KR20200104575A - 폐암 관련 돌연변이에 상보적인 pna 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐암 관련 돌연변이에 상보적인 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 PNA 프로브는 기존의 DNA 또는 RNA 프로브에 비해 표적 유전자의 선별 효율이 우수하고, 혈액 내 소량으로 존재하고 짧은 단편으로 존재하는 cfDNA(cell free DNA)를 높은 민감도와 특이도로 탐지할 수 있으며, 혈액을 이용한 암 진단 및 모니터링에 대한 정확성을 향상시켜 조기 진단을 가능하게 하고, 주기적인 약물 반응성 모니터링을 통한 맞춤형 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폐암 관련 돌연변이에 상보적인 PNA 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물{COMPOSITIONS FOR DIAGNOSING LUNG CANCER COMPRISING PEPTIDE NUCLEIC ACID PROBE COMPLEMENTARY TO LUNG CANCER RELATED MUTATIONS}

본 발명은 폐암 관련 돌연변이에 상보적인 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 관한 것이다.

폐암은 흡연이 보편화되기 시작하면서 급격히 증가하기 시작했고, 우리나라에서도 그 발생률이 가파르게 증가하고 있는 추세이다. 폐암의 중요한 위험인자로는 흡연과 기타 발암성물질(carcinogen)에 대한 직업적 노출이 있는데, 특히 기관 및 기관지에 생긴 암은 90% 이상이 흡연으로부터 초래되고 있다. 폐암은 암세포의 형태에 따라 크게 비소세포 폐암(non-small cell carcinoma)과 소세포 폐암(small cell carcinoma)으로 구분되는데, 비소세포 폐암은 전체 폐암의 약 80%를 차지하며 편평상피세포암(squamouscell carcinoma), 선암(adenocarcinoma) 및 대세포암(large-cell carcinoma)의 3가지 아형이 있다.

폐암은 다른 암에 비해 치료가 어려워 사망자가 가장 많은 암으로 알려져 있다. 대부분의 폐암은 초기 발견이 어렵고 진행된 상태에서 주로 진단되기 때문에 예후가 나쁘고, 화학요법을 이용한 치료로 폐암 환자의 생존 가능성을 높일 수 있으나, 부작용으로 인한 문제가 있다. 따라서 암을 초기에 발견할 수 있는 높은 민감도와 특이도를 가진 진단 방법의 개발이 필요하다.

현재까지 암의 진단 방법은 물리적인 것이 대부분이다. 침습적 생검(Biopsy)은 물리적인 절제 등의 방식으로 병변 조직을 도려내는 샘플링 방식으로서, 환자에게 고통을 유발하고 염증, 암세포의 파종, 출혈, 사망까지 이를 수 있으며, 전이의 위험성이 있어 반복적인 샘플링이 어려운 문제가 있다. 또한, 종양 조직에서도 샘플링 하는 위치에 따라 생물학적 특성(tumor heterogeneity)이 다르게 나타날 수 있어 조직 생검을 하더라도 정확한 정보를 얻지 못할 수 있다. 약물 처방 전과 후에 나타나는 치료의 효과 또는 약물 내성 검사를 위해 암환자에 대해 주기적인 샘플링이 필요하나, 침습적 생검은 환자에게 거부감을 일으키므로 주기적인 조직 검사가 환자에게 상당한 정신적, 육체적인 스트레스를 발생하게 하고, 아울러 상당한 비용이 소요되는 문제가 있다.

이에, 침습적 생검을 대체할 수 있는 비침습적 생검(Liquid Biopsy) 기술이 연구되고 있다. 혈액은 인체를 순환하면서 다수의 기관 및 세포 조직에서 유래된 물질들을 포함하고 있으며, 이 중에서 암 조직에서 유래된 유전자(circulating tumor DNA, ctDNA)는 최적의 동반진단용 샘플이 될 수 있다. 최근, 혈액 내 존재하는 암 유래 유전자 변이 검사를 통하여 암의 치료의 방향을 결정할 수 있고, 이는 기존의 CT 촬영 등의 영상분석보다 조기에 검사가 가능한 것으로 알려지면서 혈액 유전자를 기반으로 한 모니터링 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 액체 생검은 폐암 진단 분야에서 가장 활발히 연구되고 있는데, 지난 2016년 6월 비소세포폐암(Non-small cell lung cancer)의 EGFR 유전자 변이를 혈액으로 검사할 수 있는 진단기기가 미국 FDA 승인을 받은 바 있다.

암 관련 동반진단 제품 및 서비스는 다수의 유전자와 다양한 형태의 유전자 변이 검사가 가능하여야 하며, 특히 혈액에서 수행하기 위해서는 낮은 비율의 암 유전자 변이 검사가 가능한 민감도가 필요하다. 따라서, 유전체의 모든 서열을 결정하는 대신, 맞춤 치료를 위한 중요한 유전자와 유전변이만 선별하여 서열을 결정하는 것이 보다 효과적이고, 이에 특정 유전자만 선별해 내는 기술이 필요하다. 캡쳐 프로브 방식은 그러한 기술 중 하나로서, 캡쳐 프로브의 디자인은 표적 유전자 선별 효율과 직접적으로 관련되어 있고, 소량의 혈액 내 DNA(cell free DNA, cfDNA)를 분석하기 위해 민감도를 높이는데 매우 중요한 요소이다. 따라서, 액체 생검 기반의 차세대염기서열분석을 위해 원하는 표적 유전자 선별을 위한 캡쳐 프로브 세트를 디자인하는 기술이 요구되며, 이러한 기술을 이용하여 디자인된 암종별로 효과적인 프로브 세트가 필요하다.

이와 관련하여, 주요 표적 유전자를 선별할 수 있는 상용화된 제품으로는 SureSelect Target Enrichment System(Agilent), HaloPlex Target Enrichment System(Agilent), Nextra Rapid Capture Custom Enrichment Kit(Illumina), SeqCap EZ Choice Enrichment Kit(Roche) 등이 있는데, SureSelect는 RNA 캡쳐 프로브를, 그 외 나머지는 DNA 캡쳐 프로브를 기반으로 하고 있다. 그러나 cfDNA는 genomic DNA와 다르게 짧은 단편의 형태로 혈액에 존재하고 있어 기존의 방식을 이용한 캡쳐 프로브 디자인은 효율적이지 못하고, 특히 HaloPlex와 Nextera는 전체 유전자를 프로브가 커버하지 못하여 표적 유전자를 선발하기 어려운 문제가 있다.

따라서, 높은 결합력과 선택성으로 표적 유전자를 선별할 수 있는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브가 연구되고 있다. PNA는 DNA 유사체인 인공 합성물질로서 DNA 또는 RNA와 상보적 결합 시 결합력이 더 강하며, 열, 화학, 생물학적으로 안정성이 높은 특징이 있다. PNA 프로브를 사용함으로써 기존의 DNA 혹은 RNA 기반의 프로브 성능을 뛰어넘을 수 있고, 폐암 관련 주요 표적 유전자에 대해 캡쳐 PNA 프로브 영역을 탐지하여 최적의 캡쳐 PNA 프로브 세트를 디자인할 수 있다. 이 때, 표적 유전자는 단일염기변이(Single Nucleotide Variation, SNV), 복제수 변이(Copy Number Alteration, CNA), 유전자 융합(Gene Fusion) 등 다양한 유형의 변이까지 포함해야 한다.

대한민국 공개특허 제10-2011-0098440호는 EGFR 돌연변이 유전자가 존재하는 엑손 18, 19, 20 또는 21에서의 인프레임 결실(in frame deletion) 또는 치환 부분의 야생형과 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 야생형의 증폭을 억제함으로써 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 방법을 개시하고 있으나, EGFR 돌연변이 유전자만을 대상으로 하고 있고, 결실 또는 치환 이외의 변이 유형을 검출할 수 없는 한계가 있다.

대한민국 공개특허 제10-2011-0098440호

본 발명의 목적은 폐암 관련 유전자의 돌연변이에 상보적인 PNA 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 폐암 관련 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머와, 폐암 관련 유전자의 돌연변이에 상보적인 PNA 프로브를 이용하여 폐암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 AKT1(Serine-threonine protein kinase 1), DDR2(Discoidin domain-containing receptor 2), EGFR(Epidermal growth factor receptor), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), ALK(Anaplastic lymphoma kinase), FGFR1(Fibroblast growth factor receptor 1), KRAS(KRAS proto-oncogene), MEK1(MAP2K1, Mitogen-activated protein kinase kinase 1), NRAS(Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog), PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha), BRAF(B-Raf proto-oncogene), 및 PTEN(Phosphatase and tensin homolog) 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 상보적인 PNA(Peptide nucleic acid) 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

i) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계;

ii) 상기 분리된 핵산을 주형으로, AKT1, DDR2, EGFR, HER2, ALK, FGFR1, KRAS, MEK1(MAP2K1), NRAS, PIK3CA, BRAF, 및 PTEN 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머와, 상기 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 상보적인 PNA 프로브를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및

iii) 상기 증폭을 분석하여 상기 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이의 유무 또는 농도를 결정하는 단계;

를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 PNA 프로브는 기존의 DNA 또는 RNA 프로브에 비해 표적 유전자의 선별 효율이 우수하고, 혈액 내 소량으로 존재하고 짧은 단편으로 존재하는 cfDNA(cell free DNA)를 높은 민감도와 특이도로 탐지할 수 있으며, 혈액을 이용한 암 진단 및 모니터링에 대한 정확성을 향상시켜 조기 진단을 가능하게 하고, 주기적인 약물 반응성 모니터링을 통한 맞춤형 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 단일 염기 변이(Single Nucleotide Variation, SNV) 유형에 대한 PNA 프로브 설계 방법을 나타낸 모식도이다(① 25bp: 디자인 할 프로브의 크기(probe size), ② 160bp: cfDNA의 크기(product size), ③ 10bp: 프로브 이동 사이즈(step size), ④ 159bp: 타겟 부위 양쪽으로 설정되는 디자인 범위(probe range)).
도 2는 유전자 융합(Gene Fusion) 변이, 및 복제수 변이(Copy Number Alteration, CNA) 유형에 대한 PNA 프로브 설계 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 표적 유전자끼리 인접한 경우의 프로브 선별 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 후보 프로브 영역에 알려진 다른 변이가 있는 경우의 프로브 선별 방법을 나타낸 모식도이다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

<폐암 진단용 조성물>

본 발명의 한 양태는, AKT1(Serine-threonine protein kinase 1), DDR2(Discoidin domain-containing receptor 2), EGFR(Epidermal growth factor receptor), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), ALK(Anaplastic lymphoma kinase), FGFR1(Fibroblast growth factor receptor 1), KRAS(KRAS proto-oncogene), MEK1(MAP2K1, Mitogen-activated protein kinase kinase 1), NRAS(Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog), PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha), BRAF(B-Raf proto-oncogene), 및 PTEN(Phosphatase and tensin homolog) 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 상보적인 PNA(Peptide nucleic acid) 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물이다.

본 발명에 따른 폐암과 관련된 유전자의 돌연변이 정보는 바람직하게는 하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같을 수 있다.

No.	Gene	c_Mutation	p_Mutation	Position	Type	Reference_ID
1	AKT1	c.49G>A	E17K	14:104780214-104780214	Substitution - Missense	COSM33765
2	DDR2	c.2304T>A	S768R	1:162778600-162778600	Substitution - Missense	NM_001014796.1
3	EGFR	c.2156G>C	G719A	7:55174015-55174015	Substitution - Missense	COSM6239
4	EGFR	c.2155G>T	G719C	7:55174014-55174014	Substitution - Missense	COSM6253
5	EGFR	c.2155G>A	G719S	7:55174014-55174014	Substitution - Missense	COSM6252
6	EGFR	19del	-	7:55181293-55181478(exon19)	Deletion	-
7	EGFR	c.2290_2291ins12	A763_Y764insFQEA	7:55181299-55181300	Insertion - In frame	COSM26720
8	EGFR	c.2303G>T	S768I	7:55181312-55181312	Substitution - Missense	COSM6241
9	EGFR	c.2369C>T	T790M	7:55181378-55181378	Substitution - Missense	COSM6240
10	EGFR	c.2573T>G	L858R	7:55191822-55191822	Substitution - Missense	COSM6224
11	EGFR	c.2582T>A	L861Q	7:55191831-55191831	Substitution - Missense	COSM6213
12	HER2	Exon20_Insertion	-	17:39719787-39719834(exon20)	Insertion - In frame	-
13	ALK	ALK_Fusion	-	2:29223342-29225461(exon19-exon20)	Fusion	-
14	FGFR1	FGFR_Amplification	-	8:38411138-38468834(FGFR1)	Amplification	-
15	KRAS	c.34G>T	G12C	12:25245351-25245351	Substitution - Missense	COSM516
16	KRAS	c.34G>C	G12R	12:25245351-25245351	Substitution - Missense	COSM518
17	KRAS	c.34G>A	G12S	12:25245351-25245351	Substitution - Missense	COSM517
18	KRAS	c.35G>C	G12A	12:25245350-25245350	Substitution - Missense	COSM522
19	KRAS	c.35G>A	G12D	12:25245350-25245350	Substitution - Missense	COSM521
20	KRAS	c.35G>T	G12V	12:25245350-25245350	Substitution - Missense	COSM520
21	KRAS	c.37G>T	G13C	12:25245348-25245348	Substitution - Missense	COSM527
22	KRAS	c.37G>C	G13R	12:25245348-25245348	Substitution - Missense	COSM529
23	KRAS	c.37G>A	G13S	12:25245348-25245348	Substitution - Missense	COSM528
24	KRAS	c.38G>C	G13A	12:25245347-25245347	Substitution - Missense	COSM533
25	KRAS	c.38G>A	G13D	12:25245347-25245347	Substitution - Missense	COSM532
26	KRAS	c.181C>A	Q61K	12:25227343-25227343	Substitution - Missense	COSM549
27	KRAS	c.182A>T	Q61L	12:25227342-25227342	Substitution - Missense	COSM553
28	KRAS	c.182A>G	Q61R	12:25227342-25227342	Substitution - Missense	COSM552
29	KRAS	c.183A>C	Q61H	12:25227341-25227341	Substitution - Missense	COSM554
30	KRAS	c.183A>T	Q61H	12:25227341-25227341	Substitution - Missense	COSM555
31	MEK1 (MAP2K1)	c.167A>C	Q56P	15:66435113-66435113	Substitution - Missense	COSM1235481
32	MEK1 (MAP2K1)	c.171G>T	K57N	15:66435117-66435117	Substitution - Missense	COSM1235478
33	MEK1 (MAP2K1)	c.199G>A	D67N	15:66435144-66435144	Substitution - Missense	COSM1235479
34	NRAS	c.34G>T	G12C	1:114716127-114716127	Substitution - Missense	COSM562
35	NRAS	c.34G>C	G12R	1:114716127-114716127	Substitution - Missense	COSM561
36	NRAS	c.34G>A	G12S	1:114716127-114716127	Substitution - Missense	COSM563
37	NRAS	c.35G>C	G12A	1:114716126-114716126	Substitution - Missense	COSM565
38	NRAS	c.35G>A	G12D	1:114716126-114716126	Substitution - Missense	COSM564
39	NRAS	c.181C>A	Q61K	1:114713909-114713909	Substitution - Missense	COSM580
40	NRAS	c.182A>T	Q61L	1:114713908-114713908	Substitution - Missense	COSM583
41	NRAS	c.182A>G	Q61R	1:114713908-114713908	Substitution - Missense	COSM584
42	NRAS	c.183A>C	Q61H	1:114713907-114713907	Substitution - Missense	COSM586
43	NRAS	c.183A>T	Q61H	1:114713907-114713907	Substitution - Missense	COSM585
44	PIK3CA	c.1624G>A	E542K	3:179218294-179218294	Substitution - Missense	COSM760
45	PIK3CA	c.1633G>A	E545K	3:179218303-179218303	Substitution - Missense	COSM763
46	PIK3CA	c.1633G>C	E545Q	3:179218303-179218303	Substitution - Missense	COSM27133
47	PIK3CA	c.3140A>T	H1047L	3:179234297-179234297	Substitution - Missense	COSM776
48	PIK3CA	c.3140A>G	H1047R	3:179234297-179234297	Substitution - Missense	COSM775
49	BRAF	c.1397G>T	G466V	7:140781611-140781611	Substitution - Missense	COSM451
50	BRAF	c.1405_1406delGGinsTT	G469L	7:140781602-140781603	Indel - Missense	NM_004333.4
51	BRAF	c.1406G>C	G469A	7:140781602-140781602	Substitution - Missense	COSM460
52	BRAF	c.1415A>G	Y472C	7:140781593-140781593	Substitution - Missense	COSM1133046
53	BRAF	c.1789C>G	L597V	7:140753346-140753346	Substitution - Missense	COSM470
54	BRAF	c.1799T>A	V600E	7:140753336-140753336	Substitution - Missense	COSM476
55	PTEN	c.697C>T	R233*	10:87957915-87957915	Substitution - Nonsense	COSM5154

No.	Gene	(+/-) 20bp 서열
1	AKT1	CCACCCGCACGTCTGTAGGG[G]AGTACATCAAGACCTGGCGG
2	DDR2	GGCAAGTTCACTACAGCAAG[T]GATGTGTGGGCCTTTGGGGT
3	EGFR	CAAAAAGATCAAAGTGCTGG[G]CTCCGGTGCGTTCGGCACGG
4	EGFR	TCAAAAAGATCAAAGTGCTG[G]GCTCCGGTGCGTTCGGCACG
5	EGFR	TCAAAAAGATCAAAGTGCTG[G]GCTCCGGTGCGTTCGGCACG
6	EGFR	-
7	EGFR	-
8	EGFR	GGAAGCCTACGTGATGGCCA[G]CGTGGACAACCCCCACGTGT
9	EGFR	CTCCACCGTGCAGCTCATCA[C]GCAGCTCATGCCCTTCGGCT
10	EGFR	CAAGATCACAGATTTTGGGC[T]GGCCAAACTGCTGGGTGCGG
11	EGFR	AGATTTTGGGCTGGCCAAAC[T]GCTGGGTGCGGAAGAGAAAG
12	HER2	-
13	ALK	-
14	FGFR1	-
15	KRAS	AACTTGTGGTAGTTGGAGCT[G]GTGGCGTAGGCAAGAGTGCC
16	KRAS	AACTTGTGGTAGTTGGAGCT[G]GTGGCGTAGGCAAGAGTGCC
17	KRAS	AACTTGTGGTAGTTGGAGCT[G]GTGGCGTAGGCAAGAGTGCC
18	KRAS	ACTTGTGGTAGTTGGAGCTG[G]TGGCGTAGGCAAGAGTGCCT
19	KRAS	ACTTGTGGTAGTTGGAGCTG[G]TGGCGTAGGCAAGAGTGCCT
20	KRAS	ACTTGTGGTAGTTGGAGCTG[G]TGGCGTAGGCAAGAGTGCCT
21	KRAS	TTGTGGTAGTTGGAGCTGGT[G]GCGTAGGCAAGAGTGCCTTG
22	KRAS	TTGTGGTAGTTGGAGCTGGT[G]GCGTAGGCAAGAGTGCCTTG
23	KRAS	TTGTGGTAGTTGGAGCTGGT[G]GCGTAGGCAAGAGTGCCTTG
24	KRAS	TGTGGTAGTTGGAGCTGGTG[G]CGTAGGCAAGAGTGCCTTGA
25	KRAS	TGTGGTAGTTGGAGCTGGTG[G]CGTAGGCAAGAGTGCCTTGA
26	KRAS	ATATTCTCGACACAGCAGGT[C]AAGAGGAGTACAGTGCAATG
27	KRAS	TATTCTCGACACAGCAGGTC[A]AGAGGAGTACAGTGCAATGA
28	KRAS	TATTCTCGACACAGCAGGTC[A]AGAGGAGTACAGTGCAATGA
29	KRAS	ATTCTCGACACAGCAGGTCA[A]GAGGAGTACAGTGCAATGAG
30	KRAS	ATTCTCGACACAGCAGGTCA[A]GAGGAGTACAGTGCAATGAG
31	MEK1 (MAP2K1)	CCTTGAGGCCTTTCTTACCC[A]GAAGCAGAAGGTGGGAGAAC
32	MEK1 (MAP2K1)	GAGGCCTTTCTTACCCAGAA[G]CAGAAGGTGGGAGAACTGAA
33	MEK1 (MAP2K1)	TGGGAGAACTGAAGGATGAC[G]ACTTTGAGAAGATCAGTGAG
34	NRAS	AACTGGTGGTGGTTGGAGCA[G]GTGGTGTTGGGAAAAGCGCA
35	NRAS	AACTGGTGGTGGTTGGAGCA[G]GTGGTGTTGGGAAAAGCGCA
36	NRAS	AACTGGTGGTGGTTGGAGCA[G]GTGGTGTTGGGAAAAGCGCA
37	NRAS	ACTGGTGGTGGTTGGAGCAG[G]TGGTGTTGGGAAAAGCGCAC
38	NRAS	ACTGGTGGTGGTTGGAGCAG[G]TGGTGTTGGGAAAAGCGCAC
39	NRAS	ACATACTGGATACAGCTGGA[C]AAGAAGAGTACAGTGCCATG
40	NRAS	CATACTGGATACAGCTGGAC[A]AGAAGAGTACAGTGCCATGA
41	NRAS	CATACTGGATACAGCTGGAC[A]AGAAGAGTACAGTGCCATGA
42	NRAS	ATACTGGATACAGCTGGACA[A]GAAGAGTACAGTGCCATGAG
43	NRAS	ATACTGGATACAGCTGGACA[A]GAAGAGTACAGTGCCATGAG
44	PIK3CA	CTACACGAGATCCTCTCTCT[G]AAATCACTGAGCAGGAGAAA
45	PIK3CA	ATCCTCTCTCTGAAATCACT[G]AGCAGGAGAAAGATTTTCTA
46	PIK3CA	ATCCTCTCTCTGAAATCACT[G]AGCAGGAGAAAGATTTTCTA
47	PIK3CA	GAAACAAATGAATGATGCAC[A]TCATGGTGGCTGGACAACAA
48	PIK3CA	GAAACAAATGAATGATGCAC[A]TCATGGTGGCTGGACAACAA
49	BRAF	GGGACAAAGAATTGGATCTG[G]ATCATTTGGAACAGTCTACA
50	BRAF	-
51	BRAF	AATTGGATCTGGATCATTTG[G]AACAGTCTACAAGGGAAAGT
52	BRAF	TGGATCATTTGGAACAGTCT[A]CAAGGGAAAGTGGCATGGTA
53	BRAF	TAAAAATAGGTGATTTTGGT[C]TAGCTACAGTGAAATCTCGA
54	BRAF	TGATTTTGGTCTAGCTACAG[T]GAAATCTCGATGGAGTGGGT
55	PTEN	CCTCCAATTCAGGACCCACA[C]GACGGGAAGACAAGTTCATG

본 발명에 있어서 돌연변이란 유전자 또는 염색체의 이상에 의해 유전자에 질적 또는 양적인 변화가 생겨 유전 형질에 변화를 유발하는 현상을 의미한다. 상기 돌연변이는 바람직하게는 단일 염기 변이(Single Nucleotide Variation, SNV), 삽입-결실(Insertion-deletion, Indel) 변이, 유전자 융합(Gene Fusion) 변이, 및 복제수 변이(Copy Number Alteration, CNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 AKT1 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 1번에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 DDR2 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 2번에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 EGFR 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 3 내지 11번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 HER2 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 12번에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 ALK 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 13번에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 FGFR1 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 14번에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 KRAS 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 15 내지 30번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 MEK1(MAP2K1) 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 31 내지 33번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 NRAS 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 34 내지 43번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 PIK3CA 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 44 내지 48번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 BRAF 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 49 내지 54번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 따른 PTEN 유전자의 돌연변이는 바람직하게는 상기 표 1의 55번에 해당하는 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 있어서 PNA 프로브란 펩티드 핵산으로서, 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로, 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 단일 염기 변이를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다. PNA는 화학적으로 안정할 뿐만 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. 또한, PNA는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)와 같은 유전자 인식 물질의 하나로서, 기본 골격이 폴리아미드로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하고, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한, DNA-DNA 결합력 보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하기 때문에, PNA는 1개의 nucleotide miss match에도 융해온도(Tm)가 10~15℃ 가량 차이가 난다. 본 발명은 바로 이러한 결합력의 차이를 이용하여 돌연변이의 뉴클레오타이드 변화를 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 PNA 프로브는 바람직하게는 양말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 가질 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 PNA 프로브에는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자(quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 바람직하게는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으고, 상기 소광자는 바람직하게는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 PNA 프로브는 바람직하게는 서열번호 1 내지 25로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열일 수 있다. 각각의 PNA 프로브의 정보는 바람직하게는 하기 표 3에 나타낸 바와 같을 수 있다.

Probe_ID	표적유전자_변이	PNA 서열	서열번호	Tm
Probe_1	1_AKT1_c.49G>A	CCACGCTACTTCCTCCTCAAGAATG	1	85℃
Probe_2	2_DDR2_c.2304T>A	CCATTCATCCCCAACAGTTCTTACC	2	82℃
Probe_3	3_EGFR_c.2156G>C 4_EGFR_c.2155G>T 5_EGFR_c.2155G>A	CTTACCTTATACACCGTGCCGAACG	3	85℃
Probe_4	6_EGFR_19del 7_EGFR_c.2290_2291ins12 8_EGFR_c.2303G>T 9_EGFR_c.2369C>T	ATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACAT	4	82℃
Probe_5	7_EGFR_c.2290_2291ins12 8_EGFR_c.2303G>T	GCATGAATGCGATCTTGAGTTTCAA	5	85℃
Probe_6	9_EGFR_c.2369C>T	GTATCTCCCTTCCCTGATTACCTTT	6	78℃
Probe_7	10_EGFR_c.2573T>G 11_EGFR_c.2582T>A	TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT	7	77℃
Probe_8	11_EGFR_c.2582T>A	ATGTCTGGAGAGCATCCTCCCCTGC	8	90℃
Probe_9	12_HER2_Exon20_Insertion	CAGCCCTTGTCATCCAGGTCCACAC	9	90℃
Probe_10	13_ALK_ALK_Fusion	GCTTCCACCGGCGCAGCTCCTGTTT	10	90℃
Probe_11	14_FGFR1_FGFR_Amplification	CATAGATACTAGGCTTTAGCTTCCT	11	80℃
Probe_12	15_KRAS_c.34G>T 16_KRAS_c.34G>C 17_KRAS_c.34G>A 18_KRAS_c.35G>C 19_KRAS_c.35G>A 20_KRAS_c.35G>T 21_KRAS_c.37G>T 22_KRAS_c.37G>C 23_KRAS_c.37G>A 24_KRAS_c.38G>C 25_KRAS_c.38G>A	TATTACTGGTGCAGGACCATTCTTT	12	82℃
Probe_13	21_KRAS_c.37G>T 22_KRAS_c.37G>C 23_KRAS_c.37G>A 24_KRAS_c.38G>C 25_KRAS_c.38G>A	AGGTTTCTCTGACCATTTTCATGAG	13	82℃
Probe_14	24_KRAS_c.38G>C 25_KRAS_c.38G>A	GGTTTCTCTGACCATTTTCATGAGT	14	81℃
Probe_15	26_KRAS_c.181C>A 27_KRAS_c.182A>T 28_KRAS_c.182A>G 29_KRAS_c.183A>C 30_KRAS_c.183A>T	CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGG	15	84℃
Probe_16	31_MAP2K1_c.167A>C 32_MAP2K1_c.171G>T 33_MAP2K1_c.199G>A	TGCTCATCAAGCTCTAGCTCCTCCA	16	85℃
Probe_17	33_MAP2K1_c.199G>A	GGTCCCCAGGCTTCTAAGTACCCTG	17	90℃
Probe_18	34_NRAS_c.34G>T 35_NRAS_c.34G>C 36_NRAS_c.34G>A 37_NRAS_c.35G>C 38_NRAS_c.35G>A	GACCTGATCCTGTCTCTCACTTGTC	18	83℃
Probe_19	39_NRAS_c.181C>A 40_NRAS_c.182A>T 41_NRAS_c.182A>G 42_NRAS_c.183A>C 43_NRAS_c.183A>T	CTTCCTCTGTGTATTTGCCATCAAT	19	78℃
Probe_20	44_PIK3CA_c.1624G>A 45_PIK3CA_c.1633G>A 46_PIK3CA_c.1633G>C	GAATCTCCATTTTAGCACTTACCTG	20	79℃
Probe_21	47_PIK3CA_c.3140A>T 48_PIK3CA_c.3140A>G	ATCCAATCCATTTTTGTTGTCCAGC	21	81℃
Probe_22	49_BRAF_c.1397G>T 50_BRAF_c.1405_1406delGGinsTT 51_BRAF_c.1406G>C 52_BRAF_c.1415A>G	CTTTTTCTGTTTGGCTTGACTTGAC	22	79℃
Probe_23	52_BRAF_c.1415A>G	TTTGATTAGTTTCAGGACTCCTCCA	23	82℃
Probe_24	53_BRAF_c.1789C>G 54_BRAF_c.1799T>A	TCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG	24	81℃
Probe_25	55_PTEN_c.697C>T	AAGTACATGAACTTGTCTTCCCGTC	25	83℃

본 발명에 따른 폐암 진단용 조성물은 바람직하게는 AKT1, DDR2, EGFR, HER2, ALK, FGFR1, KRAS, MEK1(MAP2K1), NRAS, PIK3CA, BRAF, 및 PTEN 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머는 본 발명에 따른 유전자에 상보적으로 결합 가능한 바람직하게는 10 내지 40개, 더 바람직하게는 15 내지 35개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 본 발명에 따른 유전자를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.

본 발명에 따른 조성물에는 상기 프라이머 및 PNA 프로브 이외에 바람직하게는 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서 폐암이란 폐에 생긴 악성 종양을 말하며, 이는 원발성 폐암과 전이성 폐암을 포함한다. 폐암은 현미경적으로 암세포의 크기와 형태에 따라 비소세포폐암과 소세포폐암으로 구분된다. 폐암 중 약 80~85%인 비소세포폐암은 바람직하게는 편평상피세포암, 선암, 대세포암 등일 수 있다. 폐암 환자의 약 15~25%인 소세포암은 전반적으로 악성도가 강하여 발견 당시 림프관이나 혈액 순환을 통하여 다른 장기나 반대편 폐, 종격동으로 전이되어 있는 상태로 발견되는 경우가 많다.

본 발명에 있어서 진단이란 질병유무, 질병의 상태 및 질병의 예후를 확인하는 것을 포함하며, 질병상태 및 결정을 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 말한다. 본 발명에 따른 AKT1, DDR2, EGFR, HER2, ALK, FGFR1, KRAS, MEK1(MAP2K1), NRAS, PIK3CA, BRAF, 및 PTEN 유전자의 돌연변이는 폐암의 발병과 밀접한 관련성을 나타내는 유전자 돌연변이로서 상기 유전자 돌연변이 여부의 확인은 폐암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

<폐암 진단용 키트>

본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 폐암 진단용 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트이다.

본 발명에 따른 폐암 진단용 조성물에 관한 설명은 상기 기재한 바와 같다.

본 발명에 따른 키트는 유전자를 증폭하기 위한 다양한 방법에 적용될 수 있다. 본 발명에서 증폭 반응이란 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구연쇄 반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediatedamplification; TMA), 자가유지염기서열복제(self-sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 폐암 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 본 발명에 따른 프라이머 및 PNA 프로브 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 바람직하게는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

<폐암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법>

본 발명의 다른 양태는

i) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계;

ii) 상기 분리된 핵산을 주형으로, AKT1, DDR2, EGFR, HER2, ALK, FGFR1, KRAS, MEK1(MAP2K1), NRAS, PIK3CA, BRAF, 및 PTEN 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머와, 상기 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 상보적인 PNA 프로브를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및

iii) 상기 증폭을 분석하여 상기 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이의 유무 또는 농도를 결정하는 단계;

를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법이다.

본 발명에 따른 검체는 임상시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.

본 발명에서 시료란 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 부위를 포함하는 유전자 시료를 말한다. 구체적으로, 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액 등, 또는 이들로부터 추출된 내인성 유전자 또는 외인성(exogenous) 유전자 일 수 있다. 상기 세포, 조직, 기관, 체액 등은 포유류 (예컨대, 인간, 영장류, 설치류 등)의 환자로부터 채취된 것일 수 있으며, 상기 세포는 바이러스 또는 박테리아 등의 단세포 동물의 세포를 포함할 수 있다. 특히, 폐암의 경우, 상기 시료는 폐암 환자의 세포로부터 추출된 것일 수 있고, 폐암 치료 후 잔존 종양 검사를 위한 경우, 상기 유전자 시료는 종양 치료를 받은 환자의 암세포로부터 추출된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 돌연변이, PNA 프로브, 또는 프라이머 등에 관한 설명은 상기 기재한 바와 같다.

본 발명에 따른 폐암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 바람직하게는 서열번호 1 내지 25로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열인 PNA 프로브를 이용할 수 있고, 상기 PNA 프로브의 정보는 상기 표 3과 같을 수 있다.

이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 폐암과 관련된 주요 표적 유전자 변이 선별

폐암과 관련된 주요 표적 유전자를 선별하기 위해 Sanger Institute의 COSMIC 데이터베이스와 My Cancer Genome에서 제공하는 공개된 변이정보를 기반으로 12개의 표적 유전자에 대한 변이영역과 변이유형을 지정하였다.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 총 55개의 변이를 지정하였고, 변이는 52개의 단일 염기 변이(Single Nucleotide Variation, SNV) 또는 삽입-결실(Insertion-deletion, Indel) 변이, 1개의 유전자 융합(Gene Fusion) 변이, 및 2개의 복제수 변이(Copy Number Alteration, CNA) 영역으로 구성되어 있다.

실시예 2. PNA(Peptide Nucleic acid) 프로브 디자인 영역 지정

PNA 프로브를 설계하기 위해, 프로브 디자인을 위한 영역을 각각의 변이 유형별로 지정하였다.

실시예 1에서 선별한 SNV 변이 유형에 대해서는, 도 1에 나타낸 바와 같이, 표적 부위를 기준으로 Upstream과 Downstream쪽으로 각각 159bp까지 디자인 범위(probe range)를 설정하고, 표적 부위를 포함하는 cfDNA 크기(product size)는 160bp, 디자인 할 프로브의 크기(probe size)는 25bp로 설정한 후, 프로브 이동 사이즈(step size)는 10bp로 지정하여 표적부위로부터 10bp만큼씩 이동하면서 후보 프로브 영역을 계산하였다. Indel 변이 유형 또한 동일한 방법으로 설계하였다.

실시예 1에서 선별한 CNA 또는 Fusion 변이 유형에 대해서는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 변이의 영역이 넓기 때문에 디자인 범위는 표적 부위로 한정하고, 프로브 이동 사이즈를 크게 지정하여 후보 프로브 영역을 계산하였다. 이 때, 프로브 이동 사이즈는 각 유전자의 변이 별 길이를 고려하여 최적의 step size로 설정하였다.

실시예 3. Tm(melting temperature), Purine stretch 및 Complementarity 값의 계산

PNA 프로브는 DNA 프로브와 전반적으로 비슷하지만 PNA 프로브 설계 시 DNA와 다른 PNA의 특성을 고려해야 한다. 구체적으로, PNA/DNA 결합체는 DNA/DNA 결합체보다 높은 Tm 값을 가진다는 점, 퓨린(Purine) 염기가 많은 PNA 프로브는 상호 응집하는 경향이 높다는 점(Purine stretch), PNA-PNA 결합은 PNA-DNA 결합보다 매우 강하기 때문에 PNA가 서로 결합될 수 있는 self complementarity를 피해야 하는 점을 고려해야 한다. 상기 세 가지 조건을 고려하여 온라인 PNA designer 도구를 이용해 후보 PNA 프로브의 Tm, Purine stretch, Complementarity를 계산하였고, 자체적으로 구축한 파이썬(Python) scraper 모듈을 통해 주어진 PNA 서열에 대한 Tm, Purine stretch, Complementarity 계산 결과를 얻었다.

실시예 4. 최종 PNA 프로브 세트 선별

실시예 1 내지 3을 통해 도출된 후보 PNA 프로브에 대해 하기 절차를 거쳐 최종적인 PNA 프로브 세트를 선별하였다.

먼저, 표적 유전자가 서로 인접해 있어 PNA 프로브가 겹치는 경우, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대표하는 하나의 프로브만 남기고 나머지를 제거하였다. 위치가 동일한 표적 부위, 예를 들면 KRAS_c.34G>T, KRAS_c.34G>C, KRAS_c.34G>A 변이에 대해서는 하나의 프로브만 사용하였다. COSMIC 정보를 이용하여 프로브 영역에 다른 변이가 있는지 확인하고 1개 이상의 변이가 있는 경우, 도 4에 나타낸 바와 같이, 해당 프로브를 제거하였다. 프로브 서열에서 GC 40% 이상, 퓨린 60% 이하인 프로브만 남기고 나머지는 제거하였다. Specificity 고려하여, PNA 프로브가 캡쳐하는 부위와 유사한 서열이 있는지 BLAST를 수행하고, 유사서열이 있는 프로브는 가능한 제거하였다.

<110> INSILICOGEN, INCORPORATION <120> COMPOSITIONS FOR DIAGNOSING LUNG CANCER COMPRISING PEPTIDE NUCLEIC ACID PROBE COMPLEMENTARY TO LUNG CANCER RELATED MUTATIONS <130> 19P0051 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_1 <400> 1 ccacgctact tcctcctcaa gaatg 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_2 <400> 2 ccattcatcc ccaacagttc ttacc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_3 <400> 3 cttaccttat acaccgtgcc gaacg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_4 <400> 4 atattgtctt tgtgttcccg gacat 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_5 <400> 5 gcatgaatgc gatcttgagt ttcaa 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_6 <400> 6 gtatctccct tccctgatta ccttt 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_7 <400> 7 tccttctgca tggtattctt tctct 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_8 <400> 8 atgtctggag agcatcctcc cctgc 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_9 <400> 9 cagcccttgt catccaggtc cacac 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_10 <400> 10 gcttccaccg gcgcagctcc tgttt 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_11 <400> 11 catagatact aggctttagc ttcct 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_12 <400> 12 tattactggt gcaggaccat tcttt 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_13 <400> 13 aggtttctct gaccattttc atgag 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_14 <400> 14 ggtttctctg accattttca tgagt 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_15 <400> 15 cagactgtgt ttctcccttc tcagg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_16 <400> 16 tgctcatcaa gctctagctc ctcca 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_17 <400> 17 ggtccccagg cttctaagta ccctg 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_18 <400> 18 gacctgatcc tgtctctcac ttgtc 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_19 <400> 19 cttcctctgt gtatttgcca tcaat 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_20 <400> 20 gaatctccat tttagcactt acctg 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_21 <400> 21 atccaatcca tttttgttgt ccagc 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_22 <400> 22 ctttttctgt ttggcttgac ttgac 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_23 <400> 23 tttgattagt ttcaggactc ctcca 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_24 <400> 24 tcttcataat gcttgctctg atagg 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe_25 <400> 25 aagtacatga acttgtcttc ccgtc 25

Claims (19)

1. AKT1(Serine-threonine protein kinase 1), DDR2(Discoidin domain-containing receptor 2), EGFR(Epidermal growth factor receptor), HER2(Human epidermal growth factor receptor 2), ALK(Anaplastic lymphoma kinase), FGFR1(Fibroblast growth factor receptor 1), KRAS(KRAS proto-oncogene), MEK1(MAP2K1, Mitogen-activated protein kinase kinase 1), NRAS(Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog), PIK3CA(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha), BRAF(B-Raf proto-oncogene), 및 PTEN(Phosphatase and tensin homolog) 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 상보적인 PNA(Peptide nucleic acid) 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 AKT1 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
   

   
3. 제1항에 있어서, 상기 DDR2 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
   

   
4. 제1항에 있어서, 상기 EGFR 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
   

   
5. 제1항에 있어서, 상기 HER2 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
   

   
6. 제1항에 있어서, 상기 ALK 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
   

   
7. 제1항에 있어서, 상기 FGFR1 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
   

   
8. 제1항에 있어서, 상기 KRAS 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
   

   
9. 제1항에 있어서, 상기 MEK1(MAP2K1) 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
   

   
10. 제1항에 있어서, 상기 NRAS 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
    

    
11. 제1항에 있어서, 상기 PIK3CA 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
    

    
12. 제1항에 있어서, 상기 BRAF 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
    

    
13. 제1항에 있어서, 상기 PTEN 유전자의 돌연변이는 하기 표에 나타낸 돌연변이인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
    

    
14. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 단일 염기 변이(Single Nucleotide Variation, SNV), 삽입-결실(Insertion-deletion, Indel) 변이, 유전자 융합(Gene Fusion) 변이, 및 복제수 변이(Copy Number Alteration, CNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
15. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 서열번호 1 내지 25로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
16. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 AKT1, DDR2, EGFR, HER2, ALK, FGFR1, KRAS, MEK1(MAP2K1), NRAS, PIK3CA, BRAF, 및 PTEN 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트.
18. i) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계;
    ii) 상기 분리된 핵산을 주형으로, AKT1, DDR2, EGFR, HER2, ALK, FGFR1, KRAS, MEK1(MAP2K1), NRAS, PIK3CA, BRAF, 및 PTEN 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머와, 상기 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 상보적인 PNA 프로브를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    iii) 상기 증폭을 분석하여 상기 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이의 유무 또는 농도를 결정하는 단계;
    를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 서열번호 1 내지 25로 기재되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.

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