CN102199658B - 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1a常见突变检测基因芯片及其使用方法 - Google Patents
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1a常见突变检测基因芯片及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基因检测芯片，更具体地说是用于检测与恶性肿瘤、免疫抑制、精神疾病治疗药物的反应性密切，以及遗传性高胆红素血症诊断相关的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A(简称UGT1A)常见重要基因突变的基因检测芯片。本发明通过选择合适的基因突变位点进一步获得检测这些位点的探针，并制备成基因芯片，从而达到高效，准确检测这些突变位点，获得相关信息，为临床用药和预防疾病提供指导。
Description
技术领域：
本发明涉及一种基因检测芯片，更具体地说是用于检测与恶性肿瘤、免疫抑制、精神疾病治疗药物的反应性密切，以及遗传性高胆红素血症诊断相关的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A(简称UGT1A)常见重要基因突变的基因检测芯片。
背景技术：
恶性肿瘤死亡率居我国总体死亡率首位，约180/10万人，是威胁人们健康的第一杀手。而精神疾病发病率也随着加快的生活节奏而猛增，拒统计，在大城市精神疾病的发生率已达13％左右。我国高血压患病人数更是高达1.3亿。在目前和将来很长一段时间内，药物仍将是以上重大疾病治疗的主要手段。移植手术的日益成熟为许多患者带来希望，而术后的免疫抑制剂也成为不可或缺的重要治疗手段。UGT1A家族存在于肝脏、肾脏、肠道等重要组织，代谢胆红素(功能缺失可导致遗传性高胆红素血症)、类固醇激素等内源性物质，更重要的是参与上述疾病治疗药物的代谢，如抗恶性肿瘤药(伊立替康)、抗精神病药物(丙咪嗪、拉莫三嗪、氯丙嗪、氯氮平等)、免疫抑制剂(霉酚酸)、高血压治疗药物(beta受体阻滞剂)等等。UGT1A的代谢能力决定药物体内有效浓度，因此与他们的药物反应(包括疗效和毒副作用)密切相关。
药物反应的个体差异是临床上普遍的现象，产生这种差异的原因有许多，包括环境因素，如性别、年龄、体重、疾病状况在内的多种因素都可以导致不同病人对同一种药物的反应存在差别，然而20多年来的遗传药理学研究结果表明其中最重要、最根本的因素是遗传因素，即药物代谢酶、转运体和受体(药物作用靶点)的基因多态性导致了其编码蛋白的功能改变，进一步使血药浓度和药物敏感性显著不同，一言以蔽之，遗传变异导致了药物反应个体差异。
以抗肿瘤药物伊立体康为例，属喜树碱类化疗药，伊立体康为母药，在体内转化为活性成分SN-38，通过抑制拓扑异构酶发挥抗癌作用。SN-38在体内代谢主要通过UGT1A1，UGT1A1功能下降可以导致体内SN-38浓度过高也可能造成严重的不良反应：血样腹泻以及粒细胞减少。UGT1A1突变纯合子个体因UGT1A1功能明显减低，在使用伊立体康化疗时，不良反应的发生率明显升高。依据一系列的规范大规模临床试验结果，美国FDA于2005年修改伊立体康说明书，明确指出建议在使用伊立体康之前进行UGT1A1突变的检测。
UGT1A是一个超家族，由位于2q37的基因簇编码，所有UGT1A家族成员共用第2-5外显子(编码C末端)，有各自的第一外显子(编码N末端)和内含子区。因为UGT1A家族有共同的C末端，所以，有一定的底物重叠性。但也因为其单独的底物结合域，而具有一定的底物特异性。如伊立体康主要由UGT1A1代谢，但也有UGT1A7、UGT1A9的参与。正因为此底物的重叠性，使得在研究某个UGT1A酶突变功能时，需要明确UGT1A家族其他成员的遗传背景是否统一。又因为共用的2-5外显子区突变罕见，人群意义不大，所以对UGT1A家族的基因多态性研究，应着重于UGT1A家族各个第一外显子区或启动子区单倍型的研究。这就需要一个高通量的办法，同时检测多个个体的UGT1A家族重要突变位点。
经过长期研究，目前国内外已发现UGT1A的多个基因突变与相应药物的反应性(疗效和毒副反应)密切相关，目前发现的突变位点有200个之多，我们从中挑选突变功能意义强，以及根据我们的实验数据，在中国人群中频率高，人群意义大的位点，共17个(表1)。
表1UGT1A常见重要基因突变及其功能意义
以上所述的UGT1A的基因突变与恶性肿瘤、精神病、免疫抑制、高血压等的相关药物在人体内的反应性密切相关，这里所说的反应性包括了药物的疗效和安全性两个方面。现在医生都是采用经验用药，往往同种疾病进程的人，采用相同的治疗。虽然，服用药物剂量相同，但是体内药物浓度却存在明显差异。体内浓度过高，造成不良反应；而体内药物浓度过低，就会导致治疗失败。上述提到的UGT1A1指导伊立体康用药，就是非常经典的案例。因此利用各种基因检测技术在治疗之前先确定病人的上述UGT1A基因突变位点的基因型，根据检测的结果调整患者的用药种类与剂量。例如，出现UGT1A1突变携带者，医生可推荐使用其他化疗方案，或者减量使用伊立体康，或者在使用伊立体康前就采取预防不良反应的措施。这样“量体裁衣”的个体化用药模式，可以使药物发挥最佳的疗效，而且最大限度地防止不良反应的发生。
目前国内外最常用的基因突变检测方法有基于荧光定量PCR、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP法)、序列特异性PCR、以及测序等方法，这些方法操作繁琐、检测周期长、通量低，不适合对UGT1A基因座的所有第一外显子和调控区的突变进行检测，对UGT1A的功能开展科学研究和临床检测都需要一个高通量的筛选方法。
基因芯片(gene chip)，又称DNA芯片，是近些年在生物高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一，它将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)有序地固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜)上形成阵列，通过与实际样本或扩增产物进行杂交反应和对荧光等杂交信号的检测，只需一次试验，就可高通量地获得所有待检基因的信息。与其他方法相比较，基因芯片的检测方法有多样品并行处理能力、分析速度快、所需样品量少、污染少、操作简单、价格低廉等优点。因此利用基因芯片技术检测上述UGT1A的常见重要基因突变，是当下最好的选择，具有重要的现实意义。
目前尚未有对上述UGT1A全部第一外显子和调控区的重要基因突变进行全面系统检测的基因芯片及其技术方案被披露。
发明内容：
本发明的目的在于针对UGT1A基因结构特点导致对其突变以及连锁的科学研究困难，以及其突变引起功能改变而导致的药物有效性低或毒副反应严重、以及遗传性疾病或者对环境毒物易感，提供一种用于检测与UGT1A重要基因突变的基因芯片及其配套的检测试剂。本发明的检测结果可以辅助科研人员对UGT1A基因及其功能的研究，辅助经常接触毒物的工人采取防护措施，辅助临床医生制定在人体内通过UGT1A代谢药物的个体化用药方案。
根据本发明的一方面，本发明提供的基因芯片包括固相支持物和有序固定在固相支持物上的寡核苷酸探针。
所述的固相支持物可采用基因芯片领域常用的各种材料，如但不限于经活性基团修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片、各种纤维膜、尼龙膜等，用于修饰的活性基团如但不限于醛基、氨基、巯基、羧基等，本发明优选醛基化修饰的玻片。
所述固定于固相支持物上的寡核苷酸探针可与UGT1A的特定基因扩增片段特异性杂交，从而确定相关基因突变的类型。本发明所述的寡核苷酸探针序列如表2所示：
表2
表2中，每一突变位点针对未发生突变(野生型)和发生突变(突变型)两种情况各设计了正反两条用于合成探针的序列，正向探针序列对应于目标寡核苷酸片段的编码链，反向探针序列对应于目标寡核苷酸片段的随从链，在实际使用时可选择上述序列中的任意连续14～25个碱基作为检测探针的序列，如果序列中包含基因突变位点(用方框标注)，则选择的连续14～25个碱基中必须包含该突变位点。针对每个待检测的基因突变，实验人员需根据表2的序列合成至少一条野生型探针和一条突变型探针，正向或反向均可。上述某一个或某几个或全部的突变位点的检测探针组成探针组，经合成后固定于固相支持物上。
在上述设计的各探针序列的基础上，本领域技术人员可通过本领域熟知的方法进行探针合成，并对探针3′端或5′端增加间隔臂(如：聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，来增加杂交容量；以及对其3′端或5′端进行化学基团修饰(比如氨基化修饰)，使探针能通过化学键结合在相应的片基上(如醛基化片基)；优选对探针的3′端进行氨基修饰，其相较5′端修饰的探针具有更好的杂交效果。
在上述设计的各探针序列的基础上，为了控制杂交过程中各种因素对杂交信号值的干扰和对杂交过程进行评估，本领域技术人员还可通过本领域熟知的方法设计并合成芯片质控对照、阴性参照、阳性参照、空白对照等质控探针。
本发明所涉及的野生型检测探针、突变型检测探针、质控对照探针、阴性对照探针、阳性对照探针、空白对照探针的用途及其设计方法和修饰方法均是本领域一般技术人员所熟知的，详细技术细节可参阅《基因芯片技术》(李瑶编，化学工业出版社，2004年5月出版)。
根据本发明的另一方面，用上述芯片检测样本中UGT1A常见重要基因突变发生情况的检测试剂至少包括用于扩增样本中UGT1A基因的PCR引物以及上述本发明的基因芯片。本发明的PCR引物根据UGT1A基因上相关基因突变位点上下游的的序列特点设计，通过PCR反应可扩增包含一种或几种突变位点在内的UGT1A基因片段。
为便于进行结果检测，可以在PCR引物合成时进行适当的标记，所述标记基团包括：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等，这些标记及其标记方法以及各标记物的检测方法都已是本领域众所周知的常规技术。本发明优选利用不对称PCR技术进行基因扩增，其目的是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA，所有探针(包括检测探针和阴性质控探针)均是针对该单链DNA设计合成，同时对非限制性引物(高浓度引物)进行标记，本发明优选对对非限制性引物(高浓度引物)进行5′端的Cy5标记，使得合成的单链PCR产物的5′端带有荧光标记，以便在后继的扫描过程中读取结果。本发明所述的引物设计、合成、标记的方法是本领域普通技术人员所熟知的，详细操作步骤可参见《分子克隆试验指南》(J.萨姆.布鲁克等，著，黄培堂等，译，2002)。
本发明的基因芯片可以根据点样区域的数目分为1人份、4人份和多人份不等。本发明根据实际应用需要，优选4人份的设计方案，即在基片上设置4个点样区域，分别点上所需的探针，一次可检测4份生物样品。
根据本发明的另一方面，提供一种用于系统检测样本中UGT1A的常见重要基因突变的试剂盒，其至少包括本发明的上述基因芯片和PCR扩增引物，本发明的试剂盒还可进一步包含下述试剂中的一种或几种：
(1)样本处理类试剂；(2)PCR扩增类试剂；(3)杂交类试剂；(4)显色类试剂。
上述样本处理类试剂、PCR扩增类试剂、杂交类试剂、显色类试剂均可使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种具体试剂，这些试剂必要时可以包括在试剂盒中，也可以将其配方列明在试剂盒的说明书中由使用者按照说明书中的提示自行配制。
本发明的试剂盒还可包括相应的阴性对照和/或阳性对照样本。
在本发明试剂盒的操作方法为：1.将标记后的待测产物与固定在芯片上的探针进行杂交，其杂交原理与普通核酸杂交相同。杂交条件与探针和标记后的待测PCR产物的长度、GC含量、盐浓度、甲酰胺等有关，我们通过严谨的实验设计逐一确定最适合的各组分条件。优选的是在本发明的试剂盒体系中，37℃孵育6小时(暴露于水浴中，湿度饱和情况下)后可获得具有良好特异性和灵敏度的杂交结果。2.利用不同的洗脱条件，例如温度、盐浓度等最大限度地去除非特异性杂交。3.对样本检测结果进行评估：通过样本中UGT1A相关基因的突变发生情况，对该样本UGT1A上述突变情况评估，并通过后续运算给出基因连锁图谱，以及相关药物反应性信息、疾病易感性信息以及遗传性疾病信息。详细操作过程见实施例。
本发明的优点是：
1.本发明全面、系统、高通量地检测与恶性肿瘤、精神疾病、免疫抑制、高血压等的治疗药物反应(药物效应以及毒性反应)个体差异密切相关的UGT1A基因的重要基因突变位点，可针对相关药物提出治疗方案建议。
2.本发明顺应UGT1A基因簇结构特点，同时检测UGT1A第一外显子区和启动子区多个重要基因突变，可同时检测多份生物样品，为进一步研究UGT1A突变以及单倍体的功能提供便捷方法。
3.准确、灵敏、特异性地对上述基因突变进行检测。
4.操作简便快捷，对样品的需要量少，人力投入少，大大降低人为误差，可避免不同实验人员操作带来的结果差异。
5.与PCR-RFLP和测序法相比较，本发明污染轻、成本较低。
附图说明：
图1：芯片A(野生型探针I+突变型探针I+位点阳性参照+位点阴性参照)扫描图；
图2：芯片B(野生型探针II+突变型探针II+位点阳性参照+位点阴性参照)扫描图；
图3：芯片C(野生型探针II+突变型探针II+位点阳性参照+位点阴性参照)扫描图。
具体实施方式：
实施例1：UGT1A常见突变基因位点芯片检测系统的制备
1.详细制备过程
1.1.基片处理：基片采用玻璃介质，表面处理方式采用醛基化修饰。具体步骤为：
1、空白超平片的选择：选用76mm×25mm×1mm超平片，其长宽误差不超过0.2mm，厚度误差不超过0.1mm，无破损、表面无划痕；
2、超平片预处理：将超平片浸于新配的重铬酸钾洗液中，放置7天后，用去离子水清洗，晾干；
3、超平片氨基化：配制氨基硅烷的乙醇溶液，浓度分别为2％，将玻片浸入上述溶液中分别作用15分钟，取出用去离子水洗净，晾干；
4、超平片醛基化：将上述氨基化处理的超平片分别浸入5％的戊二醛PBS(0.2mol/1M，pH8.0)溶液中，分别作用30分钟，PBS溶液清洗晾干；
1.2.探针制备：探针序列设计如SEQ ID NO.1～68所示，按照本领域技术人员熟知的方法合成。
(1)在DNA合成仪上合成所需序列的寡核苷酸(包括5’端的10～15个碱基的polyT)；
(2)在DNA序列合成仪上，将寡核苷酸poly(T)分子臂引入活泼的脂族氨基臂。
(3)以HPLC纯化5’端氨基修饰的寡核苷酸，离心干燥后，溶于100mmol/LNa2CO3/NaHCO3溶液(PH9.0)，浓度为2mmol/L。
1.3.基因芯片的制备：
按图所示的UGT1A常见突变位点基因检测芯片平面结构图，在一块玻璃介质的基片上划分为两个基因探针点样区域，每个点样区域的面积为7mm*7mm，在每个点样区域内的阵列式分布的基因探针：第1行是位点UGT1A1C686A的野生型和突变型探针，第2行是位点UGT1A1C686A的阴性质控探针和阳性质控探针；第3行是位点UGT1A1(TA)6/(TA)8的野生型和突变型探针，第4行是位点UGT1A1(TA)6/(TA)8的阴性质控探针和阳性质控探针；第5行是位点UGT1A1T674G的野生型和突变型探针，第6行是位点UGT1A1T674G的阴性质控探针和阳性质控探针；第7行是位点UGT1A4C70A的野生型和突变型探针，第8行是位点UGT1A4C70A的阴性质控探针和阳性质控探针；第9行是位点UGT1A4T142G的野生型和突变型探针，第10行是位点UGT1A4T142G的阴性质控探针和阳性质控探针；第11行是位点UGT1A6T19G的野生型和突变型探针，第12行是位点UGT1A6T19G的阴性质控探针和阳性质控探针；第13行是针对UGT1A6A541G的野生型和突变型探针，第14行是位点UGT1A6A541G的阴性质控探针和阳性质控探针；第15行是位点UGT1A6A552C的野生型和突变型探针，第16行是位点UGT1A6A552C的阴性质控探针和阳性质控探针；第17行是位点UGT1A7T387G的野生型和突变型探针，第18行是位点UGT1A7T387G的阴性质控探针和阳性质控探针；第19行是位点UGT1A7C391A的野生型和突变型探针，第20行是位点UGT1A7C391A的阴性质控探针和阳性质控探针；第21行是位点UGT1A7G392A的野生型和突变型探针，第22行是位点UGT1A7G392A的阴性质控探针和阳性质控探针；第23行是位点UGT1A7T622C的野生型和突变型探针，第24行是位点UGT1A7T622C的阴性质控探针和阳性质控探针；第25行是位点UGT1A8G830A的野生型和突变型探针，第26行是位点UGT1A8G830A的阴性质控探针和阳性质控探针；第27行是位点UGT1A9-118(dT)9＞10的野生型和突变型探针，第28行是位点-118(dT)9＞10的阴性质控探针和阳性质控探针；第29行是位点UGT1A9CI399T的野生型和突变型探针，第30行是位点UGT1A9CI399T的阴性质控探针和阳性质控探针；第31行是位点UGT1A9C-440T的野生型和突变型探针，第32行是位点UGT1A9C-440T的阴性质控探针和阳性质控探针；第33行是位点UGT1A9T-331C的野生型和突变型探针，第34行是位点UGT1A9T-331C的阴性质控探针和阳性质控探针；
各检测位点的探针(包括野生型探针，突变型探针，阳性参照探针，阴性参照探针)序列如下(表3)：
表3
点样与点样后处理：
探针溶液各取2μl，用点样仪按上述格式打印到处理过的基片上；
点样后芯片在37oC、水合12小时
用0.2％的SDS溶液洗涤1遍去除游离探针，再用超纯水洗涤两遍，1800rpm，1min离心甩干
贴膜(按照点制的规格不同，贴不同的覆膜)
室温干燥18h后立即使用或真空包装后贮存于4℃备用。
UGT1A重要突变基因芯片检测系统的组成
检测系统主要由寡核苷酸芯片、杂交液、洗涤母液、各检测基因位点的PCR反应液(包括引物、dNTP、buffer等)、生物酶和阳性参照DNA标本等组分构成，寡核苷酸芯片4℃冷藏保存，其他组分于-20℃冷冻保存，其中PCR反应液需避光。各检测基因位点PCR反应液中的引物根据表5中所示的序列设计。
【实施例2】用实施例1中的芯片检测系统对UGT1A基因中的重要基因突变进行检测。
具体试剂和所用仪器：
【芯片检测系统的组成】(表4)
表4
PCR反应液1～14分别为扩增包含本发明所述的17个UGT1A基因多态性位点的片段所需的PCR引物。其中，UGT1A1C686A和UGT1A1C674G共用PCR反应液1，UGT1A6A541G和UGT1A6 A552C共用PCR反应液6，UGT1A7 T387G，UGT1A7 C391A，UGT1A7G392A共用反应液7。
【其他仪器及试剂】
PCR仪、电泳仪、杂交仪、激光共聚焦芯片扫描仪(具有635nm波长的通道)、紫外分光光度计、Promega DNA抽提试剂盒。
1.具体检测过程如下：
【临床样本的处理】
采集待检测个体的外周静脉血2ml，使用Promega DNA抽提试剂盒抽提DNA，也可用自配的DNA抽提试剂进行抽提，两种方法均为本领域技术人员所公知。用紫外分光光度计检测A260，A280比值，比值应介于1.60～1.80之间，计算DNA浓度应大于100ng/μl，。
【PCR扩增】
在0.2mL的Eppendorf管中加入PCR反应液18.8μl，模板DNA 0.8μl，及酶10.2μl，酶20.2ul，构成20.0μl反应体系(利用PCR反应液1～14共配成14管反应体系)。PCR扩增程序为：
37℃600秒
95℃240秒
70℃120秒
注意：上述成分充分混匀，最后加入Taq酶并混匀，但不可剧烈振荡；放置PCR管于PCR仪上。不同位点对应不同退火温度，以达到最高效率和最低非特异性扩增。
用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域的公知技术，其中的关键在于引物设计，利用本发明公布的引物序列，本领域的技术人员可根据经验或有关文献确定反应体系和扩增程序，独立完成该操作步骤。
【杂交】
取经37℃预热的杂交液21μl，加14管PCR产物各3μl混匀，吸取40μl混合液，转移到芯片的点样区域；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进37℃水浴保温2小时。
本发明扩增产物与基因芯片之间的杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般技术人员依照经验可以确定有关缓冲液、样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。
【洗片】
打开杂交舱，取出芯片，撕掉覆膜，用150mL洗涤液1漂洗30秒，再置于去离子水中于室温洗涤30秒，取出，在离心机上瞬时离心30秒，甩去芯片表面残留液体。
【扫描分析】
(1)将干燥后的芯片立即用GenePix4100A扫描仪扫描，PMT设置为600，激光波长为635nm；
(2)扫描图像用扫描仪自带的图像分析软件GenePix 6.0对扫描结果进行定量分析，并保存分析结果；
(3)利用与芯片检测系统配套的结果分析软件进行结果分析与整理。
(4)打印检测报告单。
2.对检测结果的分析过程如下：
通过芯片扫描仪得到的扫描图谱为一矩阵图谱，自第1行至第34行，由上至下即检测UGT1A1 C686A，UGT1A1(TA)6/(TA)8，UGT1A1 T674G，UGT1A4 C70A，UGT1A4 T142G，UGT1A6 T19G，UGT1A6 A541G，UGT1A6 A552C，UGT1A 7T387G，UGT1A 7C391A，UGT1A 7G392A，UGT1A7 T622C，UGT1A8 G830A，UGT1A9-118(dT)9＞10，UGT1A9 CI399T，UGT1A9C-440T，UGT1A9T-3310位点的基因型。探针分布情况如下表(表5)所示：
表5
| 行号 | 突变位点 | 1-3点 | 4-6点 | 7-9点 | 10-12点 |
| 第1行 | UGT1A1C686A | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第2行 | UGT1A1(TA)6/(TA)8 | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第3行 | UGT1A1T674G | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第4行 | UGT1A4C70A | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第5行 | UGT1A4T142G | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第6行 | UGT1A6T19G | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第7行 | UGT1A6A541G | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第8行 | UGT1A6A552C | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第9行 | UGT1A7T387G | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第10行 | UGT1A7C391A | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第11行 | UGT1A7G392A | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第12行 | UGT1A7T622C | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第13行 | UGT1A8G830A | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第14行 | UGT1A9-118(dT)9＞10 | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第15行 | UGT1A9CI399T | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第16行 | UGT1A9C-440T | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
| 第17行 | UGT1A9T-331C | 野生探针 | 突变探针 | 阳参探针 | 阴参探针 |
对标本进行检测，当阳性参照和阴性参照都符合要求后，按照野生型和突变型的比值确定其基因型。当某一位点只有野生型探针出现信号时该位点为野生型，只有突变型探针出现信号时该位点为突变型，当同时出现信号时为杂合子。
【实施例3】不同碱基数的探针杂交效果比较
在本发明中，对于表3中所示序列的探针实际使用时可以选择连续14-25个碱基序列来合成探针，以下实验旨在证明上述碱基数的差异并不影响结果的灵敏度和特异性。
针对UGT1A6T19G突变合成以下不同长度的突变及正常探针：
野生型探针I(SEQ ID NO.21第15～29位碱基序列，共15个碱基)
5’-TCCTTCGCTCATTTC-3’
突变型探针I(SEQ ID NO.23第15～29位碱基序列，共15个碱基)
5’-TCCTTCGCGCATTTC-3’
野生型探针II(SEQ ID NO.21第13～32位碱基序列，共19个碱基)
5’-CCTCCTTCGCTCATTTCAG-3’
突变型探针II(SEQ ID NO.23第13～32位碱基序列，共19个碱基)
5’-CCTCCTTCGCGCATTTCAG-3’
野生型探针III(SEQ ID NO.21第12～33位碱基序列，共21个碱基)
5’-GCCTCCTTCGCTCATTTCAGA-3’
突变型探针III(SEQID NO.23第12～33位碱基序列，共21个碱基)
5’-GCCTCCTTCGCGCATTTCAGA-3’
以上述序列合成的探针按照实施例1的方法制备芯片A、B和C，按照实施例1的方法扩增UGT1A6T19G野生型和突变型质粒，分别与芯片A、B和C杂交，结果显示见图1、2、3。
由上图可见，不同长度的探针均取得了较好的杂交结果，由此证明不同碱基数的探针均具有良好的灵敏度和特异性。
以上对本发明的描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种改变和调整，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
UGT专利序列-20100325_ST25
SEQUENCE LISTING
<110>中南大学
<120>尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A常见突变检测基因芯片及其使用方法
<130>尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A常见突变检测基因芯片及其使用方法
<160>136
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
ctgtgcgacg tggtttattc cccgtatgca acccttgcct cagaa 45
<210>2
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
ttctgaggca agggttgcat acggggaata aaccacgtcg cacag 45
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>3
ctgtgcgacg tggtttattc ccagtatgca acccttgcct cagaa 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ttctgaggca agggttgcat actgggaata aaccacgtcg cacag 45
<210>5
<211>41
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>5
attggttttt gccatatata tatatataag taggagaggg c 41
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<211>41
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gccctctcct acttatatat atatatatgg caaaaaccaa t 41
<210>7
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>7
attggttttt gccatatata tatatatata taagtaggag agggc 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gccctctcct acttatatat atatatatat atggcaaaaa ccaat 45
<210>9
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tcacagaact ttctgtgcga cgtggtttat tccccgtatg caacc 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ggttgcatac ggggaataaa ccacgtcgca cagaaagttc tgtga 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tcacagaact ttctgtgcga cggggtttat tccccgtatg caacc 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ggttgcatac ggggaataaa ccccgtcgca cagaaagttc tgtga 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gctgctcctc ctcagtgtcc agccctgggc tgagagtgga aaggt 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>14
acctttccac tctcagccca gggctggaca ctgaggagga gcagc 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gctgctcctc ctcagtgtcc agacctgggc tgagagtgga aaggt 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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acctttccac tctcagccca ggtctggaca ctgaggagga gcagc 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctggctcagc atgcgggagg ccttgcggga gctccatgcc agagg 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>18
cctctggcat ggagctcccg caaggcctcc cgcatgctga gccag 45
<210>19
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctggctcagc atgcgggagg ccgtgcggga gctccatgcc agagg 45
<210>20
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>20
cctctggcat ggagctcccg cacggcctcc cgcatgctga gccag 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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caggatggcc tgcctccttc gctcatttca gagaatttct gcagg 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cctgcagaaa ttctctgaaa tgagcgaagg aggcaggcca tcctg 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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caggatggcc tgcctccttc gcgcatttca gagaatttct gcagg 45
<210>24
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cctgcagaaa ttctctgaaa tgcgcgaagg aggcaggcca tcctg 45
<210>25
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>25
cctcttcagg ggttttccgt gttccctgga gcatacattc agcag 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctgctgaatg tatgctccag ggaacacgga aaacccctga agagg 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cctcttcagg ggttttccgt gttccctgga gcatgcattc agcag 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctgctgaatg catgctccag ggaacacgga aaacccctga agagg 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cattcagcag aagcccagac cctgtgtcct acattcccag gtgct 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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agcacctggg aatgtaggac acagggtctg ggcttctgct gaatg 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cattcagcag cagcccagac cctgtgtcct acattcccag gtgct 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>32
agcacctggg aatgtaggac acagggtctg ggctgctgct gaatg 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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caaattgcag gagtttgttt aatgaccgaa aattagtaga atact 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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agtattctac taattttcgg tcattaaaca aactcctgca atttg 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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caaattgcag gagtttgttt aaggaccgaa aattagtaga atact 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>36
agtattctac taattttcgg tccttaaaca aactcctgca atttg 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>37
ttgcaggagt ttgtttaatg accgaaaatt agtagaatac ttaaa 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ttgcaggagt ttgtttaatg acagaaaatt agtagaatac ttaaa 45
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<212>DNA
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tttaagtatt ctactaattt tctgtcatta aacaaactcc tgcaa 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>41
tgcaggagtt tgtttaatga ccgaaaatta gtagaatact taaag 45
<210>42
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>42
ctttaagtat tctactaatt ttcggtcatt aaacaaactc ctgca 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>43
tgcaggagtt tgtttaatga ccaaaaatta gtagaatact taaag 45
<210>44
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>44
ctttaagtat tctactaatt tttggtcatt aaacaaactc ctgca 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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catgactttc aaggagagag tatggaacca catcatgcac ttgga 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tccaagtgca tgatgtggtt ccatactctc tccttgaaag tcatg 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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catgactttc aaggagagag tacggaacca catcatgcac ttgga 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tccaagtgca tgatgtggtt ccgtactctc tccttgaaag tcatg 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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atcttcattg gtggtatcaa ctgccatcag ggaaagccat tgcct 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>50
aggcaatggc tttccctgat ggcagttgat accaccaatg aagat 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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atcttcattg gtggtatcaa ctaccatcag ggaaagccat tgcct 45
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ttgtcagtga ctgatttttt ttttatgaaa ggataaaaac acgcc 45
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ggcgtgtttt tatcctttca taaaaaaaaa atcagtcact gacaa 45
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<213>Homo sapiens
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taggtatata caatatctaa tgcaaattct cacacctatt ttgtt 45
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<213>Homo sapiens
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aacaaaatag gtgtgagaat ttgcattaga tattgtatat accta 45
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taggtatata caatatctaa t gtaaattct cacacctatt ttgtt 45
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<213>Homo sapiens
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aacaaaatag gtgtgagaat ttacattaga tattgtatat accta 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ggccttgttt tctttgctta gagcatgagt tgccatcttc tctgg 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ccagagaaga tggcaactca tgctctaagc aaagaaaaca aggcc 45
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<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ggccttgttt tctttgctta gagtatgagt tgccatcttc tctgg 45
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<213>Homo sapiens
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ccagagaaga tggcaactca tactctaagc aaagaaaaca aggcc 45
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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attagcttta atcaaattta cttttacttt atctttctga acct 44
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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aggttcagaa agataaagta aaagtaaatt tgattaaagc taat 44
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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attagcttta atcaaattta ctcttacttt atctttctga acct 44
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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aggttcagaa agataaagta agagtaaatt tgattaaagc taat 44
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Claims (2)
1.一种用于检测与UGT1A重要基因突变的基因芯片，包括固相支持物、有序固定在固相支持物上的基因探针和用于扩增样本中突变基因片段的PCR引物，基因探针包括检测不同基因位点突变的野生型检测探针、突变型检测探针、阴性质控探针及阳性质控探针，所述固定于固相支持物上的基因探针为与UGT1A的特定基因扩增片段特异性杂交的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针序列选自SEQ ID NO.1—68中各组序列中一组或多组包含基因突变位点的任意连续14～25个碱基作为检测探针的序列，每一突变位点针对未发生突变和发生突变两种情况各设计正反两条用于组成探针的序列；所述的寡核苷酸探针序列选自SEQ ID NO.69—136。
2.试剂盒，其至少包括权利要求1所述基因芯片和PCR扩增引物。
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|
| CN102199658A CN102199658A (zh) | 2011-09-28 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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2010
- 2010-03-26 CN CN201010133340.3A patent/CN102199658B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
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| 孤儿核受体对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因转录调节的研究进展;张利;《中国临床药理学与治疗学》;20071231;第19卷(第2期);全文 * |
| 张利.孤儿核受体对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因转录调节的研究进展.《中国临床药理学与治疗学》.2007,第19卷(第2期), |
Also Published As
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