CN103589795A - 一种检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒及其应用 - Google Patents
一种检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒，该试剂盒中含有检测WISP1基因C3290T位点的探针和引物，所述探针和引物能与WISP1基因C3290T位点前后的基因序列特异性结合并扩增出包含WISP1基因C3290T位点的基因序列。本发明是基于Taqman分型方法检测基因多态性的试剂盒，该试剂盒能准确、快速、简便地检测与非小细胞肺癌铂类药物化疗敏感性相关的基因位点（WISP1基因C3290T多态性）。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒及其应用。
背景技术
Wnt1诱导通路蛋白1（Wnt1 indμcible signaling pathway protein 1，WISP1）是生长因子高半胱氨酸蛋白61/结缔组织生长因子/肾母细胞瘤基因（CYR61/CTGF/NOV.CCN）家族的成员之一，对细胞增殖、粘附、生存等具有调节作用。
人类WISP1基因位于8q24.1-q24.3，有5个外显子和4个内含子，编码367个氨基酸，编码蛋白为40kDa。有研究表明，WISP1的表达水平与多种肺疾病相关，如急性肺损伤，肺纤维化及肺癌等。在非小细胞肺癌患者的癌组织中，WISP1呈高表达现象，并且其表达水平与非小细胞肺癌患者的预后相关。
研究报道WISP1基因多态性与多种疾病相关，并采用了不同的基因分型方法来进行检测。例如，A2364G(rs2929970)多态性与多种疾病相关。有研究采用Taqman探针法证明了它与脊柱骨关节炎相关；用溶解曲线法探究了此位点与高血压的关系；还有用质谱分型方法研究了它与结肠癌的关系。溶解曲线法及质谱分型是针对大样本多位点的高通量分型方法，而Taqman探针法是中通量分型的金标准，并且具有灵敏性高、花费相对较少的优点。
Taqman探针法是在PCR上下游引物间选取一段序列作为探针，并在探针上标记荧光基团和淬灭基团，该探针可与模板结合，在延伸反应中，当引物合成至探针与模板结合处是，Taq酶的5’外切酶活性可以讲解探针的5’端，使荧光基团和淬灭基团分离，释放荧光。相对于传统的限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP），Taqman探针法具有灵敏性更高、操作更简单的优势，且通量更高。
发明内容
本发明旨在提供一种检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒，该试剂盒可用于制备检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因多态性的试剂。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒中含有检测WISP1基因C3290T位点的探针和引物，所述探针和引物能与WISP1基因C3290T位点前后的基因序列特异性结合并扩增出包含WISP1基因C3290T位点的基因序列。
优选地，所述探针和引物是与WISP1基因C3290T位点前后500bp的基因序列特异性结合并能扩增出包含WISP1基因C3290T位点的基因序列。
优选地，所述检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒中含有如下探针：
FAM-TAAGTGCCTTAGCAAAAG-MGB（SEQ ID NO.1）；
VIC-ATTAAGTGTCTTAGCAAAAG-MGB（SEQ ID NO.2）；
该试剂盒中还含有如下引物：
5’-AGCTCTCTTCTTCCAAAGCTACATG-3’（SEQ ID NO.3）；
5’-TCTTGCATACGCATACACAAATATATG-3’（SEQ ID NO.4）。
其中，FAM吸收波长485-505nm，发射波长515-530nm；VIC吸收波长515-535nm，发射波长540-560nm；MGB为淬灭基团。所述与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因为WISP1基因C3290T。
所述探针、引物及包含两者的试剂盒均可应用于制备检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因多态性的试剂。
本课题组的前期研究表明，WISP1基因多态C3290T（rs2977549）可能通过影响WISP1在血浆中的表达水平，从而与肺癌易感性及其铂类药物化疗敏感性相关，而之前并无相关报道。
WISP1 C3290T位点位于WISP1基因3’非翻译区（3’ΜTR），在中国汉族人群中，其最小等位基因频率（Minor Allele Freqμency,MAF）为38.3%。由于目前还没有有关C3209T基因多态性及其功能的相关报道，本课题组近期研究才发现其与非小细胞肺癌铂类药物化疗敏感性相关，所以还没有人检测过WISP1基因C3290T多态性，更没有相关检测的试剂盒产品面世。因此，探索检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的方法及产品显得意义深远。
本发明的试剂盒能准确、快速、简便地检测与非小细胞肺癌铂类药物化疗敏感性相关的基因位点（WISP1基因C3290T多态性）。
附图说明
图1为实施例中方法验证荧光散点图；
图2实施例中实验样本荧光散点图。
具体实施方式
实施例1
1.设计Taqman探针及引物
1.1查找WISP1 C3290T位点前后500bp序列
在PΜBMED SNP数据库中搜索WISP1，进入Gene view，选择NM 003882.3转录本并显示整个基因区域的单核苷酸多态性（SNP），进入rs2977549，在Fasta seqμence中可获得此多态位点前、后500bp的序列（SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6），用于寻找合适的探针和引物。
GAATAGGAAA ACATTGCAAT AAATGGCTTG ATTTTTTAAT GTCATTTTTCCCTCTTATAG
TCTTTCTAGC TCCTTTTCAA AAGACGAGAA TATCTGATTT TCTGATAATTTAGGTGCTTA
AGCATCCAAA ATACATGGGA CACACAAAAA TCCAGGAATC CCCTGTAGCTTATTCCCTCT
TTCCCATCGG AACCAGCTCT CATCACACAT TTAAAAGATG ATTCTGTTTACCCAATGCTG
CATATTGAAT GTTGTGTAGT TATTCACAGG GAATTCTGTG CAGTGTGCAGAGAGATTCCT
AAACGGGAAA AGGACTGGGA ATACATCCTC CTTACTGTGA CCTCCCCAAAACCTAGTCCA
GTGCAAGGTA TACAGTGGTG CTCATTAAAT ACTTGATGAA TACAGGAAGCTGTGCATGTG
TTCCTACTTT TATTCGAAGC TCTCTTCTTC CAAAGCTACA TGAAAATAGAATTTTAACAG
TCAAAATTTT ATATTAAGTG（SEQ ID NO.5）
Y（Y是指WISP1C3290T位点）
CTTAGCAAAA GAGACATTTA ATATTTCAAA GAAATGCATA TGTATGTATACATATATTTG
TGTATGCGTA TGCAAGAATT CTTGTATAAA GAGAATTCAC TCCATGAATGATCTCTTCTG
TAAGTCAGTG TGAATCATGT TAGATTTTCT GAGAGTGAAA ACACCTGCCATCTACAAATT
ACAAGGCTGG ATAACAGCTC ACTCCATTTG AAATTCAGTG GAAACCCAAGAGCTAGGTTC
TTACTGAATT TGCATCTCAA TTTGGGAAAC TGAACTTAGC TTTCAAAGATCATAGGAAGT
CTGGTTGGAG AAACTAGGGA TTATTCTGGC AATGGGTGCA GGAAGGTGGTCAGAATAACC
CAGTCGCCAT TGGTTTTGAG AAACGGAACT ATCTTATGCA GAGCCCGGAGGGCAAGTCTC
AGACCCATGG GTTGAAGCCA TGGAGAAGGA AATTTGGATC CAATGTAATGAAGCGCTTTC
TAAGTCAGAA TTTCCCTGCA（SEQ ID NO.6）
1.2利用Primer Express3.0进行探针和引物的设计
（1）探针设计原则：
1.确保G-C含量在20-80%之间。
2.探针5’端的第一个碱基不能是G。
3.用Primer Express
软件计算出来的探针Tm值应当在68-70℃之间。
4.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基。
5.避免同一碱基重复过多，特别是G，不可超过4个及以上。
6.尽量使含C多于含G的探针。如果C少于G，则使用互补链上的探针。
7.如果是SNP，多态位点尽量位于探针中央。
（2）引物设计原则：
1.在探针确定以后再选择引物。
2.引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。
3.保持G-C含量在20-80%之间。
4.避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。
5.用Primer Express
软件计算出来的Tm值应当在58-60℃之间。
6.在3’端的5个碱基中，G和C碱基加起来不要超过2个。
（3）Primer Express3.0操作方法
进入Primer Express3.0软件，File/New/选择TaqMan MGB Allelic。粘贴SNP位点前后500bp序列，标定SNP位置并选择变异类型。然后选择引物/探针查找，软件即开始查找合适的引物和探针。若没有匹配的引物和探针，则可手动设计。
确定WISP1C3290T位点Taqman探针及引物如下：
探针（AB(Applied Biosystems)公司）：
probe1（C）：FAM-TAAGTGCCTTAGCAAAAG-MGB（SEQ ID NO.1）；
probe2（T）：VIC-ATTAAGTGTCTTAGCAAAAG-MGB（SEQ ID NO.2）；
FAM吸收波长485-505nm，发射波长515-530nm；
VIC吸收波长515-535nm，发射波长540-560nm；
MGB为淬灭基团。
引物（铂尚生物）：
primer-F：5’-AGCTCTCTTCTTCCAAAGCTACATG-3’（SEQ ID NO.3）；
primer-R：5’-TCTTGCATACGCATACACAAATATATG-3’（SEQ ID NO.4）。
2.SNP检测
2.1PCR扩增体系及程序
扩增体系（Takara390A）:
程序（Roche LightCycler 480II）:
95℃ 30s
[95℃ 5s
60℃ 20s]40循环
扩增产物：141bp
AGC TCTCTTCTTC CAAAGCTACA TGAAAATAGA ATTTTAACAG TCAAAATTTTATATTAAGTG Y CTTAGCAAAA GAGACATTTA ATATTTCAAA GAAATGCATA
TGTATGTATA CATATATTTG TGTATGCGTA TGCAAGA（SEQ ID NO.7）。
2.2实验方法准确性验证
对已知WISP1 C3290T位点基因型的6个样本用本检测方法进行检测，其中A6/B6为CC基因型，C6/D6为CT基因型，E6/F6为TT基因型已通过质谱分型确认，G6为阴性对照。实验结果如图1所示，A6/B6FAM荧光强度（465-510nm）远大于VIC荧光强度（533-580nm），说明其为CC基因型；C6/D6FAM与VIC荧光强度相当，说明其为CT基因型;E6/F6 VIC荧光强度远大于FAM荧光强度，说明其为TT基因型；G6为阴性对照。我们所建立的Taqman探针法检测出的对应样本的基因型与已知基因型完全一致，表明我们的Taqman SNP检测方法成功建立。
2.3实验样品SNP检测
根据上述已建立的Taqman探针法检测WISP1基因C3290T多态性的方法，我们对20个实验样本进行了分型实验。E7、F7、G7已知为CC、TC、TT基因型作为实验过程的参照。实验结果如表1及图2所示，表1中Call代表分型的实验结果（AlleleX为CC基因型，Both Alleles为TC基因型，AlleleY为TT基因型）其中E7、F7、G7分别为CC、TC、TT基因型，说明实验过程无误；所检测20例样本有2例为CC基因型，10例为TC基因型，8例为TT基因型；三种基因型在图2中呈组内分布集中，组间分布差异明显。更进一步说明我们成功建立Taqman探针法对WISP1基因C3290T多态的检测方法。实验样本结果如表1所示：
表1
采用本发明所述试剂盒能迅速快捷地检测WISP1基因C3290T多态性，且灵敏度高。
我们前期研究中收集了325例肺癌患者和254例健康对照样本。对WISP1 C3290T进行基因分型实验，发现此位点与肺癌易感性相关（P=0.023，OR=1.37，95%CI：1.03-1.81）。同时，我们在151例铂类化疗敏感和178例铂类化疗耐药的肺癌患者中也进行了C3290T位点的基因分型实验，结果表明其与肺癌铂类化疗敏感性显著相关（P＜0.001，OR=0.397，95%CI：0.28-0.61）。此结果表明，携带T等位基因的人群比携带C等位基因人群肺癌易感性高；携带T等位基因的肺癌患者比携带C等位基因的患者铂类化疗敏感性好。因此，WISP1 C3290T对肺癌患者铂类化疗具有一定的临床指导意义。
Claims (6)
1.一种检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测WISP1基因C3290T位点的探针和引物，所述探针和引物能与WISP1基因C3290T位点前后的基因序列特异性结合并扩增出包含WISP1基因C3290T位点的基因序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针和引物是与WISP1基因C3290T位点前后500bp的基因序列特异性结合并能扩增出包含WISP1基因C3290T位点的基因序列。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下探针：
FAM-TAAGTGCCTTAGCAAAAG-MGB；
VIC-ATTAAGTGTCTTAGCAAAAG-MGB；
所述试剂盒中含有如下引物：
5’-AGCTCTCTTCTTCCAAAGCTACATG-3’；
5’-TCTTGCATACGCATACACAAATATATG-3’。
4.权利要求1或2所述试剂盒在制备检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因多态性的试剂中的应用；所述与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因为WISP1基因C3290T。
5.如权利要求3所述试剂盒中的探针在制备检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因多态性的试剂中的应用；所述与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因为WISP1基因C3290T。
6.如权利要求3所述试剂盒中的引物在制备检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因多态性的试剂中的应用；所述与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因为WISP1基因C3290T。
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