CN114107449B - 一种单细胞内原位qPCR方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单细胞内原位qPCR方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)将细胞消化，吹打成为单细胞悬液，去上清，将细胞沉淀重悬，加入甲醛溶液进行固定，之后加入Triton溶液进行打孔，去上清，将细胞沉淀重悬；(2)采用分子信标探针进行探针法RT‑qPCR。本发明的qPCR方法能看到单个细胞层面表达量的差异；不用将细胞分为单个细胞，不裂解细胞，而是让qPCR试剂和探针进入细胞内部，在细胞内部进行qPCR反应，方法简便快捷易操作。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种单细胞内原位qPCR方法。
背景技术
DNA、RNA和蛋白质是定义生物的最基本要素。在生命过程中，DNA像一个蓝图规划着生命的走向，RNA和蛋白质负责将蓝图中的规划变为现实。在这个过程中，作为生命体最小单位的细胞，它的一切活动都离不开蛋白质的参与，蛋白质构成了细胞膜、细胞器、以及细胞核。同时，细胞内部的所有代谢活动都是由蛋白质完成。RNA是负责连接蛋白质与DNA的桥梁，它转录着DNA中的规划，将它们翻译表达为蛋白质，起到了承上启下的作用。但是并不是DNA中的一切规划都会翻译表达为蛋白质，因此DNA与蛋白质其实是间接联系着，直接联系二者的是RNA。因此在分子生物领域的检测中，多数生命活动是否进行以RNA和蛋白质为准。在检测RNA的方法中，实时荧光定量PCR是最普遍、最准确以及最受认可的检测方法。
实时荧光定量PCR(qPCR)是广泛用于分子生物学领域的一种成熟技术，它是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。qPCR的技术原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。qPCR的主要检测方法有两种：一种是SYBGreen法，即在qPCR体系中使用SYBGreen荧光染料，此染料可以特异性渗入双链DNA中并且发出荧光，当此染料未渗入双链DNA时，它不发出任何荧光，从而保证了当PCR反应中扩增的双链DNA增加时荧光信号也会同步对应等量增加。此方法为qPCR中最常用的方法。另一种是Taqman探针法，即PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR扩增的产物形成完全同步。
无论是SYBGreen法还是Taqman探针法都需要将细胞内的RNA提取出来，再进行下一步的qPCR反应然后来检测细胞中的RNA多少。提取RNA需要大量细胞，因此只能检测一群细胞内的目标RNA表达情况，但是实际在提取RNA的细胞群里，并不是每一个细胞的目标RNA表达情况都是一样的，单个细胞内的目标RNA的表达情况是很难在这些方法里面体现出来。因此对于检测研究来说，如果在细胞群内有些细胞目标RNA表达的多，而有些细胞目标RNA表达的少，总的提取RNA后分析可能根本看不出差异。当目标RNA表达多的细胞占比大的话，那总体来看这个细胞群内的目标RNA表达量就高些，相反，目标RNA表达少的细胞占比大，这个细胞群内目标RNA表达量就低。因此，这样只能看到一群细胞RNA表达量的方法，得出的结果其实比较笼统。目前，分子生物学领域研究都倾向于精细化，细化到单个细胞层面，希望能看到单个细胞层面出现的差异，比如现在的单细胞测序技术、单细胞蛋白质印迹检测技术等等。现在市面上也有单细胞qPCR技术，这些技术主要是将细胞分为单个的，然后将细胞包裹在油滴以及qPCR试剂内，接着将细胞裂解后进行qPCR反应，然后检测目标RNA的表达情况。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种单细胞内原位qPCR方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种单细胞内原位qPCR方法，包括如下步骤：
(1)将细胞消化，吹打成为单细胞悬液，去上清，将细胞沉淀重悬，加入甲醛溶液进行固定，之后加入Triton溶液进行打孔，去上清，将细胞沉淀重悬；
(2)采用分子信标探针进行探针法RT-qPCR。
步骤(1)中所述的消化采用胰酶，其用量根据培养细胞所使用的培养皿决定，原则上为胰酶覆盖培养皿表面所有生长细胞的表面为宜。
步骤(1)中所述的去上清采用的方式为4℃条件下500g离心3min。
步骤(1)中所述的将细胞沉淀重悬采用温度为0℃±4℃的1×PBS(0.01M、pH＝7.4)。
步骤(1)中所述的甲醛溶液在体系中的浓度为1％～4％；优选为1％。
步骤(1)中所述的甲醛溶液为体积比为1.33％的甲醛溶液。
步骤(1)中所述的固定的时间为10min～15min；优选为10min。
步骤(1)中所述的Triton溶液在体系中的浓度为0.2％。
步骤(1)中所述的Triton溶液为体积比5％±0.1％的Triton溶液。
步骤(1)中所述的打孔的时间优选为3min。
步骤(1)中所述的甲醛溶液和Triton溶液为冰溶液，温度为0℃±4℃。
步骤(2)中所述的探针法RT-qPCR采用一步法RT-qPCR试剂盒。
步骤(2)中所述的RT-qPCR使用细胞的用量为10μL RT-qPCR体系中细胞的数量小于100000个；优选为1000～100000个；更优选为1000～10000个。
步骤(2)中所述的分子信标探针的用量按照其在体系中浓度为1～5μM配比；优选为按照其在体系中浓度为1μM配比。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明能看到单个细胞层面表达量的差异。
2、本发明不用将细胞分为单个细胞，不裂解细胞，而是让qPCR试剂和探针进入细胞内部，在细胞内部进行qPCR反应，方法简便快捷易操作。
附图说明
图1是CYR61蛋白RNA的分子信标探针结构图。
图2是Hela细胞固定打孔后加入分子信标探针探针和qPCR试剂后拍的荧光图。
图3是Hela细胞固定打孔后加入分子信标探针探针和qPCR试剂，在进行了10个cycle的qPCR反应后拍的荧光图。
图4是Hela细胞固定打孔后加入分子信标探针探针和qPCR试剂，在进行了20个cycle的qPCR反应后拍的荧光图。
图5是Hela细胞固定打孔后加入分子信标探针探针和qPCR试剂，在进行了30个cycle的qPCR反应后拍的荧光图。
图6是Hela细胞固定打孔后加入分子信标探针探针和qPCR试剂，在进行了40个cycle的qPCR反应后拍的荧光图。
图7是CYR61蛋白过表达的Hela细胞、正常的Hela细胞和CYR61蛋白敲低的Hela细胞固定打孔后加入探针和qPCR试剂，进行qPCR反应后的Cq值对比图。
图8是100000个、10000个和1000个MDA-MB-231细胞在固定打孔后加入1μM分子信标探针和qPCR试剂进行qPCR反应后的Cq值对比图。
图9：100000个、10000个和1000个MDA-MB-231细胞在固定打孔后加入10μM分子信标探针和qPCR试剂进行qPCR反应后的Cq值对比图。
图10是100000个、10000个和1000个MDA-MB-231细胞在固定打孔后加入0.1μM分子信标探针和qPCR试剂进行qPCR反应后的Cq值对比图。
图11是50000个、5000个和500个Hela细胞在固定打孔后加入直链探针和qPCR试剂后进行qPCR反应后进行的扩增和Cq值对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人宫颈癌细胞Hela细胞购自中科院上海细胞库。
Taqman一步法RT-qPCR反应试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)
CYR61分子信标探针：
5'-CCAGCGCAGCCCTGCGACCACACCAACGCTGG-3'，5':6-FAM，3':BHQ1。
CYR61分子信标探针引物：
Primer-L：5'-AACGAGGACTGCAGCAAAAC-3'；
Primer-R：5'-ACAGGGTCTGCCCTCTGAC-3'。
实施例1
(1)将Hela细胞使用胰酶消化(10cm细胞培养皿培养细胞，使用3mL胰酶消化细胞)，吹打成为单细胞悬液于15mL离心管中。细胞悬液4℃条件下500g离心3min去除上清，细胞沉淀用1mL冰1×PBS(0.01M、pH＝7.4)重悬。加入3mL浓度为1.33％的冰甲醛溶液(终浓度0.3％)10min进行固定，之后加入160μL浓度为5％的冰Triton溶液(终浓度0.2％)3min进行打孔。完成后4℃条件下500g离心3min去除上清，使用1mL冰1×PBS重悬细胞，检测浓度后备用。
(2)使用Taqman一步法RT-qPCR试剂盒，按照说明书进行qPCR实验，qPCR体系为10μL。加入CYR61分子信标探针(终浓度1μM)、引物(终浓度10μM)和qPCR试剂。分别于加入分子信标探针和qPCR试剂后、进行了10个、20个、30个、40个cycle时将细胞取出，采用荧光显微镜拍照。结果如图2-6所示，细胞的荧光量从未进行qPCR反应开始到进行了40个cycle逐步增高，说明探针确实在细胞中与目标RNA结合开始发出荧光，随着结合量增加荧光量也逐步增加。
PCR程序(三步法)：
实施例2
使用CYR61过表达Hela细胞、正常Hela细胞以及CYR61敲低的Hela细胞进行实验，实验方法同实施例1。过表达CYR61蛋白的Hela细胞是通过将带有过表达CYR61蛋白基因片段的质粒转染进入Hela细胞内，这样这种质粒就会在细胞内表达产生比普通Hela细胞更多的CYR61的RNA和蛋白。敲低CYR61蛋白的Hela细胞是通过将带有目标为CYR61蛋白DNA的CRISPR-Cas9载体转入细胞中，载体进入细胞后会剪切掉目标DNA片段从而减少细胞中CYR61的RN A和蛋白表达。Hela细胞CYR61过表达使用的是pSB-SFP-CYR61质粒，采用p SB-SFP作为出发载体，CYR61基因片段的基因编码区域登录号为Gene ID：3491。敲低Hela细胞使用的是pSB-CRISPR-CYR61-7质粒，采用pSB-CRISPR-Puro作为出发载体，sgRNAs采用CRISPR-CYR61-7-F：CACCGTCTGCAGATCCCCT TCAGAG；CRISPR-CYR61-7-R：AAACCTCTGAAGGGGATCTGCAGAC。以上2种出发载体(Hu et al.2018.High-performance geneexpression and knockout tools using sleeping beauty transposon system[J].Mobile DNA.9:33.)由吉凯基因公司构建。
结果如图7所示，使用CYR61过表达Hela细胞、正常Hela细胞、以及CYR61敲低的Hela细胞qPCR实验结果有明显的差异，过表达细胞的Cq值低于正常细胞，正常细胞Cq值低于敲低细胞，这符合实际情况。Cq值是qPCR进行的循环数，当qPCR反应中的荧光量达到一定值时的循环数就是该反应的Cq值，Cq值越低表明qPCR反应越快达到设定的荧光值，也就表明这个反应中的RNA量越多。CYR61过表达细胞中的表达CYR61蛋白的RNA是肯定要多过普通细胞，而普通细胞中的CYR61蛋白的RNA也肯定要多于敲低了的细胞，因此此项实验符合预期结果，表明用此项技术可以在细胞内进行qPCR。
实施例3
分别将100000个、10000个和1000个MDA-MB-231细胞采用实施例1的方法固定打孔后加入CYR61分子信标探针(1μM)、引物(10μM)和qPCR试剂，qPCR反应后进行Cq值对比。
结果如图8所示，相差10倍浓度的细胞的qPCR结果也表明此项技术可以在细胞内进行qPCR。当RNA量相差10倍时，qPCR的循环数也相差3个左右(图8)。而100000个细胞的qPCR没有结果，这表明本技术不适合细胞过多的样本。因为qPCR体系是10μL，也就是10μL里面含有100000个细胞，每毫升细胞浓度要达到一千万个，这个细胞浓度在一般实验中很难达到。
实施例4
分别将100000个、10000个和1000个MDA-MB-231细胞采用实施例1的方法固定打孔后加入qPCR试剂、引物(10μM)和不同用量的CYR61分子信标探针(探针在体系中的终浓度分别为10μM、0.1μM)，qPCR反应后进行Cq值对比。结果如图9和10所示。图9中采用10μM的探针浓度，明显细胞量在差值10倍时样本间Cq值不在正常范畴；图10中采用0.1μM的探针浓度，从扩增后的荧光值和Cq值可以看出探针太少，根本看不出不同样本间细胞内的RNA差异；采用1μM的探针浓度的结果如图8所示，符合细胞量在差值10倍时样本间的Cq值该有的差值。
对比例1
将50000个、5000个和500个Hela细胞采用实施例1的方法固定打孔后加入qPCR试剂、引物(10μM)和Taqman直链探针(1μM)，之后进行qPCR反应。直链探针序列：5'-CAGCCCTGCGACCACACCAA-3'，反应条件与分子信标探针相同。
结果如图11所示，当细胞量在差值10倍时样本间Cq值的差值超出正常范畴，而且扩增曲线也不对，因此直链探针很难在细胞内进行qPCR。
对比例2
将Hela细胞使用胰酶消化(10cm细胞培养皿培养细胞，使用3mL胰酶消化细胞)，吹打成为单细胞悬液于15mL离心管中。细胞悬液4℃条件下500g离心3min去除上清，细胞沉淀用1mL冰1×PBS(0.01M、pH＝7.4)重悬。分别加入不同用量的浓度为1.33％的冰甲醛溶液，使其体系中的终浓度分别为4％、2％、1％、0.3％，分别固定5min、10min、15min、30min。提取样本的RNA(奕杉生物(ESscience)RNA快速提取试剂盒，货号RN001)。
结果表明，体系中终浓度为1％的甲醛溶液固定效果最好，提取出的RNA量是4％和2％冰甲醛溶液固定后提取的RNA浓度的两倍，0.3％的甲醛溶液固定后提取的RNA量虽然高，但是细胞未充分固定，在打孔时细胞破裂。在时间方面，10min可以让细胞充分固定，时间太短细胞未充分固定，打孔后细胞会破裂；时间不宜太长，时间太长细胞会黏连在一起，并且RNA会降解。
对比例3
将Hela细胞使用胰酶消化(10cm细胞培养皿培养细胞，使用3mL胰酶消化细胞)，吹打成为单细胞悬液于15mL离心管中。细胞悬液4℃条件下500g离心3min去除上清，细胞沉淀用1mL冰1×PBS(0.01M、pH＝7.4)重悬。加入浓度为1.33％的冰甲醛溶液，使其终浓度为0.3％，固定10min。之后分别加入不同用量的浓度为5％的冰Triton溶液(终浓度分别为0.5％、0.2％、0.1％)，分别打孔1min、3min、5min。完成后4℃条件下500g离心3min去除上清，使用1mL冰1×PBS重悬细胞，检测浓度后备用。使用Taqman一步法RT-qPCR试剂盒，按照说明书进行qPCR实验，加入CYR61分子信标探针(终浓度1μM)、引物(10μM)和qPCR试剂。
结果显示，0.5％、0.2％、0.1％的冰Triton溶液都可以在细胞表面打出孔洞，但是0.5％的高浓度会让细胞孔洞过大，细胞在qPCR过程中需要加热到95℃高温，细胞膜孔洞过大会使细胞破裂，RNA和反应试剂无法保存在细胞内而流出细胞，这样就失去了单细胞原位qPCR的意义；0.1％的浓度打孔过小，无法让qPCR反应试剂充分融入细胞内部；0.2％的Triton溶液浓度打孔效果最佳。打孔时间3分钟为最佳时长，打孔时间过长会使细胞孔洞过大，过短则会使细胞孔洞过小试剂无法充分进入影响实验效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> 一种单细胞内原位qPCR方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CYR61分子信标探针
<400> 1
ccagcgcagc cctgcgacca caccaacgct gg 32
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer-L
<400> 2
aacgaggact gcagcaaaac 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer-R
<400> 3
acagggtctg ccctctgac 19
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRISPR-CYR61-7-F
<400> 4
caccgtctgc agatcccctt cagag 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRISPR-CYR61-7-R
<400> 5
aaacctctga aggggatctg cagac 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>直链探针
<400> 6
cagccctgcg accacaccaa 20
Claims (4)
1.一种单细胞内原位qPCR方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将细胞消化，吹打成为单细胞悬液，去上清，将细胞沉淀重悬，加入甲醛溶液进行固定，之后加入Triton溶液进行打孔，去上清，将细胞沉淀重悬；
（2）采用分子信标探针进行探针法RT-qPCR；
步骤（1）中所述的甲醛溶液在体系中的浓度为1%；
步骤（1）中所述的Triton溶液在体系中的浓度为0.2%；
步骤（1）中所述的固定的时间为10 min；
步骤（1）中所述的打孔的时间为3 min；
步骤（2）中所述的分子信标探针为CYR61分子信标探针，其核苷酸序列如下：5'-CCAGCGCAGCCCTGCGACCACACCAACGCTGG-3'；其中，分子信标探针5'端修饰有荧光基团FAM，3'端修饰有淬灭基团BHQ1；
所述的CYR61分子信标探针的引物序列如下：
Primer-L：5'-AACGAGGACTGCAGCAAAAC-3'；
Primer-R：5'-ACAGGGTCTGCCCTCTGAC-3'；
步骤（2）中所述的分子信标探针的用量按照其在体系中浓度为1 μM配比；
所述的RT-qPCR使用的细胞的用量为10 μL RT-qPCR体系中细胞的数量为1000-10000个；
所述的方法用于检测RNA。
2.根据权利要求1所述的单细胞内原位qPCR方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的去上清采用的方式为4℃条件下500 g离心3 min；
步骤（1）中所述的甲醛溶液为体积比为1.33%的甲醛溶液；
步骤（1）中所述的Triton溶液为体积比5%±0.1%的Triton溶液。
3.根据权利要求1所述的单细胞内原位qPCR方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的消化采用胰酶，其用量根据培养细胞所使用的培养皿决定，胰酶覆盖培养皿表面所有生长细胞的表面；
步骤（1）中所述的将细胞沉淀重悬采用温度为0℃±4℃的0.01M、pH=7.4的 1×PBS；
步骤（1）中所述的甲醛溶液和Triton溶液为冰溶液，温度为0℃±4℃。
4.根据权利要求1所述的单细胞内原位qPCR方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的探针法RT-qPCR采用一步法RT-qPCR试剂盒。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5830663A (en) * | 1991-08-10 | 1998-11-03 | Medical Research Council | In situ recombinant PCR within single cells |
| CN102037362A (zh) * | 2008-03-19 | 2011-04-27 | 中国合成橡胶股份有限公司 | 用于诊断和治疗肝细胞癌的方法和剂 |
| EP2439285A1 (en) * | 2004-03-31 | 2012-04-11 | The General Hospital Corporation | Method to determine responsiveness of cancer to epidermal growth factor receptor targeting treatments |
| WO2012171997A1 (en) * | 2011-06-14 | 2012-12-20 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for determining the expression level of a gene of interest including correction of rt-qpcr data for genomic dna-derived signals |
| CN103589795A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-19 | 中南大学 | 一种检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒及其应用 |
| CN104911274A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-09-16 | 四川医科大学 | 一种单细胞实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 |
| CN108840920A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-20 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用 |
| CN109536585A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-03-29 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 细胞一步法实时定量pcr的方法、配套试剂盒及应用 |
| CN109642252A (zh) * | 2016-06-17 | 2019-04-16 | 加州理工学院 | 核酸反应及相关方法和组合物 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2549752T3 (es) * | 2010-07-19 | 2015-11-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Métodos y sistemas para el análisis de células individuales |
-
2020
- 2020-08-31 CN CN202010900980.6A patent/CN114107449B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5830663A (en) * | 1991-08-10 | 1998-11-03 | Medical Research Council | In situ recombinant PCR within single cells |
| EP2439285A1 (en) * | 2004-03-31 | 2012-04-11 | The General Hospital Corporation | Method to determine responsiveness of cancer to epidermal growth factor receptor targeting treatments |
| CN102037362A (zh) * | 2008-03-19 | 2011-04-27 | 中国合成橡胶股份有限公司 | 用于诊断和治疗肝细胞癌的方法和剂 |
| WO2012171997A1 (en) * | 2011-06-14 | 2012-12-20 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for determining the expression level of a gene of interest including correction of rt-qpcr data for genomic dna-derived signals |
| CN103589795A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-19 | 中南大学 | 一种检测与肺癌易感性及化疗敏感性相关基因的多态性的试剂盒及其应用 |
| CN104911274A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-09-16 | 四川医科大学 | 一种单细胞实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 |
| CN109642252A (zh) * | 2016-06-17 | 2019-04-16 | 加州理工学院 | 核酸反应及相关方法和组合物 |
| CN108840920A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-20 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种人CYR61蛋白Ser167位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用 |
| CN109536585A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-03-29 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 细胞一步法实时定量pcr的方法、配套试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells;Ashley T.Haase等;《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》;第87卷;摘要，第4971-4975页 * |
| Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Provirus in Mononuclear Cells by in Situ Polymerase Chain Reaction;Omar Bagasra等;《the New England Journal of Medicine》;第326卷;摘要，材料与方法 * |
| Identification of Neural Programmed Cell Death Through the Detection of DNA Fragmentation In Situ and by PCR;Yung, Y. C.等;《Current Protocols in Neuroscience》;1-24 * |
| 胡静平等.《生物医学常用实验方法》.苏州大学出版社,2019,83-84. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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