KR20110042511A - ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 Ｋ-ｒａｓ 돌연변이 검출 방법 및 키트 - Google Patents

ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 Ｋ-ｒａｓ 돌연변이 검출 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 K-ras 유전자 엑손 2의 코돈 12 또는 13 부위의 야생형과 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 이용하여 야생형의 증폭을 억제함으로써 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
K-ras, PNA 프로브, 실시간 PCR, Real-time PCR, 분자 진단, 돌연변이 검출, PNA 클램핑, PNA clamping

Description

ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 Ｋ-ｒａｓ 돌연변이 검출 방법 및 키트{Methods and kits for the K-ras mutant detection using PNA mediated Real-time PCR clamping}
본 발명은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, 이하 'PNA'라 함) 프로브를 이용한 K-ras 유전자 돌연변이 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, K-ras 유전자 코돈 12 및/또는 13의 돌연변이 검출을 위하여 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 야생형의 증폭을 억제함으로써 소량의 돌연변이형만을 높은 민감도로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
암의 발생에 암유전자(oncogene) 및 종양억제유전자(tumor suppressor gene)의 돌연변이가 관여한다는 사실이 알려지면서 여러 암유전자 및 종양억제유전자의 돌연변이를 검출하는 연구가 다양하게 진행되고 있으며, 이에 따라 암의 발생 및 약물의 예후판단에 관여하는 많은 돌연변이가 발견되고 있다. 이 중 K-ras 유전자에 의해 생성되는 단백질(p21ras)은 GTPase의 활성을 가지며 세포내의 신호전달(signal transduction)에 관여한다고 알려져 있다. K-ras 유전자의 돌연변이는 p21ras 단백질의 기능적 변화를 초래하여 세포핵의 성장신호를 필요 이상으로 전달 함으로써 세포의 성장과 분열을 촉진하여 발암과정에 관여한다. K-ras 유전자의 변이는 주로 코돈 12, 13 및 61에서 점 돌연변이(point mutation)로 발견되며, 주로 폐암 중 비소세포성 폐암에서 주로 발견되고 있다. K-ras 유전자의 돌연변이는 흡연력과 연관이 있으며 돌연변이가 발생하는 경우 암 치료에 대한 예후가 나쁘다고 보고되어 있다. 또한 편평상피세포암 및 대세포암에서도 많이 발견된다고 보고되고 있다(Yoon et al., J Lung Cancer 1(1):55-59, 2002; Beau-Faller et al., British Journal of Cancer 100: 985-992, 2009). K-ras의 점 돌연변이는 췌장 암종의 80∼100%에서 발견되고 있으며, 이들 돌연변이는 대부분이 코돈 12에 집중되어 있다. 이러한 K-ras 점 돌연변이는 비소세포성 폐암, 췌장암, 대장암 등의 진단에 있어 유용한 마커로서 폭넓게 연구되고 있다(Minamoto et al., Cancer Detection & Prevention 24:1-12, 2000; Samowitz WS et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 9: 1193-7, 2000; Andreyev HJ, et al., Br. J. Cancer 85: 692-6, 2001; Brink M, et al., Carcinogenesis 24(8): 703-10, 2003). 특히 K-ras 돌연변이 검출은 EGFR (epidermal growth factor receptor)을 표적으로 치료하는 방법에 있어 치료효과를 예측할 수 있는 중요한 지표이다 (Dacic., Adv Anat Pathol 15(4): 241-247, 2008; Dahse et al., Oral Oncology 45(9): 826-829, 2009; Krypuy et al., BMC cancer 6:295, 2006).
이러한 K-ras 돌연변이의 검출 방법으로는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 후 염기서열분석을 통한 변이 검출 방법, 야생형을 인식해 절단하는 제한효소(BstNI, MvaI)를 사용하여 절단된 야생형과 절단되지 않은 돌연 변이형 증폭산물의 크기를 통해 검출하는 방법(Restriction enzyme digestion of wild-type DNA)(Dieterle et al., Clin Cancer Res. 10:641-650, 2004), 야생형과 돌연변이 유전자의 3차원적인 구조(conformation) 차이에 따른 전기영동상 이동 거리의 변화를 통해 검출하는 방법인 중합효소연쇄반응-단일쇄 형태구조 다형성(Polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism; PCR-SSCP) 방법(Oh et al., The Korean Journal of Pathology. 35: 291-298, 2001) 등이 사용되어 왔다. 그러나 상기 방법들은 PCR 이후 제한효소로 절단하는 과정 및 전기영동의 과정, 염기서열분석의 단계를 거쳐 돌연변이를 검출하는 방법이므로 반응시간이 오래 소요되고 번거로우며 많은 비용이 소요된다. 또한 임상 시료는 돌연변이가 야생형에 비해 아주 극소량 존재하는 경우가 많기 때문에, 소량의 돌연변이를 검출하는 것이 매우 중요함에도 불구하고, 상기의 방법은 낮은 검출 민감도를 가지므로 극소량의 돌연변이의 검출이 어렵다.
민감도를 증가시키기 위해 돌연변이에 특이적인 프라이머로 돌연변이를 선택적으로 증폭하는 대립형질 특이적(allele specific) PCR 방법(Rhodes et al., Diagn mol pathol. 6(1):49-57, 1997), 임계적 변성온도(critical denaturation temperature, Tc)를 이용하여 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 콜드-PCR(Cold-PCR) 방법(Zuo et al., Modern Pathol. 22:1023-1031, 2009) 등이 사용되고 있다. 또한, 스코피언(scorpion) 프로브를 이용하여 돌연변이를 선택적으로 검출하는 스코피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR)(DxS' scorpions® and ARMS®) 방법이 사용되고 있다(Cross., Pharmacogenomics 9(4): 463-467, 2008). 이러한 기술은 쉽고 빠르게 다양한 진단에 적용이 가능하며, 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석을 위해 좋은 기술이 되고 있다(Bernard et al., Clinical Chemistry 48(8):1178-1185, 2002). 그러나 상기한 방법은 돌연변이를 검출하기 위하여 돌연변이가 발생하는 부위에 각각 프로브나 프라이머를 모두 사용해야 하기 때문에 하나의 돌연변이를 검출하기 위하여 여러 반응이 요구되는 번거로움이 있다(Rhodes et al., Diagn mol pathol. 6(1):49-57, 1997; Zuo et al., Modern Pathol. 22:1023-1031, 2009).
최근에는 돌연변이형을 선택적으로 검출하는 기술로 상기한 방법과는 달리 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 다량 존재하는 야생형의 증폭을 억제하는 방법으로 돌연변이를 선택적으로 검출하는 PNA 클램핑(clamping) 기술이 개발되었다. PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다(Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500). PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티 드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다. PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 점 돌연변이가 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있어 많이 이용되고 있다.
PNA 클램핑의 대표적인 기술로는 야생형에 특이적으로 결합하는 17mer의 PNA 프로브(서열번호 41: CCTACGCCACCAGCTCC)를 이용하여 K-ras 돌연변이형을 야생형과의 용융곡선(Tm melting curve)의 차이로 진단하는 기술이 있다(US 2008/0176226 A1, Jul. 24, 2008; Chen et al., Clinical Chemistry 50(3):481-489, 2004; Behn et al., J. Pathol 190:69-75, 2000; Rhodes et al., Diagn mol pathol. 6(1):49-57, 1997; Dabritz et al., Br. J. Cancer 92: 405-412, 2005; Beau-Faller et al., Br. J. Cancer 100: 985-992, 2009). 그러나 이 기술은 민감한 검출을 위하여 증폭반응의 사이클 수가 아닌 용융곡선의 차이로 돌연변이형을 구별하게 되는데, PNA 클램핑 프로브 이외에 용융곡선을 측정하기 위한 형광을 검출할 수 있는 공여체 형광물질(donor fluorophore)과 수용체(acceptor)가 부착되어 있는 프로브를 필요로 한다. 이와 같이 형광이 표지된 프로브를 다량 포함하여 검출을 하게 되므로 분석을 위한 비용이 높아지는 문제점이 발생한다.
본 발명자들은 종래의 17mer보다 길이가 긴(18 내지 25mer) PNA 클램핑 프로브를 이용하여 야생형과의 증폭 사이클 차이만으로 변이형을 검출함으로써 용융곡선의 차이를 이용한 변이형 검출 기술보다 간편할 뿐만 아니라, 다량의 야생형의 증폭을 완벽하게 저해하여 변이형의 검출 민감도를 향상시킴으로써 극소량 섞여있는 돌연변이를 높은 민감도로 신속 정확하게 검출할 수 있는, PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 K-ras 돌연변이 검출 기술을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 K-ras 돌연변이 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 K-ras 돌연변이 검출 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 면은
K-ras 유전자 클램핑 프라이머 세트와, 서열번호 1 내지 36 중 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브의 존재 하에, K-ras 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 K-ras 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:
단계를 포함하는, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 태양에서는, 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 K-ras 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정한다.
K-ras 유전자 클램핑 프라이머 세트는 K-ras 유전자 야생형의 코돈 12 또는 13의 상류부분(upstream)에 특이적으로 결합하는 정방향(forward) 프라이머를 포함하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 정방향 프라이머는 서열번호 37 또는 38의 것이다.
PNA 클램핑 프로브는 N-말단 또는 C-말단 링커(linker)를 갖는 것이 바람직하다.
PNA 클램핑 프로브는 실시간 PCR의 반응물 중 1 내지 1000 nM의 최종농도를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 태양에서는, DNA 삽입(intercalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는바, 예를 들어 SYBR 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. DNA 삽입이 가능한 형광물질은 모두 사용가능하며, 특별한 제한은 없다.
본 발명에 따른 방법은 대장암, 췌장암, 비소세포성 폐암, 선암 또는 편평상피세포암 등을 진단하는데 사용할 수 있다.
K-ras 유전자는 환자의 종양 표본 또는 혈액으로부터 추출되어 증폭된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 면은
서열번호 1 내지 36 중 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브:
를 포함하는, 본 발명에 따른 K-ras 유전자의 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 암 발생 및 예후에 관여하는 K-ras 유전자의 돌연변이를 단시간 내에 우수한 민감도 및 특이도로 극소량 포함되어 있는 돌연변이까지 검출할 수 있다. 또한 프로브로 이용된 PNA 자체가 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하고 검출하는 방법이 매우 간단하며 단시간 내에 검출이 이루어지므로 대량 분석 및 임상에서 사용하기에 매우 용이할 것으로 기대된다.
1. PNA 클램핑 프로브의 설계 및 제작
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 PNA 프로브는 K-ras 엑손 2의 코돈 12 또는 13의 야생형 유전자의 서열에 완벽하게 결합할 수 있는(perfectly matched) 것으로서 18개 이상, 바람직하게는 18-25개, 보다 바람직하게는 19-23개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 PNA 프로브는 K-ras 엑손 2의 코돈 12 또는 13의 야생형 유전자 부위가 프로브의 가운데에 위치하도록 고안된 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 PNA 프로브는 서열번호 1 내지 36 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지 식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것인바, 18mer 이상의 길이를 갖는 PNA 프로브로서 본 발명에 따른 PNA 클램핑 실시간 PCR을 이용하여 증폭 사이클 차이만으로 K-ras 엑손 2 코돈 12 또는 13의 돌연변이를 효과적으로 검출해낼 수 있는 것인 한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
구체적으로는, 서열번호 1 내지 3 및 7 내지 21은 K-ras 코돈 12의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브로서 K-ras 유전자 엑손 2의 코돈 12를 포함하는 125-150번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다. 서열번호 4 내지 6 및 22 내지 36은 K-ras 엑손 2의 코돈 13번 위치의 야생형과 완벽하게 결합하여 K-ras 코돈 13번 야생형 유전자의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브로서, K-ras 엑손 2의 코돈 13을 포함하는 127-151번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다(도 1 참조).
서열번호 이름 서열(5'→3') Mer수
1 KC12was-2 GCCTACGCCACCAGCTCCAAC 21
2 KC12was-1 CTACGCCACCAGCTCCAAC 19
3 KC12was-3 TGCCTACGCCACCAGCTCCAACT 23
4 KC13was-3 TCTTGCCTACGCCACCAGCTCCA 23
5 KC13was-1 CTTGCCTACGCCACCAGCT 19
6 KC13was-2 CTTGCCTACGCCACCAGCTCC 21
7 KC12was-4 CTACGCCACCAGCTCCAA 18
8 KC12was-5 CCTACGCCACCAGCTCCA 18
9 KC12was-6 CCTACGCCACCAGCTCCAA 19
10 KC12was-7 GCCTACGCCACCAGCTCCA 19
11 KC12was-8 CCTACGCCACCAGCTCCAAC 20
12 KC12was-9 GCCTACGCCACCAGCTCCAA 20
13 KC12was-10 TGCCTACGCCACCAGCTCCAA 21
14 KC12was-11 CCTACGCCACCAGCTCCAACT 21
15 KC12was-12 TGCCTACGCCACCAGCTCCAAC 22
16 KC12was-13 GCCTACGCCACCAGCTCCAACT 22
17 KC12was-14 TTGCCTACGCCACCAGCTCCAAC 23
18 KC12was-15 TTGCCTACGCCACCAGCTCCAACT 24
19 KC12was-16 CTTGCCTACGCCACCAGCTCCAAC 24
20 KC12was-17 CTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACT 25
21 KC12was-18 TTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTA 25
22 KC13was-4 GCCTACGCCACCAGCTCC 18
23 KC13was-5 TGCCTACGCCACCAGCTC 18
24 KC13was-6 TTGCCTACGCCACCAGCTC 19
25 KC13was-7 TGCCTACGCCACCAGCTCC 19
26 KC13was-8 TTGCCTACGCCACCAGCTCC 20
27 KC13was-9 CTTGCCTACGCCACCAGCTC 20
28 KC13was-10 TTGCCTACGCCACCAGCTCCA 21
29 KC13was-11 CTTGCCTACGCCACCAGCTCC 21
30 KC13was-12 CTTGCCTACGCCACCAGCTCCA 22
31 KC13was-13 TTGCCTACGCCACCAGCTCCAA 22
32 KC13was-14 CTTGCCTACGCCACCAGCTCCAA 23
33 KC13was-15 TCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAA 24
34 KC13was-16 CTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCA 24
35 KC13was-17 CTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAA 25
36 KC13was-18 TCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAAC 25
상기 프로브들 중 대표적으로 서열번호 1 내지 6의 프로브를 적용하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과, 서열번호 1 내지 6의 프로브 모두 우수한 효과를 나타내며 특히 서열번호 1 및 서열번호 4의 프로브가 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 5 참조)
본 발명의 PNA 프로브는 반응효율 및 용해도를 증가시키기 위하여 N-말단(N-terminal) 또는 C-말단(C-terminal) 링커를 포함할 수 있으며, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단)에 아민기를 1개 내지 여러 개 포함할 수 있다. 구체적인 예에서는, N-말단에 아민기(예: 라이신)가 1개 부착된 PNA 프로브를 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다(Dueholm et al., J Org chem. 59(19): 5767-5773, 1994; Christensen J peptide Sci 1(3): 175-183, 1995; Thomson et al., Tetrahedron 51(22): 6179-6194, 1995).
2. K-ras 유전자 클램핑 프라이머의 설계 및 제작
본 발명에서 "K-ras 유전자 클램핑 프라이머"라 함은 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있는 야생형 유전자의 증폭은 억제하고 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있지 않는(즉, 미스매치가 존재하는) 돌연변이 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 가리킨다. 본 발명의 클램핑 프라이머는 특별히 제한되는 것은 아니나, 보다 높은 민감도 및 특이도로 돌연변이를 검출하기 위해서는 PNA 클램핑 프로브를 기준으로 하여 한 방향으로는 PNA 프로브와 일부분이 겹쳐지도록 하며 다른 한 방향으로는 검출하고자 하는 부위를 포함하되 PCR 증폭산물의 크기를 고려하여 고안하는 것이 바람직하다. 또한 PNA 프로브와의 Tm을 고려하고, 길이는 17mer에서 30mer 사이이며, PNA 프로브의 Tm 보다 낮게 설계하는 것이 바람직하다. 진단 민감도 및 특이도를 극대화할 수 있도록, 야생형과 상보적으로 결합하는 PNA 클램핑 프로브 서열 중 돌연변이가 일어나는 염기 바로 앞부분을 포함하도록 설계하는 것이 바람직하다. 구체적인 예에 따르면, 서열번호 1과 서열번호 4의 PNA 프로브의 3' 부위의 9 내지 10개의 염기서열이 포함되도록 22mer 내지 27mer의 클램핑 프라이머를 설계하였다. 본 발명에서 예시된 서열번호 37의 정방향 프라이머는 서열번호 1의 K-ras 유전자 엑손 2의 코돈 12의 상류 부분 107-133번째 염기를 특이적으로 인식하며, 서열번호 38의 정방향 프라이머는 서열번호 4의 K-ras 유전자 엑손 2의 코돈 13의 상류 부분 115-136번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 본 발명에서 예시된 서열번호 37 또는 38의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 40의 역방향 프라이머는 K-ras 유전자 인트론 2 부위의 -17802~-17780번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었으며, 프라이머의 길이는 17mer에서 30mer 사이로 서열번호 37 또는 38과 조합되어 증폭산물의 크기가 80bp 내지 400bp가 되도록 고안되었다.
한편, K-ras 유전자의 염기서열분석을 통한 유전자 확인을 위하여 본 발명에서 제공되는 서열번호 39의 정방향 프라이머는 K-ras 유전자 인트론 1 부위의 -89~-66번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었고, 프라이머의 길이는 17mer에서 30mer 사이로 고안되었으며, 서열번호 40의 역방향 프라이머와 조합되어 증폭산물의 크기가 200bp 내지 500bp가 되도록 고안되었다. 각각의 프라이머의 특성은 하기 표 2에 정리되어 있다.
서열번호 부위 이름 방향 서열(5'→3') 길이
37 엑손 2 코돈 12
클램핑		 K12CF 정방향 GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT 27mer
38 엑손 2 코돈 13
클램핑		 K13CF 정방향 ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT 22mer
39 인트론 1 K-ras-L-F 정방향 AAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGA 24mer
40 인트론 2 K-ras-L-R 역방향 TCATGAAAATGGTCAGAGAAACC 23mer
3. PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 K-ras 돌연변이 검출
본 발명에 따른 K-ras 유전자 돌연변이 검출방법은
(a) K-ras 유전자 클램핑 프라이머 세트와 PNA 클램핑 프로브의 존재 하에, K-ras 유전자에 대해 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 K-ras 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 단계:
를 포함한다.
단계 (a)에서 사용되는 K-ras 유전자는 대상 검체로부터 추출하여 준비된다. 본 발명에서는 핵산추출에 특별한 제한이 없으며, 일반적으로 사용하는 모든 핵산 추출방법을 사용할 수 있으며, 시판중인 핵산 추출키트 등을 사용하여 환자의 혈액 또는 종양 표본으로부터 DNA를 추출하여 준비된다.
단계 (a)에서는, 실시간 PCR 방법을 이용하여 K-ras 유전자의 돌연변이를 검출한다. 실시간 PCR 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(Cycle threshold, 이하 'Ct'라고 칭한다)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 이 방법은 전기영동하여 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 빠르고 간편하게 진단할 수 있는 방법이다. 예를 들어, 본 발명에서는 형광을 이용한 실시간 PCR방법 중 PCR에 의해서 증폭된 이중가닥 DNA에 형광염료가 삽입되어 형광을 나타내는 형광삽입(intercalation) 방법을 사용한다. 이때 발생하는 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.
본 발명에서는 유전자 증폭산물을 확인하기 위한 형광물질로서 실시간 유전자 검출방법에 사용되는 DNA-결합 형광물질(DNA-binding fluorophore)을 사용하며 그 종류에 특별한 제한은 없다. 예를 들어, SYBR 그린 I 외에 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX 오렌지 등을 사용할 수 있다(Gudnason et al., Nucleic Acids Res. 35(19):e127, 2007; Bengtsson et al., Nucleic Acids Res. 31(8):e45; Wittwer et al., Clinical Chemistry 49(6):853-860, 2003).
단계 (b)에서는, 단계 (a)의 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 K-ras 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는바, 증폭된 Ct값을 비교하여 K-ras 유전자의 돌연변이 유무를 확인할 수 있다. 야생형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브가 K-ras 돌연변이 코돈 유전자 부위에 혼성화되어 증폭을 저해하게 되면 증폭이 저해되어 Ct값이 높게 나타난다. 반면 K-ras 돌연변이 코돈 부위에 돌연변이가 발생한 경우 PNA 프로브와 혼성화되지 못하고 증폭되어 Ct값이 낮게 나타나게 된다. 양성 대조 시료로부터 얻어진 Ct값에서 미지의 시료로부터 얻어진 Ct값을 빼어 얻어진 △Ct의 값을 확인하여 각 코돈의 돌연변이 유무를 확인 한다. 돌연변이형 유전자가 다량 포함되어 있을수록 Ct값이 낮게 나타나게 되므로 △Ct 차이가 클수록 돌연변이가 다량 포함되어 있음을 판단할 수 있다.
본 발명의 PNA 클램핑 프로브를 이용한 K-ras 돌연변이 실시간 PCR 방법은 대장암을 비롯하여 췌장암, 비소세포성 폐암, 선암, 편평상피세포암 등의 종양을 검사하는데 이용할 수 있으며, 종양 연구뿐만 아니라 K-ras 신호 전달 체계에 관여하는 기작을 연구하는 데에도 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한 개체군-기초 연구와 같이 다량의 시료 분석을 요구하는 연구에도 효과적으로 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: K-ras 코돈 12 및 13 야생형의 증폭을 억제하기 위한 PNA 프로브 합성
K-ras 유전자의 엑손 2 코돈 12 및 13의 야생형과 완벽하게 결합하는 2개의 PNA 프로브를 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 각 코돈의 야생형과 완벽하게 결합하는 프로브는 돌연변이와의 효과적인 분리를 위하여 돌연변이가 일어나는 염기서열이 프로브의 중간에 위치하도록 고안하였다. 한국등록특허 제 464,261호에 기재된 방법에 따라, PNA 프로브를 합성하였다(Lee et al., Org Lett, 9:3291-3293, 2007).
실시예 2: K-ras 코돈 12 및 13의 야생형 및 돌연변이 세포주(cell line)로부터의 핵산 추출
K-ras 코돈 12 및 13의 야생형 및 돌연변이의 표적핵산을 확보하기 위하여, 한국세포주은행으로부터 K-ras 코돈 12 및 13의 야생형 세포주로 Hela(genomic DNA) 인간 자궁암 세포주[KCLB10002, 한국세포주은행(KCLB), 서울, 한국]를 분양 받았으며, 돌연변이 세포주로는 하기 표 3에 나타난 세포주들을 한국세포주 은행으로부터 분양 받았다. 분양 받은 세포주는 RPMI1640(Hyclone, Thermo scientific, USA)에 10% 열-불활성화 우태아혈청(FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA)과 1× 페니실린-스트렙토마이신(Welgene, Korea)이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO2)가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 Labopass™ 티슈 미니 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 키트에서 제공한 매뉴얼에 의거하여 DNA를 추출하여 표적핵산을 확보하였다. 확보된 핵산은 나노드롭 스펙트로포토미터(ND 2000C, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하고 -20℃에 보관하여 사용하였다. K-ras 유전자의 돌연변이 집중 코돈 부위인 코돈 12 및 13의 야생형 및 돌연변이형 인간 세포주로부터 각각 분리한 전체 DNA를 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 39 및 40의 프라이머 조합을 사용하여 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 Labopass™ PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 정제한 후 염기서열분석하여 유전자형을 확인하였다. 유전자형이 확인된 야생형 및 변이형 세포주는 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 방법의 검체로 사용하였다.
KCLB No 엑손 돌연변이 세포주명 기원
00601 2 Gly12Asp (G12D) SNU-601 위궤양성 종양
10233 2 Gly12Ala (G12A) SW-1116 대장암
10228 2 Gly12Val (G12V) SW-480 대장암
10185 2 Gly12Ser (G12S) A549 폐암
21420 2 Gly12Cys (G12C) MIA PaCa2 췌장암
10229 2 Gly13Asp (G13D) LoVo 대장암
10002 2 Gly12 Hela 자궁암
10222 2 Gly12 Colo205 대장암
실시예 3: K-ras 코돈 12 및 13의 표적핵산을 증폭하기 위한 프라이머 합성
K-ras 코돈 12 및 13의 표적핵산의 증폭 및 클램핑 PCR을 위하여 K-ras 유전자의 엑손 2 부위를 분석하여 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 야생형 및 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 서열번호 39 및 40으로 이루어진 프라이머 한 세트와 서열번호 37의 K-ras 코돈 12 클램핑 프라이머, 서열번호 38의 K-ras 코돈 13 클램핑 프라이머를 합성하였으며, 코돈 12 및 13 클램핑에 사용된 역방향 프라이머는 K-ras 유전자를 확인하기 위하여 고안된 서열번호 40의 역방향 프라이머를 동일하게 사용하였다. 사용한 프라이머의 서열은 상기 표 2에 나타낸 바와 같다. 프라이머는 ㈜바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 4: K-ras 코돈 12 및 13의 야생형에 대한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법 확립
실시예 2에서 세포주로부터 추출된 DNA를 이용하여 하기 조건으로 RT-PCR 클램핑을 수행하여 기존의 K-ras 유전자의 돌연변이를 검색하는 PNA 프로브와 다른 PNA 프로브를 만들어 차이점을 비교해 보고 분석함으로써 최적의 PNA 프로브를 찾고자 하였다. 주형 DNA 용액(50 ng/㎕) 1 ㎕, 표 2에 나타난 1개의 클램핑 센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 안티센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 표 1에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100nM) 1 ㎕, 2× IQ Sybr 그린 슈퍼믹스(Bio-Rad, USA) 10 ㎕, 증류수 6 ㎕를 가하고 실시간 DNA 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD사 제품)를 이용하여 95℃에서 3분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초 그리고 PNA가 혼성화될 수 있는 70℃에서 20초 반응을 추가하고, 63℃ 30초, 72℃ 30초 반응과정을 40회 반복하였다. 형광은 72℃ 중합반응 단계에서 측정하였다.
실시예 5: K-ras 코돈 12 및 13의 야생형에 대한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법을 통한 K-ras 유전자의 돌연변이 검색
실시예 4에서 확립된 실시간 PCR을 이용한 방법을 사용하여 야생형 유전자에 돌연변이 유전자를 각각 10pg, 100pg, 500pg, 1ng, 5ng이 포함하도록 제작하여 돌연변이 유전자의 농도에 따른 Ct값 사이의 상관관계를 분석하여, 돌연변이형의 검출한계를 확인하였다.
그 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다. 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, 용액 내 상대적인 돌연변이 유전자의 농도가 높을수록 형광이 역치값에 도달하는 반응횟수를 나타내는 Ct값이 일정하게 감소하여 용액 내 돌연변이 유전자의 양과 Ct값 사이에 상관관계가 있음을 나타내었다.
비교예 1: K-ras 코돈 12 및 13 야생형 검출을 위한 종래기술과의 비교
미국공개특허 US 2008/0176226 A1에 개시된 PNA 프로브와 본 발명에 따른 PNA 프로브를 비교하기 위하여, 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 상기 미국공개특허의 K-ras 코돈 12 및 13의 야생형에 대한 PNA 프로브를 제작하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3') Mer수
41 PNA 센서 프로브 CCTACGCC ACC AGCTCC 17
상기 미국공개특허의 프로브와 본 발명에 따른 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 실시하여 돌연변이 검출여부를 확인하였다.
그 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었다. 도 3 내지 5로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 미국공개특허의 프로브 사용 시에는 돌연변이형의 존재나 농도 증가에 따라 Ct값에 별다른 차이가 없어(즉 ΔCt값이 작아) 돌연변이의 검출이 어려웠던 것에 비해, 본 발명에 따른 PNA 프로브 사용 시 돌연변이형의 존재에 의해 Ct값이 크게 감소할(즉 ΔCt값이 클) 뿐만 아니라, 돌연변이형의 농도 증가에 따라 Ct값이 일정하게 감소하여 돌연변이형을 효과적으로 검출해낼 수 있었다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 PNA 프로브 사용 시 1:1000 비율로 섞여있는 돌연변이의 유무도 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
도 1은 PNA 기반의 PCR 클램핑 원리를 나타내는 모식도이고;
도 2a는 K-ras 코돈 12의 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이며;
도 2b는 K-ras 코돈 13의 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이고;
도 3은 본 발명에서 고안된 서열번호 1 내지 6의 PNA 프로브와 종래기술의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 통한 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이며,
도 4는 본 발명에서 고안된 서열번호 1 또는 4의 PNA 프로브와 종래기술의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 통한 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도(증폭 사이클 수)를 비교한 그래프이고;
도 5는 K-ras 돌연변이를 가진 세포주를 대상으로 본 발명에서 고안된 서열번호 1 또는 4의 PNA와 종래기술의 PNA 프로브를 이용하여 K-ras 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이다.
<110> Panagene Inc. <120> Methods and kits for the K-ras mutant detection using PNA mediated Real-time PCR clamping <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 1 gcctacgcca ccagctccaa c 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 2 ctacgccacc agctccaac 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 tgcctacgcc accagctcca act 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 4 tcttgcctac gccaccagct cca 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 5 cttgcctacg ccaccagct 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 6 cttgcctacg ccaccagctc c 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 7 ctacgccacc agctccaa 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 8 cctacgccac cagctcca 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 9 cctacgccac cagctccaa 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 10 gcctacgcca ccagctcca 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 11 cctacgccac cagctccaac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 12 gcctacgcca ccagctccaa 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 13 tgcctacgcc accagctcca a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 14 cctacgccac cagctccaac t 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 15 tgcctacgcc accagctcca ac 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 16 gcctacgcca ccagctccaa ct 22 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 17 ttgcctacgc caccagctcc aac 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 18 ttgcctacgc caccagctcc aact 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 19 cttgcctacg ccaccagctc caac 24 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 20 cttgcctacg ccaccagctc caact 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 21 ttgcctacgc caccagctcc aacta 25 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 22 gcctacgcca ccagctcc 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 23 tgcctacgcc accagctc 18 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 24 ttgcctacgc caccagctc 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 25 tgcctacgcc accagctcc 19 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 26 ttgcctacgc caccagctcc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 27 cttgcctacg ccaccagctc 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 28 ttgcctacgc caccagctcc a 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 29 cttgcctacg ccaccagctc c 21 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 30 cttgcctacg ccaccagctc ca 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 31 ttgcctacgc caccagctcc aa 22 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 32 cttgcctacg ccaccagctc caa 23 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 33 tcttgcctac gccaccagct ccaa 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 34 ctcttgccta cgccaccagc tcca 24 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 35 ctcttgccta cgccaccagc tccaa 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 36 tcttgcctac gccaccagct ccaac 25 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 37 gaatataaac ttgtggtagt tggagct 27 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 38 acttgtggta gttggagctg gt 22 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 39 aaaaggtact ggtggagtat ttga 24 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 40 tcatgaaaat ggtcagagaa acc 23 <210> 41 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe - prior art <400> 41 cctacgccac cagctcc 17

Claims (11)

  1. K-ras 유전자 클램핑 프라이머 세트와, 서열번호 1 내지 36 중 어느 하나의 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, K-ras 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
    상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 K-ras 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:
    단계를 포함하는, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 K-ras 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서, K-ras 유전자 클램핑 프라이머 세트는 K-ras 유전자 야생형 코돈 12 또는 13의 상류부분에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머를 포함하는 것인, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  4. 제3항에 있어서, 정방향 프라이머는 서열번호 37 또는 38의 것인, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서, PNA 클램핑 프로브는 N-말단 또는 C-말단 링커(linker)를 갖는 것인, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서, PNA 클램핑 프로브는 실시간 PCR의 반응물 중 1 내지 1000 nM의 최종농도를 갖는 것인, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  7. 제1항에 있어서, DNA 삽입(intercalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서, DNA 삽입(intercalating) 형광물질은 SYBR 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것인, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서, 대장암, 췌장암, 비소세포성 폐암, 선암 또는 편평상피세포암을 진단하는데 사용하기 위한, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  10. 제1항에 있어서, K-ras 유전자는 환자의 종양 표본 또는 혈액으로부터 추출되어 증폭된 것인, K-ras 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  11. 서열번호 1 내지 36 중 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브:
    를 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 K-ras 유전자의 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트.
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