CN109423512B - 一种人细胞色素cyp2c19和abcb1基因多态性位点检测试剂盒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人细胞色素CYP2C19和ABCB1基因多态性位点检测试剂盒及用途,所述检测试剂盒采用依据细胞色素P450CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560和ABCB1:rs4148727,共2个基因的的4个多态性位点的核苷酸序列合成引物及探针,进行实时荧光定量等位基因探针检测,判断待测目标是否属于用药易感人群。使用该方法,可以进行临床用药方案的指导及调整,为临床个性化治疗提供依据,预防药物的不良反应。本方法可同时对2个基因的4个多态性位点同时检测,具有简便、准确、快速、高通量等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地涉及一种人细胞色素P450 CYP2C19和ABCB1基因多态性位点检测试剂盒及用途。
背景技术
缺血性心脏病和缺血性脑卒中是世界卫生组织(WHO)公布的全球死因的首要两位,动脉粥样硬化、斑块破裂、血栓形成是心脑血管事件发生的直接原因,而血栓性疾病已成为人类健康的第一杀手,抗血小板治疗是预防血栓性疾病的主要手段。
斑块破裂和血栓形成是导致急性心血管事件的基本病理改变,抗栓尤其是抗血小板治疗是急性冠脉综合征最重要的干预措施。血小板无细胞核、是产生于骨髓巨核细胞胞浆的碎片。其在循环中的最大生存周期约10d。在正常情况下,血小板在血液循环中处于非激活状态,而当血管内皮损伤或是动脉粥样硬化斑块破裂、内皮下的基质暴露、出现活化因子时,血小板即可被激活并在生理止血过程中起重要作用。
抗血小板药物就是针对血小板激活的各个环节和相关靶点研发而成的,在机制上可作用于血小板激活、黏附、聚集的各个阶段。
目前主要使用的药物有:
环氧化酶(COX)抑制剂:阿司匹林可促进COX-1活性部位第529位丝氨酸乙酰化,不可逆抑制COX-1的活性。COX-1在前列腺素类生物合成的初始步骤中起着关键作用,它可催化花生四烯酸转化为前列腺素H2(PGH2),而PGH2是TXA2的直接前体。阿司匹林抑制COX-1的结果是导致TXA2生成减少,而TXA2是强烈的血小板致聚物,TXA2生成减少终影响到血小板的聚集和释放反应。
ADP受体抑制剂:氯吡格雷。该药物口服后在小肠吸收,受到ABCB1基因编码的质子泵P-糖蛋白调控,吸收后85%-95%被羧化酶水解为非活性的羧酸类代谢产物SR26334,仅10%-15%经肝脏细胞色素P450(CYP450)酶系代谢为活性产物。氯吡格雷活性代谢产物R-130964在经过肝脏循环时通过共价键不可逆地和血小板表面的ADP受体(P2Y12)结合,阻断ADP对腺苷酸环化酶的抑制作用,促进cAMP依赖的VASP磷酸化,抑制纤维蛋白原与血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体结合,进而抑制血小板的聚集。此外,氯吡格雷还能阻断继发的ADP介导的糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物的活化后引起的血小板活化扩增,从而抑制其他激动剂诱导的血小板聚集。
由于氯吡格雷必须经生物转化为活性产物才能抑制血小板的聚集。该生物转化过程需CYP2C19基因编码的细胞色素P450在肝内代谢完成,活性产物能选择性地、不可逆地阻断二磷酸腺苷依赖的血小板聚集。
不同个体对于氯吡格雷具有不同的反应性,约有40%的亚裔病人在治疗后仍显示出残留的血小板聚集,即所谓的“氯吡格雷抵抗”。其主要原因是CYP2C19*2,CYP2C19*3CYP2C19基因突变致使氯吡格雷的活性代谢产物减少导致的。最新临床研究结果证实CYP2C19基因突变所导致的弱代谢个体,其栓塞重新形成的风险增加,心脑血管事件的发生风险增加,病死率升高。对于CYP2C19基因突变的个体,需要增加氯吡格雷的剂量(负荷剂量为300mg或600mg),以达到阻断血小板聚集的效果。
蛋白酶激活受体-1(ABCB1)是细胞表面的一种G蛋白偶联受体,为凝血酶受体。凝血酶是最强的血小板活化剂,通过ABCB1介导细胞反应。人类血小板表达ABCB1受体,ABCB1能与G12/13和Gq家族偶联,并通过分泌ADP而间接激活Gi信号传递途径,引起血小板活化的一系列改变,诱发凝血反应。在血栓形成与止血过程中发挥关键作用。
因此,上述多基因进行SNP检测对于实现抗血小板药物的个性化用药,降低心血管疾病的病死率具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人细胞色素CYP2C19和ABCB1基因多态性位点检测试剂盒及用途。
在本发明的第一方面,提供了ABCB1:rs4148727基因位点和/或其检测试剂的用途,用于制备试剂或试剂盒,所述试剂或试剂盒用于检测被检测对象对抗血小板药物的敏感性。
在另一优选例中,所述试剂或试剂盒用于脑卒中个性化用药指导。
在另一优选例中,所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂:CYP2C19*2:rs4244285基因位点、CYP2C19*3:rs4986893基因位点、和CYP2C19*17:rs12248560基因位点。
在另一优选例中,所述被检测对象包括:人或非人动物(如家畜、家禽、实验动物等)。
在另一优选例中,所述抗血小板药物选自下组:
环氧化酶(COX)抑制剂和ADP受体抑制剂。
在另一优选例中,所述环氧化酶(COX)抑制剂包括:阿司匹林、双氯芬酸、美洛昔康、萘丁美酮等。
在另一优选例中,所述ADP受体抑制剂包括:氯吡格雷、和噻氯吡啶。
在另一优选例中,所述抗血小板药物选自下组:
氯吡格雷和阿司匹林。
在另一优选例中,如果所述被检测对象ABCB1:rs4148727位点基因型为CC时,建议氯吡格雷-阿司匹林联用;和/或
当检测到ABCB1:rs4148727位点出现突变(基因型为CT或TT)时,建议单用阿司匹林。
在另一优选例中,如果所述被检测对象在选自下组的一个或多个基因位点发生如下突变,则说明该对象对所述抗血小板药物不敏感:
CYP2C19*2:rs4244285 G→A;
CYP2C19*3:rs4986893 G→A;
CYP2C19*17:rs12248560 C→T;
ABCB1:rs4148727C→T。
在另一优选例中,所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。
在另一优选例中,所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂:
(a)用于基因检测的特异性引物;
(b)用于基因检测的特异性探针;
(c)用于基因检测的芯片;
(d)用于检测突变的基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体;
其中,所述特异性引物、所述特异性探针、所述芯片针对选自下组的基因位点:CYP2C19*2:rs4244285基因位点、CYP2C19*3:rs4986893基因位点、CYP2C19*17:rs12248560基因位点和ABCB1:rs4148727基因位点。
所述突变的基因含有选自下组的突变的基因位点:CYP2C19*2:rs4244285基因位点、CYP2C19*3:rs4986893基因位点、CYP2C19*17:rs12248560基因位点ABCB1:rs4148727基因位点。
在另一优选例中,所述引物包括:
引物对1,针对CYP2C19*2:rs4244285基因位点:
上游引物5’-3’序列为:AGATATGCAATAATTTTCCCACTATC(Seq ID No.1),
下游引物5’-3’序列为:ATAAAGTCCCGAGGGTTGTTGATG(Seq ID No.2);
引物对2,针对CYP2C19*3:rs4986893基因位点:
上游引物5’-3’序列为:GATGGAAAAATTGAATGAAAACATCA(Seq ID No.3),
下游引物5’-3’序列为:CTGGGAAATCCAAAATTCTATATTG(Seq ID No.4);
引物对3,针对CYP2C19*17:rs12248560基因位点:
上游引物5’-3’序列为:TCTTCTGATGCCCATCGTGGCGCATT(Seq ID No.5),
下游引物5’-3’序列为:TAGTTATTCTGAATATATACCACATT(Seq ID No.6)。
引物对4,针对ABCB1:rs4148727基因位点
上游引物5’-3’序列为:TTCAACTGCTCATTAAGACGTCCTAC(Seq ID No.7),
下游引物5’-3’序列为:CTTGGGTTTTCACTGATTAGTGC(Seq ID No.8)。
在另一优选例中,所述个引物还包括含引物序列Seq ID No.1-14的延伸引物在另一优选例中,所述试剂或试剂盒用于实时荧光定量PCR检测。
在另一优选例中,所述实时荧光定量PCR中,退火温度为60-67℃之间,PCR扩增片段长度为80-300bp。
在另一优选例中,所述实时荧光定量PCR中,荧光探针退火温度为60-70℃之间。
在另一优选例中,所述探针的双末端进行化学基团的修饰,5’端修饰有荧光激发基团,3端修饰有荧光崒灭基团。
在另一优选例中,所述试剂或试剂盒中还包括选自下组的探针序列:
探针1,针对CYP2C19*2:rs4244285基因位点:
P1:FAM-TATGGGTTCCCCGGGAAATAA-BHQ1(SEQ ID NO.9)
P2:ROX-TATGGGTTCCCTGGGAAATAA-BHQ2(SEQ ID NO.10);
探针2,针对CYP2C19*3:rs4986893基因位点:
P3:VIC-TTACCTGGATTCAGGGGGT-BHQ1(SEQ ID NO.11)
P4:TAMRA-TTACCTGGATCCAGGGGGT-BHQ2(SEQ ID NO.12);
探针3,针对CYP2C19*17 rs12248560基因位点:
P5:FAM-TTCTCAAAGCATCTCTGATGT-BHQ1(SEQ ID NO.13)
P6:ROX-TTCTCAAAGTATCTCTGATGT-BHQ2(SEQ ID NO.14)。
探针4,针对ABCB1:rs4148727基因位点:
P9:FAM-AATTTTTGAGTGCATGACTAT-BHQ1(SEQ ID NO.15)
P10:ROX-AATTTTTGAGTACATGACTAT-BHQ2(SEQ ID NO.16)。
在另一优选例中,所述探针还包含探针序列P1-P14的延伸引物系列。
本发明的第二方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括ABCB1:rs4148727基因位点检测试剂。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂:CYP2C19*2:rs4244285基因位点、CYP2C19*3:rs4986893基因位点、和CYP2C19*17:rs12248560基因位点。
在另一优选例中,所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂:
(a)用于基因检测的特异性引物;
(b)用于基因检测的特异性探针;
(c)用于基因检测的芯片;
(d)用于检测突变的基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体;
其中,所述特异性引物、所述特异性探针、所述芯片针对选自下组的基因位点:CYP2C19*2:rs4244285基因位点、CYP2C19*3:rs4986893基因位点、CYP2C19*17:rs12248560基因位点和ABCB1:rs4148727基因位点。
所述突变的基因含有选自下组的突变的基因位点:
CYP2C19*2:rs4244285基因位点、CYP2C19*3:rs4986893基因位点、CYP2C19*17:rs12248560基因位点和ABCB1:rs4148727基因位点。
在另一优选例中,所述引物包括:
引物对1,针对CYP2C19*2:rs4244285基因位点:
上游引物5’-3’序列为:AGATATGCAATAATTTTCCCACTATC(Seq ID No.1),
下游引物5’-3’序列为:ATAAAGTCCCGAGGGTTGTTGATG(Seq ID No.2);
引物对2,针对CYP2C19*3:rs4986893基因位点:
上游引物5’-3’序列为:GATGGAAAAATTGAATGAAAACATCA(Seq ID No.3),
下游引物5’-3’序列为:CTGGGAAATCCAAAATTCTATATTG(Seq ID No.4);
引物对3,针对CYP2C19*17:rs12248560基因位点:
上游引物5’-3’序列为:TCTTCTGATGCCCATCGTGGCGCATT(Seq ID No.5),
下游引物5’-3’序列为:TAGTTATTCTGAATATATACCACATT(Seq ID No.6)。
引物对4,针对ABCB1:rs4148727基因位点
上游引物5’-3’序列为:TTCAACTGCTCATTAAGACGTCCTAC(Seq ID No.7),
下游引物5’-3’序列为:CTTGGGTTTTCACTGATTAGTGC(Seq ID No.8)。
在另一优选例中,所述个引物还包括含引物序列Seq ID No.1-8的延伸引物。
在另一优选例中,所述试剂盒用于实时荧光定量PCR检测。
在另一优选例中,所述实时荧光定量PCR中,退火温度为60-67℃之间,PCR扩增片段长度为80-300bp。
在另一优选例中,所述实时荧光定量PCR中,荧光探针退火温度为60-70℃之间。
在另一优选例中,所述探针的双末端进行化学基团的修饰,5’端修饰有荧光激发基团,3端修饰有荧光崒灭基团。
在另一优选例中,所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列:
探针1,针对CYP2C19*2:rs4244285基因位点:
P1:FAM-TATGGGTTCCCCGGGAAATAA-BHQ1(SEQ ID NO.9)
P2:ROX-TATGGGTTCCCTGGGAAATAA-BHQ2(SEQ ID NO.10);
探针2,针对CYP2C19*3:rs4986893基因位点:
P3:VIC-TTACCTGGATTCAGGGGGT-BHQ1(SEQ ID NO.11)
P4:TAMRA-TTACCTGGATCCAGGGGGT-BHQ2(SEQ ID NO.12);
探针3,针对CYP2C19*17 rs12248560基因位点:
P5:FAM-TTCTCAAAGCATCTCTGATGT-BHQ1(SEQ ID NO.13)
P6:ROX-TTCTCAAAGTATCTCTGATGT-BHQ2(SEQ ID NO.14)。
探针4,针对ABCB1:rs4148727基因位点:
P7:FAM-AATTTTTGAGTGCATGACTAT-BHQ1(SEQ ID NO.15)
P8:ROX-AATTTTTGAGTACATGACTAT-BHQ2(SEQ ID NO.16)。
在另一优选例中,所述探针还包含探针序列P1-P8的延伸引物系列。
本发明的第三方面,提供了一种体外检测样品是否存在单核苷酸变异的方法,包括步骤:
(a)用特异性引物扩增样品的多核苷酸,得到扩增产物;和
(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸变异:
CYP2C19*2:rs4244285 G→A;
CYP2C19*3:rs4986893 G→A;
CYP2C19*17:rs12248560 C→T;和
ABCB1:rs4148727 C→T。
在另一优选例中,所述的扩增产物的长度为80-2000bp,且含有一个或多个选自下组的单核苷酸变异:
CYP2C19*2:rs4244285 G→A;
CYP2C19*3:rs4986893 G→A;
CYP2C19*17:rs12248560 C→T;和
ABCB1:rs4148727 C→T。
本发明的第四方面,提供了一种检测个体对抗血小板药物的敏感性的方法,它包括步骤:
(i)检测该个体的选自下组的基因位点,并与对应的正常基因位点相比较是否存在基因突变:
CYP2C19*2:rs4244285;
CYP2C19*3:rs4986893;
CYP2C19*17:rs12248560;
ABCB1:rs4148727 C→T。
在另一优选例中,所述的基因突变是选自下组的单核苷酸变异:
CYP2C19*2:rs4244285 G→A;
CYP2C19*3:rs4986893 G→A;
CYP2C19*17:rs12248560 C→T。
ABCB1:rs4148727 C→T。
在另一优选例中,所述的个体是人。
在另一优选例中,如果ABCB1:rs4148727;和/或CYP2C19*2:rs4244285;和/或CYP2C19*3:rs4986893;和/或CYP2C19*17:rs12248560不存在突变,则说明对氯吡格雷敏感。
在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,获得一种与抗血小板药物的敏感性相关的基因多态性位点,实验结果表明,通过检测本发明的基因多态性位点能够对评估个体对抗血小板药物的敏感性。再此基础上,完成了本发明。
本发明涉及利用荧光水解探针(Taqman)法甄别细胞色素P450CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 2个基因的的4个多态性位点的方法。并使用该方法所所形成的试剂盒,判断待测目标是否属于用药易感人群,进而指导和调整临床用药方案,为临床个性化治疗提供依据,预防药物的不良反应。
在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料,本文在此处例举优选的方法和材料。
细胞色素P450
细胞色素P450(cytochromeP450,CYP),为超家族氧化酶酶,广泛分布于各种生命形式,从低等细菌到高等动,植物,是多功能氧化酶的重要组成成分,存在于多组织细胞的微粒体中,在人体内该酶主要存在于肝脏组织内。P450活性决定药物的代谢速率及体内清除,因而又称为药物代谢酶。P450酶系的基因主要有CYP1,CYP2,CYP3三个家族,相应的几种重要酶有:CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5。
P450家族参与代谢的药物占市场上销售药物的80%以上,一旦该酶的功能发生改变,会影响药物的代谢和疗效。在药物的不良反应研究中,大约48%与P450酶基因的多态性密切相关。
P450遗传多态性是引起P450酶缺失,表达量下降或增高,底物特异性改变的主要原因,最终引起药物代谢动力学改变,导致不同个体对同一药物产生不同药物应答。
CYP2C19是第二亚家族中的一个重要成员,CYP2C19基因位于染色体区10q24.2上,都由9个外显子构成,与CYP2C9有92%的序列同源性,由490个氨基酸组成的蛋白主要表达在肝组织,在十二指肠也有表达,是人体重要的药物代谢酶之一。由P450酶负责代谢的药物中,12%是经CYP2C19代谢。
CYP2C19具有很多SNP位点,其遗传多态性在心脑血管药物的代谢过程中发挥重要作用。
目前,在已发现的CYP2C19 25个突变等位基因中,至少有10个造成了酶活性的改变,最常见的是CYP2C19*2和CYP2C19*3和CYP2C19*17(rs12248560)。其中慢代谢型以CYP2C19*2:和CYP2C19*3为主,快代谢型以CYP2C19*17为主。
CYP2C19*2mRNA翻译时蛋白的剪切会导致突变失活,而CYP2C19*3能构成一个终止子,破坏转录蛋白的活性。据统计,CYP2C19*2和CYP2C19*3两个突变位点能解释几乎100%的东亚人和85%的高加索人种的相关弱代谢遗传缺陷。大量证据证实,不同人种在CYP2C19的底物的代谢能力有很大差异;2–5%高加索人是弱代谢者,而13–23%的亚洲人是弱代谢者。这是一由于在亚洲人口中CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因的高频率造成的。
蛋白酶激活受体-1(ABCB1)
ABCB1是细胞表面的一种G蛋白偶联受体,为凝血酶受体。凝血酶是最强的血小板活化剂,通过ABCB1介导细胞反应。人类血小板表达ABCB1受体,ABCB1能与G12/13和Gq家族偶联,并通过分泌ADP而间接激活Gi信号传递途径,引起血小板活化的一系列改变,诱发凝血反应。在血栓形成与止血过程中发挥关键作用。
本发明提出了一种基于一种脑卒中用药与遗传相关性来判断待测目标是否属于用药易感人群的检测方法。依据细胞色素P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 2个基因的的4个多态性位点的核苷酸序列合成引物及探针,对待测样本进行实时荧光定量水解探针PCR,依据所反应生成的荧光值判断PCR扩增产物的基因型。根据荧光的不同判断该样本是否是属于药物敏感人群。
在本发明的一个优选的实施方式中,所使用的引物包括:
CYP2C19*2:rs4244285套引物
上游引物5’-3’序列(Seq ID No.1)为:AGATATGCAATAATTTTCCCACTATC,
下游引物5’-3’序列(Seq ID No.2)为:ATAAAGTCCCGAGGGTTGTTGATG;
CYP2C19*3:rs4986893套引物
上游引物5’-3’序列(Seq ID No.3)为:GATGGAAAAATTGAATGAAAACATCA,
下游引物5’-3’序列(Seq ID No.4)为:CTGGGAAATCCAAAATTCTATATTG;
CYP2C19*17:rs12248560套引物
上游引物5’-3’序列(Seq ID No.5)为:TCTTCTGATGCCCATCGTGGCGCATT,
下游引物5’-3’序列(Seq ID No.6)为:TAGTTATTCTGAATATATACCACATT;
ABCB1:rs4148727套引物
上游引物5’-3’序列(Seq ID No.7)为:TTCAACTGCTCATTAAGACGTCCTAC,
下游引物5’-3’序列(Seq ID No.8)为:CTTGGGTTTTCACTGATTAGTGC。
本发明所述引物还可以是含上述引物序列(Seq ID No.1-Seq ID No.14)的延伸引物系列。
优选地,退火温度为60-67℃之间,PCR扩增片段长度为80-300bp。
优选地,在实时荧光定量PCR中,荧光探针退火温度为60-70℃之间。其中,所述实时荧光定量等位基因特异性PCR中,退火温度为60-67℃之间,PCR扩增片段长度为820-300bp;待测基因组DNA浓度范围为1-20ng之间。
优选地,在实时荧光定量PCR中,所用探针包括
CYP2C19*2:rs4244285探针:
P1:FAM-TATGGGTTCCCCGGGAAATAA-BHQ1(SEQ ID NO.9)
P2:ROX-TATGGGTTCCCTGGGAAATAA-BHQ2(SEQ ID NO.10)
CYP2C19*3:rs4986893探针:
P3:VIC-TTACCTGGATTCAGGGGGT-BHQ1(SEQ ID NO.11)
P4:TAMRA-TTACCTGGATCCAGGGGGT-BHQ2(SEQ ID NO.12)
CYP2C19*17 rs12248560探针:
P5:FAM-TTCTCAAAGCATCTCTGATGT-BHQ1(SEQ ID NO.13)
P6:ROX-TTCTCAAAGTATCTCTGATGT-BHQ2(SEQ ID NO.14)
探针7,针对ABCB1:rs4148727基因位点:
P7:FAM-AATTTTTGAGTGCATGACTAT-BHQ1(SEQ ID NO.15)
P8:ROX-AATTTTTGAGTACATGACTAT-BHQ2(SEQ ID NO.16)。
本发明所述探针包括:双末端进行化学基团的修饰,5‘端的荧光激发基团及3端的荧光淬灭基团。和含探针序列(P1-P14)的延伸引物系列。
本发明中,所述脑卒中可以是由心血管疾病发展形成。
本发明还提供一种基于细胞色素P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 2个基因的的4个多态性位点诊断用试剂。其用于实施本发明所述的检测方法,包括优化的实时荧光定量水解探针多重PCR反应体系;所述引物;含人P450CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;ABCB1:rs4148727基因基因组DNA片段的质粒阳性对照;Taq DNA聚合酶;DMSO等PCR增强剂。
本发明还提供一种试剂盒,其用于实施本发明所述的检测方法,包括上述细胞色素P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 2个基因的的4个多态性位点诊断用试剂。
本发明在甄别细胞色素P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727的4个多态性位点基因型的技术方案的基础上,提供了药物敏感人群诊断试剂,所述实时荧光定量水解探针PCR中,采用本发明所述的4套引物。
本发明甄别P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727的4个多态性位点应用于制备用药敏感人群诊断试剂中,所述诊断试剂是包括本发明的引物、反应缓冲液、含人P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727基因组DNA片段的质粒、Taq DNA聚合酶以及荧光探针的试剂盒。
本发明在脑卒中用药敏感人群基因遗传多态性研究中,建立了一种简便、准确、快速、高通量的用于检测脑卒中用药敏感人群筛查的实时荧光定量探针水解PCR的方法,还可以应用于SNP与其他疾病的相关性研究。
本发明依据人P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 SNP两侧的核酸序列合成相应引物,依据SNP位点设计相应的核苷酸探针,将SNP位点设计在探针的中间,并在探针的核苷酸5‘端进行荧光染料标记,同时在3‘端进行荧光淬灭染料的标记。利用优化的PCR反应程序,通过实时荧光探针水解定量PCR反应,对人血液样本提取的基因组DNA进行扩增,并根据各探针标记的不同波长的荧光读数据来进行基因多态性分析。
本发明中,所采用的实时荧光探针水解定量PCR方法的优化过程包括Taq DNA聚合酶的运用、合理的引物及探针设计和修饰以及多重PCR反应体系的优化。
由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在,本发明运用了热启动的TaqDNA聚合酶,该聚合酶的最大优势是其不同于普通Taq DNA聚合酶,通过化学修饰,当温度低于50℃时,其聚合酶活性完全受抑制,95℃10分钟后其聚合酶活性被释放。因此,其进行DNA合成时极大提高了PCR扩增的特异性,同时降低了引物二聚体的产生。
同时,通过选择更优化的PCR反应条件,如引物浓度范围(0.5-5mM);引物长度范围(20-30bp);探针长度范围(15-21bp);反应时的退火温度(57℃-67℃);扩增片段长度(80-300bp);待测基因组DNA浓度范围(0.5-10ng)等进一步提高了PCR扩增的专一性和扩增效率。
本发明中,运用实时荧光定量PCR技术中的荧光探针水解法(Taqman PCR),依据细胞色素P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 2个基因的4个多态性位点的核苷酸序列合成引物及探针,对待测样本进行实时荧光定量水解探针PCR,依据所反应生成的荧光值判断PCR扩增产物基因的基因多态性。4套引物间的基因组扩增产物的荧光差异与标准参考样品(克隆的含人细胞色素P450CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727基因组DNA片段的质粒)的比较,提高了数据分析结果的可靠性和准确率。
本发明利用探针PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。对反应体系如引物浓度、退火温度、片段扩增长度、模板DNA浓度,反应体系的试剂添加剂等进行一系列优化,从而准确快速检测人基因组中的P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727SNP位点,本发明技术方案的原理和方法亦适用于其它基因的SNP检测。
本发明中提供了4套特异性引物,扩增人P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727基因上的特异序列;运用实时荧光定量PCR的Taqman方法,检测人P450CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 4个SNP位点。本发明首次建立通过实时荧光定量PCR水解探针技术(Taqman技术)同时检测P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 4个多态性分布的方法。本发明的4个SNP组合的检测方案具有操作简便、快速、准确率高、高通量等特点,适合进行大规模P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727基因SNP的分布检测及其与疾病的相关性研究。同时,判断待测目标是否属于用药易感人群,进而指导和调整临床用药方案,为临床个性化治疗提供依据,预防药物的不良反应,实现精准用药。
本发明通过实时荧光定量PCR Taqman方法分析人P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 4个多态性位点。并应用该方法检测其中P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;3个SNP位点组合在中国健康人群以脑卒中药物治疗复发患者中的分布,确定特定3SNP与脑卒中药物治疗复发密切的相关性,从而论证了本发明在临床上的应用性和可行性。
本发明对CYP2C19*2;CYP2C19*3;和CYP2C19*17 3 SNP组合在在中国健康人群以脑卒中药物治疗复发患者中的分布的评估,进一步发现这3个SNP位点可能作为氯吡格雷/阿司匹林治疗卒中患者事件药物抗性的高危因子,可从脑卒中药物治疗复发患者中检测出易感人群,进而实现指导和调整临床用药方案。另外,作为全新的氯吡格雷/阿司匹林抗药性生物标志物组合,可大大提高用药精准度,预防药物的不良反应。综上所述,对于CYP2C19*2;CYP2C19*3;和CYP2C19*17这3个SNP位点组合检测不仅可用于预防药物的不良反应,进而指导和调整临床用药方案,还可为临床个性化治疗提供依据,实现精准用药。
P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727 4个SNP位点组合的检测对于预防药物的不良反应,指导和调整临床用药方案,实现精准用药相关有重要作用与临床意义,因此,本发明不仅为氯吡格雷/阿司匹林治疗提供了实验依据,还为甄别建立了高通量的实时荧光定量PCR Taqman方法,为实现早期精准用药奠定了理论与实验基础。从而大大降低药物的不良反应发病率,不仅对患者个人还对整个社会的经济和医疗水平的发展、提高都有不可估量的重大意义。
本发明的主要优点在于:
建立了一种简便、准确、快速、高通量的用于检测脑卒中用药敏感人群筛查的的方法。
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1实时荧光定量等位基因特异性PCR的建立及其临床评估和应用
一.实时荧光定量等位基因特异性PCR方法的建立
实时荧光定量PCR技术具有实时监测、定量和高通量等特点,而且操作简便、灵敏度高。荧光定量PCR分为探针定量PCR(Taqman法)及荧光染料定量PCR。探针PCR(Taqman法)是指扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。根据反应检测到的相应的荧光从而对产物进行判断。相对于荧光染料,Taqman探针具有序列特异性,只结合到互补区,而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系,因此特异性强灵敏度高,而且条件优化容易;而相对于杂交探针,Taqman探针只要设计一条探针,因此探针设计较便宜方便,而且也能完成基本的定量PCR要求。
Taqman法检测SNP的基本原理是基于特异性的荧光探针只能与相对应的完全互补核酸模板结合,但核酸模板出现非特异核酸序列探针与模板不能结合。所以,应用一对双标记Taqman探针,分别针对双等位SNP的不同基因型,只有完全匹配的探针扩增出各自对应的基因型;用两种不同波长的荧光染料分别标记这两种探针,就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。
本发明采用上述基于经过改良的实时荧光定量PCR Taqman法:在一个反应管中进行双重PCR反应,检测四重荧光。通过同时进行两个反应孔反应可一次完成对CYP2C19*2;CYP2C19*3和CYP2C19*17 3个SNP位点组合的6个荧光通道检测。对1068名阿司匹林治疗组和1081名氯吡格雷/阿司匹林治疗患者进行临床实验,对其作为用药代谢检测组合的可能性作出评估。首先对CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17进行组合:至少携带一个*2or*3变异的称为功能缺失等位基因携带者。至少携带一个*17变异的称为功能获得等位基因携带者。其分布见表1。
表1
CYP2C19功能缺失等等位基因携带者,氯吡格雷-阿司匹林联用与阿司匹林单用相比没有明显获益。而在功能正常等位基因携带者中,氯吡格雷-阿司匹林联用与阿司匹林单用相比减少了卒中复发进50%。
本发明以人全基因组中(GenBank:NCBI Reference Sequence:P450CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727)SNP位点两侧100-200之间的核苷酸序列为基础,设计相应的引物对进行DNA目的片段扩增;同时针对这4个SNP位点设计8条核酸序列特异不同荧光基团标记的Taqman探针,运用实时荧光定量PCRT Taqman的方法检测P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727基因上的8个SNP位点。
本发明依据人P450 CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727基因的SNP(GenBank:NCBI Reference Sequence:rs4244285;rs4986893;rs12248560;和rs4148727)两侧序列合成相应的引物,将SNP位点设计在Taqman探针的中部。通过实时荧光定量PCR Taqman反应,对人血液样本提取的DNA进行扩增,并根据扩增所显示的荧光值进行目的基因的SNP分析。
二.实验方法:
1.获得待测样品:血液中人基因组DNA的抽提,取人血液500μL,用血液DNA抽提试剂盒抽提,测定260nm吸光值以计算DNA浓度,并将其稀释到10ng/uL浓度。
2.根据人基因组中(GenBank:NCBI Reference Sequence:P450CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727)SNP位点两侧100-200之间的核苷酸序列为基础,设计相应的引物对进行DNA目的片段扩增;同时针对这4个SNP位点设计8条核酸序列特异不同荧光基团标记的Taqman探针,运用实时荧光定量PCR Taqman的方法检测P450 CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1基因上的8个SNP位点。
具体设计如下所示(两侧方框为引物;中间下划线标记为探针;括号内为SNP位点):
CYP2C19*2:rs4244285(SEQ ID NO.17)
AGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC(G/A)GGAACCCATAACAAA TTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTAT
CYP2C19*3:rs4986893(SEQ ID NO.18)
GATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTG(A/G)ATCCAGGT AAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTG
CYP2C19*17:rs12248560(SEQ ID NO.19)
AATGTGGTATATATTCAGAATAACTAATGTTTGGAAGTTGTTTTGTTTTGCTAAAACAAAGTTTTAGCAAACGATTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG(C/T)ATCTCTGATGTAAGAGATAATGCGCCACGATGGGCATCAG AAGA
ABCB1:rs41487277(SEQ ID NO.20)
AATCCCTAAGCCATGTAACTCTTCGAGGTTTTGTTTGTTTTTTCAACTGCTCATTAAGACGTCCTACACCTTAGCAAAAAGATCACACATATTCTTCAATGCTTTGGAGCCATAGTCATG(C/T)ACTCAAAATTTATTTTATCT
表2实时荧光定量PCR引物及Taqman探针
本发明构建的引物—探针荧光值与基因SNP型的对应关系,如表3所示。
表3所示为本发明提出的实时荧光定量PCR Taqman的两个孔预测荧光检测结果(表内为荧光的简写)
3.人CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1基因DNA片段的克隆及测序,测序结果与基因库序列比较一致
4.实时荧光定量等位基因特异性PCR的实施:对人基因组DNA(gDNA,10ng/μL),进行实时实时荧光定量PCR Taqman反应。阳性对照为本发明克隆并测序鉴定的含人CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1基因组DNA片段的质粒,阴性对照为水。反应体系及条件如下:
反应条件为95℃,5min;95℃30秒;62℃60秒;40个循环。
5.实时荧光定量等位PCR方法的评估
5.1.在阳性对照质粒上的测试:
以本发明制备的8个分别含CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB14个SNP位点基因组DNA片段的pBluescript II(SK(+)质粒为PCR反应的阳性对照,对实时荧光定量PCR体系进行评估,如引物浓度、探针浓度、Mg离子浓度等进行调整,并进一步对反应条件进行优化,对方法的临床应用可行性进行探讨。
以CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1基因质粒为模板为例,反应条件:95℃10分钟,95℃15秒,64℃60秒;40个循环。根据扩增后所获得的荧光值进行SNP分析。
本实施例中,采用4套引物和8条探针进行荧光定量PCR扩增反应。
5.2.在人基因组DNA样本上的测试,获得基因组DNA样本上的结果。
6.实时荧光定量PCR Taqman方法的优化
6.1由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在,本发明运用了化学修饰热启动DNA聚合酶,由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在,本发明运用了热启动的Taq DNA聚合酶,该聚合酶的最大优势是其不同于普通Taq DNA聚合酶,通过化学修饰,当温度低于50℃时,其聚合酶活性完全受抑制,95℃10分钟后其聚合酶活性被释放。因此,其进行DNA合成时极大提高了PCR扩增的特异性,同时降低了引物二聚体的产生。
6.2同时,通过选择更优化的PCR反应条件,如引物浓度范围(0.5-5mM);引物长度范围(20-30bp);探针长度范围(15-21bp);反应时的退火温度(57℃-67℃);扩增片段长度(80-300bp);待测基因组DNA浓度范围(0.5-10ng)等进一步提高了PCR扩增的专一性和扩增效率。
二.临床评估及临床应用:
采用本发明建立的CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17和ABCB1基因的的4个多态性位点的检测方法。对阿司匹林治疗人群和氯吡格雷/阿司匹林治疗人群进行筛查,可以判断待测目标是否属于用药易感人群,进行临床用药方案的指导及调整,为临床个性化治疗提供依据,预防药物的不良反应。
各SNP型在人群中的分布,如表3所示,由此可见,该4个SNP位点与氯吡格雷/阿司匹林抗药性存在高度相关性,对该SNP组合的检测可以判断待测目标是否属于用药易感人群,进行临床用药方案的指导及调整,为临床个性化治疗提供依据,预防药物的不良反应
表4 4SNP组合在阿司匹林治疗人群和氯吡格雷/阿司匹林治疗人群中的筛查结果
缩写:NE,未检测.
上表中,发生率为用药后卒中复发率,在氯吡格雷/阿司匹林联用组中,ABCB1变异携带者(CT,或TT)的卒中复发率与野生型患者相比无显著差别,因此ABCB1变异携带者中(CT,或TT)不推荐使用氯吡格雷。而,ABCB1基因野生型患者(CC)中,单用阿司匹林的发生率(12.9%)要显著高于氯吡格雷-阿司匹林联用的发生率(7.8%)。ABCB1基因野生型患者中,单用阿司匹林组的卒中复发率高出氯吡格雷-阿司匹林联用组约65%,因而建议氯吡格雷-阿司匹林联用。同样的,CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17未突变患者中,单用阿司匹林的发生率要显著高于氯吡格雷-阿司匹林联用的发生率,因而建议氯吡格雷-阿司匹林联用。
实施例2:用测序法检测CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17和ABCB1基因基因型
目前基因多态性的位点的金标准是测序法,本实施例采用测序法对CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17和ABCB1基因在健康人群中的分布进行研究。通过与实时荧光定量PCR Taqman所获得的结果进行比对来评估本发明的方法的可靠性和准确性。
测序法是指通过常规PCR技术将待测样本的目的基因片段扩增,通过传统的双脱氧法进行序列测定,并与原始序列比对,从而对多态性位点进行分析,是目前最普遍使用的用于SNP研究的方法。利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种分子水平上的差异,可用于基因型分型和生物多样性的研究。
本实施例以CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17和ABCB1基因在健康人群中的筛查分布为例,采用测序手段检测在健康人群中的基因型分布情况。
本实施例测序检测方法,对CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17和ABCB1基因SNP在健康人群中的分布进行研究。通过与其他人种的比较,解析中国人群中该组SNP位点在氯吡格雷/阿司匹林用药敏感性的差异。同时与上述Taqman法进行比对,证明了两种方法检测结果的一致性
依据人CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17和ABCB1基因多态性位点两侧核苷酸序列分别合成4套相应的引物,每套引物均针对专一的一个多态性位点,该多态性位点位于PCR扩增产物中间,从而便于测序和分析
优选地上述的PCR反应程序包括:
(a)由于PCR扩增中的非特异性扩增和引物二聚体的存在,本发明运用了pfu DAN聚合酶,该酶具有5’端-3’端的DNA合成酶活性和3’-5’端的DNA外切酶活性,因此既能进行DNA合成又可以即时识别并切除错配核苷酸,极大提高了PCR扩增的特异性,同时降低了引物二聚体的产生。
(b)通过对引物3’端末端进行硫代磷酸化修饰,防止引物末端被pfu DAN聚合酶3’-5’外切酶活性进行降解,从而进一步提高扩增的专一性。
(c)通过对引物浓度范围(0.5-5mM)、引物长度范围(20-30bp)、反应时的退火温度(60℃-67℃)、扩增片段长度(200-400bp)、待测基因组DNA浓度范围(5-15ng)、反应体系等更精准的优化及选定,进一步提高了PCR的扩增效率和扩增专一性。
本实施例利用PCR反应中引物在3’端末端存在错配时不能延伸的特点,将等位基因SNP位点设计在荧光定量PCR引物的3’端的末端,并对其进行合适的修饰,加上pfu DNA聚合酶的应用等手段,另外还对PCR的反应条件如引物浓度、退火温度、片段扩增长度、模板DNA浓度等一系列条件进行优化,通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测,根据有无扩增产物及BanI酶切片段长短而获得可靠、准确的结果。本发明不仅可准确检测人基因组中的CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17和ABCB1基因,同时还适用于其它基因突变及SNP检测。
一.实验方法:
1.获得待测样品:血液中人基因组DNA的抽提,取人血液500μL,用血液DNA抽提试剂盒抽提,测定260nm吸光值以计算DNA浓度,并将其稀释到10ng/μL浓度。
2.引物的设计:参照人基因组中(GenBank:NCBI Reference Sequence:CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;CYP2C19*17:rs12248560和ABCB1:rs4148727)SNP位点两侧200-300bp之间的核苷酸序列为基础,设计相应的引物对进行DNA目的片段扩增;见表3:
表5测序分析引物的设计
3.同时对每条引物3’端的末端进行硫代磷酸化修饰。
4.人CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1基因组DNA片段的克隆及测序:
4.1.引物设计:参照人基因组中(GenBank:NCBI Reference Sequence:CYP2C19*2:rs4244285;CYP2C19*3:rs4986893;和CYP2C19*17:rs12248560;和ABCB1:rs4148727)SNP位点两侧100-200之间的核苷酸序列为基础,设计相应的引物对进行DNA目的片段扩增;
引物序列见表5:
获得的序列分别为以下:
CYP2C19*2:rs4244285:(SEQ ID NO.17)
AGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC(G/A)GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTAT
CYP2C19*3:rs4986893:(SEQ ID NO.18)
GATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTG(A/G)ATCCAGGTAAGGCCA AGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTG
CYP2C19*17 rs12248560:(SEQ ID NO.19)
AATGTGGTATATATTCAGAATAACTAATGTTTGGAAGTTGTTTTGTTTTGCTAAAACAAAGTTTTAGCAAACGATTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG(C/T)ATCTCTGATGTAAGAGATAATGCGCCACGATGGGCATCAGAAGA
ABCB1:rs41487277(SEQ ID NO.20)
AATCCCTAAGCCATGTAACTCTTCGAGGTTTTGTTTGTTTTTTCAACTGCTCATTAAGACGTCCTACACCTTAGCAAAAAGATCACACATATTCTTCAATGCTTTGGAGCCATAGTCATG(C/T)ACTCAAAATTTATTTTATCT
4.2.PCR扩增反应:采用以下PCR反应体系。
在一个200μL微量PCR反应管内加入以下试剂:
加入去离子灭菌水至终体积50uL。
PCR反应条件为94℃5分钟,94℃30秒,54℃1分钟,72℃1分钟,40个循环,然后72℃延伸10分钟。
4.3.PCR产物克隆:扩增出的PCR片段,经PCR产物回收试剂盒回收,然后用T4 DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)补平末端,再经琼脂糖凝胶电泳,将目标片段用胶回收试剂盒回收纯化,然后插入到pBluesecript II SK(+)载体上的EcoRV位点中,方法见文献(Sambrooks,分子克隆手册),将连接产物转化到DH5菌株中,用PCR方法筛选阳性克隆。
4.4.将阳性克隆进行DNA序列测定,其测序结果与基因库序列比较一致。
5.阳性对照的建立:
以含CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1基因组DNA片段的质粒.
二.结果分析:
1.CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17和ABCB1在中国汉族人群中的分布
本发明检测CYP2C19*2;CYP2C19*3;和CYP2C19*17和ABCB1SNP组合在中国人群中的分别如表6
表6
从两种方法在人群的分布百分比的比较上看(见表4),本发明提出的的检测方法与测序检测方法两者结果呈现高度的一致性。因此本发明提出的的实时荧光定量PCRTaqman方法检测具有较高的可靠性和准确性,从而可用于甄别待测目标是否属于用药易感人群,进行临床用药方案的指导及调整,为临床个性化治疗提供依据。
实施例3
本实施例提供了一种人细胞色素P450 CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727基因组单核苷酸多态性(SNP)实时荧光定量PCR Taqman检测试剂盒。
本试剂盒可对人基因组中的CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727位点进行鉴定检测,适用于该组合SNP分析的分型。试剂盒采用荧光探针水解法(Taqman法)的原理,包括最适于实时荧光定量PCR反应的引物浓度,探针浓度,并且采用了热启动Taq DNA聚合酶及与多重实时荧光定量反应最匹配的缓冲液和引物组合,可以有效地抑制非特异性的PCR扩增,达到高灵敏、高通量实时荧光定量PCR扩增反应的目的。进行实验时,PCR反应液的配制十分方便简单。可对人基因组CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727进行准确分析。
表7试剂盒的组成包括:
反应液试剂A:含热启动Taq DNA polymerase的2×PCR Master
反应液试剂B:CYP2C19*2;CYP2C19*3两套引物及相应的4条SNP探针
反应液试剂D:CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727两套引物及相应的4条SNP探针
工作标准品1:含人CYP2C19*2;CYP2C19*3SNP位点的4个DNA克隆
工作标准品2:含人CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727 SNP位点的4个DNA克隆
本实施例利用本试剂盒对人基因组CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727 SNP进行鉴定检测,所适用的Real Time PCR扩增仪包括:
Applied Biosystems 7900HT/7300/7500Real-Time PCR System、7500 FastReal-Time PCR System、StepOnePlusTM Real-Time PCR System(Applied Biosystems)
Mx3000PTM(Stratagene)
本试剂盒运输可在2~8℃环境下进行。储存时,须置-20℃保存。
有效期:本试剂盒有效期为12个月,在有效期内使用。
本试剂盒使用了热启动Taq DNA聚合酶进行PCR扩增,通过监测反应液中特异性荧光达到检测PCR产物的目的。以人基因组DNA中的CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727基因进行PCR扩增为目的,通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下的引物延伸三个步骤循环往复,可在短时间内扩增对人基因组CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727基因组DNA片段。
试剂盒中的DNA聚合酶由于使用了热启动Taq DNA聚合酶,从而抑制引物退火时产生的引物二聚体及其引起的非特异性扩增,大大提高PCR扩增的准确率。
利用本试剂盒采用荧光探针检测法对人基因组中的对人基因组CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727 SNP进行鉴定检测,通过检测PCR反应液中的荧光信号强度,可以对SNP进行准确检测。
本试剂盒适用于Real-time PCR反应,可以快速、准确地对人基因组CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727 SNP进行检测、分析。
反应液中预先混有引物,PCR反应液配制时,只需加入DNA模板、无菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应,操作简单方便。
DNA聚合酶使用了热启动DNA聚合酶,与公司独自开发的多重PCR缓冲液系统相结合,具有高扩增效率,高扩增灵敏度,高扩增特异性的特点。
利用本试剂盒包括以下步骤:
1、将抽提的人基因组DNA用核酸稀释缓冲液稀释到0.5-15ng/μL。
2、各取2μL稀释的样品DNA,分别加入2个PCR反应孔中。
3、取试剂盒中的反应管B和C各8μL,分别加入2个反应孔中。
4、取反应管A中的10μL试剂分别加入反应孔中。
7、依照上述同样方法分别处理阴性对照;工作标准品1;工作标准品2;
8、将以上制备好的反应液混匀,然后在5000rpm转速下离心3分钟。
9、将反应管放入实时荧光PCR扩增仪进行扩增反应。
10、循环参数设定:95℃10min;95℃20秒;62℃60秒;40个循环。
采用该试剂盒对正常中国汉族人群健康者的CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727 SNP进行了检测比较(表6),检测结果如以上实施例所述。由此可见,本发明试剂盒不仅可用于正常人群中的CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17;和ABCB1:rs4148727 SNP分布与疾病相关性的研究,而且可用于从而可用于甄别待测目标是否属于用药易感人群,进行临床用药方案的指导及调整,为临床个性化治疗提供依据。
使用本实施例中的试剂盒,对于随机选取的500个患者的样本进行SNP检测。然后基于以下原则进行用药指导:
(a)当检测到ABCB1:rs4148727位点基因型为CC时,建议氯吡格雷-阿司匹林联用;
(b)当检测到ABCB1:rs4148727位点出现突变(基因型为CT或TT)时,建议单用阿司匹林;
(c)当检测到CYP2C19*2:rs4244285出现单突变(基因型为GA)或双突变(基因型为AA)时,不建议使用氯吡格雷;
(d)当检测到CYP2C19*3:rs4986893出现单突变(基因型为GA)或双突变(基因型为AA)时,不建议使用氯吡格雷;
(e)当检测到CYP2C19*17:rs12248560出现单突变(基因型为CT)或双突变(基因型为TT)时,慎用氯吡格雷。
部分典型患者的情况如下表所示。
表8
注:“――”表示该位点不存在突变(即野生型);“-+”表示该位点存在单突变(杂合);“++”表示该位点存在双突变(纯合)。
例如,对于ABCB1:rs4148727而言,“――”表示CC;“-+”表示CT;“++”TT。CYP2C19*2;CYP2C19*3;CYP2C19*17的表示以此类推。
对3-1号患者(类似患者共12例),按常规阿司匹林给药,治疗效果明显。
对3-2号患者(类似患者共31例)按常规阿司匹林给药,治疗效果明显。
对3-3号患者(类似患者共46例),氯吡格雷-阿司匹林联用,治疗效果明显。
对3-4号患者(类似患者共13例),氯吡格雷-阿司匹林联用,治疗效果明显。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京天坛医院
<120> 一种人细胞色素CYP2C19和ABCB1基因多态性位点检测试剂盒及用途
<130> P2017-0173
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agatatgcaa taattttccc actatc 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ataaagtccc gagggttgtt gatg 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatggaaaaa ttgaatgaaa acatca 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgggaaatc caaaattcta tattg 25
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcttctgatg cccatcgtgg cgcatt 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tagttattct gaatatatac cacatt 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttcaactgct cattaagacg tcctac 26
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cttgggtttt cactgattag tgc 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tatgggttcc ccgggaaata a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tatgggttcc ctgggaaata a 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttacctggat tcagggggt 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttacctggat ccagggggt 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttctcaaagc atctctgatg t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttctcaaagt atctctgatg t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aatttttgag tgcatgacta t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aatttttgag tacatgacta t 21
<210> 17
<211> 151
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n=g或a
<400> 17
agatatgcaa taattttccc actatcattg attatttccc nggaacccat aacaaattac 60
ttaaaaacct tgcttttatg gaaagtgata ttttggagaa agtaaaagaa caccaagaat 120
cgatggacat caacaaccct cgggacttta t 151
<210> 18
<211> 126
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(46)
<223> n=a或g
<400> 18
gatggaaaaa ttgaatgaaa acatcaggat tgtaagcacc ccctgnatcc aggtaaggcc 60
aagttttttg cttcctgaga aaccacttac agtctttttt tctgggaaat ccaaaattct 120
atattg 126
<210> 19
<211> 155
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<222> (111)..(111)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 19
aatgtggtat atattcagaa taactaatgt ttggaagttg ttttgttttg ctaaaacaaa 60
gttttagcaa acgatttttt ttttcaaatt tgtgtcttct gttctcaaag natctctgat 120
gtaagagata atgcgccacg atgggcatca gaaga 155
<210> 20
<211> 141
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<222> (121)..(121)
<223> n=c或t
<400> 20
aatccctaag ccatgtaact cttcgaggtt ttgtttgttt tttcaactgc tcattaagac 60
gtcctacacc ttagcaaaaa gatcacacat attcttcaat gctttggagc catagtcatg 120
nactcaaaat ttattttatc t 141
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ataagtggtt ctatttaatg tg 22
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ccactttcat cctgggctgt gctccctg 28
Claims (6)
1.ABCB1: rs4148727基因位点和/或其检测试剂的用途,其特征在于,用于制备试剂或试剂盒,所述试剂或试剂盒用于检测被检测对象对抗血小板药物的敏感性,所述抗血小板药物选自下组:阿司匹林、氯雷他定、或其组合。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂:CYP2C19*2: rs4244285基因位点、CYP2C19*3: rs4986893基因位点、和CYP2C19*17: rs12248560基因位点。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,如果所述被检测对象ABCB1: rs4148727位点基因型为CC时,建议氯吡格雷-阿司匹林联用;和/或
当检测到ABCB1: rs4148727位点出现突变,即基因型为CT或TT时,建议单用阿司匹林。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,如果所述被检测对象在选自下组的一个或多个基因位点发生如下突变,则说明该对象对所述抗血小板药物不敏感:
CYP2C19*2: rs4244285 G→A;
CYP2C19*3: rs4986893 G→A;
CYP2C19*17: rs12248560 C→T;
ABCB1: rs4148727 C→T。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。
6.一种用于检测被检测对象对抗血小板药物的敏感性的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括ABCB1: rs4148727基因位点检测试剂,以及选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂: CYP2C19*2: rs4244285基因位点、CYP2C19*3: rs4986893基因位点、和CYP2C19*17: rs12248560基因位点,所述抗血小板药物选自下组:阿司匹林、氯雷他定、或其组合,
其中,所述的检测试剂为:
(a) 用于基因检测的特异性引物;和/或
(b) 用于基因检测的特异性探针;
其中,所述特异性引物包括选自下组的一种或多种:
引物对1,针对CYP2C19*2: rs4244285基因位点:
上游引物5’-3’序列为:AGATATGCAATAATTTTCCCACTATC(Seq ID No.1),
下游引物5’-3’序列为:ATAAAGTCCCGAGGGTTGTTGATG(Seq ID No.2);
引物对2,针对CYP2C19*3: rs4986893基因位点:
上游引物5’-3’序列为:GATGGAAAAATTGAATGAAAACATCA(Seq ID No.3),
下游引物5’-3’序列为:CTGGGAAATCCAAAATTCTATATTG(Seq ID No.4);
引物对3,针对CYP2C19*17: rs12248560基因位点:
上游引物5’-3’序列为:TCTTCTGATGCCCATCGTGGCGCATT(Seq ID No.5),
下游引物5’-3’序列为:TAGTTATTCTGAATATATACCACATT(Seq ID No.6);和
引物对4,针对ABCB1: rs4148727基因位点
上游引物5’-3’序列为:TTCAACTGCTCATTAAGACGTCCTAC(Seq ID No.7),
下游引物5’-3’序列为:CTTGGGTTTTCACTGATTAGTGC(Seq ID No.8);
和/或所述特异性探针包括选自下组的一种或多种:
探针1,针对CYP2C19*2: rs4244285基因位点:
P1:FAM- TATGGGTTCCCCGGGAAATAA-BHQ1 (SEQ ID NO.9)
P2: ROX- TATGGGTTCCCTGGGAAATAA-BHQ2(SEQ ID NO.10);
探针2,针对CYP2C19*3: rs4986893基因位点:
P3:VIC- TTACCTGGATTCAGGGGGT-BHQ1(SEQ ID NO.11)
P4:TAMRA- TTACCTGGATCCAGGGGGT-BHQ2(SEQ ID NO.12);
探针3,针对CYP2C19 *17 rs12248560基因位点:
P5:FAM-TTCTCAAAGCATCTCTGATGT-BHQ1(SEQ ID NO.13)
P6:ROX- TTCTCAAAGTATCTCTGATGT-BHQ2(SEQ ID NO.14);
探针4,针对ABCB1: rs4148727基因位点:
P7:FAM-AATTTTTGAGTGCATGACTAT -BHQ1(SEQ ID NO.15)
P8:ROX- AATTTTTGAGTACATGACTAT -BHQ2(SEQ ID NO.16)。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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