JP2015070808A - Ｊａｋ２変異遺伝子の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】高感度でありながら、擬陽性を生じない正確なＪＡＫ２遺伝子変異の検出方法の提供。【解決手段】ヒト由来の遺伝子含有試料中のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の有無を検出する方法であって、（Ａ）ヒト由来の遺伝子含有試料に対して遺伝子増幅手法により、ＪＡＫ２遺伝子のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程、（Ｂ）（Ａ）で得られた増幅物を制限酵素ＢｓａＸ１で処理する工程、及び（Ｃ）（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ又はその相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブ及び（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブの存在下に、（Ｂ）で得られた処理物に対して遺伝子増幅手法により、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程、を含むＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。【選択図】なし
Description
本発明は、骨髄増殖性腫瘍の診断に有用なＪＡＫ２遺伝子変異の検出方法に関する。
骨髄増殖性腫瘍(MPN:myeloproliferative neoplasms)とは、造血幹細胞の異常により骨髄系細胞の過剰な増殖をきたす疾患群であり、真性赤血球増加症（PV:polycythemia vera）、本態性血小板血症(ET:essential thrombocytosis)及び原発性骨髄線維症(PMF:primary myelofibrosis)が含まれる。これらの疾患は、血栓症や心筋梗塞を併発するほか、症状が進むと白血病化することもあるため、診断を確定させる遺伝子マーカーの存在証明が必要である。
ＭＰＮにおける遺伝子マーカーとしてＪＡＫ２遺伝子の変異が知られており、その変異はＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ（ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ）であることが知られている。この変異は、ＰＶ患者の９５％、ＥＴ患者及びＰＭＦ患者のおよそ半数に見られる。現在、ＪＡＫ２変異を検出することがＭＰＮの診断基準のひとつとなっている。当該ＪＡＫ２変異の検出手段としては、ＰＮＡプローブを用いたＬＡＭＰ法（非特許文献１）が知られている。
G Minnucci, et al., A novel, highly sensitive and rapid allele-specific loop-mediated amplification assay for the detection of the JAK2V617F mutation in chronic myeloproliferative neoplasms, Haematologica 97: 1394-1400 (2012)
しかしながら、従来の検出技術では、感度が高くなったことに伴い、擬陽性の問題が顕在化している。すなわち、実際はＪＡＫ２変異が陰性であるにもかかわらず陽性と判定され、抗がん剤を投与されてしまうケースが懸念されている。
従って、本発明の課題は、高感度でありながら、擬陽性を生じない正確なＪＡＫ２遺伝子変異の検出方法を提供することにある。
従って、本発明の課題は、高感度でありながら、擬陽性を生じない正確なＪＡＫ２遺伝子変異の検出方法を提供することにある。
そこで本発明者は、野生型ＪＡＫ２遺伝子を検出することなく、変異型ＪＡＫ２遺伝子を高感度に検出できる手段を開発すべく検討したところ、変異領域を増幅するＰＣＲを行った後、制限酵素BsaX1処理により野生型ＪＡＫ２遺伝子を特異的に分解し、次いで変異型ＪＡＫ２遺伝子に特異的な蛍光プローブと野生型ＪＡＫ２遺伝子に特異的なＢＮＡプローブとの存在下に再度ＰＣＲを行い、蛍光強度を測定すれば、野生型ＪＡＫ２遺伝子の増幅が強力に抑制でき、変異型ＪＡＫ２遺伝子が高感度で検出でき、かつ野生型ＪＡＫ２遺伝子の検出を排除できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。
〔１〕ヒト由来の遺伝子含有試料中のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
（Ａ）ヒト由来の遺伝子含有試料に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２遺伝子のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程、
（Ｂ）（Ａ）で得られた増幅物を制限酵素BsaX1で処理する工程、及び
（Ｃ）（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ又はその相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブ及び（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブの存在下に、（Ｂ）で得られた処理物に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程、
を含むＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔２〕（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブが、ＬＮＡ−ＢＮＡ複合体プローブである〔１〕記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔３〕（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔにハイブリダイゼーションする蛍光プローブが、GenBankアクセッション番号ＡＬ１６１４５０における５５０５２番目のグアニンを先頭とし、３’側に１０〜３０塩基を有する配列に蛍光標識したプローブである〔１〕又は〔２〕記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔４〕（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔの相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブが、GenBankアクセッション番号ＡＬ１６１４５０における５５０７２番目のシトシンを先頭とし、５’側に１２〜３２塩基を有する配列に蛍光標識したプローブである〔１〕又は〔２〕に記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔５〕（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブがＪＡＫ２野生型遺伝子の１８４９Ｇを含む９〜２１塩基又はその相補鎖を有する配列の糖鎖構造が変異したＢＮＡプローブである〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔６〕（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブが、CCACAGACACATACT又はその相補鎖を有する配列の糖鎖構造が変異したＢＮＡプローブである〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔７〕工程（Ａ）、次いで工程（Ｂ）のサイクルを１〜２回行う〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
（Ａ）ヒト由来の遺伝子含有試料に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２遺伝子のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程、
（Ｂ）（Ａ）で得られた増幅物を制限酵素BsaX1で処理する工程、及び
（Ｃ）（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ又はその相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブ及び（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブの存在下に、（Ｂ）で得られた処理物に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程、
を含むＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔２〕（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブが、ＬＮＡ−ＢＮＡ複合体プローブである〔１〕記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔３〕（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔにハイブリダイゼーションする蛍光プローブが、GenBankアクセッション番号ＡＬ１６１４５０における５５０５２番目のグアニンを先頭とし、３’側に１０〜３０塩基を有する配列に蛍光標識したプローブである〔１〕又は〔２〕記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔４〕（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔの相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブが、GenBankアクセッション番号ＡＬ１６１４５０における５５０７２番目のシトシンを先頭とし、５’側に１２〜３２塩基を有する配列に蛍光標識したプローブである〔１〕又は〔２〕に記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔５〕（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブがＪＡＫ２野生型遺伝子の１８４９Ｇを含む９〜２１塩基又はその相補鎖を有する配列の糖鎖構造が変異したＢＮＡプローブである〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔６〕（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブが、CCACAGACACATACT又はその相補鎖を有する配列の糖鎖構造が変異したＢＮＡプローブである〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
〔７〕工程（Ａ）、次いで工程（Ｂ）のサイクルを１〜２回行う〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
本発明の検出方法によれば、野生型ＪＡＫ２遺伝子の検出がほとんどなく、かつ変異型ＪＡＫ２遺伝子を０．０５％までの感度で正確に検出できる。従って、従来法と同様の高感度を維持でき、かつＪＡＫ２変異陰性の患者を陽性又は擬陽性と判定することがなくなり、必要のない患者に抗がん剤を投与する危険性を回避することが可能となった。
本発明に用いる塩基配列及び塩基番号は、Gen Bank Accessin No.AL161450の記載に基づくものである。ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔは、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆに相当する。
本発明のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法は、次の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む。
（Ａ）ヒト由来の遺伝子含有試料に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２遺伝子のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程。
（Ｂ）（Ａ）で得られた増幅物を制限酵素BsaX1で処理する工程。
（Ｃ）（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ又はその相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブ及び（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブの存在下に、（Ｂ）で得られた処理物に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程。
本発明のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法は、次の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む。
（Ａ）ヒト由来の遺伝子含有試料に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２遺伝子のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程。
（Ｂ）（Ａ）で得られた増幅物を制限酵素BsaX1で処理する工程。
（Ｃ）（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ又はその相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブ及び（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブの存在下に、（Ｂ）で得られた処理物に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程。
（工程（Ａ））
工程（Ａ）に用いるヒト由来の遺伝子含有試料としては、血液又は骨髄を用いることもでき、ヒトの赤血球、白血球、血小板又は造血幹細胞を含む試料から遺伝子を抽出した試料も用いることができる。具体的には、骨髄又は血液から、ＤＮＡを抽出した試料が挙げられる。より具体的には、骨髄又は血液から細胞を採取し、細胞を破砕し、次いでタンパク質を除去することにより得られた試料が挙げられる。
工程（Ａ）に用いるヒト由来の遺伝子含有試料としては、血液又は骨髄を用いることもでき、ヒトの赤血球、白血球、血小板又は造血幹細胞を含む試料から遺伝子を抽出した試料も用いることができる。具体的には、骨髄又は血液から、ＤＮＡを抽出した試料が挙げられる。より具体的には、骨髄又は血液から細胞を採取し、細胞を破砕し、次いでタンパク質を除去することにより得られた試料が挙げられる。
ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる手法としては、この変異部位を含む領域を増幅できる遺伝子増幅手法であればよく、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。工程（Ａ）のＰＣＲに用いられるプライマーとしては下記表１のインナーフォワードプライマー（ＦＩ）（配列番号３）、工程（Ａ）のインナーリバースプライマー（ＲＩ−Ａ）（配列番号４）、アウターフォワードプライマー（ＦＯ）（配列番号１）及びアウターリバースプライマー（ＲＯ）（配列番号２）が用いられる。
具体的には、表１のＦＯ及びＲＯを用いたＰＣＲを行い、２回目以降はＦＩ及びＲＩ−Ａを用いたＰＣＲを行うのが好ましい。またＰＣＲ反応は１回以上、特に２回行うのが好ましい。各々のＰＣＲ反応は、９０〜９５℃３分→（９０〜９５℃３０秒、５５〜６０℃３０秒、７０〜７５℃４０秒）×２５サイクル→７０〜７５℃２分とするのが好ましい。
これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔを含む５００〜６００塩基の領域が増幅される。なお、工程（Ａ）で得られる増幅物中には、野生型ＪＡＫ２の増幅物及び変異型ＪＡＫ２（ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ）の増幅物が含まれる。
（工程（Ｂ））
工程（Ｂ）は、（Ａ）で得られた増幅物を制限酵素ＢｓａＸ１で処理する工程である。この処理は、例えばこの増幅物に制限酵素BsaX1を添加し、３５〜４０℃で１〜３時間行うのが好ましい。
工程（Ｂ）は、（Ａ）で得られた増幅物を制限酵素ＢｓａＸ１で処理する工程である。この処理は、例えばこの増幅物に制限酵素BsaX1を添加し、３５〜４０℃で１〜３時間行うのが好ましい。
この制限酵素処理により、野生型ＪＡＫ２遺伝子が特異的に分解され、変異型ＪＡＫ２遺伝子が濃縮される。この制限酵素処理は１回以上、特に２回行うのが好ましい。
さらに、工程（Ａ）の遺伝子増幅を行い、次いで工程（Ｂ）を行うというサイクルを１回以上、特に２回繰り返すのが、野生型ＪＡＫ２遺伝子を分解し、変異型ＪＡＫ２遺伝子を濃縮するうえで特に好ましい。
（工程（Ｃ））
工程（Ｃ）は、（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ又はその相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブ及び（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブの存在下に、（Ｂ）で得られた処理物に対して遺伝子増幅手法によりＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程である。
工程（Ｃ）は、（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ又はその相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブ及び（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブの存在下に、（Ｂ）で得られた処理物に対して遺伝子増幅手法によりＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程である。
（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ又はその相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブは、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔの変異部位にハイブリダイゼーションするプローブであり、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ（変異型ＪＡＫ２遺伝子）を検出するためのプローブである。当該プローブとしては、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔにハイブリダイゼーションする蛍光プローブの場合は、GenBankアクセッション番号ＡＬ１６１４５０における５５０５２番目のグアニンを先頭とし、３’側に１０〜３０塩基を有する配列に蛍光標識したプローブが好ましい。また、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔの相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブの場合は、GenBankアクセッション番号ＡＬ１６１４５０における５５０７２番目のシトシンを先頭とし、５’側に１２〜３２塩基を有する配列に蛍光標識したプローブであるのが好ましい。さらに具体的には、表１の配列番号６の配列を有する配列に蛍光標識したプローブが好ましい。
（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブは、野生型ＪＡＫ２遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションして野生型ＪＡＫ２遺伝子の増幅を抑制するプローブである。当該プローブとしては、ＪＡＫ２野生型遺伝子の１８４９Ｇを含む９〜２１塩基又はその相補鎖を有する配列の糖鎖構造が変異したＢＮＡプローブが好ましく、ＪＡＫ２の野生型遺伝子１８４９Ｇを含む１２〜１７塩基又はその相補鎖を有する配列の糖鎖構造が変異したＢＮＡプローブがより好ましい。さらに具体的には、CCACAGACACATACT又はその相補鎖を有する配列の糖鎖構造が変異したＢＮＡプローブが好ましい。ここでＢＮＡプローブの糖鎖構造としては、以下のものが挙げられる。
（式中、Ｒは、アルキル基を示し、特にメチル基が好ましい。）
これらの糖鎖構造のうち、２種以上を有するＬＮＡ−ＢＮＡ複合体プローブを用いるのが好ましく、ＬＮＡと２’，４’−ＢＮＡCOCの複合態プローブ、ＬＮＡと３’−Amino−２’，４’−ＢＮＡの複合体プローブ、ＬＮＡと２’，４’−ＢＮＡNCの複合体プローブ等がさらに好ましい。
本発明のようなＢＮＡプローブを用いた場合、ＰＮＡプローブを用いた場合に比べて、検出感度が顕著に向上する。
工程（Ｃ）のＰＣＲは、前記蛍光プローブ及びＢＮＡプローブの存在下で行う。ＰＣＲ反応は、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅できるプライマーを用いて行えばよい。例えば、表１のインナーフォワードプライマー（ＦＩ）とインナーリバースプライマー（ＲＩ−Ｂ）を用いてＰＣＲ反応を行うのが好ましい。またＰＣＲ反応は１回以上で行えばよい。ＰＣＲ反応は、例えば９０〜９５℃３分→（９０〜９５℃３０秒，５５〜６５℃３０秒，６５〜７０℃３０秒）×４０サイクルとするのが好ましい。
工程（Ｃ）により、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔの変異部位を有するＤＮＡが増幅され、かつＢＮＡクランプにより野生型ＪＡＫ２遺伝子の増幅が顕著に抑制される。ＰＣＲ反応後は、反応液の温度を上昇させながら蛍光プローブの蛍光強度を測定すればよい。
本発明方法によれば、工程（Ｂ）により野生型ＪＡＫ２遺伝子が分解され、かつ工程（Ｃ）により変位型ＪＡＫ２遺伝子のみが増幅されるため、擬陽性の危険性をなくし、かつ高感度でＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔを検出できる。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
試験例１
（１）反応液２０μＬ（０．５×Titanium Taq DNA polymerase，１×Titanium PCR buffer，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ，０．５μＭ ＦＯ（表１）、ＲＯ（表１）、template genomic ＤＮＡ １μＬ）を調製し、検出したい変異を含む領域をＰＣＲ法により増幅した調製した（温度条件：９４℃，３ｍｉｎ→（９４℃，３０ｓｅｃ，５８℃，３０ｓｅｃ，７２℃，４０ｓｅｃ）×２５ｃｙｃｌｅｓ→７２℃，２ｍｉｎ）。
（２）ＰＣＲ後の反応液１μＬを制限酵素反応液１０μＬ（０．４units BsaXI，１×NEBuffer ４）へ供試し、３７℃、２時間処理した。
（３）本技術の感度の確認のため、上記のＰＣＲ、制限酵素処理を１回、２回、３回実施したサンプルを準備し、続く融解曲線解析へ供試した。なお、２回目以降のＰＣＲでは、プライマーはＦＯ、ＲＯの代わりにＦＩ（表１）、ＲＩ−Ａ（表１）を用いた。
（４）融解曲線解析では、制限酵素処理したサンプル１μＬを反応液１５μＬ（０．５×Titanium Taq DNA polymerase，１×Titanium PCR buffer，０．２ｍＭ dNTP mix，１μＭ ＦＩ（表１）、０．１μＭ ＲＩ−Ｂ（表１）、０．５μＭ ＢＮＡプローブ（表１）、０．０５μＭ蛍光プローブ（表１））中へ添加し、ＰＣＲを実施した（温度条件：９４℃，５ｍｉｎ→（９４℃，３０ｓｅｃ，６０℃，３０ｓｅｃ，６８℃，３０ｓｅｃ）×４０ｃｙｃｌｅｓ）。ＰＣＲ後、反応液を９５℃、２ｍｉｎ→６５℃、２ｍｉｎ→４０℃，２ｍｉｎの条件でインキュベートしたのち、０．５℃／ｓｅｃの割合で４０℃から８０℃までの蛍光強度を継続的に測定した。
（１）反応液２０μＬ（０．５×Titanium Taq DNA polymerase，１×Titanium PCR buffer，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ，０．５μＭ ＦＯ（表１）、ＲＯ（表１）、template genomic ＤＮＡ １μＬ）を調製し、検出したい変異を含む領域をＰＣＲ法により増幅した調製した（温度条件：９４℃，３ｍｉｎ→（９４℃，３０ｓｅｃ，５８℃，３０ｓｅｃ，７２℃，４０ｓｅｃ）×２５ｃｙｃｌｅｓ→７２℃，２ｍｉｎ）。
（２）ＰＣＲ後の反応液１μＬを制限酵素反応液１０μＬ（０．４units BsaXI，１×NEBuffer ４）へ供試し、３７℃、２時間処理した。
（３）本技術の感度の確認のため、上記のＰＣＲ、制限酵素処理を１回、２回、３回実施したサンプルを準備し、続く融解曲線解析へ供試した。なお、２回目以降のＰＣＲでは、プライマーはＦＯ、ＲＯの代わりにＦＩ（表１）、ＲＩ−Ａ（表１）を用いた。
（４）融解曲線解析では、制限酵素処理したサンプル１μＬを反応液１５μＬ（０．５×Titanium Taq DNA polymerase，１×Titanium PCR buffer，０．２ｍＭ dNTP mix，１μＭ ＦＩ（表１）、０．１μＭ ＲＩ−Ｂ（表１）、０．５μＭ ＢＮＡプローブ（表１）、０．０５μＭ蛍光プローブ（表１））中へ添加し、ＰＣＲを実施した（温度条件：９４℃，５ｍｉｎ→（９４℃，３０ｓｅｃ，６０℃，３０ｓｅｃ，６８℃，３０ｓｅｃ）×４０ｃｙｃｌｅｓ）。ＰＣＲ後、反応液を９５℃、２ｍｉｎ→６５℃、２ｍｉｎ→４０℃，２ｍｉｎの条件でインキュベートしたのち、０．５℃／ｓｅｃの割合で４０℃から８０℃までの蛍光強度を継続的に測定した。
本実験で使用した測定サンプルは野生型遺伝子をもつ細胞株（ＵＴ−７／ＥＰＯ株）と変異型遺伝子をもつ細胞株（ＨＥＬ株）より抽出したＤＮＡを任意の変異の割合（０．００１％，０．００５％，０．０１％，０．０５％，０．１％，０．５％，１％及び１０％）となるようブレンドしたものである。
得られた蛍光データを用いて、蛍光強度の変化量（時間微分）を算出し、温度との関係をグラフ化した（図１）。測定サンプル中の変異の有無は５８℃付近に現れるピークの有無で判定される。その結果、図１のように本発明方法によれば感度０．０５％まではっきりと変異を検出できた。
試験例２
試験例１の条件のもと、健常人３０人分のサンプルを用いて擬陽性が検出されるかを検討した。なお、最初のＰＣＲ、制限酵素のステップは２回繰り返した。また、陽性コントロールとして、ＨＥＬ株より抽出したＤＮＡを用いた。
その結果、図２に示すように、３０例の健常者サンプルのＪＡＫ２変異を測定したが、ひとつとして陽性例は検出されなかった。この実験は３回実施し、延べ９０回検討している。
ひとつ蛍光強度に変化が見られているが、これは陽性コントロール（ＪＡＫ２変異陽性の細胞株抽出ＤＮＡ）である。また、灰色のラインは測定サンプルの代わりに水を添加したno template controlである。
試験例１の条件のもと、健常人３０人分のサンプルを用いて擬陽性が検出されるかを検討した。なお、最初のＰＣＲ、制限酵素のステップは２回繰り返した。また、陽性コントロールとして、ＨＥＬ株より抽出したＤＮＡを用いた。
その結果、図２に示すように、３０例の健常者サンプルのＪＡＫ２変異を測定したが、ひとつとして陽性例は検出されなかった。この実験は３回実施し、延べ９０回検討している。
ひとつ蛍光強度に変化が見られているが、これは陽性コントロール（ＪＡＫ２変異陽性の細胞株抽出ＤＮＡ）である。また、灰色のラインは測定サンプルの代わりに水を添加したno template controlである。
試験例３
試験例１の条件において、ＢＮＡプローブの代わりにＰＮＡプローブを用いて、それぞれの感度を比較した。最初のＰＣＲ、制限酵素のステップは２回実施し、用いたＰＮＡプローブの濃度はＢＮＡプローブと同様とした。
その結果、図３に示すように、ＰＮＡプローブでは検出感度が０．５％までであり、ＢＮＡプローブでは感度０．０５％まで検出できた。
試験例１の条件において、ＢＮＡプローブの代わりにＰＮＡプローブを用いて、それぞれの感度を比較した。最初のＰＣＲ、制限酵素のステップは２回実施し、用いたＰＮＡプローブの濃度はＢＮＡプローブと同様とした。
その結果、図３に示すように、ＰＮＡプローブでは検出感度が０．５％までであり、ＢＮＡプローブでは感度０．０５％まで検出できた。
Claims (7)
- ヒト由来の遺伝子含有試料中のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
（Ａ）ヒト由来の遺伝子含有試料に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２遺伝子のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程、
（Ｂ）（Ａ）で得られた増幅物を制限酵素BsaX1で処理する工程、及び
（Ｃ）（１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ又はその相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブ及び（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブの存在下に、（Ｂ）で得られた処理物に対して遺伝子増幅手法によって、ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ部位を含む検出領域を選択的に増幅させる工程、
を含むＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。 - （２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブが、ＬＮＡ−ＢＮＡ複合体プローブである請求項１記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
- （１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔにハイブリダイゼーションする蛍光プローブが、GenBankアクセッション番号ＡＬ１６１４５０における５５０５２番目のグアニンを先頭とし、３’側に１０〜３０塩基を有する配列に蛍光標識したプローブである請求項１又は２記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
- （１）ＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔの相補鎖にハイブリダイゼーションする蛍光プローブが、GenBankアクセッション番号ＡＬ１６１４５０における５５０７２番目のシトシンを先頭とし、５’側に１２〜３２塩基を有する配列に蛍光標識したプローブである請求項１又は２に記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
- 〔５〕（２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブが、ＪＡＫ２野生型遺伝子の１８４９Ｇを含む９〜２１塩基又はその相補鎖を有する配列の糖鎖構造が変異したＢＮＡプローブである請求項１〜４のいずれかに記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
- （２）ＪＡＫ２野生型遺伝子又はその相補鎖にハイブリダイゼーションするＢＮＡプローブが、CCACAGACACATACT又はその相補鎖を有する配列の糖鎖構造が変異したＢＮＡプローブである請求項１〜５のいずれかに記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
- 工程（Ａ）、次いで工程（Ｂ）のサイクルを１〜２回行う請求項１〜６のいずれかに記載のＪＡＫ２Ｇ１８４９Ｔ変異遺伝子の検出方法。
Priority Applications (1)
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| WO2017082503A1 (ko) * | 2015-11-11 | 2017-05-18 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Bcr/abl 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 다중검출용 펩티드핵산 프로브, 이를 포함하는 유전자변이 다중검출 조성물, 다중검출 키트 및 유전자변이 다중검출방법 |
| CN114350767A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-04-15 | 武汉海希生物科技有限公司 | 检测jak2基因v617f突变的引物和探针及其应用和试剂盒 |
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2013
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|---|---|---|---|---|
| WO2017082503A1 (ko) * | 2015-11-11 | 2017-05-18 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Bcr/abl 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 다중검출용 펩티드핵산 프로브, 이를 포함하는 유전자변이 다중검출 조성물, 다중검출 키트 및 유전자변이 다중검출방법 |
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| KR101953092B1 (ko) * | 2015-11-11 | 2019-06-13 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Ｂｃｒ／ａｂｌ 음성 골수증식종양 관련 유전자변이 다중검출용 펩티드핵산 프로브, 이를 포함하는 유전자변이 다중검출 조성물, 다중검출 키트 및 유전자변이 다중검출방법 |
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