NO175380B - Fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av nukleinsyremolekyler og reagenspakke til bruk ved utförelse av fremgangsmåten - Google Patents
Fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av nukleinsyremolekyler og reagenspakke til bruk ved utförelse av fremgangsmåtenInfo
- Publication number
- NO175380B NO175380B NO870794A NO870794A NO175380B NO 175380 B NO175380 B NO 175380B NO 870794 A NO870794 A NO 870794A NO 870794 A NO870794 A NO 870794A NO 175380 B NO175380 B NO 175380B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- fragment
- gene
- hindiii
- nucleic acid
- standard
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 76
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 75
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 75
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 51
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 124
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 36
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 31
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 23
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 claims description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 6
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 5
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 5
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 101150026150 mt gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av visse nukleinsyremolekyler, særlig graden av amplifikasjon av gener og/eller tilsvarende budbringer RNA-molekyler ved bruk av sandwich- eller oppløsnings-hybridiseringsmetoden. En annen side ved oppfinnelsen angår den reagenspakke som anvendes ved fremgangsmåten.
Antallet kopier individuelle gener i genomet er vanligvis konstant. I noen tilfeller er der bare ett gen pr. haploid genom, og i andre tilfeller er der flere. Under visse omstendig-heter kan antallet kopier forandre seg. Amplifikasjonen av visse gener er f.eks. funnet å ha forbindelse med utviklingen av kreft. Det er også vist at ytre faktorer, såsom farmasøytika og metaller etc. forårsaker amplifikasjon av visse gener. For utviklingen av en sykdom er det feilaktige eller økede ekspresjonsnivå av et gen såsom et onkogen, dvs. mengden av budbringer RNA i cellen, av største viktighet. Økede antall av noen kromosomer er årsaken til visse arvelige sykdommer eller andre forstyrrelser, mens noen arvelige sykdommer bare krever duplika-sjon av ett recessivt gen. I alle slike tilfeller er det viktig å bestemme antallet kromosomer eller gener som foreligger.
Antallet av visse DNA-molekyler, f.eks. graden av amplifikasjon av gitte gener, bestemmes for tiden ved digestering av det ekstraherte DNA som skal undersøkes ved hjelp av restriksjonsenzymer og ved separering av nukleotidfragmentene i henhold til lengde ved agarosegel-elektroforese. Deretter blir det enkelttrådede DNA overført og festet til et nitrocellulosefilter, hvor hybridisering finner sted ved anvendelse av det gen som skal undersøkes eller en del av dette gen som en sonde. Resultatene fås ved autoradiografi (Southern, J. Mol. Biol. 98, pp. 503-517, 1975). I hver parallell analyse er mengden av cellulært DNA den samme.
Intensitetene av hybridiseringsbåndene, dvs. signalene, sammenlignes og forholdene mellom kopitallene av genene under under-søkelse i forsøksprøvene anslås. Fremgangsmåten gir bare tilnærmede resultater. På samme måte måles RNA ved bruk av Northern-blotting-metoder eller dot-blotting-metoder. Disse metoder er kvantitativt meget unøyaktige (Thomas, Methods in Enzymol-, 100. pp. 255-266, 1983).
Kjente metoder, såsom Southern- og Northern-blottingsmetoder er langsomme og vanskelige å utføre. Da de bare gir tilnærmede resultater, er deres diagnostiske verdi tvilsom i tilfeller hvor det er viktig å kjenne antallet av visse nukleinsyremolekyler pr. gitt enhet, såsom en celle.
Sandwich- eller oppløsnings-hybridiseringsmetoder beskrevet i US-PS 4.486.539 og i britisk patentsøknad nr. GB 2 169 403 er kvantitative (Virtanen et al., Lancet 1, pp. 381-383, 1983). Dessuten krever fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en standard nukleinsyre, hvis kopitall er konstant og tillater bestemmelsen av antallet relevante nukleinsyremolekyler pr. gitt enhet, såsom en celle, nukleus, ribosom eller kromosom.
Formålet med oppfinnelsen er å skaffe en nøyaktig og hurtig kvantitativ metode til nukleinsyremolekylbestemmelse som også er hurtigere og enklere å utføre enn de metoder som for tiden brukes. Den kan anvendes til diagnose av kreft og prenatal diagnose, for påvisning av agenter som bevirker genamplifikasjon og til demonstrasjon av utviklingen av f.eks. medikamentresistens, samt til bestemmelsen av ekspresjonsnivået av budbringer RNA. Oppfinnelsens formål oppnås ved en fremgangsmåte og en reagenspakke til bruk i fremgangsmåten, kjennetegnet ved de trekk som fremgår av patentkravene.
Minst to bestemmelser er nødvendige i den foreliggende oppfin-nelse. Én bestemmer nukleinsyremolekylet, som kan foreligge i flere kopier, forsøksnukleinsyren. Den andre bestemmer det grunnleggende nukleinsyremolekyl som med fordel foreligger i konstant antall, standardnukleinsyren. I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen angir et nukleinsyremolekyl en bestemt nukleotidsekvens på 10-12 nukleotider eller et gen inneholdende flere tusen nukleotider. Det kan også bety et budbringer RNA eller en nukleotidsekvens betraktelig lengre enn et enkelt gen, dvs. et ampiikon.
Bestemmelsen av forsøks- og standard-nukleinsyrer utføres ved bruk av en ellers vanlig sandwich-hybridiseringsmetode beskrevet f.eks. i US-PS 4.486.539 eller en oppløsnings-hybridiseringsmetode beskrevet i britisk patentsøknad nr. GB 2 169 403. Oppfinnelsen angår også en reagenspakke inneholdende nukleinsyrereagenser bestående av minst ett forsøkssondepar og minst ett standardsondepar.
Reagensene eller sondene som anvendes i fremgangsmåten, fremstilles ved bruk av rekombinant DNA-teknikker fra nukleinsyrer som er tilstrekkelig homologe med forsøks- og standardnuklein-syrene. Tilstrekkelig homologe nukleinsyrer kan også fremstilles syntetisk og semisyntetisk.
Forsøks- og standard-nukleinsyrene kan isoleres direkte fra celler og identifiseres ved forskjellige hybridiseringsteknik-ker. Slike forsøks- og standardnukleinsyrer er imidlertid også tilgjengelige i handelen og fra forskjellige genbanker. Forsøks-og standard-nukleinsyrer kan være enten DNA eller RNA.
Sondepar som er egnet for sandwich- eller oppløsnings-hybridise-ringsmetoden fremstilles fra nukleinsyrer som er tilstrekkelig homologe med forsøks- og standard-nukleinsyrene ved rekombinant DNA-teknikker. De relevante nukleinsyrer digesteres ved egnede restriksjonsenzymer; minst to av de resulterende restriksjons-fragmenter som er anordnet forholdsvis nær hinannnen klones til minst to egnede vektorer. Et av fragmentene, detektorsonden, merkes med en egnet detekterbar markør, og den andre, oppfan-gingssonden, blir enten festet til en egnet bærer eller et stoff festes til denne, hvilket stoff tillater separasjon av den resulterende hybrid fra hybridiseringsblandingen ved hjelp av et annet stoff, såsom den komplementære komponent av et affinitetspar.
Forsøks- og standard-sondeparene kan bygges sammen i egnede reagenspakker, hvor forsøks- og standard-sondeparene er begge DNA eller RNA eller forsøkssondeparet er DNA og standardsondeparet er RNA, eller omvendt. Den forutgående og ytterligere behandling av prøvene før hybridiseringen og hybridiserings-betingelsene bør derfor rette seg etter de sondepar som benyttes i forsøket.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særlig egnet til bestemmelse av antallet nukleinsyremolekyler direkte fra cellulære homogenater. Fremgangsmåten kan selvsagt også anvendes til bestemmelse av rensede eller rene nukleinsyrer. Før fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres, bør imidlertid den mest egnede forbehandling av nukleinsyreprøven velges.
Det er mulig å utføre både DNA- og RNA-bestemmelser ved bruk av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Deoksyribonukleinsyrer denatureres for oppnåelse av enkelttråder, om nødvendig. Enkelttrådede budbringer RNA-molekyler som potensielt forstyrrer hybridiseringsforsøket kan hydrolyseres, f.eks. ved alkalisk koking. Prøven denatureres ikke i forbindelse med ribonuklein-syrebestemmelser, da den dobbelttrådede dioksyribonukleinsyre ikke virker forstyrrende inn på RNA-bestemmelsen. Det er selvsagt mulig å bryte opp DNA med deoksyribonuklease, eller forandre det kjemisk eller mekanisk slik at det ikke kan ta del i hybridiseringsreaksjonen. Derfor må, i forbindelse med DNA- og RNA-bestemmelser, en egnet fremgangsmåte til ytterligere behanding av prøven velges, eller alternativt denne ytterligere behandling kan sløyfes. Valget av en egnet fremgangsmåte for den videre behandling er selvsagt avhengig av fremgangsmåten som benyttes i forbehandlingen av nukleinsyreprøven. En rekke fremgangsmåter til forbehandling og videre behandling av nukleinsyreprøver er blitt beskrevet i litteraturen, hvilket tillater at den mest egnede metode kan velges i hvert tilfelle.
Bestemmelser hvor både forsøks- og standard-nukleinsyrene er enten DNA eller RNA kan utføres ved bruk av en udelt prøve. Bestemmelser hvor forsøksnukleinsyrene er DNA og standardnuk-leinsyrene RNA eller omvendt, må utføres ved bruk av en delt prøve, da forskjellige fremgangsmåter for videre behandling er nødvendige. Prøven kan selvsagt deles, selv om forsøks- og standard-nukleinsyrene er av den samme nukleinsyretype.
Selve hybridiseringsforsøket utføres ved at den udelte prøve-oppløsning bringes i berøring samtidig med minst ett forsøks-sondepar og ett standardsondepar. Dersom prøveoppløsningen er blitt delt, bringes den separat i berøring med minst ett forsøkssondepar og et standardsondepar. I slike tilfeller blir mengden av forsøksnukleinsyre bestemt i én reaksjonsbeholder og mengden av standardnukleinsyre i den andre.
Uansett hvorvidt prøven deles eller ikke, tillates hybridiseringen å finne sted ved de mest fordelaktige betingelser og tidsrom i hvert tilfelle. Straks reaksjonen eller reaksjonene har funnet sted, blir de resulterende forsøks- og standardhybrider separert fra hybridiseringsblandingen eller -blandingene ved bæreren og vasket, eller ved et isolasjonsmiddel såsom det komplementære medlem av et affinitetspar. Markøren som er festet til forsøks-og standardhybridene måles og resultatet sammenlignes med standardkurver. På denne måte kan antallet nukleinsyremolekyler som skal undersøkes bestemmes pr. valgte enhet.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er av praktisk diagnostisk verdi, særlig i påvisningen av visse typer kreft. I småcellede lungekarsinom er c-myc-genet ofte amplifisert og dets ekspresjonsnivå adskillig høyere enn i normalt vev. I tilfeller av neuroblastoma er N-myc-genet amplifisert.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også benyttes til å vise de mutagene eller karsinogene virkninger av visse midler eller utviklingen av medikamentresistens. Det er kjent at ytre seleksjonstrykk kan føre til øket ekspresjon av et bestemt gen. I behandlingen av kreft utvikler celler motstandsevne overfor et gitt medikament ved amplifikasjon av genet, hvis ekspresjonspro-dukt inaktiverer medikamentet. Et slikt tilfelle er metotreksat som induserer amplifikasjon av genet for dihydrofolatreduktase (DHFR). Et ytterligere eksempel er amplifikasjon av genet for metallotionin under påvirkning av kadmium.
Ekspresjonsnivået for et gen er viktig fra fenotypen og celle-funksjonens synspunkt. Dette kan undersøkes ved måling av mengden budbringer RNA, som korrelerer med mengden protein som det koder for. Transkripsjonsproduktet av et onkogen bestemmer måten som dette til slutt vil uttrykkes på.
Ekspresjonsnivåene av et onkogen varierer avhengig av celletype, differensieringsnivå og utviklingsfase av cellen. F.eks. på et visst stadium av fosterutvikling kopieres c-myc-onkogenet hurtig, mens på et annet trinn er denne meget langsom. Graden av amplifikasjon korrelerer ofte med ekspresjonsnivået av genet, skjønt det sistnevnte kan øke betydelig uten at den førstnevnte gjør det. I slike tilfeller bestemmes onkogenets rolle best ved måling av dets ekspresjonsnivå snarere enn antallet kopier. I noen tilfeller kan kvanititativ bestemmelse av budbringer RNA være enklere og mer praktisk enn kvantifisering av selve genproduktet. Som et eksempel kan nevnes c-myc-onkogenet, et labilt protein som lett koaguleres ved varme.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også benyttes til identifisering av numeriske kromosomale abnormaliteter, såsom Downs syndrom. I prenatal diagnostikk er det også mulig å bestemme hvorvidt fosteret er defekt, dvs. homozygot for et eller annet recessivt gen.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og nukleinsyrereagensene som anvendes i fremgangsmåten er beskrevet i nærmere detalj neden-under .
Eksempel 1
Kvantifisering av en amplifisert onkogen
a) Nukleinsyrereaqenser og deres fremstillinq
STANDARDSONDER
Celle- standardnukleinsyre
c-Ki-rasI-genet er tilstede i alle menneskelige celler. Sondeparene for sandwich-hybridisering ble fremstilt ved subkloning av HindIII-fragmentet av c-Ki-rasI-genet som i lengde målte 3,8 kb, hvis restriksjonskart er blitt beskrevet av Chang et al., PNAS 79, pp 4848-52, 1982. Fragmentet er tilgjengelig f.eks. klonet inn i pBR322-plasmidet (ATCC 41032) og kan fås f.eks. fra
ATCC culture collection.
Videre behandling av celle- standardnukleinsvren
pBR322-klonen beskrevet ovenfor ble behandlet med Bglll- og Hindlll-restriksjonsenzymer, og de resulterende fragmenter ble isolert fra agarosegel; rensede fragmenter som var anordnet nær hinannen ble subklonet inn i to egnede vektorer for fremstilling av detektor- og oppfangingssondene.
Standard detektorsonde
Et Bglll-Bglll-fragment som i lengde målte ca. 1,1 kb ble subklonet inn i BamHI-restriksjonsenzymsetet av pBR322-plasmidet og merket ved nick-translasjon med <125>I-merket dCTP.
Standard oppfangingssonde
Bglll-Hindlll-fragmentet på ca. 0,5 kb ble innsatt i M13 mplO-og mpll-fag-vektorer mellom restriksjonssetene for BamHI- og Hindlll-restriksjonsenzymene og festet til et nitrocellulosefilter (150 ng DNA/dia 1 cm).
FORSØKSSONDER
Forsøksnukleinsyre
Et sondepar for sandwich-hybridisering ble fremstilt fra et klonet c-myc-gen som kan fås f.eks. fra ATCC culture collection (ATCC 41010). Restriksjonskartet for genet er blitt beskrevet av Watt et al., PNAS 80, pp. 6307-6311, 1983.
Videre behandling av forsøksnukleinsyren
c-myc-genet ble behandlet med Hindlll-, Xbal- og Pstl-restriksjonsenzymer og fragmentene isolert fra agarosegelen, renset og subklonet inn i egnede vektorer for å fremstille detektor- og oppfangingssondene.
Forsøks- detektorsonde
De enkelttrådede haler av Hindlll-Xbal-restriksjonsfragmentet av c-myc-genet, som målte 3,7 kb i lengde, ble gjort dobbelttrådede ved DNA-polymerase. Hindlll-linkerne ble innsatt ved T4-DNA-ligase i de resulterende DNA-fragmenter med butt ende; etter fenolekstraksjon ble DNA behandlet med Hindlll-restriksjonsenzymet. DNA-fragmentet ble deretter klonet inn i pBR322-plasmidet ved restriksjonssetet for Hindlll-restriksjonsenzymet og merket ved nick-translasjon med 125I-merket dCTP.
Forsøks- oppfangingssonde
Det 1,1 kb store Xbal-Pstl-fragment av c-myc-genet ble klonet inn i M13 mplO- og mpll-fagkloningsvektorene mellom restriksjonssetene for Xbal- og Pstl-restriksjonsenzymene og festet til nitrocellulosefilteret (150 ng DNA/dia 1 cm).
b) Bestemmelse av standardkurven
Prøvene som ble benyttet til bestemmelse av standardkurven besto
av en alkalisk-denaturert pBR322-klon av c-myc-genet. Sandwich-hybridiseringsoppløsningen, til hvilken de ovenfor angitte forsøkssonder ble tilsatt, besto av 4 x SSC, 1 x Denhardts oppløsning, 200 /xg/ml sildesperma-DNA og 0,2 prosent SDS. Hybridisering fant sted ved 65°C i 17-19 timer, hvoretter filtrene ble vasket i vaskeoppløsningen (0,1 x SSC 0,2 prosent SDS) ved 50°C. Markøren som var festet til sandwichhybridene ble deretter tellet i gamma-telleren.
c) Bestemmelse av antall gener
Prøvene omfattet 1) celler fra en morkake fra menneske og 2)
Colo 3 20-celler som kan fås f.eks. fra ATCC culture collection (ATCC-CCC220) . DNA ble isolert fra begge prøver, og den samme mengde celle-DNA denaturert ved alkalisk koking ble satt til i begge forsøk. Alkalisk denaturering hydrolyserte eventuelt RNA som forelå i prøven.
Forsøket ble utført ved at der til hver prøve ble tilsatt både c-myc- og c-Ki-rasI-filtrene og de to merkede reagenser, hvilket tillot måling av både standard- og forsøks-DNA for hver prøve. På basis av c-Ki-rasI-bestemmelsene ble hver prøve funnet å inneholde den samme mengde DNA, og det kan derav sluttes at c-myc-genet i Colo 320-celler foreligger i et 16-20 ganger høyere kopitall enn i den normale situasjon. Resultatene er vist i tabell 2.
Eksempel 2
Kvantifisering av amplifisert gen
a) Nukleinsyrereagenser og deres fremstilling
STANDARDSONDER
Celle- standardnukleinsvre
Sammenligningsnukleinsyren ble tatt fra promotorområdet av metallotioningenet hos mus, dvs. MT-genet, og DNA umiddelbart på oversiden av det. Strukturen av MT-genet er blitt beskrevet av Pavlakis og Hamer, PNAS 80_, pp. 397-401, 1983. Referanse-nukleinsyrefragmentet er tilgjengelig f.eks. klonet inn i pBPV-MMTneo (342-12)-vektoren (ATCC 37224) og kan fås f.eks. fra ATCC culture collection.
Ytterligere behandling av celle- standardnukleinsyre
Det MT-gen som er beskrevet ovenfor ble behandlet med Kpnl-, Bglll- og EcoRI-restriksjonsenzymer for subkloning inn i pAT153-plasmidet. Kpnl-halen ble omdannet til en Hindlll-hale med en linker.
Standard deteksionssonde
EcoRI-Kpnl-(Hindlll)-fragmentet som målte ca. 1,2 kb og var anordnet på oversiden av promotorområdet for metallotioningenet ble klonet til pAT153-plasmidet mellom restriksjonssetene for EcoRI- og Hindlll-restriksjonsenzymene og merket ved nick-translasjon med <32>P-merket nukleosidtrifosfater.
Standard oppfangin<g>ssonde
Kpnl-Bglll-fragmentet på 0,8 kb omfattende promotorområdet for metallotioningenet og området på oversiden av dette ble klonet inn i M13 mpl8- og M13 mpl9-fagvektorer mellom restriksjonssetene for Kpnl- og BamHI-restriksjonsenzymene og festet til nitrocellulosefilteret.
FORSØKSSONDER
Forsøksnukleinsvre
Sondeparet for sandwich-hybridiseringsforsøket ble fremstilt ved bruk av det i handelen tilgjengelige pMTVdhfr-plasmid (Betfiesda Research Laboratories, produkt nr. 53 69SS), hvilken struktur er beskrevet av Lee et al., Nature 294. pp. 228-232, 1981.
Videre behandling av forsøksnukleinsyre
pMTVdhfr-plasmidet inneholdende cDNA av dihydrofolatreduktase-genet (DHFR) ble behandlet med Hindlll- og Bglll-restriksjonsenzymer.
Forsøks- deteksi onssonde
Hindlll-Bglll-fragmentet som målte 0,75 kb og svarte til området som koder for DHFR-genet av pMTVdhfr-plasmidet ble innsatt i plasmid pAT153-vektoren mellom restriksjonssetene for Hindlll-og BamHI-restriksjonsenzymene og merket ved nick-translasjon med <32>P-merket nukleosidtrifosfater.
Forsøks- oppfangingssonde
Et HindiII-fragment som målte 1,4 kb tatt fra MMTV-genområdet av pMTVdhfr-plasmidet ble klonet inn i M13 mpl8- og M13 mpl9-fagvektorene.
b) Bestemmelse av standardkurven
Prøven som ble brukt i forsøket var renset DNA fra pMTVdhfr-plasmidet. Selve forsøket ble utført som beskrevet i eksempel lb, med den unntagelse at en væske-scintillasjonsteller ble brukt til telling. Den resulterende standardkurve er vist i tabell 3.
c) Bestemmelse av antallet gener
Cellelinjer som var skaffet fra fibroblastcelle NIH 3T3 fra mus,
hvilken cellelinje er tilgjengelig fra ATCC culture collection og som har nummer CRL 1658 og som var blitt transfisert med forskjellige mengder cDNA svarende til mRNA av DHFR-genet ble dyrket på celledyrkingsplater og benyttet som prøven. Cellene ble lysert ved bruk av natriumdodecylsulfat og deres DNA ble brutt opp ved anvendelse av skjærkrefter, idet de ble presset gjennom en fin hypoderm nål fra en injeksjonssprøyte. En 250 pl prøve svarende til ca. IO<6> celler ble tatt fra homogenatet og 50 /il NaOH tilsatt. Prøven ble kokt og nøytralisert med eddiksyre og hybridiseringsblandingen. Det samlede volum var 0,5 ml. Alle sondene som er beskrevet ovenfor ble tilsatt samtidig, og et såkalt blindfilter ble tilsatt som en bakgrunn-sammenlignings-prøve. Hybridisering, vasking og markørtelling ble utført som i
eksempel lb, bortsett fra at en væske-scintillasjonsteller ble brukt til telling. Resultatene er vist i tabell 4.
MT-genet er en indre markør som måler antallet celler som foreligger i en prøve. Resultatene viser at i dette forsøk ga IO<6> celler et MT-spesifikt signal på 165 + 20 cpm. DHFR-reagensene måler mengden DHFR-cDNA. Antallet celler ble utledet fra det MT-spesifikke signal. Det var således mulig å bestemme antallet DHFR-cDNA-kopier i forskjellige cellelinjer som vist i tabell 4.
Eksempel 3
Kvantifisering av budbringer RNA
a) Nukleinsyrereagenser og deres fremstilling
Ved bruk av forsøkssondene beskrevet i eksempel 2, er det også
mulig å måle mengden mRNA som fås fra DHFR-cDNA. Strukturen av pMTVdhfr-plasmidet er slik at transkripsjonen av DHFR-genet begynner ved MMTV-promotoren. De resulterende budbringere er ca. 1,0 kb lange. Av dette fås 0,25 kb fra MMTV-promotorområdet og resten fra DHFR-cDNA (Lee et al., Nature 294, pp. 228-232, 1981).
STANDARDSONDER
Celle-standardnukleinsyren, standard-detektor- og standard-oppfangingssonden var som beskrevet i eksempel 2.
FORSØKSSONDER
Forsøksnukleinsyren, forsøks-detektor- og forsøks-oppfangings-sonden var som beskrevet i eksempel 2.
b) Bestemmelse av standardkurven
Prøven som ble brukt til standardkurve-bestemmelse besto av
budbringer RNA svarende til dihydrofolatreduktase-genet fremstilt ved in vitro transkripsjon. Det DNA som var nødvendig for transkripsjon ble fremstilt ved subkloning av 1,4 kb Hindlll-fragmentet av MMTV-promotoren av pMTVdhfr-plasmidet og 0,75 kb Hindlll-Bglll-fragmentet (DHFR-cDNA) ved siden av hverandre inn i pSP64-plasmidet (Promega Biotec) mellom restriksjonssetene for Hindlll- og BamHI-restriksjonsenzymene. Prøve-RNA ble lagret i 0,2 prosent SDS vandig oppløsning.
Sandwich-hybridiseringsforsøket ble utført som beskrevet i eksempel lb og 2b, men denatureringen ble sløyfet.
c) Bestemmelse av antallet budbringer RNA- molekvler Antallet budbringer RNA-molekyler som svarer til DHFR-genet, ble
bestemt fra cellelinjene som beskrevet i eksempel 2.
Cellene ble lysert ved bruk av natriumdodecylsulfat, og deres DNA ble underkastet lett skjærbehandling ved pressing gjennom en fin hypoderm nål fra en injeksjossprøyte. En 250 /xl prøve av homogenatet ble tatt, svarende til ca. 5 x IO<6> celler. Homogenatet ble deretter satt til sandwich-hybridiseringsforsøket uten denaturering. Sandwich-hybridisering fant sted som beskrevet i eksempel 2c og lb, med den unntagelse at bare DHFR-sondene ble satt til hybridiseringsoppløsningen. I en parallell prøve på 250 jul homogenat ble celleantallet bestemt ved bruk av MT-sonden som beskrevet i eksempel 2c.
Resultatene er vist i tabell 6.
Resultatene viste at cellelinje I produserte pr. celle ca. 100 budbringer RNA-molekyler fra DHFR-genene, og cellelinje II produserte ca. 500 budbringer RNA-molekyler fra DHFR-genene.
Eksempel 4
Kvantifisering av amplifisert gen ved oppløsnings-hybridisering
a) Nukleinsvrereagenser og deres fremstilling
STANDARDSONDER
Celle-standardnukleinsyre, standard-detektor- og standard-oppfangingssonde var som beskrevet i eksempel 2. 1,2 kb EcoRI-Kpnl-(Hindlll)-fragmentet i pAT153 ble merket ved nick-translasjon med <125>I-merket deoksycytidin. De 0,8 kb Kpnl-Bglll-fragmenter i M13 mpl8 og M13 mpl9 ble modifisert med biotin ved bruk av Photoprobe™-reagensen (Vector Laboratories, CA, USA, produktnr. SP-1000).
FORSØKSSONDER
Forsøksnukleinsyren, forsøks-detektor- og forsøks-oppfangings-sonden var som beskrevet i eksempel 2. 0,75 kb Hindlll-Bglll-fragmentet i pAT153 ble merket med <125>I-merket deoksycytidin. 1,4 kb HindiII-fragmentene i M13 mpl8 og M13 mpl9 ble biotiny-lert ved bruk av Photoprobe™ som angitt ovenfor.
b) Bestemmelse av standardkurvene
En celle-standardkurve ble fremstilt ved bruk av en kjent mengde
celler, fra hvilke hybridiseringssignalet ble målt ved bruk av standardsondene som kjente igjen MT-genet. En forsøksnuklein-syre-standardkurve ble fremstilt med pMTVdhfr-plasmidet og forsøkssondene som kjente igjen dette plasmid. Hybridiseringer ble utført i 200 pl av en oppløsning bestående av 0,6 M NaCl, 20 mM fosfatbuffer, pH 7,5, 1 mM EDTA, 4 prosent polyetenglykol (PEG 6000) i 1,5 timer ved 70°C. Etter reaksjonen ble 50 jul streptavidin-agarose (Bethesda Research Laboratories, Maryland, USA, produktnr. 5942SA), og 1 M NaCl, 10 mM natriumfosfat, pH 7,5, 1 mM EDTA satt til det endelige volum på 500 ul. Hybridene ble samlet opp på streptavidin-agarosen ved 37°C i 15 minutter. Agarosen ble vasket én gang i 5 minutter med den buffrede 1 M NaCl-oppløsning ved 37°C og to ganger i 2 minutter med 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitrat ved 55°C. Mengden bundne hybrider ble bestemt ved måling av agarosen i en gammateller. (Syvanenen et al., Nucleic Acids Res. 14, 5037-5048, 1986). Resultatene er vist i tabell 7 og 8.
c) Bestemmelse av antallet gener
Prøver av cellelinjene beskrevet i eksempel 2 ble behandlet på
lignende måte, bortsett fra at volumet pr. prøve svarende til ca. 2 x IO<6> celler var 125 fil. Bestemmelsen av antall celler og antall forsøksnukleinsyre-molekyler ble utført i separate ampuller ved tilsetning av celleprøven, de riktige detektor- og oppfangingssonder og komponentene av hybridiseringsblandingen til et endelig volum på 200 fil. Sammenligningsprøver uten cellestandard eller forsøks-DNA ble inkludert. Hybridisering, oppsamling av hybrider, vasking og måling ble utført som beskrevet i eksempel 4b. Resultatene ble avlest fra standardkurver fremstilt i parallell som beskrevet i eksempel 4b. Resultatene er vist i tabell 9.
Claims (12)
1. Fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av nukleinsyremolekyler ved en sandwich- eller oppløsnings-hybridiseringsmetode, karakterisert ved at antallet av visse nukleinsyremolekyler pr. gitt biologisk enhet som eksisterer i den undersøkte organisme, bestemmes ved å sammenligne antallet forsøks-nukleinsyremolekyler, som potensielt foreligger i flere kopier i enheten, med antallet valgte standard-nukleinsyremolekyler som fordelaktig foreligger i et konstant antall pr. samme enhet, ved at den udelte, eller om nødvendig delte nukleinsyreprøve, bringes i berøring med minst ett førsøkssondepar som er tilstrekkelig homologt med den nukleinsyre som bestemmes og med minst ett valgt og egnet standardsondepar som er tilstrekkelig homologt med det nukleinsyremolekyl, som fordelaktig foreligger i et konstant antall, hvilket sondepar består av en detektorsonde og en oppfangingssonde, idet detektorsondene av det nevnte forsøks-sondepar og det nevnte standardsondepar er merket med en egnet detekterbar markør og oppfangingssondene er blitt festet til en egnet bærer eller et stoff er blitt festet til de nevnte oppfangingssonder, hvilket tillater isolering av de resulterende hybrider, og etter at hybridiseringsreaksjonen eller -reaksjonene har funnet sted, separeres fofsøkshybriden og standardhybriden, om nødvendig, og den nevnte festede markør måles, idet antallet nukleinsyremolekyler pr. gitt biologisk enhet som eksisterer i den undersøkte organisme, fås ved at antallet forsøks- og standardnukleinsyrer sammenlignes.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at forsøks- og standardnuk-leinsyrene er deoksyribonukleinsyrer.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at forsøksnukleinsyren er ribonukleinsyre og standardnukleinsyren er deoksyribonukleinsyre.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at forsøks- og standardnuk-leinsyrene er ribonukleinsyrer.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at forsøksnukleinsyren er deoksyribonukleinsyre og standardnukleinsyren er ribonukleinsyre.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2 og 3, karakterisert ved at detektorsonden i standardsondeparet - et rekombinant plasmid som omfatter et 1,1 kb Bglll-Bglll-fragment av Hindlll-fragmentet av det menneskelige c-Ki-rasI-gen, idet det nevnte HindIII-fragment er klonet inn i pBR322-plasmidet og det nevnte BglII-BglII-fragment er subklonet inn i restriksjonssetet for BamHI-restriksjonsenzymet i pBR322-plasmidet - og oppfangingssondene - rekombinante fager omfattende et 0,5 kb BglII-HindIII-fragment av Hindlll-fragmentet av det menneskelige c-Ki-rasI-gen, idet det nevnte Hindlll-fragment er klonet inn i pBR322-plasmidet og det nevnte Bglll-Hindlll-fragment er subklonet inn i M13 mplO- og M13 mpll-fagvektorene mellom restriksjonssetene for BamHI- og HindiII-restriksjonsenzymene - bringes, enten hver for seg eller sammen med forsøkssondeparet, i berøring med en udelt eller om nødvendig delt nukleinsyreprøve.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2 og 3, karakterisert ved at detektorsonden av standardsondeparet - et rekombinant plasmid som omfatter et 1,2 kb EcoRl-Kpnl(Hindlll)-fragment fra oversiden av promotorområdet av mus-metallotioningenet, hvilket fragment er blitt subklonet inn i pAT153-plasmidet mellom restriksjonssetene for restriksjonsenzymene EcoRI og Hindlll - og oppfangingssondene - rekombinante fager omfattende et 0,8 kb KpnI-BglII-fragment fra promotorområdet for metallotioningenet og området på oversiden av det, hvilket fragment er blitt subklonet inn i M13 mpl8- og M13 mpl9-fagvektorene mellom restriksjonssetene for Kpnl- og BamHI-restriksjonsenzymene - bringes, enten hver for seg eller sammen med forsøkssondeparet, i berøring med en udelt eller når nødvendig delt nukleinsyreprøve.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2, 5, 6 og 7, karakterisert ved at for bestemmelse av graden av amplifikasjon av c-myc-onkogenet og/eller antallet budbringer RNA-molekyler som svarer til dette gen, idet detektorsonden av forsøkssondeparet - et rekombinant plasmid som omfatter et 3,7 kb HindIII-XbaI-fragment av c-myc-genet, idet det nevnte fragment er blitt subklonet inn i pBR322-plasmidet ved restriksjonssetet for Hindlll-restriksjonsenzymet - og oppf angingssondene - rekombinante fager omfattende et 1,1 kb Xbal-Pstl-fragment av c-myc-genet, hvilket fragment er blitt subklonet inn i M13 mplO- og M13 mpll-fagvektorene mellom restriksjonssetene for Xbal- og Pstl-restriksjonsenzymene - bringes, enten hver for seg eller sammen med standardsondeparet, i berøring med en udelt eller om nødvendig en delt nukleinsyreprøve.
9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2, 3, 6 og 7, karakterisert ved at for bestemmelse av graden av amplifikasjon av dihydrofolatreduktase- eller DHFR-genet og/eller antallet budbringer RNA-molekyler som svarer til dette gen, idet detektorsonden av forsøkssondeparet - et rekombinant plasmid omfattende et 0,75 kb Hindlll-Bglll-fragment som koder for DHFR-genet av pMTVdhfr-plasmidet, hvilket fragment er blitt subklonet inn i pAT153-plasmid-vektoren mellom restriksjonssetene for Hindlll- og BamHI-restriks jonsenzymene - og oppfangingssondene - rekombinante fager som omfatter et 1,4 kb Hindi 11-fragment av MMTV-genområdet av pMTVdhf r-plasmidet, hvilket fragment er blitt subklonet inn i M13 mpl8- og M13 mpl9-fagvektorene ved restriksjonssetet for Hindlll-restriksjonsenzymet - bringes, enten hver for seg eller sammen med standardsondeparet, i berøring med en udelt eller om nødvendig en delt nukleinsyre-prøve .
10. Reagenspakke for den kvantitative bestemmelse av nukleinsyremolekyler, ved en fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at pakken inneholder minst ett forsøkssondepar og minst ett standardsondepar, idet detektor sondene av både forsøkssondeparet og standardsondeparet er merket med en egnet markør, og oppfangingssondene er blitt festet til en egnet bærer eller et egnet stoff er blitt festet til oppfangingssondene, hvilket tillater isolering av sandwich-hybrider.
11. Reagenspakke som angitt i krav 10, karakterisert ved at detektorsonden i f orsøkssondeparet som anvendes for bestemmelsen av graden av amplifikasjon av c-myc-onkogenet, og/eller antallet budbringer RNA-molekyler som svarer til dette gen, er et rekombinant plasmid som omfatter et 3,7 kb Hindlll-Xbal-restriksjons-fragment av c-myc-genet, hvilket fragment er blitt subklonet inn i pBR322-plasmidet ved restriksjonssetet for Hindlll-restriksjonsenzymet, og oppfangingssondene er rekombinante fager som omfatter et 1,1 kb Xbal-Pstl-fragment av c-myc-genet, hvilket fragment er blitt subklonet inn i M13 mplO- og M13 mpll-fagvektorene mellom restriksjonssetene for Xbal- og Pstl-restriksjonsenzymene, og detektorsonden i standardsondeparet er et 1,1 kb BglII-BglII-fragment av Hindlll-fragmentet av det menneskelige c-Ki-rasI-gen, idet det nevnte HindIII-fragment er blitt klonet inn i pBR322-plasmidet og det nevnte Bglll-Bglll-fragment er blitt subklonet inn i pBR322-plasmidet ved restriksjonssetet for BamHI-restriksjonsenzymet, og oppfangingssondene er rekombinante fager som omfatter et 0,5 kb BglII-HindII-fragment av Hindlll-fragmentet av c-Ki-rasI-genet, idet det nevnte HindIII-fragment er blitt subklonet inn i pBR322-plasmidet for c-Ki-rasI-genet, og det nevnte Bglll-Hindlll-fragment er blitt subklonet inn i M13 mplO- og M13 mpll- fagvektorene mellom restriksjonssetene for BamHI- og Hindlll-restriksj onsenzymene.
12. Reagenspakke som angitt i krav 10, karakterisert ved at detektorsonden i forsøkssondeparet som anvendes til bestemmelse av graden av amplifikasjon av dihydrofolatreduktase- eller DHFR-genet og/eller antallet budbringer RNA-molekyler som svarer til dette gen er et rekombinant plasmid som omfatter et 0,75 kb Hindlll-BglII-fragment som koder for DHFR-genet av pMTVdhfr-plasmidet, hvilket fragment er blitt subklonet inn i pAT153-plasmid-vektoren mellom restriksjonssetene for Hindlll- og BamHI-restriks jonsenzymene, og oppfangingssondene er rekombinante fager som omfatter et 1,4 kb HindIII-fragment av MMTV-genområdet for pMTVdhfr-plasmidet, hvilket fragment er blitt subklonet inn i M13 mpl8- og M13 mpl9-fagvektorene ved restriksjonssetet for Hindlll-restriksjonsenzymet, og detektorsonden av standardsondeparet er et rekombinant plasmid som omfatter et 1,2 kb EcoRI-Kpnl-fragment fra oversiden av promotorområdet av mus-metallotioningenet, hvilket fragment er blitt subklonet inn i pAT153-plasmidet mellom restriksjonssetene for EcoRI- og Hindlll-restriksjonsenzymene, og oppfangingssondene er rekombinante fager som omfatter et 0,8 kb Kpnl-Bglll-fragment av metallotioningenet som er dannet av promotorområdet og området på oversiden av det, hvilket fragment er blitt subklonet inn i M13 mpl8- og M13 mpl9-fagvektorene mellom restriksjonssetene for Kpnl- og BamHI-restriksjonsenzymene.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI860836A FI76119C (fi) | 1986-02-27 | 1986-02-27 | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO870794D0 NO870794D0 (no) | 1987-02-26 |
| NO870794L NO870794L (no) | 1987-08-28 |
| NO175380B true NO175380B (no) | 1994-06-27 |
| NO175380C NO175380C (no) | 1994-10-05 |
Family
ID=8522222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO870794A NO175380C (no) | 1986-02-27 | 1987-02-26 | Fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av nukleinsyremolekyler og reagenspakke til bruk ved utförelse av fremgangsmåten |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62205800A (no) |
| KR (1) | KR870008033A (no) |
| AT (1) | AT393511B (no) |
| AU (1) | AU603562B2 (no) |
| BE (1) | BE1001168A4 (no) |
| CA (1) | CA1287558C (no) |
| CH (1) | CH675593A5 (no) |
| DD (1) | DD270383A5 (no) |
| DE (1) | DE3706285A1 (no) |
| DK (1) | DK174784B1 (no) |
| ES (1) | ES2061411A6 (no) |
| FI (1) | FI76119C (no) |
| FR (1) | FR2594849B1 (no) |
| GB (1) | GB2187283B (no) |
| HU (1) | HU201808B (no) |
| IE (1) | IE66904B1 (no) |
| IL (1) | IL81695A (no) |
| IS (1) | IS3197A7 (no) |
| IT (1) | IT1202581B (no) |
| LU (1) | LU86792A1 (no) |
| NL (1) | NL195097C (no) |
| NO (1) | NO175380C (no) |
| NZ (1) | NZ219421A (no) |
| PT (1) | PT84368B (no) |
| SE (1) | SE468816B (no) |
| ZA (1) | ZA871401B (no) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714380A (en) | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| EP0304845A3 (en) * | 1987-08-28 | 1991-03-06 | Profile Diagnostic Sciences Inc. | Method and kit for assaying gene expressions |
| DE68921918T2 (de) * | 1988-05-09 | 1995-09-07 | Univ Temple | Verfahren zur Voraussage der Wirksamkeit einer antineoplastichen Behandlung bei einzelnen Patienten. |
| AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| AU5731790A (en) * | 1989-05-18 | 1990-12-18 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Rna probe for detecting c-fes mrna |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| DK138090D0 (da) * | 1990-06-06 | 1990-06-06 | Novo Nordisk As | Diagnostisk analysemetode |
| DE69214243T2 (de) * | 1991-09-23 | 1997-02-06 | Pfizer | Verfahren für die Detektion von spezifische mRNS und DNS in Zellen |
| US6300058B1 (en) | 1992-01-29 | 2001-10-09 | Hitachi Chemical Research Center, Inc. | Method for measuring messenger RNA |
| GB9210916D0 (en) * | 1992-05-21 | 1992-07-08 | Isis Innovation | Nucleic acid quantification |
| CA2140763A1 (en) * | 1992-07-28 | 1994-02-03 | Masato Mitsuhashi | Gene detection system |
| US5580971A (en) * | 1992-07-28 | 1996-12-03 | Hitachi Chemical Company, Ltd. | Fungal detection system based on rRNA probes |
| ES2055661B1 (es) * | 1993-01-20 | 1995-03-01 | Univ Malaga | Determinacion de la expresion genica por captura especifica de arn y su cuantificacion directa por electroforesis capilar en zona libre. |
| GB9309966D0 (en) * | 1993-05-14 | 1993-06-30 | Nordion Int Inc | Detection of prostrate-specific antigen in breast tumors |
| GB9415489D0 (en) * | 1994-08-01 | 1994-09-21 | Nordion Int Inc | Detection of prostate-specific antigen in amniotic fluid |
| AT401062B (de) * | 1994-09-26 | 1996-06-25 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung von nukleinsäuren |
| JP5565781B2 (ja) | 2010-03-31 | 2014-08-06 | 有限会社山口ティー・エル・オー | 核酸クロマトグラフ法を利用した肺炎原因菌の検出方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4442203A (en) * | 1981-06-30 | 1984-04-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Gene amplification assay for detecting tumor promoters |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| AU555146B2 (en) * | 1982-03-15 | 1986-09-11 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Method for intorducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products materials |
| CA1252046A (en) * | 1982-11-04 | 1989-04-04 | Martin J. Cline | Methods for oncogenic detection |
| FI71768C (fi) * | 1984-02-17 | 1987-02-09 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
| US4675283A (en) * | 1984-07-19 | 1987-06-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Detection and isolation of homologous, repeated and amplified nucleic acid sequences |
| FI72146C (fi) * | 1985-01-02 | 1987-04-13 | Orion Yhtymae Oy | Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror. |
| FR2583771B1 (fr) * | 1985-06-21 | 1988-12-09 | Centre Nat Rech Scient | Sequences d'adn d'archaebacteries homologues a l'oncogene v-myc, proteines codees par ces sequences, leurs procedes d'obtention et leurs applications immunologiques |
-
1986
- 1986-02-27 FI FI860836A patent/FI76119C/fi not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-02-25 JP JP62042442A patent/JPS62205800A/ja active Granted
- 1987-02-26 IE IE49687A patent/IE66904B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 NZ NZ219421A patent/NZ219421A/xx unknown
- 1987-02-26 FR FR878702541A patent/FR2594849B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 CA CA000530691A patent/CA1287558C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 AT AT431/87A patent/AT393511B/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 IT IT19501/87A patent/IT1202581B/it active
- 1987-02-26 KR KR870001680A patent/KR870008033A/ko not_active Application Discontinuation
- 1987-02-26 IS IS3197A patent/IS3197A7/is unknown
- 1987-02-26 BE BE8700177A patent/BE1001168A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 SE SE8700821A patent/SE468816B/sv not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 LU LU86792A patent/LU86792A1/fr unknown
- 1987-02-26 DK DK198700993A patent/DK174784B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 ES ES08700776A patent/ES2061411A6/es not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-26 DE DE19873706285 patent/DE3706285A1/de active Granted
- 1987-02-26 NO NO870794A patent/NO175380C/no unknown
- 1987-02-26 GB GB8704517A patent/GB2187283B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 ZA ZA871401A patent/ZA871401B/xx unknown
- 1987-02-26 CH CH756/87A patent/CH675593A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 HU HU87750A patent/HU201808B/hu unknown
- 1987-02-26 AU AU69275/87A patent/AU603562B2/en not_active Expired
- 1987-02-26 NL NL8700483A patent/NL195097C/nl not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 PT PT84368A patent/PT84368B/pt unknown
- 1987-02-27 DD DD87300286A patent/DD270383A5/de unknown
- 1987-02-27 IL IL81695A patent/IL81695A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO175380B (no) | Fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av nukleinsyremolekyler og reagenspakke til bruk ved utförelse av fremgangsmåten | |
| US5741677A (en) | Methods for measuring telomere length | |
| Buck et al. | Action of a RAP1 carboxy-terminal silencing domain reveals an underlying competition between HMR and telomeres in yeast. | |
| Hendrix et al. | High prevalence of latently present cytomegalovirus in arterial walls of patients suffering from grade III atherosclerosis. | |
| Wemmie et al. | Cadmium tolerance mediated by the yeast AP-1 protein requires the presence of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene, YCF1. | |
| Baker et al. | Purification of the yeast centromere binding protein CP1 and a mutational analysis of its binding site | |
| Bouton et al. | Fine-structure analysis of the DNA sequence requirements for autonomous replication of Saccharomyces cerevisiae plasmids | |
| CN108103245B (zh) | 检测慢病毒质量指标组合的方法及其应用 | |
| Shell et al. | Xeroderma pigmentosum complementation group C protein (XPC) serves as a general sensor of damaged DNA | |
| CN108642156A (zh) | 一种t790m基因突变的数字pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
| Malim et al. | Functional characterization of a complex protein-DNA-binding domain located within the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat leader region | |
| CN107119110A (zh) | 微量样本中人类基因组DNA SRY基因的TaqMan探针实时荧光PCR检测的引物 | |
| Flessel et al. | The MF alpha 1 gene of Saccharomyces cerevisiae: genetic mapping and mutational analysis of promoter elements. | |
| EP2019136A1 (en) | Method for detecting or quantifying wheat endogenous dna and method for determining contamination rate of genetically modified wheat in test sample | |
| CN110387411A (zh) | 用于检测狼疮性肾炎或评估狼疮性肾炎风险的方法及其应用 | |
| CN108998516A (zh) | 快速检测人类y染色体微缺失的多重pcr引物组、试剂盒和应用 | |
| CN110305938A (zh) | 一种用于定量检测cho宿主细胞dna残留量的引物对及检测方法 | |
| CN109762901B (zh) | 用于富集低频dna突变的dna探针应用于多种突变的同时检测 | |
| Bermudez-Cruz et al. | Characterization of an abundant, unique 1.7-kilobase bovine herpesvirus 4 (BHV-4) late RNA and mapping of a BHV-4 IE2 transactivator-binding site in its promoter-regulatory region | |
| CN114958980A (zh) | 一种检测hiv基因组拷贝数的方法 | |
| Mathison et al. | Mutations in the anticodon stem affect removal of introns from pre-tRNA in Saccharomyces cerevisiae | |
| Tsuchiya et al. | Characterization of a DNA uptake reaction through the nuclear membrane of isolated yeast nuclei | |
| RU2752902C1 (ru) | Набор олигонуклеотидов и способ мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления РНК SARS-CoV-2 | |
| CN117248017A (zh) | 人nras基因突变检测试剂盒及其应用 | |
| CN113789374A (zh) | 用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针及检测方法 |