験核酸および標準核酸がデオキシリボ核酸である
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の定量法。 ４　被験核酸がリボ核酸であり標準核酸がデオキシリボ
   核酸である特許請求の範囲第１項または第２項記載の定
   量法。 ５　被験核酸および標準核酸がリボ核酸である特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の定量法。 ６　被験核酸がデオキシリボ核酸であり標準核酸がリボ
   核酸である特許請求の範囲第１項または第２項記載の定
   量法。 ７　ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ I 遺伝子のＨｉｎｄIII断片
   のＢｇｌII−ＢｇｌII断片１．１ｋｂからなる組み換え
   プラスミドであって、該ＨｉｎｄIII断片がプラスミド
   ｐＢＲ３２２中にクローン化されており該ＢｇｌII−Ｂ
   ｇｌII断片がプラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素Ｂａｍ
   Ｈ I の制限酵素部位中にサブクローン化されたもので
   ある標準プローブペアーのデテクタープローブ、および
   ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ I 遺伝子のＨｉｎｄIII断片のＢ
   ｇｌII−ＨｉｎｄIII断片０．５ｋｂからなる組み換え
   ファージであって、該ＨｉｎｄIII断片がプラスミドｐ
   ＢＲ３２２中にクローン化されており該ＢｇｌII−Ｈｉ
   ｎｄIII断片がＭ１３ｍｐ１０およびＭ１３ｍｐ１１フ
   ァージベクターの制限酵素ＢａｍＨ I およびＨｉｎｄ
   IIIの制限酵素部位間にサブクローン化されたものであ
   る標準プローブペアーのキャプチャリングプローブが、
   個々にまたは被験プローブペアーとともに、分割されて
   いないかまたは必要なときには分割された核酸サンプル
   と接触させられる特許請求の範囲第１項、第２項、第３
   項または第４項記載の定量法。 ８　マウスメタロチオニン遺伝子のプロモーター領域の
   上流からのＥｃｏＲ I −Ｋｐｎ I （ＨｉｎｄIII）断
   片１．２ｋｂからなる組み換えプラスミドであって、該
   断片がプラスミドｐＡＴ１５３の制限酵素ＥｃｏＲ I
   およびＨｉｎｄIIIの制限酵素部位間にサブクローン化
   されたものである標準プローブペアーのデテクタープロ
   ーブ、およびメタロチオニン遺伝子のプロモーター領域
   およびその上流領域からのＫｐｎ I −ＢｇｌII断片０
   ．８ｋｂからなる組み換えファージであって、該断片が
   Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ファージベクター
   の制限酵素Ｋｐｎ I およびＢａｍＨ I の制限酵素部位
   間にサブクローン化されたものである標準プローブペア
   ーのキャプチャリングプローブが、個々にまたは被験プ
   ローブペアーとともに、分割されていないかまたは必要
   なときには分割された核酸サンプルと接触させられる特
   許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載
   の定量法。 ９　ｃ−ｍｙｃがん遺伝子の増幅の程度および／または
   該遺伝子に対応するメッセンジャーＲＮＡ分子の数を測
   定するために、ｃ−ｍｙｃ遺伝子ののＨｉｎｄIII−Ｘ
   ｂａ I 断片３．７ｋｂからなる組み換えプラスミドで
   あって、該断片がプラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素Ｈ
   ｉｎｄIIIの制限酵素部位にサブクローン化されたもの
   である被験プローブペアーのデテクタープローブ、およ
   びｃ−ｍｙｃ遺伝子のＸｂａ I −Ｐｓｔ I 断片１．１
   ｋｂからなる組み換えファージであって、該断片がＭ１
   ３ｍｐ１０およびＭ１３ｍｐ１１ファージベクターの制
   限酵素Ｘｂａ I およびＰｓｔ I の制限酵素部位間にサ
   ブクローン化されたものである被験プローブペアーのキ
   ャプチャリングプローブが、個々にまたは標準プローブ
   ペアーとともに、分割されていないかまたは必要なとき
   には分割された核酸サンプルと接触させられる特許請求
   の範囲第１項、第２項、第３項、第６項、第７項または
   第８項記載の定量法。 １０　ジヒドロ葉酸リダクターゼまたはＤＨＦＲ遺伝子
   の増幅の程度および／または該遺伝子に対応するメッセ
   ンジャーＲＮＡ分子の数を測定するために、プラスミド
   ｐＭＴＶｄｈｆｒのＤＨＦＲ遺伝子をコードするＨｉｎ
   ｄIII−ＢｇｌII断片０．７５ｋｂからなる組み換えプ
   ラスミドであって、該断片がプラスミドベクターｐＡＴ
   １５３の制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨ I の制限
   酵素部位間にサブクローン化されたものである被験プロ
   ーブペアーのデテクタープローブ、およびプラスミドｐ
   ＭＴＶｄｈｆｒのＭＭＴＶ遺伝子領域のＨｉｎｄIII断
   片１．４ｋｂからなる組み換えファージであって、該断
   片がＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ファージベク
   ターの制限酵素ＨｉｎｄIIIの制限酵素部位間にサブク
   ローン化されたものである被験プローブペアーのキャプ
   チャリングプローブが、個々にまたは標準プローブペア
   ーとともに、分割されていないかまたは必要なときには
   分割された核酸サンプルと接触させられる特許請求の範
   囲第１項、第２項、第３項、第６項、第７項または第８
   項記載の定量法。 １１　少なくとも１つの被験プローブペアーおよび少な
   くとも１つの標準プローブペアーを含有し、該被験プロ
   ーブペアーおよび該標準プローブペアーの両方のデテク
   タープローブが適当な標識で標識されており、該被験プ
   ローブペアーおよび該標準プローブペアーの両方のキャ
   プチャリングプローブが適当な担体に固定されているか
   またはサンドイッチハイブリッドの単離を可能にする物
   質が該キャプチャリングプローブに固定されていること
   を特徴とする核酸分子の定量のための試薬。 １２　ｃ−ｍｙｃがん遺伝子の増幅の程度および／また
   は該遺伝子に対応するメッセンジャーＲＮＡ分子の数の
   測定に用いる被験プローブペアーのデテクタープローブ
   がｃ−ｍｙｃ遺伝子のＨｉｎｄIII−Ｘｂａ I 制限酵素
   断片３．７ｋｂからなる組み換えプラスミドであり、該
   断片がプラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素ＨｉｎｄIII
   の制限酵素部位にサブクローン化されており、被験プロ
   ーブペアーのキャプチャリングプローブが該ｃ−ｍｙｃ
   遺伝子のＸｂａ I −Ｐｓｔ I 断片１．１ｋｂからなる
   組み換えファージであり、該断片がＭ１３ｍｐ１０およ
   びＭ１３ｍｐ１１ファージベクターの制限酵素Ｘｂａ
   I およびＰｓｔ I の制限酵素部位間にサブクローン化
   されており、標準プローブペアーのデテクタープローブ
   がヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ I 遺伝子のＨｉｎｄIII断片の
   ＢｇｌII−ＢｇｌII断片１．１ｋｂであり、該Ｈｉｎｄ
   III断片がプラスミドｐＢＲ３２２にクローン化されて
   おり、該ＢｇｌII−ＢｇｌII断片がプラスミドｐＢＲ３
   ２２の制限酵素ＢａｍＨ I の制限酵素部位にサブクロ
   ーン化されており、標準プローブペアーのキャプチャリ
   ングプローブが該ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ I 遺伝子のＨｉｎ
   ｄIII断片のＢｇｌII−ＨｉｎｄIII断片０．５ｋｂから
   なる組み換えファージであり、該ＨｉｎｄIII断片が該
   ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ I 遺伝子のプラスミドｐＢＲ３２２
   にサブクローン化されており、該ＢｇｌII−ＨｉｎｄI
   II断片がＭ１３ｍｐ１０およびＭ１３ｍｐ１１ファージ
   ベクターの制限酵素ＢａｍＨ I およびＨｉｎｄIIIの制
   限酵素部位間にサブクロー化されている特許請求の範囲
   第１１項記載の試薬。 １３　ジヒドロ葉酸リダクターゼまたはＤＨＦＲ遺伝子
   の増幅の程度および／または該遺伝子に対応するメッセ
   ンジャーＲＮＡ分子の数の測定に用いる被験プローブペ
   アーのデテクタープローブがプラスミドｐＭＴＶｄｈｆ
   ｒのＤＨＦＲ遺伝子をコードするＨｉｎｄIII−Ｂｇｌ
   II断片０．７５ｋｂからなる組み換えプラスミドであり
   、該断片がプラスミドベクターｐＡＴ１５３の制限酵素
   ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨ I の制限酵素部位にサブク
   ローン化されており、被験プローブペアーのキャプチャ
   リングプローブがプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒのＭＭＴ
   Ｖ遺伝子領域のＨｎｄIII断片１．４ｋｂからなる組み
   換えファージであり、該断片がＭ１３ｍｐ１８およびＭ
   １３ｍｐ１９ファージベクターの制限酵素ＨｉｎｄIII
   の制限酵素部位にサブクローン化されており、標準プロ
   ーブペアーのデテクタープローブがマウスメタロチオニ
   ン遺伝子のプロモーター領域の上流からのＥｃｏＲ I
   −Ｋｐｎ I 断片１．２ｋｂからなる組み換えプラスミ
   ドであり、該断片がプラスミドｐＡＴ１５３の制限酵素
   ＥｃｏＲ I およびＨｉｎｄIIIの制限酵素部位間にサブ
   クローン化されており、標準プローブペアーのキャプチ
   ャリングプローブがプロモーター領域およびそ上の流領
   域によって形成されたメタロチオニン遺伝子のＫｐｎ
   I −ＢｇｌII断片０．８ｋｂからなる組み換えファージ
   であり、該断片がＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９
   ファージベクターの制限酵素Ｋｐｎ I およびＢａｍＨ
   I の制限酵素部位間にサブクローン化されている特許
   請求の範囲第１１項記載の試薬。