LU86792A1 - Quantification de molecules d'acide nucleique et trousse de reactifs utilisee - Google Patents
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Description
» V
La presente invention est relative à la quantification de certaines molécules d'acide nucléique, en particulier du degré d'amplification des gènes et/ou des molécules d'ARN messager correspondant, au moyen de la méthode d'hybri-5 dation-sandwich ou en solution, et à la trousse de réactifs mise en oeuvre.
Le nombre de copies de qènes individuels dans le génome est généralement constant- Dans certains cas, il n'y a qu'un gène par génome haploïde et plusieurs dans d'autres.
10 Dans certaines circonstances, le nombre de copies peut changer. On a trouvé par exemple, que l'amplification de certains gènes est associée au développement du cancer. On sait aussi que des facteurs extérieurs, comme des produits pharmaceutiques et des métaux, etc.,, provoquent l'amplification de certains 15 cènes. Le taux d'expression défectueux ou augmenté d'un gène, comme un oncogène, c'est-à-dire la quantité d'ARN messaqer dans la cellule revêt une importance majeure pour le développement d'une maladie. Un nombre accrû de certains chromosomes est la cause de certaines maladies héréditaires ou d’autres 20 troubles, tandis que certaines maladies héréditaires ne requièrent que la duplication d'un gène récessif. Dans tous les cas, il est important de déterminer le nombre de gênes ou de chromosomes présents.
Le nombre de certaines molécules d'ADN, par 25 exemple le degré d'amplification de qènes donnes, est couramment déterminé par digestion de l'ADN extrait à étudier avec des enzymes de restriction et séparation des fragments de nucléotide en fonction de leur longueur, par électrophorèse sur qel d'agarose. L'ADN à brin unique est ensuite transféré et fixé 30 sur un filtre de nitrocellulose, où l'hybridation a lieu avec le gène à étudier ou une partie du gène en tant que sonde. Les résultats sont obtenus par autoradioqraphie (Southern, J. Mol. Biol. â§, pp. 503-517, 1975) . Dans chaque analyse parallèle, la quantité d'ADN cellulaire est la même. Les intensités des 35 bandes d'hybridation, c'est-à-dire les signaux, sont comparées et 2 les rapports entre les taux de réplication des gènes étudiés dans les échantillons d’essai, sont obtenus par déduction.
La méthode ne fournit que des résultats approximatifs. De même, l’ARN est mesuré avec les méthodes de fixation sur 5 papier-filtre (blotting) de Northern ou par points. Ces méthodes sont très imprécises quantitativement (Thomas, Methods in Enzymol., 100, pp. 255-266, 1983).
Des méthodes connues, comme les méthodes de fixation sur papier-filtre de Southern et de Northern, sont lentes et 10 difficiles à réaliser. Comme elles ne fournissent que des résultats approximatifs, leur intérêt diagnostique est douteux dans les cas où il est important de connaître le nombre de certaines molécules d'acide nucléique par unité donnée, telle qu'une cellule 15 Les méthodes d'hybridation-sandwich ou en solution, décrites dans le Brevet US N° 4 486 539 et dans la Demande de Brevet britannique N° GB 2 169 403 sont quantitatives (Virtanen et coll., Lancet 1^, pp. 381-383, 1983). De plus, la méthode de la présente invention nécessite un acide nucléique 20 standard dont le taux de réplication est constant et permet la détermination du nombre de molécules d'acide nucléique correspondant par unité donnée, comme une cellule, un noyau, un ribosome ou un chromosome.
La présente invention a pour but de produire une méthode 25 quantitative précise et rapide de détermination des molécules d'acide nucléique, qui est aussi plus rapide et plus simple à mener que les méthodes utilisées couramment. Elle peut être utilisée pour des diagnostics de cancer et prénataux, pour détecter des agents qui provoquent une amplification des 30 gènes et pour mettre en évidence le développement par exemple d'une résistance à un médicament, ainsi que pour déterminer le taux d'expression d'ARN messager.
Il faut procéder à au moins deux déterminations dans la présente invention. On détermine la molécule d'acide nucléique, 35 qui peut être présente dans plusieurs copies, à savoir l'acide 3 nucléique d'essai. Par ailleurs, on détermine la molécule d'acide nucléique constitutif avantageusement présente en nombre constant, l'acide nucléicrue étalon dit "standard".
Dans la méthode selon la présente invention, une molécule 5 d'acide nucléique représente une certaine séquence de nucléotides de 10 à 12 nucléotides ou un gène contenant plusieurs milliers de nucléotides. Elle peut aussi signifier un ARN messager ou une séquence de nucléotides beaucoup plus longue qu'un simple gène, c'est-à-dire un amplicone.
10 La détermination des acides nucléiques d'essai et standard est faite selon une méthode d'hybridâtion-sandwich par ailleurs normale, décrite par exemple dans le Brevet US N° 4 486 539 ou une méthode d'hybridation en solution décrite dans la Demande de brevet britannique N° GB 2 169 403. L'in-15 vention concerne aussi une trousse de réactifs contenant des réactifs d'acide nucléique, comprenant au moins une paire de sondes d'essai et au moins une paire de sondes standards.
Les réactifs ou sondes, utilisés dans cette méthode, sont préparés par des techniques d'ADN recombinant, à partir 20 d'acides nucléiques suffisamment homologues des acides nucléiques d'essai et standard. Des acides nucléiques suffisamment homologues peuvent aussi être préparés, par voie synthétique ou semi-synthétique.
Les acides nucléiques d'essai et standard peuvent 25 être directement isolés à partir des cellules et identifiés par diverses techniques d'hybridation. Ces acides nucléiques d'essai et standard sont cependant aussi disponibles industriellement et chez diverses banques de gènes. Des acides nucléiques d'essai et standard peuvent être des ADN ou des ARN.
30 Des paires de sondes convenables pour la méthode d'hybridation-sandwich ou en solution, sont préparées à partir d'acides nucléiques suffisamment homologues des acides nucléiques d'essai et standard par des techniques d'ADN recombinant. Les acides nucléiques correspondants sont digérés 35 par des enzymes de restriction convenables ; deux au moins 4 des fragments de restriction résultants situés relativement près les uns des autres sont clonés dans au moins deux vecteurs convenables. L'un des fragments, la sonde de détection, est marquée avec un marqueur détectable convenable et 5 l'autre, la sonde de capture, est fixée à un support convenable ou bien une substance est fixée à celle-ci, laquelle substance permet la séparation de l'hybride résultant à partir du mélange d'hybridation au moyen d'une autre substance, comme le composant complémentaire d'une paire d'affinité.
10 Les paires de sondes d'essai et standard peuvent être asemblées dans des trousses de réactifs convenables, dans lesquelles les paires de sondes d'essai et standard sont toutes deux un ADN ou un ARN, ou bien la paire de sondes d'essai est formée d'ADN et la paire de sondes standards d' 15 ARN, ou vice-versa. Le prétraitement et le traitement supplémentaire des échantillons avant l'hybridation et les conditions d'hybridation doivent donc convenir aux paires de sondes utilisées dans le test.
La méthode de la présente invention convient parti-20 culièrement pour déterminer le nombre de molécules d'acide nucléique directement à partir des homogênates cellulaires.
La méthode peut évidemment aussi être utilisée pour la détermination d'acides nucléiques purifiés ou purs. Cependant, avant d'effectuer la méthode de l'invention, on doit choisir le 25 prétraitement le plus convenable de l'échantillon d'acide nucléique.
Il est possible d'effectuer à la fois des déterminations d'ADN et d'ARN selon la méthode de l'invention. Les acides désoxyribonucléiques sont dénaturés pour obtenir des 30 brins uniques si cela est nécessaire. Des molécules d'ARN messager à brin unique perturbant potentiellement le test d'hybridation, peuvent être hydrolysées, par exemple par ébullition alcaline. L'échantillon n'est pas dénaturé dans le cas des déterminations d'acide ribonucléique, puisque l'acide 35 désoxyribonucléique à double brin n'interfère pas avec la 5 détermination d'ARN. Il est bien sûr possible de briser 1'ADN avec une désoxyribonucléase ou de la modifier chimiquement ou mécaniquement de telle sorte qu'il ne puisse pas participer à la réaction d'hybridation. A propos des détermi-5 nations d'ADN et d'ARN, une méthode convenable pour un traitement supplémentaire de l'échantillon doit donc être choisie ou, dans une variante, un tel traitement peut être omis. Le choix d'une méthode convenable pour le traitement supplémentaire dépend bien sûr de la méthode utilisée pour le traite-10 ment préliminaire de l'échantillon d'acide nucléique. De nombreuses méthodes de prétraitement et de traitement supplémentaire des échantillons d'acide nucléique ont été décrites dans la littérature, si bien qu'il est possible de choisir la méthode la plus convenable dans chaque cas.
15 Des déterminations dans lesquelles les acides nuclé iques à la fois d'essai et standard, sont soit des ADN, soit des ARN, peuvent être réalisées avec un échantillon qui n'est pas divisé. Des déterminations dans lesquelles les acides nucléiques d'essai sont des ADN et les acides nucléiques stan-20 dards sont des ARN ou vice-versa, doivent être effectuées avec un échantillon divisé, dans la mesure où il est nécessaire de procéder a différentes méthodes pour le traitement supplémentaire. L'échantillon peut évidemment être divisé, même si les acides nucléiques d'essai et standard sont du même 25 type d'acide nucléique.
Le test d'hybridation lui-même est réalisé par mise de la solution d'échantillon non-divisée, simultanément en contact avec au moins une paire de sondes d'essai, et une paire de sondes standards. Si la solution de l'échantillon 30 a été divisée, elle est mise séparément en contact avec au moins une paire de sondes d'essai et une paire de sondes standards. Dans ces cas, la quantité d'acide nucléique d'essai est déterminée dans un réacteur et la quantité d'acide nucléique standard dans un autre.
35 Que l'échantillon soit divisé ou non, on laisse 6 l'hybridation avoir lieu dans les conditions et pendant le temps les plus avantageux dans chaque cas. Lorsque le ou les réactions ont eu lieu, les hybrides d'essai et standard résultants sont séparés du ou des mélanges d'hybridation par le 5 support et lavés, ou par un agent d'isolation comme le membre complémentaire d'une paire d'affinité. Le marqueur attaché aux hybrides d'essai et standard est mesuré et le résultat est comparé à des courbes d'étalonnage.De cette façon, le nombre de molécules d'acide nucléique à étudier peut être déterminé 10 par unité choisie.
La méthode de 1'invention a un intérêt diagnostique pratique en particulier dans la détection de certains types de cancer. Dans le carcinome du poumon à petites cellules, le gêne c-myc est souvent amplifié et son taux d'expression 15 considérablement supérieur à celui qui est observé dans un tissu normal. Dans les cas de neuroblastomes, le gène N-myc est amplifié.
La méthode de la présente invention peut aussi être utilisée pour mettre en évidence les effets mutagènes ou 20 carcinogènes de certains agents, ou le développement de la résistance à un médicament. On sait qu'une pression de sélection externe peut aboutir à l'expression accrue d'un certain gêne. Dans le traitement du cancer, des cellules développent une résistance à un médicament donné par amplification du gène, 25 dont le produit d'expression inactive le médicament. Un tel cas est celui du méthotrexate qui induit une amplification du gêne pour la dihydrofolate reductase (DHFR). Un autre exemple est celui de l'amplification du gène pour la métallothionine sous l'influence du cadmium.
30 Le taux d'expression d'un gène est important du point de vue du phénotype et du fonctionnement de la cellule. On peut l'étudier en mesurant la quantité d'ARN messager qui est en relation avec la quantité de protéine codée par celui-ci. Le produit de transcription d'un oncogène détermine la 35 manière avec laquelle il sera finalement exprimé.
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Les taux d'expression d'un oncogène varient en fonction du type de cellule, du taux de différenciation et de la phase de développement de la cellule. Par exemple, à un certain stade du développement foetal, l'oncogène c-myc est 5 rapidement répliqué, tandis qu'à un autre stade, cela est très lent. Le degré d'amplification est souvent en corrélation avec le taux d'expression du gène, bien que ce dernier puisse augmenter notablement sans que le premier n'augmente. Dans ces cas, le rôle d'un oncogène est mieux déterminé par la mesure 10 de son taux d'expression plutôt que du nombre de réplication. Dans certains cas, une détermination quantitative de l'ARN messager peut être plus simple et plus commode que la quantification du gène lui-même. On peut mentionner à titre d'exemple, l'oncogène c-myc, une protéine labile facilement coagulée par 15 la chaleur.
La méthode de 11 invention peut aussi être utilisée pour identifier des anomalies chromosomiques numériques comme le syndrome de Down. Dans des diagnostics prénataux, il est aussi possible de déterminer si le foetus est anormal, c'est-à-20 dire homozygote pour un certain gène récessif.
La méthode de l'invention et les réactifs d'acide nucléique utilisés dans la méthode, sont davantage décrits ci-après.
Exemple 1 - 25 Quantification d'un oncogène amplifié, a) Réactifs d'acide nucléique et leur préparation.
Sondes standards :
Acide nucléique standard de cellule : Le gène c-Ki-rasI est présent dans toutes les cellules humaines. Les paires de sondes 30 pour 1'hybridation-sandwich ont été préparées par sous-clonage du fragment Hind III du gène c-Ki-rasI, qui a une longueur de 3,8 kb et dont la carte de restriction a été décrite par Chang et coli., PNAS 79, pp. 4848-52, 1982. Le fragment est disponible, par exemple cloné dans le plasmide pBR 322 (ATCC 35 41032) et peut être obtenu par exemple à partir de la collée- 8 tion de cultures ATCC.
-Traitement supplémentaire de l'acide nucléique standard de cellule.
Le clone pBR 322 décrit plus haut a été traité avec 5 les enzymes de restriction BglII et Hind III et les fragments résultants ont été isolés à partir du gel d'agarose ; des fragments purifiés situés dans un proche voisinage, ont été sous-clonés dans deux vecteurs convenables pour la préparation des sondes de détection et de capture.
10 - Sonde de détection standard. Un fragment BglII-BglII
mesurant environ 1,1 kb de long a été sous-cloné dans le site de l'enzyme de restriction BaraHI du plasmide pBR 322 et marqué 125 par mck-translation avec du dCTP marqué avec de 1' I.
- Sonde de capture standard. Le fragment Bglli ~ Hindlll d'en-15 viron 0,5 kb, a été inséré dans les vecteurs constitués par les phages Ml3 mplO et mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction BamHI et Hindm et fixé à un filtre de nitrocellulose (150 ng d'ADN/dia 1 cm).
Sondes d'essai.
20 - Acide nucléique d'essai. Une paire de sondes pour 1'hybrida tion-sandwich a été préparée à partir d'un gène c-myc cloné qui peut être obtenu par exemple à partir de la collection de cultures ATCC (ATCC 41010) . La carte de restriction du gène a été décrite par Watt et coli., PNAS 130, pp. 6307-6311, 1983). 25 - Traitement supplémentaire de l'acide nucléique d'essai.
Le gène c-myc a été traité avec les enzymes de restriction Hindm / Xbal et PstI et les fragments isolés à partir du gel d'agarose, purifiés et sous-clonés dans des vecteurs convenables, pour préparer les sondes de détection et de capture.
30 - Sonde de détection d'essai : les queues à brin unique du fragment de restriction HindHI-Xbal du gène c-myc, mesurant 3,7 kb de long, ont été rendues à double brin par 1'ADN polymérase. Les linkers Hindlll oht été insérés par la T4-ADN-ligase dans les fragments d’ADN à extrémités collantesrésul-35 tants ; après extraction par du phénol, 1'ADN a été traité avec 9 l'enzyme de restriction Hindill . Le fragment d'ADN a été ensuite cloné dans le plasmide pBR 322 au site de restriction de l'enzyme de restriction Hindill et marqué par nick- 125 translation avec du dCTP marqué avec de 1' I.
5 - Sonde de capture d'essai : le fragment Xbal-PstI de 1,1 kb du gène c-myc a été cloné dans les vecteurs de clonage constitués par les phages Ml3 mplO et mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction Xbal et PstI et fixé à un filtre de nitrocellulose (150 ng d'ADN/dia. 1 cm) .
10 b) Détermination de la courbe d'étalonnage.
L'échantillon utilisé pour la détermination de la courbe d'étalonnage consistait en un clone pBR 322 dénaturé par un alcalin, du gène c-myc. La solution d'hybridation-sandwich à laquelle ont été ajoutées les sondes d'essai ci-15 dessus, consistait en 4 x SSC, 1 x solution de Denhardt, 200 yg/ml d'ADN de sperme de hareng et 0,2 % de SDS. L'hybridation a eu lieu à 65°C pendant 17-19 heures, puis les filtres ont été lavés dans la solution de lavage (0,1 x SSC, 0,2 % de SDS) à 50°C. Le marqueur attaché aux hybrides-sandwich a été 20 ensuite compté dans un compteur gamma.
Tableau I
Echantillon cpm_ molécules/essai ' filtre c-myc 25 0 40 106 75 5 x 106 190 107 340 30 108 2200 c) Détermination du nombre de gènes
Les échantillons comprenaient 1) des cellules provenant d'un placenta humain et 2) des cellules colo 320, qui 35 peuvent être obtenues par exemple à partir de la collection de 10 cultures ATCC (ATCC-CCC220). L'ADN a été isolé à partir des deux échantillons et la même quantité d'ADN de cellule, dénaturé par un alcalin à l'ébullition, a été ajoutée aux essais. La dénaturation alcaline a hydrolysétout l'ARN présent 5 dans l'échantillon.
On a effectué l'essai en ajoutant à chaque échantillon à la fois les filtres c-myc et c-Ki-rasI et les deux réactifs marqués, ce qui a permis de mesurer à la fois l'ADN d'essai et standard pour chaque échantillon. En fonction des 10 déterminations c-Ki-rasI, on a trouvé que chaque essai contenait la même quantité d'ADN et on a pu eh déduire que le gène c-myc dans les cellules colo 320 est présent selon un taux de réplication 16 à 20 fois supérieur à celui qui est observé dans la situation normale. Les résultats sont indiqués dans 15 le Tableau II.
Tableau II
Echantillon filtre c-Ki-rasI Filtre c-myc cpm* cpm* nombre 20
Cellules placentaires 7 humaines 486 340 10'
Cellules colo 320 432 3205 1,6 x 10^ la lecture obtenue pour le filtre à blanc a été soustraite 25 des lectures.
Exemple 2
Quantification de gêne amplifié, a) Réactifs d'acide nucléique et leur préparation.
30 Sondes standards.
- Acide nucléique standard de cellule : l'acide nucléique témoin a été pris dans la région du promoteur du gène mêtallothionine chez la souris, c'est-à-dire le gêne MT avec l'ADN immédiatement en amont de celui-ci. La structure du gène MT a été 35 décrite par Pavlakis and Hamer, PNAS 8£, pp. 397-401, 1983.
Il
Le fragment d'acide nucléique de référence est disponible, par exemple, cloné dans le vecteur pBPV-MMneo(442-12) (ATCC 37224) et peut être obtenu par exemple â partir de la collection de cultures ATCC.
5 - Traitement supplémentaire de l'acide nucléique standard de cellule» Le gêne MT décrit plus haut a été traité avec les enzymes de restriction Kpnl, Bglll et EcoRI pour le sous-clonaqe dans le plasmide pATl53. La queue Kpnl a été convertie en queue Hindm avec un linker, 10 - Sonde de détection standard. Le fragment EcoRI-Kpnl-Olindlil) mesurant environ 1,2 kb et situé en amont de la région promotrice du gène mëtallothionine, a été cloné dans le plasmide pAT!53 entre les sites de restriction des enzymes de restriction EcoRI et HindiJT , et m a r q u é p u r nick- 15 translation avec des nucléosides triphosphates marqués avec . 32 du p, - Sonde de capture standard , Le fragment Kpni-Bglil de 0,8 kb comprenant la région du promoteur du gène mëtallothionine et la région en amont de celle-ci, a ôté cloné dans les vecteurs 20 constitués par les phages M13 mpl8 et Ml3 mpl9 entre les sites de restriction des enzymes de restriction Kpnl et BamIII et fixé à un filtre de nitrocellulose.
Sondes d'essai.
- Acide nucléique d'essai, La paire de sondes pour le teut 25 d'hybridation-sandwich a été préparée avec le plasmide pMTVdhfr disponible industriellement (Bethesda Research Laboratories, produit w° 5369SS) dont la structure est décrite par Lee et coll., Nature 294, pp. 228-232, 1981,
Traitement supplémentaire de 1'acide nucléique d'essai.
30 Le plasmide pMTVdhfr contenant l'ADNc du qëne pour la dihydro-folate réductase (DHFR) a été traité avec les enzymes de restriction Hindlii et Bgllï .
- Sonde de détection d'essai. Le fragment Hindu 1- Bglll mesurant 0,75 kb et correspondant â la région codant pour le 35 gêne DHFR du plasmide pMTVdhfr a été inséré dans le vecteur
U
constitue par le plasmide ρΛΤΐ53 entre les sites de restriction
des enzymes de restriction HindTII et BanüII
et marqué par nick-translation avec des nuclêoside- 32 triphosphates marqués avec du p.
5 - Sonde de capture d'essai.Un fragment Hindin mesurant 1,4 kb provenant de la région du qëne MMTV du plasmide pMTV-dhfr, a été cloné dans les vecteurs constitués par les phages Ml3 mpl8 et M13 mpl9, 10 b) Détermination de la courbe d'étalonnage L'échantillon utilisé pour l'essai était de l'ADN purifié provenant du plasmide pMTVdhfr. L'essai lui-mCme a été effectué selon la procédure de l'Exemple lbf sauf qu'un compteur à scintillation liquide a été utilisé pour le comptage. 15 La courbe standard résultante est indiquée dans le Tableau lii.
Tableau III
Echantillon_ cpm_
molécules/essai filtre DHFR
20 ““ ' 0 17 106 45 3 x 106 79 107 210 25 " ' " " .......
c) Détermination du nombre do gènes
Des lignées cellulaires provenant de cellule de fibroblaste de souris NIH 3Γ3 (Collection de culture ATCC, CRL 1658), gui ont été transfectées avec différentes quantités d'ADNc correspondant à l'AHNni du 30 gêne DHFR, ont été cultivées sur des plaques de culture cellulaire et utilisées comme échantillon. Les cellules ont été lysées avec du dodécylsulfatc de sodium et leur ADN â été cisaillé par compression à travers une fine aiguille hypodermique depuis une serinque. Un échantillon de 250 y1 correspon-35 dant S environ 10® cellules a été prélevé de l'homocénat et 13 50 yl de NaOH ont été ajoutés. L'échantillon a été chauffé à ébullition et neutralisé avec de l'acide acétique et le mélange d'hybridation. Le volume total était de 0,5 ml. Toutes les sondes décrites plus haut ont été ajoutées simultanément et 5 un filtre dit à blanc a été ajouté en tant que témoin de fond. L'hybridation, le lavage et le comptage du marqueur ont été réalisés selon la procédure de l'Exemple lb, sauf qu'un compteur à scintillation liquide a été utilisé pour le comptage.
Les résultats sont donnés dans le Tableau IV.
10 Tableau IV
Cellule N° de cel- -- -r Iules dans cpm* N° de molécules N° de cpm l'échantil- dans l'échantillon αο^1 s
Ion 15
Cellule témoin (pas de DHFR- , ADNc) 182 1,05x10 21 < I0b
Lignée I 138 0,9 xlO^ 80 3 x 10^ 3
Lignée II 210 l,25xl06 732 5 x 107 40 20 - *cpm : la lecture obtenue avec le filtre à blanc a été soustraite.
Le gêne MT est un marqueur interne qui mesure le nombre de cellules présentes dans un échantillon. Les résultats montrent que dans ce test, 10^ cellules ont donné un signal 25 spécifique de MT de 165 + 20 cpm. Les réactifs DHFR mesurent la quantité de DHFR-ADNc. Le nombre de cellules a été déduit à partir du signal spécifique de MT. Il a été donc possible de déterminer le nombre de copies de DHFR-ADNc dans différentes lignées cellulaires, comme cela est montré dans le Tableau 30 IV.
Exemple 3
Quantification d'ARN messager, a) Réactifs d'acide nucléique et leur préparation.
Il est aussi possible de mesurer la quantité 35 d'ARNm dérivé de 11ADNc de DHFR avec les sondes d'essai décrites 14 dans l'Exemple 2. La structure du plasmide pMTVdhfr est telle que la transcription du gène DHFR commence au promoteur MMTV.
Les messagers résultants ont une longueur d'environ 1,0 kb, dont environ 0,25 kb sont dérivés de la région promotrice 5 MMTV et le reste de l'ADNc de DHFR (Lee et colï., Nature 294 pp. 228-232, 1981).
Sondes standards.
L'acide nucléique standard de cellule, la sonde de détection standard et la sonde de capture standard étaient 10 tais que décrits dans l'Exemple 2.
Sondes d'essai.
L'acide nucléique d'essai, la sonde de détection d'essai et la sonde de capture d'essai étaient tels que décrits dans l'Exemple 2.
15 b) Détermination de la courbe d'étalonnage.
L'échantillon utilisé pour la détermination de la courbe d'étalonnage consistait en ARN messager correspondant au gène pour la dihydrofolate rêductase produite par une 20 transcription in vitro. L'ADN requis pour la transcription a été préparé par sous-clonage du fragment HindiII de 1,4 kb du promoteur MMTV du plasmide pMTVdhfr et du fragment HindiII Bglil de 0,75 kb (ADNc de DHFR) voisins dans le plasmide pSP64 (Promega Biotec) entre les sites de restriction des 25 enzymes de restriction HindlII et BamHI. L'ARN servant d'échantillon a été stocké dans une solution aqueuse à 0,2 % de SDS.
Le test d'hybridation-sandwich a été conduit de la façon qui est décrite dans les Exemples lb et 2b, mais la dénaturation a été omise.
30 - 35 _ 15
Tableau V
Echantillon cpm_
molécules/essai filtre DHFR
5 - 0 20 5 x 106 65 107 130 5 x 107 390 10 108 653 c) Détermination du nombre de molécules d'ARN messager
Le nombre de molécules d'ARN messager correspondant au gène DHFR, a été déterminé à partir des lignées cellulai-15 res décrites dans l'Exemple 2.
Les cellules ont été lysées avec du dodécylsulfate de sodium et leur ADN a été cisaillé légèrement par compression à travers une fine aiguille hypodermique à partir d'une seringue. Un échantillon de 250 yl du produit d'homogénéisa-20 tion a été prélevé, correspondant à environ 5.108 cellules. L'homoaénat a été ensuite ajouté au test d'hybridation-sandwich sans dénaturation. L'hybridation-sandwich a eu lieu selon la procédure des Exemples 2c et lb, sauf que les seules sondes DHFR ont été ajoutées à la solution d'hybridation. On 25 a déterminé le nombre de cellules dans un échantillon parallèle de 250 yl d'homogénate avec la sonde MT telle que décrite dans l'Exemple 2c. Les résultats sont fournis dans le Tableau VI.
Tableau VI
30--—-
Nombre de cel- n„
Cellule Iules dans 1' - . ^-îs=ü- r échantillon cnm , , ., - cules dans 1' I par ____ échantillon j cellule
Lignée I 380 3,5 x 106 1465 3,45 x 108 100 35 Lignée II 430 4,2 x 106 4800 2 x 109 500 ie •ft
Cpm : la lecture Obtenue avec le filtre à blanc a été sous traite.
Les résultats ont montré que la liqnêe cellulaire I a produit par cellule environ 100 molécules d’ARNm à partir 5 des gènes DHFR et que la lignée cellulaire II a produit environ 500 molécules d'ARNm à partir des gènes DHFR.
Exemple 4
Quantification des gènes amplifiés par hybridation de la solution 10 a) Réactifs diacide nucléique et leur préparation Sondes standards.
L'acide nucléique standard de cellule, la sonde de détection standard et la sonde de capture standard ont été les mêmes que dans 1'Example 2. Le fragment de 1,2 kb EcoRT- 15 Kpnl-(HindlII) dans le plasmide pATl53 a étémarqué par nick- translation avec de la déoxycytidine marquée à l'^^I. Les fragments de 0,8 kb Kpnl-BglII dans les plages Ml3 mpl8 et M13 mpl9 Ont été modifiés par la biotine en utilisant le
TM
réactif Photoprobe (Laboratoires Vector, CA, USA, produit 20 n° SP-1000).
Sondes d'essai.
L'acide nucléique d'essai, la sonde de détection d'essai et la sonde de capture d'essai sont les mêmes que·* dans l'Exemple 2. Le fragment de 0,75 kb HindlII-lîglll dans 25 le plasmide pAT153 a été marqué avec de la déoxycyt.i d.i ne 125 marquée à 1' I, Les fragments de 1,4 kb HindlII dans les plages M13 mpl8 et M13 mp!9 ont été biotynilés en utilisant
TM
le réactif Photoprobe comme ci-dessus, b) Détermination des courbes d'étalonnage 30 Une courbe d'étalonnage de cellule a été préparée en utilisant une quantité connue de cellules, à partir desquelles le signal d'hybridation a été mesuré en utilisant les sondes standards reconnaissant le gène MT. Une courbe d'étalonnage de l'acide nucléique d'essai a été préparée avec le 35 plasmide pMTVdhfr et les sondes d'essai reconnaissant ce 17 * plasmide, Les hybridations ont été effectuées dans 200 μΐ d'une solution comprenant 0,6 M de NaCl, 20 mM de tampon phosphate, à pH 7,5, 1 mM d1 EDTA et 4 % de polyéthylèneglycol (JPEG 6000) pondant une heure et demie à 70°C. Après 5 la réaction, 50 μΐ d1agarose-streptavidine (Bethesoda
Research Laboratories, Maryland, USA, produit n° 5942SA), et 1 M de NaCl, 10 mM de phosphate de sodium, à pH 7,5, 1 mM d’EDTA ont été ajoutés jusqu'à un volume final de 500 μΐ. Les hybrides ont été recueillis sur l'agarose-10 streptavidine à 37UC pendant 15 minutes. L'agarose a été lavée une fois pendant 5 minutes avec la solution tamponnée avec 1 M de NaCl à 37 °C et deux fois pendant 2 minutes avec 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrate de sodium à 55^0. La quantité d'hybrides liés a été déterminée en mesurant l'agarose 15 dans un compteur gamma (Syvânen et Coll., Nucloie Acids Rus. 14, 5037-5048, 1986). Les résultats sont indiqués dans les Tableaux Vil et VIII.
TABLEAU VII
2 0 Echantillon cpm
cellules/essai sondes MT
0,8 x 106 162 1,6 x 106 216 25 3 x 106 298
TABLEAU VIII
Echantillon epm
30 moléculos/essai sondes DHFR
106 148 5 x 1Û6 394 5 x 107 2240 35------------------- 18 c) Détermination du nombre de gènes
Des échantillons du lignées cellulaires décrits dans l'Exemple 2 ont été traités de manière similaire, sauf que le volume par échantillon correspondant- approximativement 5 à 2 x 10^ cellules était de 125 μΐ- Les déterminations du nombre de cellules et du nombre de molécules d'acide nucléique d'essai ont été effectuées dans des fioles djflé-rentes en ajoutant l'échantillon de cellule, les sondes de détection et de capture appropriées, et les composés du mc-10 lange d'hybridation jusqu'à un volume final de 200 μΐ. Los essais de contrôle sans l'étalonnage de cellule ou d'ADN d'essai ont été inclus. L’hybridation, la collection des hybrides, le lavage et la mesure ont été 1 ai ts comme décrit dans l'Exemple 4b. Les résultats ont été lus à partir des 15 courbes d'étalonnage en parallèle avec ce qui est décrit dans l'Exemple 4b. Les résultats sont indiqués dans le Tableau IX.
TABLEAU IX
20 cellule MT_ DHFR_____ L 1 1 cpm No des cel 1 u— cpm No des mole- No, les dans l'é- cules dans des chantillon J'échantillon copies
Cellule témoin 253 2,3 x 10^ 73 < 10^ 25 Lignée I 210 1,5 x 106 233 3,8 x 10ft 3
Lignée II 237 2,1 x 106 3059 8,8 x 107 42 cpm î Les valeurs des essais témoins sans étalonnage de cellule OU d'acide nucléique d'essai ont été déduites.
Claims (13)
1, Methode quantitative pour la détermination des molécules d'acide nucléique par une méthode d1 hybridât.Lon-sandwich ou en solution, caractérisée en ce que le nombre de 5 molécules d'acide nucléique donné par unité donnée est. déterminé par comparaison du nombre des molécules d'acide nucléique d'essai potentiellement présentes dans plusieurs copies dans l'unité, au nombre de molécules d'acide nucléique standard choisi avantageusement présentes en nombre 10 constant dans la môme unité.
2. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que les acides nucléiques présents dans l'échantillon : a) sont mis si nécessaire sous une forme dans laquelle i is peuvent 15 participer à la réaction d'hybridation ,* b) de quelconquesacides nucléiques perturbant éventuellement la réaction d'hybridation sont mis si nécessaire sous une forme dans laquelle ils ne peuvent pas interférer avec le test d'hybridation; 20 c) sont mis en contact, soit non-divisés, soit après division obligatoire, avec au moins une paire de sondes d'essai suffisamment homologues de l'acide nucléique éventuellement présent, dans plusieurs copies et avec au moins une paire de sondes standards choisies et convenables suffisamment homologues de la molécule 25 d'acide nucléique avantageusement présent en nombre constant ; les sondes de détection de cette paire de sondes d'essai et de cette paire de sondes standards sont marquées avec un marqueur détectable convenable et les sondes de capture ont été fixées à un support convenable oü une substance a été fixée 30 aux sondes de capture, laquelle permet l'isolation des hybrides résultants \ d) après réalisation de la ou des réactions d'hybridation, l'hybride d'essai et l'hybride standard sont séparés lorsque cela est nécessaire et le marqueur attaché est mesuré ; le 35 nombre de molécules d'acide nucléique par unité donnée est 20 obtenu par comparaison des nombres de molécules d'acide nucléique d'essai et standard.
3. Méthode suivant les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que les acides nucléiques standard et d'essai 5 sont des acidës désoxyribonucléiques.
4. Méthode suivant les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'acide nucléique d'essai est un acide ribonucléique et l'acide nucléique standard est un acide désoxyribonucléique. 10
5. Méthode suivant les revendications 1 et 2, carac térisée en ce que les acides nucléiques d'essai et standard sont des acides ribonucléiques.
6. Méthode suivant les revendications 1 et 2, caractérisée en ce que l'acide nucléique d'essai est un acide 15 désoxyribonucléique et l'acide nucléique standard est un acide ribonucléique.
7. Méthode suivant les revendications 1, 2, 3 et 4, caractérisée en ce que la sonde de détection de la paire de sondes standards - un plasmide recombinant comprenant un 20 fragment BglII -Bglll de 1,2 kb du fragment HindlII du gène humain c-Ki-rasI, ce fragment HindlII étant cloné dans le plasmide pBR322 et ce fragment Bglll -Bglll étant sous-cloné dans le site de restriction de l'enzyme de restriction BamHI du plasmide pBR322 - et les sondes de capture - des 25 phages recombinants comprenant un fragment BglII-HindlII de 0,5 kb du fragment HindlII du gène humain c-Ki-rasi , ce fragment HindlII étant cloné dans le plasmide pBR322 et le fragment Bglll -HindlII étant souscloné dans les vecteurs constitués par les phages M13 mplO et M13 mpll entre les 30 sites de restriction des enzymes de restriction BamHI et HindlII - sont mises en contact, soit individuellement, soit avec la paire de sondes d'essai, avec un échantillon d'acide nucléique non divisé ou divisé lorsque cela est nécessaire.
8. Méthode suivant les revendications 1, 2, 3 et 35 4, caractérisée en ce que la sonde de détection de la paire 21 de sondes standards - un plasmide recombinant comprenant un fragment EcoRI-Kpnl(HindlII de 1,2 kb en amont de la région promotrice du gène métallothionine de la souris, lequel fragment a été sous-cloné dans le plasmide pAT153 entre 5 les sites de restriction des enzymes de restriction EcoRI et HindlII - et les sondes de capture - des phages recombinants comprenant un fragment KpnI-BglII de 0,8 kb provenant de la région promotrice du gène métallothionine et de la rëqion en amont de celle-ci, lequel fragment a été sous-cloné 10 dans les vecteurs constitués par les phages M13 mpl8 etM13 mp19 entre les sites de restriction des enzymes de restriction Kpnl et BamHl - sont mises en contact, soit individuellement, soit avec la paire de sondes d'essai avec un échantillon d'acide nucléique non-divisé ou divisé, si cela est nécessaire. 15
9. Méthode suivant les revendications 1, 2, 3, 6, 7 et 8, caractérisée en ce que pour déterminer le degré d'amplification de l'oncogène c-myc et/ou le nombre de molécules d'ARN messager correspondant à ce gène, la sonde de détection de la paire de sondes d'essai - un plasmide recombinant 20 comprenant un fragment HindlII -Xbal de 3,7 kb du gêne c-myc, ce fragment étant sous-cloné dans le plasmide pBR322 au site de restriction de l'enzyme de restriction HindlII - et les sondes de capture - des phages recombinants comprenant un fragment Xbal-PstI de 1,1 kb du gêne c-myc, lequel fragment a 25 été sous-cloné dans les vecteurs M13 mplO et M13 mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction Xbal et PstI - sont mises en contact, soit individuellement soit avec la paire de sondes standards, avec un échantillon d'acide nucléique non-divisé ou divisé, si cela est nécessaire. 30
10. Méthode suivant les revendications 1,2, 3, 6, 7 et 8, caractérisée en ce que pour déterminer le degré d'amplification de la dihydrofolate réductase ou du gène DHFR et/ou le nombre de molécules d'ARN messager correspondant à ce gène, la sonde de détection de la paire de sondes d'essai - un plas-35 mide recombinant comprenant un fragment HindlII -BglII de 0,75 kb codant pour le gène DHFR du plasmide pMTVdhfr, lequel 22 fragment a été sous-cloné dans le vecteur constitué par le plasmidè pAT153 entre les sites de restriction des enzymes de restriction HindiII et BamHI - et les sondes de capture -des phages recombinants comprenant un fragment HindlII de .5 1,4 kb de la région du gène MMTV du plasmidè pMTVdhfr, lequel fragment a été sous-cloné dans les vecteurs constitués par les phaaes M13 mpl8 et M13 mpl9 au site de restriction de l'enzyme de restriction HindlII - sont mises en contact, soit individuellement, soit avec la paire de sondes standards, avec 10 un échantillon d'acide nucléique non-divisé ou divisé si cela est nécessaire.
11. Trousse de réactifs pour la détermination quantitative de molécules d'acide nucléique, caractérisée en ce que la trousse contient au moins une paire de sondes d'essai 15 et au moins une paire de sondes standards, les sondes de détection à la fois de la paire de sondes d'essai et de la paire de sondes standards étant marquées avec un marqueur convenable et les sondes de capture ayant été fixées à un support convenable ou bien une substance ayant été fixée aux sondes 20 de captures, permettant l'isolation des hybrides sandwich.
12. Trousse de réactifs suivant la revendication 11, caractérisée en ce que la sonde de détection de la paire de sondes d'essai utilisée pour la détermination du degré d'amplification de l'oncogène c-myc et/ou du nombre de molé- 25 cules d'ARN messager correspondant à ce gène, est un plasmidè recombinant comprenant un fragment de restriction HindlII Xbal de 3,7 kb du gène c-mvc, lequel fragment a été sous-cloné dans le plasmidè pBR322 au site de restriction de l'enzyme de restriction HindlII , et les sondes de capture sont des phages 30 recombinants comprenant un fragment Xbal-PstI de 1,1 kb du gène c-myc, lequel fragment a été sous-cloné dans les vecteurs constitués par les phages M13 mplO et M13 mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction Xbal et PstI, et la sonde de détection de la paire de sondes standards est 35 un fragment BglII-BglII de 1,1 kb du fragment HindlII du 23 / (./ gène humain c-Ki-rasI, ce fragment HindlII ayant été cloné dans le plasmide pBR322 et le fragment BglII-BglII ayant été sous-cloné dans le plasmide pBR322 au site de restriction de l'enzyme de restriction BamHI, et les sondes de capture sont 5 des phages recombinants comprenant un fragment BglII-HindlII de 0,5 kb du fragment HindlII du gêne c-Ki-rasI, ce fragment Hindiil ayant été sous-cloné dans le plasmide pBR322 du gène c-Ki-rasI, et ce fragment BglII-HindlII ayant été sous-cloné dans les vecteurs constitués par les phages Ml3 10 mplO et Ml3 mpll entre les sites de restriction des enzymes de restriction BamHI et HindlII.
13. Trousse de réactifs suivant la revendication 11, caractérisée en ce que la sonde de détection de la paire de sondes d'essai utilisée pour la détermination du degré 15 d'amplification de la dihydrofolate réductase ou du gène DHFR et/ou du nombre de molécules d'ARN messager correspondant à ce gène, est un plasmide recombinant comprenant un fragment HindlII-BglII de 0,75 kb codant pour le gène DHFR du plasmide pMTVdhfr, lequel fragment a été sous-cloné dans le vec-20 teur constitué par le plasmide DAT153 entre les sites de restriction des enzymes de restriction HindlII et BamHI , et les sondes de capture sont des phages recombinants comprenant un fragment HindlII de 1,4 kb de la région du gène MMTV du plasmide pMTVdhfr, lequel fragment a été sous-cloné dans les 25 vecteurs constitues par les phages M13 mpl8 et M13 mpl9 au site de restriction de l'enzyme de restriction HindlII , et la sonde de détection de la paire de sondes standards est un plasmide recombinant comprenant un fragment EcoRI-Kpnl de 1,2 kb provenant de la région en amont de la région promo-30 trice du gène métallothionine de la souris, lequel fragment a été sous-cloné dans le plasmide pAT153 entre les sites de restriction des enzymes de restriction EcoRI et HindlII , et les sondes de capture sont des phages recombinants comprenant un fragment KpnI-BglII de 0,8 kb du gène métallothionine 35 formé par la région promotrice et la région en amont de 24 celle-ci, lequel fragment a été sous-cloné dans les vecteurs constitués par les phages M13 mpl8 et M13 mpl9 entre les sites de restriction des enzymes de restriction Kpnl et BamHI.
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