KR101953092B1

KR101953092B1 - Ｂｃｒ／ａｂｌ 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 다중검출용 펩티드핵산 프로브, 이를 포함하는 유전자변이 다중검출 조성물, 다중검출 키트 및 유전자변이 다중검출방법

Info

Publication number: KR101953092B1
Application number: KR1020160069392A
Authority: KR
Inventors: 김용구; 김명신; 박준홍; 송민식; 박희경; 김경탁
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 주식회사 시선바이오머티리얼스
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2019-06-13
Also published as: US20180355414A1; KR20170055400A; WO2017082503A1; US11028428B2

Abstract

본 발명은 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자에 상보적으로 결합하여 유전자 변이를 다중검출할 수 있도록 제작된, 서열번호 7 내지 10으로 표시된 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브, 이를 포함하는 유전자 변이 다중검출 조성물, 키트 및 이를 사용하여 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 변이를 다중검출하는 방법을 제공한다. 이를 통해, BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자의 돌연변이를 한 번의 검출 과정으로 신속하고 정확하게 다중검출할 수 있으므로 BCR/ABL 음성 골수증식종양을 효과적으로 진단하여 질병의 진단, 추적관찰, 예후추정 및 치료 시에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

ＢＣＲ／ＡＢＬ 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 다중검출용 펩티드핵산 프로브, 이를 포함하는 유전자변이 다중검출 조성물, 다중검출 키트 및 유전자변이 다중검출방법{Peptide nucleic acid probe for multiplex-detecting BCR/ABL negative MPN related gene mutations, composition for multiplex-detecting gene mutation there of, gene mutation detecting multiplex kit and gene mutation detecting multiplex methods}

본 발명은 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자변이를 다중검출하기 위한 펩티드핵산 프로브, 이를 포함하는 유전자변이 다중검출 조성물, 다중검출 키트 및 유전자변이 다중검출방법에 관한 것이다.

골수증식종양(myeloproliferative neoplasm, MPN)이란, 하나 이상의 혈구계열에서 성숙세포가 과도하게 생성되는 클론성 조혈모세포질환이며, 2008 WHO 분류에 따라 BCR/ABL1 양성 만성골수성백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML), 만성호중구백혈병(chronic neutrophilic leukemia), 진성적혈구증가증(polycythaemia vera, PV), 일차골수섬유증(primary myelofibrosis, PMF), 진성고혈소판증가증(essential thrombocythaemia, ET), 만성호산구백혈병(chronic eosinophilic leukemia, NOS), 비만세포증(mastocytosis) 및 미분류 골수증식종양(myeloproliferative neoplasm, unclassifiable) 등이 이에 속한다.

진성적혈구증가증은 정상적인 적혈구 생성 조절기전과는 무관하게 적혈구 생성이 증가되는 특징을 갖는 골수증식종양으로 적혈구계뿐만 아니라 과립구계, 거대핵세포계도 동시에 증식하는 범혈구증가증(panmyelosis)을 초래한다. 진성혈소판증가증은 거대핵세포가 일차적으로 증식하는 골수증식종양으로 특징은 말초혈액에서 지속적인 혈소판증가증(450 x 10⁹/L이상)을 보이고, 골수에서는 크고 성숙한 거대핵세포가 증가하며, 긴 무증상기를 보이나 혈전증이나 출혈경향을 나타낼 수 있다. 일차골수섬유증은 환자의 30%는 무증상으로, 비장비대 소견이나 혈액검사에서 빈혈, 백혈구증가, 혈소판증가를 보여 우연히 발견된다. 백적모세포증(leukoerythroblastosis)과 혈청내 LD 증가를 보이며 초기에는 진성혈소판증가증과 유사하게 심한 혈소판 증가를 보인다. 눈물방울모양의 적혈구를 동반한 대소부동변형적혈구증가증(anisopoikilocytosis)을 보이고, 골수는 세포충실도가 높으며 심한 레티쿨린 또는 콜라겐섬유화를 보여 말기에는 골수섬유화로 인한 골수부전을 유발한다.

Classic MPN으로 분류되는 진성적혈구증가증, 진성고혈소판증가증, 일차골수섬유증은 최근까지 뚜렷한 분자유전학적 표지자가 보고되지 않았으나, 2005년 야누스 티로신키나제 2 (Janus Tyrosine Kinase 2, JAK2) V617F 유전자 변이가 보고되면서 진단과 연구의 새로운 전환점을 맞이하게 되었다. 이 부위는 JAK2 단백의 pseudokinase autoinhibitory JH2 domain에 해당하며, 이 돌연변이에 의한 JAK2 티로신키나제의 구조적 활성화(constitutive activation)가 성장인자와 무관하게 세포의 증식을 일으키는 것이 확인되었다. c.1849G>T 또는 c.1849_1851delinsTTT 염기치환에 의해 발생하는 JAK2 V617F 돌연변이는 BCR/ABL 음성 골수증식종양의 발생에 관여하는 중요한 유전자 변이로 보고에 따라 다소 차이가 있지만 대체로 진성적혈구증가증의 90-95%, 진성고혈소판증가증의 35-70%, 일차골수섬유증의 50% 정도에서 검출된다. 따라서 진성적혈구증가증이 의심되는 환자에서 JAK2 V617F 돌연변이 유무가 진단에 매우 유용하다. 그러나 진성적혈구증가증에서는 95% 이상에서 양성인 반면, 진성고혈소판증가증와 일차골수섬유증에서는 30-40% 이상이 JAK2 V617F가 관찰되지 않아, JAK2 V617F 이 외 새로운 분자유전학적 표지자에 대한 필요성이 지속적으로 제기되어 왔다.

두번째로 트롬보포이에틴수용체(thrombopoietin receptor, TPO-R; myeloproliferative leukemia protein, MPL) 10번 엑손에 위치한 트립토판 (tryptophan)이 다른 아미노산으로 치환되는 MPL W515 돌연변이가 BCR/ABL 음성 골수증식종양에서 보고되었다. MPL W515 변이는 주로 BCR/ABL 음성 골수증식종양 중 진성고혈소판증가증과 일차골수섬유증에서 보고되어 있다. 이 돌연변이는 JAK2 V617F 음성 일차골수섬유증의 약 7-25%, 진성고혈소판증가증의 1-24%에서 관찰되고, 진성적혈구증가증에서 발생빈도는 매우 낮아 현재까지 단 2개의 증례만이 보고되었다. MPL W515 돌연변이의 아형은 지금까지 총 5가지가 알려져 있고, 트립토판이 류신(leucine)으로 치환되는 W515L, 라이신(lysine)으로 치환되는 W515K, 아르기닌(arginine)으로 치환되는 W515R, 알라닌(alanine)으로 치환되는 W515A, 세린(serine)으로 치환되는 W515S이다. 그 중 c.1544G>T염기치환에 의한 W515L과 c.1543_1544delinsAA 염기치환에 의한 W515K가 가장 흔하며, 진성고혈소판증가증에서 각각 55%, 21%, 일차골수섬유증에서 각각 93%, 7%로 W515L이 더 흔히 관찰된다. MPL W515 돌연변이와 임상양상의 연관성에 대한 몇몇 보고에 따르면, 진성고혈소판증가증의 경우, MPL W515 돌연변이를 가질 경우 JAK2 V617F 양성에 비해 혈색소와 총 백혈구수가 낮고 혈소판수가 높았다. 골수소견 상으로는 세포충실도가 비교적 낮고 적혈구 계열의 혈구수가 적었지만, 거대핵세포수는 비교적 많았다.

최근에 보고된 BCR/ABL 음성 골수증식종양과 관련된 칼레티큘린 유전자(CALR) 돌연변이는 JAK2 V617F/MPL W515 돌연변이 음성 골수증식종양 환자에서 대부분 관찰되어 BCR/ABL 음성 골수증식종양을 유발하는 새로운 원인 유전자로 밝혀졌다. Nangalia J 등의 연구는 151명의 BCR/ABL 음성 골수증식종양 환자를 대상으로 massive parallel sequencing을 시행하여 calreticulin을 부호화하는 CALR 유전자의 엑손 9번에서 반복되는 결손/중복 또는 삽입으로 인한 틀이동 돌연변이를 보고하였다(비특허문헌 1). 최근 연구에 의하면 CALR 유전자 돌연변이는 진성적혈구증가증에서 관찰되지 않았고 JAK2 V617F/MPL W515 돌연변이 음성 진성고혈소판증가증 환자의 67%에서, 일차골수섬유증 환자의 88%에서 관찰되었다(비특허문헌 2). 보고된 CALR 유전자 돌연변이의 대부분(약 80%)은 c.1092_1143del52 염기결손(L367fs*46, type 1)이 약 50%를 차지하고, c.1154_1155insTTGTC 염기삽입(K385fs*47, type 2)가 약 30%를 차지하는 hot spot이었다.

1. 미국공개특허 US20040229253A1 2. 한국공개특허 KR20130106692A 3. 미국공개특허 US20150080255A1} 4. US20150079091A1

1. Nangalia J et al, N Engl J Med. 2013;369(25):2391-405 2. Klampfl T et al, N Engl J Med. 2013;369(25):2379-90

선별검사의 성격을 갖는 분자유전학적 체외진단검사의 필수 요건은 높은 민감도로 BCR/ABL 음성 골수증식종양의 분자유전학적 병인에 관여하는 주요 유전자 변이를 검출대상으로 선정하는 것이 매우 중요하다. 그러나 국내 기술에 의한 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 돌연변이 다중검출을 위한 상용화된 체외진단법이 개발되어 있지 않으며 임상시험 자료도 부족하여 다중검출 분자유전학적 검사기술이 접목된 선별검사법을 개발하여 임상에 적용될 수 있도록 할 필요성이 시급하다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자에 상보적으로 결합하여 유전자 변이를 다중검출할 수 있도록 제작된, 서열번호 7 내지 10으로 표시된 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 제공한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자는 야누스 티로신키나제 2(JAK2), 트롬보포이에틴 수용체(MPL) 및 칼레티큘린(CALR) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 유전자 변이는 (i) 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F), (ii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 류신으로 치환(MPL W515L), (iii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K), (iv) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 아르기닌으로 치환(MPL W515R), (v) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 알라닌으로 치환(MPL W515A), (vi) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 세린으로 치환(MPL W515S), (vii) 칼레티큘린 유전자의 c.1092_1143del52 염기결손(L367fs*46), 및 (viii) 칼레티큘린 유전자의 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입(K385fs*47) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F)은 c.1849G>T 또는 c.1849_1851delinsTTT 염기치환에 의한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 류신으로 치환(MPL W515L)은 c.1544G>T염기치환에 의한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K)은 c.1543_1544delinsAA 염기치환에 의한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 펩티드 핵산 프로브는 양 말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6- carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 상술한 펩티드 핵산 프로브를 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 변이 다중검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상술한 유전자 변이 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 변이 다중검출 키트를 제공한다.

본 발명은 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자에 상보적으로 결합하여 유전자 변이를 다중검출할 수 있도록 제작된 조성물로서, (i) 서열번호 7 및 9로 표시되는 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 포함하는 제1용액과, 서열번호 8 및 10으로 표시된 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 포함하는 제2용액; 또는 (ii) 서열번호 7 및 10으로 표시되는 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 포함하는 제1용액과, 서열번호 8 및 9로 표시된 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 포함하는 제2용액으로 구성되고, 상기 제1용액과 제2용액은 혼합되지 않은 상태로 존재하여, 이를 각각 또는 순차적으로 대상 DNA 시료와 접촉하여 반응시킬 수 있도록 구성된 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 다중 유전자 변이 다중검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 유전자 변이 다중검출용 조성물의 제1용액에 포함되는 펩티드 핵산 프로브는 야누스 티로신키나제 2(JAK2) 및 칼레티큘린(CALR) 유전자 중 하나 이상에 상보적으로 결합하고, 상기 제2용액에 포함되는 펩티드 핵산 프로브는 트롬보포이에틴 수용체(MPL) 및 칼레티큘린(CALR) 유전자 중 하나 이상에 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 유전자 변이 다중검출용 조성물의 제1용액은 (i) 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F), 및 (ii) 칼레티큘린 유전자의 c.1092_1143del52 염기결손(L367fs*46) 또는 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입(K385fs*47)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자 변이를 검출하고, 상기 제2용액은 (i) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K), (ii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 아르기닌으로 치환(MPL W515R), (iii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 알라닌으로 치환(MPL W515A), (iv) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 세린으로 치환(MPL W515S), 및 (v) 칼레티큘린 유전자의 c.1092_1143del52 염기결손(L367fs*46) 또는 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입(K385fs*47)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자 변이를 검출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, (i) 상기 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F)은 c.1849G>T 또는 c.1849_1851delinsTTT 염기치환에 의한 것, (ii) 상기 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 류신으로 치환(MPL W515L)은 c.1544G>T염기치환에 의한 것, 또는 (iii) 상기 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K)은 c.1543_1544delinsAA 염기치환에 의한 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 상술한 유전자 변이 다중검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 다중 유전자 변이 다중검출 키트를 제공한다.

본 발명은 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자에 상보적으로 결합하여 유전자 변이 부분을 특이적으로 증폭할 수 있도록 제작된, 서열목록 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 서열을 포함하는 프라이머를 제공한다.

본 발명은 대상 DNA 시료에 상술한 펩티드 핵산 프로브를 첨가하여 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화된 산물을 온도를 변화시키면서 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 얻어진 융해곡선을 변이 유전자의 표준 융해온도와 비교하는 단계를 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 변이 다중검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 혼성화시키는 단계는, 대상 시료를 프라이머와 혼합하여 PCR을 수행하여 증폭하는 단계를 수행한 다음, 상기 증폭 산물에 펩티드 핵산 프로브를 첨가하여 혼성화시키는 단계를 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 대상 DNA 시료에 상기 상술한 유전자 변이 다중검출용 조성물을 첨가하되, 상기 제1용액 및 제2용액을 각각 또는 순차적으로 첨가하여 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화된 산물을 온도를 변화시키면서 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 얻어진 융해곡선을 변이 유전자의 표준 융해온도와 비교하는 단계를 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 변이 다중검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 혼성화시키는 단계는, 대상 시료를 프라이머와 혼합하여 PCR을 수행하여 증폭하는 단계를 수행한 다음, 상기 증폭 산물에 유전자 변이 다중검출용 조성물을 첨가하여 혼성화시키는 단계를 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 프라이머는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자에 상보적으로 결합하여 유전자 변이 부분을 특이적으로 증폭할 수 있도록 제작된, 서열목록 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 방법에 의하여 검출하는 유전자 변이는, (i) 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F), (ii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 류신으로 치환(MPL W515L), (iii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K), (iv) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 아르기닌으로 치환(MPL W515R), (v) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 알라닌으로 치환(MPL W515A), (vi) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 세린으로 치환(MPL W515S), (vii) 칼레티큘린 유전자의 c.1092_1143del52 염기결손(L367fs*46), 및 (viii) 칼레티큘린 유전자의 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입(K385fs*47) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 방법에 의하여 검출하는 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F) 변이는 c.1849G>T 또는 c.1849_1851delinsTTT 염기치환인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 방법에 의하여 검출하는 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 류신으로 치환(MPL W515L) 변이는 c.1544G>T염기치환인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 방법에 의하여 검출하는 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K) 변이는 c.1543_1544delinsAA 염기치환인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자의 변이를 신속하고 정확하게 다중검출할 수 있는 펩티드핵산 프로브를 제공하여, 이를 사용하여 상기 유전자의 변이를 효과적으로 검출할 수 있으며, 나아가 BCR/ABL 음성 골수증식종양과 관련된 유전자 돌연변이를 한 번 시행하여 신속 및 효과적으로 다중검출하여 질병진단, 추적관찰, 예후추정 및 치료 시에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 JAK2 유전자의 염기변이 위치와 PNA 프로브, 프라이머 위치를 나타내는 도면이다.
도 2는 MPL 유전자의 염기변이 위치와 PNA 프로브, 프라이머 위치를 나타내는 도면이다.
도 3은 CALR 유전자의 염기변이 위치와 PNA 프로브, 프라이머 위치를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 JAK2-2 변이를 검출하는 펩티드핵산 프로브와 합성 DNA를 이용한 융해곡선 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 MPL-3 변이를 검출하는 펩티드핵산 프로브와 합성 DNA를 이용한 융해곡선 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 CALR-del4 변이를 검출하는 펩티드핵산 프로브와 합성 DNA를 이용한 융해곡선 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 CALR-ins5p 변이를 검출하는 펩티드핵산 프로브와 합성 DNA를 이용한 융해곡선 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따라 BCR/ABL 음성 골수증식종양 환자 DNA를 이용하여 관련 유전자변이 융해곡선를 나타낸 그래프이다.
도 9는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 환자 DNA를 이용한 관련 유전자변이 융해곡선을 나타낸 그래프이다.
도 10은 JAK2 유전자의 다양한 변이를 검출하는 펩티드핵산 프로브와 합성 DNA를 이용한 융해곡선 그래프이다.
도 11은 MPL 유전자의 다양한 변이를 검출하는 펩티드핵산 프로브와 합성 DNA를 이용한 융해곡선 그래프이다.
도 12는 CALR 유전자의 다양한 결실 변이를 검출하는 펩티드핵산 프로브와 합성 DNA를 이용한 융해곡선 그래프이다.
도 13은 CALR 유전자의 결실 변이를 검출하는 펩티드핵산 프로브와 샘플을 이용한 융해곡선 그래프이다.
도 14는 CALR 유전자의 다양한 삽입 변이를 검출하는 펩티드핵산 프로브와 합성 DNA를 이용한 융해곡선 그래프이다.
도 15은 본 발명에 따른 조성물의 간섭 효과를 최소화하기 위하여 1용액(A set)과 2용액(B set)으로 나누어 구성한 조성물의 민감도를 확인한 결과이다.
도 16은 1용액(A set)과 2용액(B set)으로 나누어 구성한 본 발명의 조성물의 검출한계를 확인한 결과이다.
도 17은 1용액(A set)과 2용액(B set)으로 나누어 구성한 본 발명의 조성물의 민감도를 확인한 결과이다.
도 18은 1용액(A set)과 2용액(B set)으로 나누어 구성한 본 발명의 조성물의 특이성을 검증한 결과이다.
도 19은 1용액(A set)과 2용액(B set)으로 나누어 구성한 본 발명의 조성물의 동일 원인 유전자의 다중검출을 검증한 결과이다.
도 20은 1용액(A set)과 2용액(B set)으로 나누어 구성한 본 발명의 조성물의 다른 원인 유전자의 다중검출을 검증한 결과이다.
도 21은 1용액(A set)과 2용액(B set)으로 나누어 구성한 본 발명의 조성물의 6개 원인 유전자 모두의 다중검출을 검증한 결과이다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자에 상보적으로 결합하여 유전자 변이를 다중검출할 수 있도록 제작된, 서열번호 7 내지 10으로 표시된 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브, 이를 포함하는 유전자 변이 다중검출 조성물, 키트 및 이를 사용하여 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 변이를 다중검출하는 방법을 제공한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

또한, '표적핵산'은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. '표적핵산'은 본 명세서에서 사용되는 용어 '타겟핵산', '타겟핵산서열' 또는 '타겟서열'과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 발명의 '유전자변이'는 표적핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적핵산의 SNP 또는 표적핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선분석을 통해 분석할 수 있다.

본 발명은 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자에 상보적으로 유전자 변이를 다중검출할 수 있도록 제작된, 서열번호 7 내지 10으로 표시된 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 제공한다. 보다 구체적으로는 표적핵산의 유전자 변이를 다중검출하며, 일례로 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자는 야누스 티로신키나제 2(JAK2), 트롬보포이에틴 수용체(MPL) 및 칼레티큘린(CALR) 중에서 선택된 어느 하나 이상이다.

보다 구체적으로는 상기 유전자 변이는 (i) 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F), (ii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 류신으로 치환(MPL W515L), (iii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K), (iv) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 아르기닌으로 치환(MPL W515R), (v) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 알라닌으로 치환(MPL W515A), (vi) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 세린으로 치환(MPL W515S), (vii) 칼레티큘린 유전자의 c.1092_1143del52 염기결손(L367fs*46), 및 (viii) 칼레티큘린 유전자의 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입(K385fs*47) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 일례로, 상기 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F)은 c.1849G>T 또는 c.1849_1851delinsTTT 염기치환에 의한 것, 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 류신으로 치환(MPL W515L)은 c.1544G>T염기치환에 의한 것, 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K)은 c.1543_1544delinsAA 염기치환에 의한 것일 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 야누스 티로신키나제 2 유전자는 NCBI 번호인 JAK2_NM_004972.3에 기재된 염기서열로 구성되어 있으며, 이의 아미노산 서열은 NP_004963.1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 트롬보포이에틴 수용체 유전자는 NCBI 번호인 MPL_NM_005373.2 에 기재된 염기서열로 구성되어 있으며, 이의 아미노산 서열은 NP_005364.1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 칼레티큘린 유전자는 NCBI 번호인 CALR_NM_004343.3에 기재된 염기서열로 구성되어 있으며, 이의 아미노산 서열은 NP_004334.1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

선별검사의 성격을 갖는 분자유전학적 체외진단검사의 필수 요건은 높은 민감도로 BCR/ABL 음성 골수증식종양의 분자유전학적 병인에 관여하는 JAK2, MPL, CALR 유전자에서 흔하게 관찰되는 돌연변이를 검출대상으로 선정하는 것이 매우 중요하므로, JAK2 V617F, MPL W515L/K, CALR L367fs*46/K385fs*47 돌연변이를 검출대상으로 선정하였다. BCR/ABL 음성 골수증식종양 진단 시 아형 분류를 위한 관련 돌연변이(JAK2 V617F, MPL W515L/K, CALR L367fs*46/K385fs*47 mutation) 선별진단용 다중검출 검사키트 개발 및 상품화는 BCR/ABL 음성 골수증식종양의 치료방침이 다르므로 의심되는 신환에서 정확한 진단이 매우 중요하며 관련 유전자 돌연변이의 검출이 진단의 정확도를 높이는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 대표적인 유전자 변이인 JAK2 V617F, MPL W515L/K, CALR L367fs*46/K385fs*47 돌연변이 여부를 신속하고 정확하게 다중검출하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, BCR/ABL 음성 골수증식종양에 관련되어있는 JAK2, MPL, CALR의 SNP 및 Indel을 포함하는 9~16 mer 길이로 제작할 수 있다. PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 프로브를 design 할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm 값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 design이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 detection이 가능하다. 기존의 HRM method에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 SNP가 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 프로브 sequence와 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.

상기 펩티드 핵산 프로브는 양 말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6- carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고, 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명은 상술한 유전자 변이 다중검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 변이 다중검출 키트를 제공한다. 상기 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함하는 것도 가능하다. 상기 키트를 이용하면, PNA 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 다중검출할 수 있고, 이를 통하여 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 유무와 다중검출이 가능하다.

상기와 같이 구성하는 경우, 동일하거나 유사한 유전자 위치에 결합하는 펩티드 핵산 프로브 간에 간섭 현상이나 결합 방해 현상을 최소화하여 보다 정밀하고 정확한 검출이 가능해진다. 즉, 야누스 티로신키나제 2(JAK2)에 대한 펩티드 핵산 프로브와 트롬보포이에틴 수용체(MPL)에 대한 펩티드 핵산 프로브를 혼합하여 동시에 처리하는 경우, 두 프로브간 간섭 현상으로 인한 자기 소광이 일어날 수 있어 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F) 변이에 대한 정확도 및 민감도가 감소할 우려가 있다. 또한, 칼레티큘린(CALR) 유전자에 대한 염기서열 결핍 및 추가를 검출하려고 이들 각각에 대한 펩티드 핵산 프로브를 혼합하여 동시에 처리하는 경우 역시, 두 프로브의 결합위치가 너무 가깝기 때문에 결합과정에서 칼레티큘린 유전자의 염기결손 변이에 대한 검출 정확도 및 민감도가 감소할 우려가 있다. 따라서, 이들을 적당하게 나누어 제1용액 및 제2용액에 포함될 수 있도록 구성하면 상기 문제점을 해결할 수 있다. 상기 제1용액 또는 제2용액이라는 용어는, 2 이상의 펩티드 핵산 프로브를 혼합 시 이를 하나의 용액에 모두 혼합시키는 것이 아니라 2 이상의 용액에 나누어 혼합시켜 검출용 조성물을 준비한다는 의미일 뿐, 대상 DNA 시료와 접촉하거나 검출하는 순서를 의미하는 것은 아니다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 유전자 변이 다중검출용 조성물의 제1용액에 포함되는 펩티드 핵산 프로브는 야누스 티로신키나제 2(JAK2) 및 칼레티큘린(CALR) 유전자 중 하나 이상에 상보적으로 결합하고, 상기 제2용액에 포함되는 펩티드 핵산 프로브는 트롬보포이에틴 수용체(MPL) 및 칼레티큘린(CALR) 유전자 중 하나 이상에 상보적으로 결합할 수 있다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 유전자 변이 다중검출용 조성물의 제1용액은 (i) 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F), 및 (ii) 칼레티큘린 유전자의 c.1092_1143del52 염기결손(L367fs*46) 또는 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입(K385fs*47)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자 변이를 검출하고, 상기 제2용액은 (i) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K), (ii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 아르기닌으로 치환(MPL W515R), (iii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 알라닌으로 치환(MPL W515A), (iv) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 세린으로 치환(MPL W515S), 및 (v) 칼레티큘린 유전자의 c.1092_1143del52 염기결손(L367fs*46) 또는 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입(K385fs*47)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자 변이를 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일태양은, 대상 DNA 시료에 상술한 펩티드 핵산 프로브를 첨가하여 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화된 산물을 온도를 변화시키면서 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 얻어진 융해곡선을 변이 유전자의 표준 융해온도와 비교하는 단계를 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 변이 다중검출 방법을 제공한다.

본 발명자들은 BCR/ABL 음성 골수증식종양과 관련된 JAK2, MPL, CALR 유전자들을 비교 분석하여, 표 2의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열 각각을 포함하는 PNA를 제작하였고, 이러한 PNA를 이용하여 BCR/ABL 음성 골수증식종양 환자 샘플로부터 융해곡선을 얻었으며, 상기 융해곡선으로부터 융해온도(Tm)를 확인한 결과, 후술하는 실시 예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 유전자변이에 따른 서로 다른 결과를 얻을 수 있었다.

상기 혼성화시키는 단계는 본 발명에 따른 PNA를 BCR/ABL 음성 골수증식종양 의심 환자 DNA 샘플과 반응시키는 것이다. 이 단계는 상기 혼성화시키는 단계는, 대상 시료를 프라이머와 혼합하여 PCR을 수행하여 증폭하는 단계를 수행한 다음, 상기 증폭 산물에 펩티드 핵산 프로브를 첨가하여 혼성화시키는 단계일 수 있다. 즉, 혼성화 단계는 PCR 과정을 포함할 수 있고, PCR을 위한 정방향/역방향 프라이머 셋트를 이용하는 것이 가능하다. 이러한 혼성화 단계와 PCR 조건은 이 기술분야에서 보통의 지식을 가진 자(이하, '당업자'라고 함)에게 널리 알려진 다양한 모든 방법을 포함할 수 있다. 또한, PCR이 끝난 후에는 용융 과정을 포함하는 것도 가능하다.

그런 다음, 상기 온도별 융해곡선을 얻는 단계는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 의심 환자 DNA 샘플의 융해온도(Tm)를 얻기 위한 것이다. 이를 위하여, 상기 혼성화시킨 산물의 온도를 높이면서 형광의 세기를 측정하여, 온도에 따른 형광세기 변화를 온도별 융해곡선으로 얻을 수 있다. 즉, Hybridization methode 분석방법으로서 FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis)를 이용할 수 있고, 상기 FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후 만들어진 산물과 넣어준 프로브간의 결합력의 차이를 Tm으로 구분하여 분석하는 것이다. 예를 들어, 일반적인 실시간 PCR 장치를 이용하여, 1℃ 증가시킬 때 마다 형광의 세기를 측정함으로서 Tm값을 얻을 수 있다.

이어서, 상기 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자변이를 다중검출하는 단계는 상기 얻은 융해곡선의 융해온도로부터 유전자변이의 유무와 종류를 다중검출하는 것이다. 예를 들어, 상기 얻은 융해곡선의 융해온도를 기 알고 있는 유전자변이 차이에 따른 융해온도와 비교하여 염기변이의 유무와 종류를 다중검출할 수 있다. 유전자변이마다 본 발명에 따른 PNA를 적용한 융해곡선은 서로 다른 융해온도(Tm)를 가지고 있고(도 4 내지 도 7 참조), 이러한 차이를 이용하여 유전자변이 유무와 종류의 다중검출이 가능하다.

본 발명은 상기에서 상술한 바와 같이 간섭현상이 최소화될 수 있도록 제1용액 및 제2용액으로 나누어 구성한 유전자 변이 다중검출용 조성물을 대상 DNA 시료에 각각 또는 순차적으로 첨가하여 혼성화시키는 단계; 상기 혼성화된 산물을 온도를 변화시키면서 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 얻어진 융해곡선을 변이 유전자의 표준 융해온도와 비교하는 단계를 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 변이 다중검출 방법을 제공한다. 이를 통해 다중 유전자에 대한 동시 검출시 발생할 수 있는 간선 현상 등을 최소화할 수 있다.

간섭현상이 최소화될 수 있도록 제1용액 및 제2용액으로 나누어 구성한 유전자 변이 다중검출용 조성물은, (i) 서열번호 7 및 9로 표시되는 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 포함하는 제1용액과, 서열번호 8 및 10으로 표시된 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 포함하는 제2용액; 또는 (ii) 서열번호 7 및 10으로 표시되는 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 포함하는 제1용액과, 서열번호 8 및 9로 표시된 염기서열 및 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 펩티드 핵산 프로브를 포함하는 제2용액으로 구성되고, 상기 제1용액과 제2용액은 혼합되지 않은 상태로 존재하여, 이를 각각 또는 순차적으로 대상 DNA 시료와 접촉하여 반응시킬 수 있도록 구성된 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 다중 유전자 변이 다중검출용 조성물이다.

본 발명의 일태양에 따르면, 상기 혼성화시키는 단계는, 대상 시료를 프라이머와 혼합하여 PCR을 수행하여 증폭하는 단계를 수행한 다음, 상기 증폭 산물에 유전자 변이 다중검출용 조성물을 첨가하여 혼성화시키는 단계를 수행할 수 있다.

상기 프라이머는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자에 상보적으로 결합하여 유전자 변이 부분을 특이적으로 증폭할 수 있도록 제작된, 서열목록 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.

상기 방법에 의하여 검출하는 유전자 변이는, (i) 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F), (ii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 류신으로 치환(MPL W515L), (iii) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K), (iv) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 아르기닌으로 치환(MPL W515R), (v) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 알라닌으로 치환(MPL W515A), (vi) 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 세린으로 치환(MPL W515S), (vii) 칼레티큘린 유전자의 c.1092_1143del52 염기결손(L367fs*46), 및 (viii) 칼레티큘린 유전자의 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입(K385fs*47) 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 방법에 의하여 검출하는 야누스 티로신키나제 2 유전자의 617 위치의 아미노산 발린의 페닐알라닌으로 치환(JAK2 V617F) 변이는 c.1849G>T 또는 c.1849_1851delinsTTT 염기치환인 것, 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 류신으로 치환(MPL W515L) 변이는 c.1544G>T염기치환인 것, 트롬보포이에틴 수용체 유전자의 515 위치의 아미노산 트립토판의 라이신으로 치환(MPL W515K) 변이는 c.1543_1544delinsAA 염기치환일 수 있다.

이하에서는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: BCR / ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 다중검출용 펩티드핵 산의 제조

본 실시예에서는, 다양한 BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자 중에서 JAK2, MPL, CALR의 유전자를 선택하였다. 그리고 상기 BCR/ABL 음성 골수증식종양 의심 환자의 DNA를 주형으로 PCR을 수행하기 위해 JAK2, MPL, CALR의 프라이머를 제조하였다.

도 1 내지 도 3은 본 발명에 따른 JAK2, MPL, CALR유전자 일부와 SNP와 Indel 및 이로부터 도출된 PNA의 염기서열 일례를 나타내는 염기서열도이다. 도 1 내지 도 3에서, 각 유전자별 염기변이는 붉은색 또는 로 표기하였고, 이를 바탕으로 한 본 발명에 따른 PNA의 염기서열은 노란색 박스 안에 프라이머는 염기시작과 끝에 붉은색으로 표기하였다.

이와 같이, 본 발명에 따른 유전자 증폭을 위한 프라이머 염기서열을 결정하였고, 하기 표 1에 나타내었다.

명칭	방향	염기서열(5'-3')	길이 (bp)	용융온도 (℃)	크기(bp)
JAK2m	F(정방향)	AGCAGCAAGTATGATGAGCAAGC(서열번호1)	23	63.10	122
JAK2m	R(역방향)	CAGATGCTCTGAGAAAGGCATTA(서열번호2)	23	60.87
MPLm	F	GATCTCCTTGGTGACCGCTCT(서열번호3)	21	63.00	102
MPLm	R	GGGCGGTACCTGTAGTGTGC(서열번호4)	20	62.82
CALRm	F	GCAGCAGAGAAACAAATGAAGGA(서열번호5)	23	62.94	206	결실(del)=154
CALRm	R	CCTCTCTACAGCTCGTCCTTGG(서열번호6)	22	62.68		삽입(ins)=211

명칭	유전자변이	염기서열(5'-3' Fluorescence)	완전일치 표적 Perfect match target
JAK2-2	V317F(TTC, TTT)	Dabcyl-GTATGTGTCTGTGG-O-K(Cy5)(서열번호7)	Wild type
MPL-3	W515L, W515K	Dabcyl-CTGAGGTGGCAGT-O-K(FAM)(서열번호8)	Wild type
CALR-d4	1092_1143del52	Dabcyl-AAGCCTCTGCTCCTC-O-K(HEX) (서열번호9)	Wild type
CALR-in5p	1154_1155insTTGTC	Dabcyl-CAATTGTCCTCTGCC-O-K(Texas Red) (서열번호10)	c.1154_1155insTTGTC

* 상기 표 2에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다.

PNA 프로브는 4개의 프로브를 모두 하나의 튜브에서 실시하는 multiplex 형태로 프라이머 셋트 3개와 4개의 PNA 프로브 조합으로 진행하였다. 조합에는 같은 형광이 겹치지 않도록 제작하였다. 그런 다음, 상기 표 2에 나타난 바와 같은 염기서열과 리포터 및 소광자로 본 발명에 따른 PNA 프로브를 제작하였다. 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브(FAM, HEX, Texas Red, Cy5-labeled, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제방법을 통해 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.

실시예 2: BCR / ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 다중검출용 펩티드핵 산의 융해곡선분석

상기 실시예 1에 따라 제작된 본 발명에 따른 PNA를 이용하여, BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 DNA 샘플에 대하여 용해곡선을 도출하였다.

융해곡선분석은 CFX96^™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕ 이 되도록 10㎕의 2X qPCR PreMix(시선바이오, 한국)에 0.5㎕ 프로브(상기 실시예 1에서 제조된 PNA 프로브), 1㎕ 합성 유전자 염기변이 DNA(네오프로브, 한국, 표3)를 첨가한 다음 융해곡선분석을 실시하였다.

	명칭	염기서열(5'-3')	Type
1	JAK2_PM	GTCTCCACAGACACATACTCC(서열번호11)	JAK2 Wild type
2	JAK2_1MM	GTCTCCACAGAAACATACTCC(서열번호12)	JAK2 V617F (TTC)
3	JAK2_2MM	GTCTCCACAAAAACATACTCC(서열번호13)	JAK2 V617F (TTT)
4	MPL-3_PM	TGCTGAGGTGGCAGTTTC(서열번호14)	MPL Wild type
5	MPL-3_MM1	TGCTGAGGTTGCAGTTTC(서열번호15)	MPL W515L (TTG)
6	MPL-3_MM2	TGCTGAGGAAGCAGTTTC(서열번호16)	MPL W515K (AAG)
7	CALR-d4_PM	ACGAGGAGCAGAGGCTTAA(서열번호17)	CALR Wild type
8	CALR-d4_MM	ACGAGGAGCAGAGGACAA(서열번호18)	CALR del52 (c.1092_1143del52)
9	CALR-ins5p_PM	GGAGGCAGAGGACAATTGTC(서열번호19)	CALR ins5 (c.1154_1155insTTGTC)
10	CALR-ins5p_MM1	GGAGGCAGAGGACAAGGAGG(서열번호20)	CALR Wild type
11	CALR-ins5p_MM2	CGAGGAGCAGAGGACAAGGAGG(서열번호21)	CALR Wild type

도 4 내지 도 6은 본 발명의 실시예에 따라 PNA 프로브와 유전자변이를 가지는 합성 DNA 샘플을 혼성화시키고, 상기 혼성화시킨 산물의 온도를 높이는 과정에서 나타나는 Tm값을 얻기 위한 melting peak를 나타낸다. 여기에서는, 실시간 PCR 기기의 융해과정은 95℃에서 3분간 변성시킨 다음, 75℃에서 30초, 65℃에서 30초, 55℃에서 30초, 45℃에서 30초, 35℃에서 30초, 25℃에서 30초, 20℃에서 50초 동안 반응시켰으며, 이후 80℃까지 1℃ 올리고 10초간 기다린 후 형광을 측정하였다. 이는 PNA 프로브가 합성된 DNA 올리고머와 정확하게 혼성화되도록 하기 위함이다.

프로브	유전자변이	야생형	유전자변이	혼합형 Heterozygote (변이형 & 야생형)	혼합형 Heterozygote (변이형 & 변이형)
JAK2-2	V617F (TTC)	60±3℃	46±3℃	46℃ & 60℃	30℃ & 46℃
JAK2-2	V617F (TTT)	60±3℃	30±3℃	30℃ & 60℃	30℃ & 46℃
MPL-3	W515L	70±3℃	57±3℃	57℃ & 70℃	44℃ & 57℃
MPL-3	W515K	70±3℃	44±3℃	44℃ & 70℃	44℃ & 57℃
CALR-d4	del52	62±3℃	50±3℃	50℃ & 62℃	-
CALR-in5p	ins5	55±3℃	63±3℃	63℃ & 55℃	-

* Bold : 완전일치, Perfect match(= full matched)

표 4에서는 앞선 혼성화 반응에서 도출된 Tm값을 정리한 것으로 Tm값 분석을 통해서 해당 유전자변이를 확인할 수 있다. 또한 제작된 PNA 프로브가 각각의 유전자변이에 대해서 다른 Tm값을 얻어 미지의 표적핵산에 대한 염기변이를 검출할 수 있다.

실시예 3: BCR / ABL 음성 골수증식종양 관련 환자 샘플 DNA를 이용한 펩티드핵산의 융해곡선 분석

상기 실시예 1에 따라 제작된 본 발명에 따른 PNA를 이용하여, BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 DNA 샘플에 대하여 용해곡선을 도출하였다. PCR은 CFX96^™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 모든 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕ 이 되도록 2X qPCR PreMix (시선바이오, 한국), 0.05μM 정방향 프라이머 및 0.5μM 역방항 프라미어(asymmetric PCR)에 0.5㎕ 프로브(상기 실시예 1에서 제조된 PNA 프로브) 4종, 1㎕ BCR/ABL 음성 골수증식종양 의심환자 DNA를 첨가하고, 나머지는 DW로 보충한 다음 실시간 PCR을 실시하였다.

도 8은 본 발명의 실시 예에 따라 BCR/ABL 음성 골수증식종양 환자 DNA를 혼성화시키고, 상기 혼성화시킨 산물의 온도를 높이는 과정의 일례를 설명하기 위한 그래프이다. 여기에 나타난 바와 같이, 리얼타임 PCR 과정은 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 74℃에서 45초 동안 반응시켰다. 이를 40 cycle 반복하였고, 실시간으로 형광을 측정하였다. 융해곡선 분석은 95℃에서 3분간 변성시킨 다음, 75℃에서 30초, 65℃에서 30초, 55℃에서 30초, 45℃에서 30초, 35℃에서 30초, 25℃에서 30초, 20℃에서 50초 동안 반응시켰으며, 이후 80℃까지 1℃ 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 10초간 정지 상태를 유지하였다(도 8 참조).

도 9는 각각 본 발명에 따른 각각의 펩티드핵산을 BCR/ABL 음성 골수증식종양 환자 DNA에 대하여 적용하여 얻은 온도별 융해곡선 그래프의 일례이다. 도 9 각각에서, 6개 융해곡선은 4개의 프로브와 3개의 PCR 프라이머 셋트가 동시에 들어있는 1개 튜브에서 실시한 것이며 이중에서 해당 변이형이 있는 형광을 표시한 것이다. 해당 변이형 이외에 다른 유전자에서는 모두 야생형의 Tm값 및 용융점(melting peak)이 관찰되었다. 위 3개는 좌측으로부터 JAK2-2(Cy5), JAK2-2(Cy5), MPL-3(FAM)이고 아래 3개는 좌측으로부터 MPL-3(FAM), CALR-ins5p(Texas Red), CALR-d4(HEX)의 순이다. 도 9에 나타난 바와 같이, BCR/ABL 음성 골수증식종양 환자 DNA에서 본 발명에 따른 PNA를 적용한 융해곡선은 서로 다른 융해온도(Tm)를 가지고 있음을 확인할 수 있다. 또한, 야생형 DNA와 비교하여 서로 다른 융해온도(Tm) 차이가 발생하는 것을 확인할 수 있다.

샘플	JAK2-2	MPL-3	CALR-d4	CALR-in5p	유전자 변이
1번	30℃&60℃	70℃	62℃	55℃	JAK2 V617F
2번	46℃	70℃	62℃	55℃	JAK2 V617F
3번	60℃	44℃&70℃	62℃	55℃	MPL W515K
4번	60℃	57℃&70℃	62℃	55℃	MPL W515L
5번	60℃	70℃	62℃	55℃&63℃	CALR ins5
6번	60℃	70℃	50℃&62℃	55℃	CALR del52

* Bold: BCR/ABL 음성 골수증식종양 관련 유전자변이를 포함하는 결과

* Italic: 정상인의 유전자 염기의 Tm 온도

표 5는 상기 도 9의 온도별 융해곡선 그래프로부터 얻은 융해온도(Tm)를 정리한 표의 일례이다. 표 5에서, 굵고 밑줄로 표시된 것은(온도표시) 해당 유전자변이를 가지고 있음을 표시한다. 상기 표 5에 나타난 Tm값을 바탕으로 JAK2, MPL, CALR 유전자의 염기변이를 다중검출할 수 있다.

실시예 4: 효과적인 유전자 변이 검출 펩티드핵산 프로브 선별 과정

효과적인 유전자 변이 검출 펩티드핵산 프로브를 선별하기 위하여 JAK2, MPL, CALR 유전자의 다양한 유전자 변이에 대한 펩티드핵산 프로브를 제작하여 실험을 수행하였다.

(1) JAK2 유전자 변이

JAK2-3 프로브는 표 6에서 보는 염기서열로 합성하려 하였으나, JAK2-1, JAK2-2를 먼저 확인한 다음에 진행하기 위해서 제작하지 않았다. JAK2-1은 30℃ 부근에 프로브 다이머로 보이는 피크가 나타나서 이후 진행을 하지 않고, JAK2-2를 선택하였다.(도 10 참고)

(2) MPL 유전자 변이

MPL은 3개의 후보 중에서 MLP-1, MPL-2는 W515L과 W515K를 구분하지 못하고 모두 같은 Tm값을 가져 탈락하였고 MPL-3 프로브를 선택하여 진행하였다. (도 11 참고) MPL-3는 MLP-1, MPL-2에 결합하는 스트랜드가 아닌 반대쪽 스트랜드에 맞게 제작하였다. 이는 TG>TT vs TG>AA로 변하여서 생기는 Tm값의 차이가 CA>AA vs CA>TT로 바뀌어서 생기는 Tm값의 차이가 크기 때문에 사용 가능한 부분이다.

(3) CALR 결실 변이

CALR-d1은 야생형과 결실변이에 해당하는 DNA 올리고에서 좋지 않은 용융점(melting peak)를 나타내어 탈락하였다. CALR-d2, CALR-d3 프로브는 같은 서열을 가지나 형광의 종류만 다르게 제작하였으며, 야생형과 결실변이에 해당하는 DNA 올리고에서는 좋은 Tm값과 용융점을 가졌으나 실제 샘플에서는 프로브로 잡은 서열이 표적에 반복적으로 나타나는 현상 때문에 야생형에 해당하는 부분에 변이형에 해당하는 피크(도 12의 붉은 화살표)를 나타내어 야생형임에도 불구하고 변이형이 포함된 것으로 판단할 가능성이 있어 탈락하였다. (도 12 참고) 도 13에는 샘플을 이용한 용융점 분석을 나타낸 그래프이다.

(4) CALR 삽입 변이

삽입변이를 검출하기 위해서는 완전 일치하는 표적핵산을 변이형으로 하고 비완전 매치를 야생형으로 하였을 때 검출이 용이하기 때문에 이에 삽입된 변이를 완전 일치 표적으로 하여 CALR-in1, CALR-in2, CALR-in3은 wild type에서 낮은 Tm값을 나타내었으며 그에 따라 변이형은 어떠한 Tm값도 나타내지 않았다(도 14의 Homozygote의 붉은색). CALR-in1과 CALR-in3는 사용된 염기서열은 동일하며 형광물질만 다르게 제작되었다. 또한 CALR-in3 프로브는 CALR-del52를 검출하는 PNA 프로브와의 간섭을 피하기 위해 형광을 5'에 결합하여 제작하였다. CALR-in1~3은 모두 야생형을 검출하지 못하였으며, 따라서 CALR-in5p를 이용하여 유전자 변이 검출에 사용하였다. CALR-del52 변이도 CALR-ins5 입장에서는 야생형으로 인식되어 52℃ 근처에서 Tm값이 나타나게 된다(도 7 참고). 그러나 3'-말단의 C에 불완전 일치가 발생하여 야생형 보다 약간 낮은 Tm이 발생됨을 알 수 있다.

실시예 5: 선별된 펩티드핵산 프로브들의 최적 조합 구성

상기에서 선별된 펩티드핵산 프로브들간에 간섭 현상을 최소화하는 조합을 찾기 위하여 다음 표와 같이 구성하였다.

	혼합 조성물 1	혼합 조성물 2
제1용액 (A set)	JAK2-2 MPL-3 CALR-d4 CALR-in5p	JAK2-2 CALR-d4
제2용액 (B set)	-	MPL-3 CALR-in5p

상기와 같이 간섭 현상이 발생할 수 있는 프로브들을 다른 용액에 존재하도록 분리하여 구성한 경우(혼합 조성물 2) 문제 되었던 self quenching 문제가 해결되고 돌연변이 검출 민감도가 증가한 것을 확인하였다(도 15a 및 b 참조).

실시예 6: 검출한계 설정

돌연변이 6개와 상보적인 야생형 3개를 대상으로 인공 클로닝을 시행한 후 희석하여 상기에서 제작한 혼합조성물 2의 검출한계를 설정하였다. 검출한계 설정은 3회 반복시행하며 원인 유전자의 돌연변이별로 각각 시행하였다. 희석배수는 100% 돌연변이, 50% 돌연변이, 25% 돌연변이, 10% 돌연변이, 7.5% 돌연변이, 및 0% 돌연변이로 수행하였다. 검출한계 실험 결과 10% 돌연변이까지 검출 가능한 것을 확인하였다(도 16a,b,c 참조).

실시예 7: 민감도 검증

혼합조성물 2의 민감도를 검증하기 위하여, Fragment analysis와 Sanger sequencing으로 검증된 환자 검체(총 57명)를 대상으로 FCMA 시행하여 비정상적 곡선이 관찰됨을 확인하였다. 민감도 검증은 3회 반복시행하며 원인 유전자의 돌연변이별로 각각 시행하였다(표 7 참조).

유전자	돌연변이	질환
JAK2 (n=27)	V617F	PV (n=20)
JAK2 (n=27)	그 외 엑손12 돌연변이	PV (n=6), PMF (n=1)
MPL (n=6)	W515L/K	ET (n=3)
MPL (n=6)	W515L/K	PMF (n=3)
CALR (n=24)	유형1	ET (n=9), PMF (n=1)
	유형2	ET (n=8), PMF (n=2)
	그 외 엑손9 돌연변이	ET (n=4)

실험 결과, JAK2 V617F 돌연변이 결과는 27개 시료 모두에 대하여 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법(allele specific real-time PCR) 결과와 모두 일치하였다.

MPL W515L/K 돌연변이 결과는 3개 일치, 2개는 위음성이었으나, 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응법(allele specific real-time PCR) 결과를 확인한 결과 돌연변이 양이 10% 미만으로 검출한계 이하였다. Tm 값이 기존 설정값과 상이한 검체 1개가 있어 염기서열 분석한 결과 MPL W515S로 확인되었다.

CALR type 1/2 돌연변이는 20개 일치, 2개 위양성, 2개 위음성이었다. 위양성 검체는 그 외 엑손9 돌연변이였으며, 유형1 돌연변이 프로브 위치를 일부 포함하는 결손으로 확인되어 type1 돌연변이로 검출된 것으로 판단되었다. 위음성 검체는 염기서열 분석결과, c.1105_1156del52과 c.1131_1151delinsGTGCCTCCTCCTGGAGG 으로 각각 52bp 결손과 4bp 결손으로 확인되었다. 이에 대하여 fragment analysis 결과 상 type1 결손(c.1092_1143del52)와 정상야생형 간 PCR 산물 크기 차이가 정확히 일치하여 잘못 해석할 수 있으며, type2 삽입(c.1154_1155insTTGTC) 와 정상야생형 간 PCR 산물 크기 차이(5bp)와 유사하여 혼동할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나 염기서열분석 상 CALR type1과 typ2 돌연변이가 아닌 것으로 확인되어 본 발명품이 fragment analysis보다 우수한 것으로 판단된다 (표 8 및 도 17a, b 참조).

구분	기존 검사결과	FMCA 검사결과
CALR 위양성	c.1092_1138del47	유형1 돌연변이 (c.1092_1143del52)
CALR 위양성	c.1099_1132del34	유형1 돌연변이 (c.1092_1143del52)
CALR 위음성	유형 1 돌연변이 (c.1092_1143del52) : 52bp 차이	c.1105_1156del52 : 52bp 차이(염기서열확인)
CALR 위음성	유형 2 돌연변이 (c.1154_1155insTTGTC) : 5bp 차이	c.1131_1151delinsGTGCCTCCTCCTGGAGG : 4bp 차이(염기서열확인)

따라서, 혼합조성물 2를 사용한 FMCA 검사의 민감도를 검증한 결과, 검출한계 10% 이상의 검체에서 real-time PCR 및 fragment analysis 검사결과(기존 검사결과)와 모두 일치함을 확인하였다.

실시예 8: 특이도 검증

혼합조성물 2의 특이도를 검증하기 위하여 야생형 DNA 96개를 대상으로 FCMA 수행한 결과, 비정상 곡선이 관찰되지 않음을 확인하였다(도 18 참조). 특이도 검증은 3회 시행하며 원인 유전자의 돌연변이별로 각각 시행하였다.

실시예 9: 다중검출 검증

같은 원인 유전자의 환자 DNA를 혼합하여 같은 채널에서 다중 검출이 가능함을 확인하였다(도 19). 다중검출 검증은 3회 반복하여 원인 유전자별로, JAK2 V617F 염기치환이 다른 돌연변이 혼합하여 검사, MPL W515L과 W515K 돌연변이 혼합하여 검사, CALR type 1과 type 2를 혼합하여 검사를 각각 수행하였다. 실험 결과는 도 19에 도시하였다.

다른 원인 유전자의 환자 DNA를 혼합하여 다른 채널에서 다중 검출이 가능함도 확인하였다(도 20a,b). 다중검출 검증은 3회 반복하여 각각 수행하였다. 구체적으로, JAK2 V617F 돌연변이와 MPL W515L/K 돌연변이 혼합하여 검사, JAKV V617F 돌연변이와 CALR type 1/2를 혼합하여 검사, MPL W515L/K 돌연변이와 CALR type 1/2를 혼합하여 검사를 수행하였다.

6개 원인 유전자 돌연변이 환자 DNA를 혼합하여 6개 돌연변이의 동시 검출이 가능함을 확인하였다(도 21a,b,c). 다중검출 검증은 3회 반복수행하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Peptide nucleic acid probe for multiplex-detecting BCR/ABL negative MPN related gene mutations, composition for multiplex-detecting gene mutation there of, gene mutation detecting multiplex kit and gene mutation detecting multiplex methods <130> PN1601-038 <150> KR 10-2015-0158056 <151> 2015-11-11 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agcagcaagt atgatgagca agc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cagatgctct gagaaaggca tta 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gatctccttg gtgaccgctc t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gggcggtacc tgtagtgtgc 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcagcagaga aacaaatgaa gga 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cctctctaca gctcgtcctt gg 22 <210> 7 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 7 gtatgtgtct gtgg 14 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 8 ctgaggtggc agt 13 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 9 aagcctctgc tcctc 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 10 caattgtcct ctgcc 15 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2_PM <400> 11 gtctccacag acacatactc c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2_1MM <400> 12 gtctccacag aaacatactc c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JAK2_2MM <400> 13 gtctccacaa aaacatactc c 21 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PL-3_PM <400> 14 tgctgaggtg gcagtttc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MPL-3_MM1 <400> 15 tgctgaggtt gcagtttc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MPL-3_MM2 <400> 16 tgctgaggaa gcagtttc 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALR-d4_PM <400> 17 acgaggagca gaggcttaa 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALR-d4_MM <400> 18 acgaggagca gaggacaa 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALR-ins5p_PM <400> 19 ggaggcagag gacaattgtc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALR-ins5p_MM1 <400> 20 ggaggcagag gacaaggagg 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALR-ins5p_MM2 <400> 21 cgaggagcag aggacaagga gg 22

Claims

(a) JAK2(Janus Tyrosine Kinase 2) 유전자의 변이 영역에 결합하는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 PNA(peptide nucleic acid) 프로브, 트롬보포이에틴수용체(myeloproliferative leukemia protein, MPL) 유전자의 변이 영역에 결합하는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 PNA 프로브, CALR(Calreticulin) 유전자의 결실 변이 영역에 결합하는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 PNA 프로브, 및 CALR(Calreticulin) 유전자의 삽입 변이 영역에 결합하는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 PNA 프로브;
(b) JAK2(Janus Tyrosine Kinase 2) 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트, 트롬보포이에틴수용체(MPL) 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트, 및 CALR(Calreticulin) 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트;를 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 원인 다중 유전자 변이 검출용 조성물로서,
상기 JAK2 유전자의 변이(JAK2 V617F)는 c.1849G>T 염기치환 또는 c.1849_1851delinsTTT 염기치환에 의한 것이고,
상기 MPL 유전자의 변이(MPL W515L 또는 MPL W515K)는 c.1544G>T 염기치환 또는 c.1543_1544delinsAA 염기치환에 의한 것이고,
상기 CALR 유전자의 변이(L367fs*46 또는 K385fs*47)는 c.1092_1143del52 염기결실 또는 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입에 의한 것을 특징으로 하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 원인 다중 유전자 변이 검출용 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6- carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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제 1 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 원인 다중 유전자 변이 검출용 키트.
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(i) 대상 시료에 제 1 항의 조성물을 첨가하여 시료의 DNA를 증폭 및 혼성화시키는 단계;
(ii) 상기 (i)의 혼성화된 산물을 온도를 변화시키면서 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
(iii) 상기 (ii)에서 얻어진 융해곡선을 변이 유전자의 표준 융해온도와 비교하는 단계;를 포함하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 원인 다중 유전자 변이 검출 방법으로서,
상기 변이 유전자는 JAK2 유전자, MPL 유전자 또는 CALR 유전자이고,
상기 JAK2 유전자의 변이(JAK2 V617F)는 c.1849G>T 염기치환 또는 c.1849_1851delinsTTT 염기치환에 의한 것이고,
상기 c.1849G>T 염기치환의 경우, 변이 유전자의 표준 융해온도는 46℃이고, 야생형의 표준 융해온도는 60℃이고,
상기 c.1849_1851delinsTTT 염기치환의 경우, 변이 유전자의 표준 융해온도는 30℃이고, 야생형의 표준 융해온도는 60℃이고,
상기 MPL 유전자의 변이(MPL W515L 또는 MPL W515K)는 c.1544G>T 염기치환 또는 c.1543_1544delinsAA 염기치환에 의한 것이고,
상기 c.1544G>T 염기치환의 경우, 변이 유전자의 표준 융해온도는 57℃이고, 야생형의 표준 융해온도는 70℃이고,
상기 c.1543_1544delinsAA 염기치환의 경우, 변이 유전자의 표준 융해온도는 44℃이고, 야생형의 표준 융해온도는 70℃이고,
상기 CALR 유전자의 변이(L367fs*46 또는 K385fs*47)는 c.1092_1143del52 염기결실 또는 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입에 의한 것이고,
상기 c.1092_1143del52 염기결실의 경우, 변이 유전자의 표준 융해온도는 50℃이고, 야생형의 표준 융해온도는 62℃이고,
상기 c.1154_1155insTTGTC 염기삽입의 경우, 변이 유전자의 표준 융해온도는 63℃이고, 야생형의 표준 융해온도는 55℃인 것을 특징으로 하는 BCR/ABL 음성 골수증식종양 원인 다중 유전자 변이 검출 방법.
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