CN107446921B - Thsd7a基因序列及表达改变检测及其在冠心病预测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，一方面涉及冠心病易感基因THSD7A的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，以及用于检测所述SNP位点的相应的组合物及试剂盒，尤其涉及所述SNP位点的核酸亲和配体在制备用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的组合物中的应用。另一方面涉及检测THSD7A基因的相应组合物及试剂盒，还涉及该THSD7A基因的核酸亲和配体在制备用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的组合物中的应用。本发明为研发针对性的冠心病基因治疗提供了新的进一步的科学依据，为发现新的冠心病分子机制、发展新的药物靶点以及冠心病的个性化治疗提供了新线索。

Description

THSD7A基因序列及表达改变检测及其在冠心病预测中的应用

本申请是申请日为2015年1月21日、申请号为201510029413.7、发明名称为“THSD7A基因序列及表达改变检测及其在冠心病预测中的应用”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及与冠心病易感性相关的THSD7A基因上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，以及用于检测所述SNP位点的相应的组合物及试剂盒，尤其涉及所述SNP位点的核酸亲和配体在制备用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的组合物中的应用。

背景技术

冠心病，又称冠状动脉性心脏病，是由冠状动脉血管壁粥样硬化引起的以冠状动脉狭窄甚至闭塞为形态学改变的缺血性心脏病。冠心病危害极大，根据世界卫生组织的数据，在世界范围内，以冠心病为主的缺血性心脏病是威胁人类健康的头号杀手。数据显示：在2008年，全球大约有多于730万人死于冠心病(WHO，2011)。虽然从死亡率上看中国目前并不是冠心病的重灾区，但是，由于人口基础大，我国的冠心病受累人数是十分惊人的。估计中国每年超过100万人死于冠心病。另外，随着我国经济水平的发展和人民生活水平的提高，发明人国家的冠心病发病率还在逐年升高。

临床和流行病学研究证明，冠心病是常见的复杂多基因疾病，引起疾病的原因包括遗传因素、环境因素以及两者的交互作用。冠心病有家族聚集性，研究表明，冠心病的遗传度约为40％到60％。因此，冠心病易感基因和易感位点的鉴定将为发现新的冠心病分子机制、发展新的药物靶点以及冠心病的早期基因诊断和个性化治疗提供新线索。遗传学上，寻找多基因疾病的易感基因多利用关联分析。遗传关联分析分为两个策略：候选基因关联分析和全基因组关联分析(genome wide association study，GWAS)。得益于人类基因组计划和HapMap 计划对人类遗传图谱的揭示，从全基因组水平寻找与疾病相关的变异成为可能。在过去的六年里，全基因组关联分析发展成为研究复杂多基因疾病遗传基础的重要方法之一，已有超过50个冠心病相关位点通过该方法被发现，其中绝大部分位点是在白种人的研究中发现。然而，由于遗传的异质性，这些结果并不能为黄种人，尤其是发明人中国汉族人群所用。另一方面，已发现的位点中仅有6个是基于中国汉族人群的研究所发现，这远不足以解释中国汉族人群的冠心病遗传基础。此外，已有的研究多仅关注了相关位点，而对于鉴定相关位点所指代的易感基因缺乏有效的方法。

鉴于已知用来解释中国汉族人群的冠心病遗传基础的基因及位点的数量较少，为了提高汉族人群冠心病易感性检测、筛查或预测的准确度，从而更容易、更直接、更灵敏且更特异性地检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性，有必要寻找新的与冠心病易感性相关的易感基因和SNP位点。

发明内容

本发明发现了一种新的能够解释中国汉族人群的冠心病遗传基础的与冠心病易感性相关的THSD7A基因，同时确证了THSD7A基因上与冠心病易感性密切相关的SNP位点rs17165136以及与17165136连锁的SNP位点。本发明具体技术方案如下：

第一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其代表THSD7A基因上的单核苷酸多态性(SNP)位点rs17165136，DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其中单核苷酸n为A的携带者患冠心病的风险高于等位基因G。

第二方面，本发明提供了分离的核酸分子，其代表THSD7A基因上与SNP位点rs17165136连锁的SNP位点，所述连锁的SNP位点选自以下任一项：

(1)rs6957230，其DNA序列如SEQ ID NO:2所示，其中单核苷酸n为C的携带者患冠心病的风险高于等位基因T；

(2)rs17165141，其DNA序列如SEQ ID NO:3所示，其中单核苷酸n为T的携带者患冠心病的风险高于等位基因C；

(3)rs17165148，其DNA序列如SEQ ID NO:4所示，其中单核苷酸n为T的携带者患冠心病的风险高于等位基因C；

(4)rs16877182，其DNA序列如SEQ ID NO:5所示，单核苷酸n为C的 携带者患冠心病的风险高于等位基因T；

(5)rs10499406，其DNA序列如SEQ ID NO:6所示，其中单核苷酸n为T的携带者患冠心病的风险高于等位基因C；

(6)rs16877184，其DNA序列如SEQ ID NO:7所示，其中单核苷酸n为A的携带者患冠心病的风险高于等位基因G；

(7)rs7341453，其DNA序列如SEQ ID NO:8所示，其中单核苷酸n为G的携带者患冠心病的风险高于等位基因A；

(8)rs10499401，其DNA序列如SEQ ID NO:9所示，其中单核苷酸n为T的携带者患冠心病的风险高于等位基因C。

序列SEQ ID NO:1-9构成新的与冠心病易感性相关的单核苷酸多态性(SNP)。它们允许灵敏、特异性、有效和简单的对冠心病易感性的检测、筛查或预测方法，例如通过采用广为流传且易于使用的技术如PCR或核酸杂交，其具有高适用性和利用率，特别是在世界的欠发达地区。由于上述SNP是在中国汉族人群中鉴定的，因此认为新的SNP可特别适用于中国汉族人群冠心病易感性检测、筛查或预测。

第三方面，本发明提供了上述分离的核酸分子的任意组合。

在本发明的优选实施方案中，所述组合至少包含SEQ ID NO:1，以及任选的SEQ IDNO:2-9的一或多个序列。在本发明的另一优选的实施方案中，任何上文提到的分离的核酸分子的组合还可以与额外的SNP组合，优选冠心病易感性的其他合适的SNP组合。

在本发明的实施方案中，任意单一SNP可以用作冠心病易感性的生物标志物，优选任何可能的两个或更多个本发明的SNP的组合，尤其优选rs17165136和其他一或多个SNP的组合。

第四方面，本发明提供了用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的组合物，所述组合物包含如上文定义的一个或多个SNP位点的核酸亲和配体。

在本发明的优选实施方案中，上文提到的核酸亲和配体可以是特异于上文定义的一个或多个SNP位点的寡核苷酸，或者是特异于上文定义的一个或多个SNP位点的探针。在本发明的另一优选的实施方案中，上文提到的亲和配体可以是具有与如上文定义的SNP位点的核苷酸互补的序列的寡核苷酸。

第五方面，本发明提供了用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的 试剂盒，其包含特异于上文定义的一个或多个SNP位点的寡核苷酸，或者特异于上文定义的一个或多个SNP位点的探针。在本发明的另一优选的实施方案中，所述寡核苷酸具有与如上文定义的SNP位点的核苷酸互补的序列。

第六方面，本发明提供了包含如上文定义的一个或多个SNP位点的核酸亲和配体在制备用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的组合物中的应用。

第七方面，本发明提供了一种检测、筛查或预测对象的冠心病易感性的方法，包括以下步骤：

(1)从对象样品分离核酸；

(2)确定在如上文定义的一个或多个SNP位点处存在的核苷酸序列，其中如上文定义的危险等位基因的存在指示有更大的可能性患冠心病。

第八方面，本发明提供了用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的组合物，所述组合物包含特异于THSD7A基因的核酸亲和配体。

第九方面，本发明提供了用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的试剂盒，其包含特异于THSD7A基因的核酸亲和配体，以及任选地辅助成分，所述辅助成分包括：PCR缓冲液、dNTP、聚合酶、离子如二价阳离子或一价阳离子、杂交溶液。

第十方面，本发明提供了THSD7A基因的核酸亲和配体在制备用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的组合物中的应用。

本发明带来的有益效果是：

本发明发现了与冠心病易感性关联的位于THSD7A基因内含子区上的SNP位点rs17165136、位于rs17165136上下游的与rs17165136连锁的一系列SNP位点，通过检测汉族人群待测样品基因组的上述各位点的单核苷酸多态性可以对未出现冠心病早期临床症状的人群，尤其是具有传统危险因素的冠心病高危人群进行无创快速简便的筛查，早期发现冠心病易感对象，并采取相应的保健措施，降低冠心病与心肌梗死的发病率。本发明为研发针对性的冠心病基因治疗提供了新的进一步的科学依据，为发现新的冠心病分子机制、发展新的药物靶点以及冠心病的个性化治疗提供了新线索。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为冠心病样品进行昂飞人类全基因组(Affymetrix Genome-wide Human)SNP5.0芯片实验片段化后电泳图；

图2为全基因组关联分析曼哈顿图；

图3为rs17165136上下游共500kb区域的关联分析结果示意图；

图4为THSD7A基因细胞表达谱分析示意图；

图5为THSD7A基因表达水平与rs17165136位点分型相关分析结果示意图；

图6a为敲低THSD7A后，细胞间黏附分子(ICAM)的基因表达示意图；

图6b为敲低THSD7A后，L-选择素的基因表达示意图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而不是为了限制本发明的范围。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。

在详细描述本发明的示例性实施方案之前，对理解本发明很重要的术语给出定义。

如本文所用，术语“分离的核酸分子”指核酸实体，例如DNA、RNA等，其中所述实体基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白、脂质、糖或其他物质，如细胞碎片或生长培养基。一般来说，术语“分离”并不意味着完全不存在这类物质，或者不存在水、缓冲液或盐，除非它们以实质上干扰本发明的方法的量存在。

上文提到的SEQ ID NO:1-9各自包含一段51个核苷酸，并且表示上述SNP位点的等位基因序列及其上游和下游的25个核苷酸背景序列。

本文提到的SEQ ID NO:1定义SNP位点rs17165136的序列，其位于6号 染色体THSD7A基因的内含子区上，其中单核苷酸n为A的携带者患冠心病的风险高于等位基因G。

本文提到的SEQ ID NO:2-9定义为是与冠心病易感性关联的位于SNP位点rs17165136上下游共500kb区域中的与rs17165136连锁的一系列SNP位点。

在本发明的具体实施方案中，核酸分子不限于SEQ ID NO:1-9的序列，其可以包含SEQ ID NO:1-9的序列、基本上由SEQ ID NO:1-9的序列组成、或者由SEQ ID NO:1-9的序列组成。例如，如本文所定义，所述序列可以包含SEQ ID NO:1-9的3'和/或5'背景中的相邻区域，例如从其所在的基因组位置开始3'和/或5'方向的一段额外的约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、10000或更多个核苷酸。

在本发明的其他实施方案中，核酸分子可以包含SEQ ID NO:1-9的片段，基本上由SEQ ID NO:1-9的片段组成，或者由SEQ ID NO:1-9的片段组成，所述SEQ ID NO:1-9的片段至少必须包含位于SEQ ID NO:1-9的位置26处的多态位点。例如，本发明涉及约50、40、30、20或10个或更少个核苷酸长度或者其间的任何值的序列，其必须至少包含位于SEQ ID NO:1-9的位置26处的多态位点。所述片段可以朝向5'或3'方向或者双向5'和3'方向延伸所示长度。优选长度为50个核苷酸及更少的片段，多态位点位于序列的中心。

本领域技术人员能够根据上文的rs-命名，从适合的数据库和相关的信息系统如单核苷酸多态性数据库(dbSNP)(其援引加入本文)中确定其确切的位置、核苷酸序列。

在本发明的其他实施方案中，涉及一个或多个，例如一组上文提到的多态的改变的序列，构成冠心病易感性的生物标志物。如本文所用，术语“冠心病易感性的生物标志物”指所提到的SNP与冠心病易感性之间具有关联性。

在其他优选实施方案中，一或多个或全部上述SNP序列可以构成生物标志物。优选地，单一SNP可以用作如上文定义的冠心病易感性的生物标志物。还优选任何可能的两个或更多个本发明的SNP的组合。尤其优选rs17165136和其他一或多个SNP的组合。

在另一优选实施方案中，本发明涉及分离的核酸的组合，其中所述组合至少包含SEQ ID NO:1，以及任选的SEQ ID NO:2-9的一或多个序列。

在本发明的具体实施方案中，任何上文提到的SNP的组合或组合还可以与 额外的SNP组合，优选本领域技术人员已知的冠心病易感性的其他合适的SNP。

如本文所用，术语“确定在SNP位点的核苷酸序列”指任何合适的方法或技术，其检测位于包含SEQ ID NO:1-9的任一个或者任何组合的位置26处的核苷酸的性质。这种方法可以主要是测序技术或者基于互补核酸结合的技术。

在本发明的另一优选实施方案中，所述确定核苷酸序列可以通过等位基因特异性寡核苷酸(ASO)-斑点印迹分析、引物延伸测定、iPLEX SNP基因型分型、动态等位基因特异性杂交(DASH)基因型分型、使用分子信标、四引物ARMSPCR、游离内切核酸酶侵入测定、寡核苷酸连接酶测定、PCR-单链构象多态性(SSCP)分析、定量实时PCR测定、基于SNP微阵列的分析、限制性酶片段长度多态性(RFLP)分析、靶向重新测序分析和/或全基因组测序分析来进行。

如本文所用，术语“核酸亲和配体”指能够结合如上文定义的SNP位点的核酸分子。优选地，所述核酸亲和配体能够结合SEQ ID NO:1-9的序列或其片段，所述片段包含如上文定义的SNP位点，其中所述SEQ ID NO:1-9的序列包含如上文所述的各自的核苷酸。在本发明的其他实施方案中，核酸亲和配体还能够特异性地结合与SEQ ID NO:1-9的序列或其片段(包含如上文定义的SNP位点)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.5％或99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的DNA序列，其中所述SEQ ID NO:1-9的序列包含如上文所述的各自的核苷酸，或者结合所述序列的任何片段。

在其他具体实施方案中，所述核酸亲和配体可以是能够特异性地结合SEQ ID NO:1-9的SNP序列的短核酸分子，例如RNA、DNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA分子或者本领域技术人员已知的任何其他合适的核酸形式。

在其他具体实施方案中，所述核酸亲和配体可以包含技术人员已知的任何合适的功能组分，例如标签、荧光标记、放射性标记、染料、蛋白或抗体或肽的结合或识别位点、可用于PCR方法的另一段DNA、可用作限制性酶的识别位点的一段DNA等。核酸亲和配体还可以以催化RNA的形式提供，所述催化RNA特异性地结合并切割包含本发明的SNP的序列。

本发明的组合物可以额外地包含检测冠心病易感性所必需或可用的其他成分，例如缓冲液、dNTP、聚合酶、离子如二价阳离子或一价阳离子、杂交溶液等。

在本发明的另一优选实施方案中，上文提到的亲和配体可以是特异于上文 定义的一个或多个SNP位点的寡核苷酸，或者是特异于上文定义的一个或多个SNP位点的探针。如本文所用，术语“特异于一个或多个SNP位点的寡核苷酸”指长度为约12-38个核苷酸，优选约15-30个核苷酸的核酸分子，优选DNA分子。例如，所述寡核苷酸可以具有16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。这些分子优选可以与危险等位基因核苷酸上或周围的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸互补，但是包含与SEQ ID NO:1-9相关的所述如上文定义的危险等位基因核苷酸的互补序列。

在其他实施方案中，本发明还涉及特异性地结合SEQ ID NO:1-9的背景中如上文所示的SNP位点附近的寡核苷酸分子。这些寡核苷酸可以设计为一对引物的形式，允许扩增例如长度为50bp、75bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp、750bp、1000bp或更多且包括本发明的SNP的多态位点的DNA段。

如本文所用，术语“特异于上文定义的一个或多个SNP位点的探针”指DNA片段，其能够特异性地结合本发明的SNP位点。例如，所述探针可以这样设计，从而其仅结合包含危险等位基因核苷酸的序列。可以例如在杂交实验中通过改变盐的浓度、修改反应温度、向反应加入其他合适的化合物等来进一步调整探针的特异性。还可以这样设计探针，从而其结合SNP位点外部，例如在SEQ ID NO:1-9的序列内，或者其互补序列。

在其他实施方案中，本发明的探针可以与SEQ ID NO:1-9的序列或其片段(包含如上文定义的SNP位点)、与所述序列的任何片段、或者与这些序列的互补序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99.5％或99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同，其中所述SEQ ID NO:1-9的序列包含如上文所述的各自的危险等位基因核苷酸。

本发明的探针可以具有任何合适的长度，例如15、20、30、40、50、100、150、200、300、500、1000或超过1000个核苷酸的长度。探针还可以是适当修饰的，例如通过加入标记，如荧光标记、染料、放射性标记等。

在另一方面，本发明涉及用于检测、筛查或预测冠心病易感性的试剂盒，其包含特异于上文定义的一个或多个SNP位点的寡核苷酸，或者特异于上文定义的一个或多个SNP位点的探针。在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸具有与如上文定义的危险等位基因核苷酸互补的序列。在其他实施方案中，如上 文定义的试剂盒可以包含辅助成分，例如PCR缓冲液、dNTP、聚合酶、离子如二价阳离子或一价阳离子、杂交溶液等。在其他实施方案中，所述试剂盒还可以包含辅助成分如第二亲和配体，例如二抗，检测染料，或者进行核酸检测所必需的其他合适的化合物或液体。这类成分以及进一步的细节是本领域技术人员已知的，并且可以根据所进行的检测方法而变化。此外，所述试剂盒可以包含说明书和/或可以提供所获得的结果的相关性的信息。

如本文所用，术语“检测、筛查或预测对象的冠心病易感性”表示可以确定在对象中存在冠心病，即实际上患有疾病症状或者表现出疾病的表型。该术语还包括检测或鉴定冠心病携带者状态，这可以是表型上不明显的。

如本文所用，“对象样品”可以是来源于对象身体的任何合适的部分的任何样品。在一实施方案中，样品可以来源于纯组织或器官或细胞类型。在本发明的其他实施方案中，样品可以来源于体液，例如来源于血液、血清、唾液、尿、粪便、精液、淋巴液等。特别优选采用血液样品，其包含含有DNA的细胞，例如非成熟的红细胞、红细胞前体细胞、白细胞等。在本发明的上下文中使用的样品应当优选以临床可接受的方式采集，更优选以保留核酸或蛋白的方式采集。

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例和图不应理解为限制性的。本领域技术人员能够清楚地设想本文列出的原理的进一步的修改。

实施例1：全基因组范围内筛选冠心病易感位点：

实验人群

本实施例中，冠心病患者(冠脉造影阳性)，即冠心病病例组样品及病例资料来自中国解放军总医院，对照组样品及资料来自北京地区体检中心。参与实验的所有人群样品均给予书面通知，并由其本人或家属签署了知情同意书。实验操作遵照《赫尔辛基宣言》规定的伦理原则，由北京大学伦理委员会审核通过。

其中，冠心病病例组样品入选标准符合下列三个条件之一：

(1)既往有心肌梗死(MI)病史；

(2)既往有皮冠状动脉介入术或冠状动脉旁路移植术治疗史；

(3)冠状动脉血管造影证实三支主要冠状动脉中至少一支管腔直径狭窄大于50％。

对照组样品入选标准为同时符合下列三个条件：

(1)既往无冠心病家族史；

(2)无冠心病临床症状(如胸痛、胸闷、呼吸苦难等)；

(3)心电图无异常。

具有两个或两个以上危险因素(危险因素包括：大于45岁的男性或大于55岁的女性，高血压，糖尿病，高血脂及超重)的人将接受运动平板负荷试验检查，心电图正常且无临床症状者可以入选。此外，有脑卒中或外周血管疾病的人被排除在外。

血压评定：

专业的临床医生对入选人群进行血压测量。采用标准的汞柱式血压计测量右臂血压，测量时所有受试者均在安静状态下，且测试前30分钟没有吸烟、喝茶或饮用咖啡。

符合下列三个条件之一定义为高血压：

(1)正在使用降压药物；

(2)非同日三次血压测量值，收缩压(SBP)≥140mmHg，或/和舒张压(DBP)≥90mmHg；

(3)病例标注有高血压病史。

糖尿病评定：

血样在清晨空腹12小时后采取化验，符合下列四个条件之一定义为糖尿病：

(1)空腹血糖≥7.0mmol/L；

(2)餐后2小时血糖≥11.1mmol/L；

(3)目前应用降糖药物；

(4)病例标注有糖尿病史。

如果空腹血糖在5.6-7.0mmol/L或餐后2小时血糖在7.8-11.1mmol/L，那么将根据糖耐量试验(OGTT)进行判断。

血脂评定：

血样在清晨空腹12小时后采取化验，化验指标包括TG、TC、LDL-C、HDL-C。由于几乎所有的冠心病病人都在接受降脂治疗，其测量的血脂值并不 能真实反应其自身血脂情况，因此，在本发明实施例中，所展示的是其血脂测量值，而并不对其是否患病进行评定。

吸烟评定：根据入选人群自述。

实验试剂

本实施例中，昂飞人类全基因组(Affymetrix Genome-wide Human)SNP 5.0实验所使用的试剂如表1所示：

表1 Affymetrix Genome-wide Human SNP 5.0实验所用试剂规格表

Golden Gate分型实验所使用的veraCode GoldenGate SNP分型试剂盒购自Illumina公司。

等位基因特异性连接酶链反应(Allele Specific Ligase Chain Reaction，ASLCR)分型实验所使用的试剂如下：

常规PCR试剂

具体操作步骤

一、Affymetrix Genome-wide Human SNP 5.0实验

1)样品要求和纯化

用于芯片的样品对于原始基因组DNA的质量要求较高，如DNA需要保持双链形式；无PCR抑制物，如血红素、EDTA等；无RNA或蛋白的残留；不能污染其他人的基因组DNA或其它物种的DNA；不能是严重降解的。

2)Sty酶切

96孔板样品，涡旋10秒混匀，2000rpm离心30秒。每个样品取5μL至新96孔板，2000rpm离心30秒，置于冰上。按照表2配制Sty I酶切混合体系：

表2

试剂	单个样品/μL	48样品(有富余)/μL
			AccuGENE水	11.55	637.6
NEB缓冲液3(10×)	2	110.4
			BSA(100×；10mg/mL)	0.2	11
Sty I限制性内切酶(10U/μL)	1	55.2
			总量	14.75	814.2

用12道P200排枪转67μL混合体系入12孔排管。用12道P20排枪从排管中取14.75μL混合物加入每个样品孔中，这时每个孔总体积19.75μL。封膜，压紧，混匀，离心。确定聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)仪已预热好后，放入96孔板，进行GW5.0/6.0酶切程序，具体运行条件如表3所示：

表3

温度	时间
		37℃	120分钟
65℃	20分钟
		4℃	保持

3)Sty连接

按照表4配制Sty I连接混合体系：

表4

试剂	单个样品/μL	48样品(有富余)/μL
			T4连接酶缓冲液(10×)	2.5	150
Sty I适配物(50μM)	0.75	45
			T4DNA连接酶(400U/μL)	2	120
总量	5.25	315

用P100单枪，分装25μL Sty I酶切混合物入排管各孔。用12道P20排枪，从排管取5.25μL Sty I酶切混合物入Sty酶切产物，每个孔总体积为25μL。封膜，压紧，混匀，离心。确保PCR仪已预热，将96孔板放入PCR仪运行GW5.0/6.0连接程序，具体运行条件如表5所示：

表5

温度	时间
		16℃	180分钟
70℃	20分钟
		4℃	保持

4)样品的稀释

在solution basin中倒入约10ml的AccuGENE水，用12道P200排枪取75μL水，加入每个连接产物样品孔中，总体积达到100μL。封膜，压紧，混匀，离心。

5)Sty PCR

取10μL稀释后的样品到相应的PCR板上相应位置，每一排样品做三个重复的PCR反应。将50mL管置于冰上，按照表6配制Sty PCR混合物：

表6

高速涡旋混合物3次，每次1秒，确保混匀。

用12道P200排枪取90μL Sty PCR混合物加入到每个样品中，为避免污染，每次加入后换枪头。每孔总体积为100μL。封膜，压紧，混匀，离心。GW5.0/6.0PCR程序，具体运行参数如表7所示：

表7

程序运行完毕后取出样品板，2000rpm离心30秒。小心揭开封膜，抽取样品吸出1μL加入上样缓冲液中准备电泳，原则为每个样品均要抽测到，每个PCR板均要抽测到(如3个96孔板PCR，至少要抽测96个样品电泳)。样品板封膜，压紧，2000rpm离心30秒，-20℃保存。抽测样品电泳：2％琼脂糖电泳，150V，25分钟，确认PCR产物大小分布为约200bp至1100bp。异常样品剔除，不进行后续实验。

6)Nsp酶切

与上述的Sty酶切步骤基本一致，区别是Nsp I酶切混合物配制。按照表8配制NspI酶切混合物：

表8

试剂	单个样品/μL	48样品(有富余)/μL
			AccuGENE水	11.55	637.6
NEB缓冲液2(10×)	2	110.4
			BSA(100×；10mg/mL)	0.2	11
Nsp I(10U/μL)	1	55.2
			总量	14.75	814.2

7)Nsp连接

与上述的Sty连接步骤基本一致，区别是Nsp I连接混合物配制。按照表9配制NspI连接混合物：

表9

试剂	单个样品/μL	48样品(有富余)/μL
			T4连接酶缓冲液(10×)	2.5	150
Nsp I适配物(50μM)	0.75	45
			T4DNA连接酶(400U/μL)	2	120
总量	5.25	315

8)Nsp连接产物的稀释

9)Nsp PCR

Nsp PCR的操作参照Sty PCR，两者的区别是Nsp的模板每排样品要分装出4份进行PCR(Sty是3份)。因为要比Sty多做一板PCR，因而Nsp PCR混合物的配制也要比Sty的相应多出1板。

10)用密理博(Millipore)过滤板进行PCR产物纯化

将7板PCR产物2000rpm离心30秒，汇总入深孔板，这时每个样品孔有700μL PCR产物(Sty：100μL×3；Nsp：100μL×4)。用12道P1200排枪在每个样品孔加入1.0mL磁珠：缓慢加入，且用排枪吸吹5次以上，充分的混匀为了让PCR产物吸附在磁珠上。遮盖深孔板，室温孵育10分钟。

用12道P1200排枪将深孔板中样品转移至过滤板，位置对应。用封膜将过滤板中无样品的孔封严，以便进行下面的负压过滤。

连接好真空过滤装置，打开真空泵，维持20-24的Hg柱，直到所有的液体滤过(大约40-50分钟)，关闭真空泵。检查每个孔，全部液体滤过的孔应该是无光泽的，若某些孔有光泽则表明仍有残存液体，可再过滤小于10分钟(总共不要超过60分钟)。

将12道P1200排枪调至900μL，每个孔加入900μL 75％乙醇，打开真空泵维持20-24Hg，1-2分钟当液面下降后，再加入900μL 75％乙醇(每个孔总共1.8mL75％乙醇)，遮盖过滤板，待液体全部滤过(10-15分钟)，关闭真空泵。检查每个孔，若仍有残留液体，可再过滤小于5分钟(总共不超过20分钟)。可用洁净纸巾吸干过滤板底部的多余乙醇。再过滤10分钟(不要超过，如果确 定已经没有多余的乙醇亦可少于10分钟)。关闭真空泵，用纸检查过滤板底部没有多余乙醇。

安装接受板。将3mlNEB缓冲液倒入solution basin中，用12道P200排枪向过滤板每孔中加入55μL EB缓冲液，注意枪头深入过滤板，在足够接近的情况下直接加到磁珠顶部，不要接触磁珠也尽量不要加到壁上。轻弹过滤板确保EB缓冲液都到达底部磁珠上。用封膜封紧过滤板，在Jitterbug上振荡10分钟。

检查确保每个孔的磁珠被充分重悬，以洗脱磁珠上的DNA。撕掉封膜，安装到真空过滤装置上，维持20-24Hg 5-15分钟，确保液体全部滤过过滤板，关闭真空泵。检查每个孔，若表明仍有残存液体、发亮等，可再进行真空过滤15分钟。取下过滤板，封膜，1400rcf室温离心5分钟。取下接收板，用12道P200排枪转移45μL洗脱液体到新的PCR板上，封膜，置于-20℃保存，以备下一步片段化。

取剩余洗脱液1-2μL，用水稀释100倍，混匀，测浓度。正常值：测量浓度约50μL/μL(最好不要低于45μL/μL)，OD260/OD280在1.8至2.0，OD320接近于0(0±0.005)。

11)片段化

这步实验是整个实验流程中最为关键的一步，且片段化试剂对于温度极其敏感，要求操作迅速准确，两个操作者之间协调配合好，离心机4℃预冷且标记好“将要进行重要实验，请勿使用”等警示语，不要让其他人临时占用。排管和样品均置于冰上。排管中每个孔加入28μL 10×片段化缓冲液。用12道P20排枪吸取5μL 10×片段化缓冲液加入到每个样品孔中，使每样品孔体积达到50μL。配制稀释的片段化试剂，不同批次的片段化试剂浓度有所差异，根据具体批次浓度，按照表10配制0.1U/μL片段化试剂：

表10

向排管中快速每孔分装28μL稀释好的片段化试剂(避免管底存在气泡，影响下一步移液的准确性)。用12道P20排枪，向每个样品中加入5μL稀释好的片段化试剂，迅速，无反复吸吹动作。这时每个样品孔体积为55μL。立即封膜，压紧，确保封严，涡旋3秒钟。4℃2000rpm离心30秒(中间转移过程中均置于冰上)。迅速置于预热好的PCR仪上，进行GW5.0/6.0片段化程序，具体运行参数如表11所示：

表11

温度	时间
		37℃	35分钟
95℃	15分钟
		4℃	Hold

弃去多余的稀释后片段化试剂(不可重复使用)。片段化程序结束后，2000rpm离心30秒，每个样品吸取1.5μL加入上样缓冲液，4％琼脂糖电泳检测，平均片段长度应小于180bp。附图1为冠心病样品进行Affymetrix Genome-Wide Human SNP 5.0芯片实验片段化后电泳图。

12)标记

按照表12配制标记反应混合物：

表12

试剂	单个样品/μL	48样品(有富余)/μL
			TdT混合物(5×)	14	772.8
DNA标记试剂(30mM)	2	110.4
			TdT酶(30U/μL)	3.5	193.2
总量	19.5	1076.4

每个排管中加入89μL标记反应混合物，用12道P20排枪向每个样品中加入19.5μL标记反应混合物，总体积为73μL。封膜，压紧。涡旋约3秒。2000rpm离心30秒。放入预热好的PCR仪上，运行GW5.0/6.0标记程序，具体运行参数如表13所示：

表13

程序结束后，2000rpm离心30秒，产物可置于-20℃保存。

13)杂交

按照表14配制杂交混合物:

表14

试剂	单张芯片/μL	48芯片(有富余)/μL
			MES(12×)	12	660
Denhardt’s(50×)	13	715
			乙二胺四乙酸(0.5M)	3	165
HSDNA(10mg/mL)	3	165
			OCR，0100	2	110
人Cot-1DNA(1mg/mL)	3	165
			吐温-20(3％)	1	55
二甲基亚砜(100％)	13	715
			TMACL(5M)	140	7700
总量	190ml	10.45ml

高速涡旋，确保杂交混合物均一且无沉淀(5分钟左右)。向标记后的每个样品中加入190μL杂交混合物，总体积为263μL。封膜，压紧。涡旋30秒，确保混匀。2000rpm离心30秒。保证封膜封严的情况下，剪刀剪下要进行杂交的样品，其余-20℃保存。运行GW5.0/6.0杂交样品变性程序，95度10min后49度保持。样品仍置于PCR仪中保持恒温，小心揭去封膜。用200μL枪，将变过性的样品全部快速注入芯片。将芯片封严，迅速置于50℃，60rpm杂交炉中，单张芯片操作时间在1分钟左右，不超过1.5分钟。上样完毕后，检查杂交炉平衡(一次最多杂交32张芯片)，保持50℃，60rpm杂交16至18小时。

14)洗染和芯片扫描

杂交16至18小时后，将杂交过的样品转移至1.5mL EP管中，置于-80℃长期保存，芯片中注满芯片保存缓冲液。洗染前将芯片恒温于室温。新鲜配制SAPE溶液和抗体溶液，分别分装600μL于1.5mL管中；分装1mL芯片保存缓冲液于1.5mL EP管中。SAPE溶液、抗体溶液和芯片保存缓冲液对应放置于洗染工作 站的“1”、“2”、“3”位置。

对应芯片选择“Genome Wide SNP5_450”程序进行洗染。预热扫描仪，选择对应的芯片类型进行扫描。

二、Affymetrix Genome-wide Human SNP 5.0芯片数据分析

1)利用昂飞AGCC软件对扫描过的dat文件转换为cel文件。

2)利用昂飞基因分型4.0软件根据每张芯片的质控进行初筛，标准为：SNP5.0芯片质控位点分型率>86％。低于此标准的芯片直接剔除，不参与后续分析。

3)使用昂飞基因分型4.0软件进行初步分型，符合以下标准的样品进行后续分析：单张芯片分型率不低于95％且杂合度正常。

4)剔除不合格样品后重新使用昂飞基因分型4.0进行分型。

5)最终分型结果以CHP文件或TXT文件输出。

6)基因型与表型数据合并，利用Golden Helix SVS或Plink软件进行后续分析。

7)SNP过滤筛选，保留同时满足如下条件的SNP进入下一步的分析。

(i)对照组哈迪温伯格检验P值>5*10^-3；

(ii)病例组低频等位基因频率≥2％；

(iii)对照组低频等位基因频率≥2％；

(Iv)病例组单一SNP分型率>95％；

(V)对照组单一SNP分型率>95％；

8)主成分分析，由Plink软件完成。

9)分位数图绘制，由R软件完成。

10)补齐分析，由Plink软件完成。

三、GoldenGate分型实验及分析方法

GoldenGate分型实验由基因组所完成。它包含了三条引物，一条引物是分析的条形码，而另两个区分SNP。首先，基因组DNA与三条引物、DNA聚合酶、连接酶共同孵育，进行引物延伸反应，得到PCR反应的模板。PCR产物随后用荧光标记的等位基因特异的引物进行扩增，与固相载体上的磁珠进行杂交，并读出结果。每个样品可同时检测384个SNP位点。分型结果的分析利用Illumina Genome Studio软件进行。

四、ASLCR方法

1)制备PCR产物，该产物用于制备连接反应用的长探针。配制以下体系：

PCR条件如下：

94度 3min

94度 20s

55度 30s

72度 45s 步骤2-4，35个循环

72度 5min

16度 20s

收集体系，尽可能去掉石蜡油(以防以后造成把石蜡油当体系的问题)，或者使用封膜的方法。

2)磷酸化引物。配制以下体系：

37度6个小时或过夜。加入5μL 50mM EDTA和25μL超纯水中止反应(即30μL 8.33mMEDTA)。-20度保存。

3)制备长探针：六条探针引物中一条(rsX)用来制备长探针。配制以下体系：

PCR条件如下：

94度 3min

94度 20s

55度 30s

72度 1min 步骤2-4，50个循环

72度 5min

16度 20s

收集体系，尽可能去掉石蜡油(以防以后造成把石蜡油当体系的问题)，或者使用封膜的方法。

4)基因组DNA PCR，准备以下体系：

PCR条件如下：

94度 3min

94度 20s

55度 30s

72度 15s 步骤2-4，45-50个循环

72度 5min

16度 20s

5)等位基因特异性连接反应

将对于一个位点设计或制备的多条引物预混成三组：第一组(A)：引物名字为rsX-N/A/T/G/C的引物，终浓度每个引物1μM。第二组(B)：引物名字为 rsX-NA/NT/NG/NC的引物并且用T4多聚核苷酸激酶处理过的，终浓度每个引物1μM。第三组(C)：，终浓度每个引物40nM。

配制以下体系：

反应条件如下：

94度 20s

48度 2.5min 步骤1-2 35个循环，

16度 20s

6)连接后产物PCR

将LCR产物加入90μL超纯水，混匀，配制以下体系：

PCR条件如下：

94度 3min

94度 20s

55度 30s

72度 45s 步骤2-4，25个循环

72度 5min

16度 20s

取1μL体系加入到10μL高度去离子(HiDi)甲酰胺。在95℃下变性3分钟，置于冰上，冷却后离心，上机进行毛细管电泳。

实验结果

一、上述实验所得到的人群信息如表15所示

表15人群信息

二、多阶段筛选结果

本实施例利用Affymetrix Genome-wide Human SNP 5.0芯片(包含443104个SNP位点)对约650个样品完成了全基因组关联分析。对样品进行质控后，剩余280个冠心病病例样本和350个正常对照样本。经过位点质控筛选后，剩余31万个位点。通过主成分分析，删掉了6个疑似有分层的对照样品。然后用筛选后的数据进行QQ-plot分析，膨胀系数为1.02，表明人群没有潜在的分层。在此基础上，利用Plink软件，以HapMapⅡ中90个中国汉人和日本人的SNP 数据为参考数据对发明人的原始数据进行了补齐分析。补齐分析的质控参数INFO值大于0.8(PLINK软件推荐)的数据予以保留。补齐后，位点总数达到182万个。图2展示的是位于22条常染色体的位点所做的关联分析曼哈顿图(其中，图2中的每一个点代表一个SNP位点，x轴为SNP位点在1-22号染色体的物理位置分布，其中，相邻两个线条之间的部分分别代表一条染色体；y轴为单核苷酸多态性位点与冠心病的关联显著性，以-log10(p)表示，此值越大，说明P值越小，该位点与冠心病的相关性越强)。在芯片数据中，发明人选择了277个候选位点在近1000例病例对照人群中进行下一轮筛选。结果有271个位点可以被GoldernGate方法成功分型，其中2个SNP由于分型率小于97以及5个SNP由于在对照人群中哈温检验P值小于0.01而被弃掉。

通过质控的位点中，有16个SNP可以重复验证上一轮实验的结果。经过前述两轮验证后剩余的16个位点如表16所示。

表16两轮验证后剩余的16个位点

接下来，利用LCR的方法在810例冠心病病例样本和853例正常对照样本中进行了这16个位点的分型。经过结果分析，位于THSD7A基因内含子区的rs17165136(危险等位基因为A)多态性位点仍然为阳性结果。

为了进一步确认rs17165136与冠心病易感性的相关性，本实施例还考察了rs17165136位点在每个筛选阶段人群中的结果。结果如表17所示。

表17

由表17可知，rs17165136与冠心病易感性具有显著的关联性。

在第一轮的补齐分析结果中，发明人发现除了rs17165136，位于rs17165136上下游的与其连锁的以下位点也呈现明显的相关性(P＜0.01)：

rs6957230(危险等位基因为C)；

rs17165141(危险等位基因为T)；

rs17165148(危险等位基因为T)；

rs16877182(危险等位基因为C)；

rs10499406(危险等位基因为T)；

rs16877184(危险等位基因为A)；

rs7341453(危险等位基因为G)；

rs10499401(危险等位基因为T)。

发明人对rs17165136上下游共500kb区域的位点进行了关联分析，图3是rs17165136上下游共500kb区域的关联分析结果(其中，图中的每一个点代表一个SNP，横轴表示了在这个区域存在的基因，左侧纵轴为单核苷酸多态性位点与冠心病的关联显著性，该值越大，说明该位点与冠心病的相关性越强。图中的曲线表示的是用1000基因组计划中中国北方人和日本人群数据估计的该染色体区域的重组率，单位(CM/Mb)对应右侧纵轴；区域中rs17165136标记为方块，其他位点与该位点的连锁不平衡关系(r²)用颜色深浅表示。该图的制作工具为在线工具SNAP(http://www.broadinstitute.org/mpg/snap/ldplot.php))。如图3所示，不仅rs17165136与冠心病易感性呈现明显相关性，而且上述与rs17165136连锁的各个位点也与冠心病易感性呈现相关性。

更具体地，芯片数据中其他与rs17165136连锁的相关位点与冠心病关联分析的结果如表18所示。

表18芯片数据中与rs17165136连锁的相关位点与冠心病关联分析的结果

其中，上述各个位点的序列具体如下：

rs17165136的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示，具体如下：TGAAGGTCCTTAAACACTTCTATGC[A/G]TGGAATAACACTTATAAGTATTTTA

rs6957230的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示，具体如下：TACTCTTGGAGTGTCACCAAATCAT[C/T]CTGGGCAGGATTTTTCTTCTCTTCT

rs17165141的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示，具体如下：GCTAGCTTGGTATCAAAACAATGGA[C/T]TGCTTATTCTTCTAAGGTGACATTT

rs17165148的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.4所示，具体如下：TTAGATTTATAACTGTGAGCACTCC[C/T]TGGTTGAAAGAAATCAGAAGTAATA

rs16877182的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示，具体如下：ATTCAATCAAATTTTAAAGTTGGTA[C/T]TAATTATACTTGTTATTGGAATGTA

rs10499406的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.6所示，具体如下：TACATGCTTGTCTCATCGAAATATT[A/G]TACAGTTAAATATAACCTATGTCAT

rs16877184的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.7所示，具体如下：TAACAACTTTTAGAGAAAGGCAAGG[A/G]AAAATACGCCGTATACATTCTAAAA

rs7341453的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.8所示，具体如下：TGTGCAGAGAATATAGAAAGAATAA[A/G]GGAAGGCAATAGAAGAAATAATAAC

rs10499401的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.9所示，具体如下：TTGGAGATCACTTTTGACCATACCC[A/G]TCGCTAATTACCTAAATACGCCAGT

实施例2rs17165136位点的多中心验证

为了进一步验证实施例1中的rs17165136单核苷酸多态性位点，本实施例将对上述位点进行多中心的验证。验证所用的方法仍然是LCR和直接测序相结合。具体操作如下：

研究人群

用于实验的冠心病患者(冠脉造影阳性)样品及资料来自哈尔滨医科大学附属医院、中日友好医院和阜外医院、郑州大学第一附属医院。对照样品及资料来自与病例地域匹配的东北和北方地区体检中心；南方人群验证的病例样品及资料来自江苏省第一人民医院、浙江省宁波市第一人民医院、华中科技大学同济医学院附属医院、广东省医学院附属医院，对照样品来自与病例地域匹配的体检中心。共计7074个病例，8689个对照。参与实验的所有人群样品均给予书面通知，并由其本人或家属签署了知情同意书。实验操作遵照《赫尔辛基宣言》规定的伦理原则，由北京大学伦理委员会审核通过。

实验试剂及具体操作步骤

本实施例中，ASLCR分型实验的具体操作方法及所用试剂与实施例1中ASLCR方法及所用的试剂一样。

一、本实施例所得到的人群信息如表19所示：

表19人群信息

由表19可知，发明人尽量匹配了每个人群中病例和对照组的年龄和性别，以最大限度减少人群分层对结果的影响。

实验结果二、rs17165136位点在每个验证阶段人群中的结果。

由表20可知，rs17165136位点能在5个验证人群中得到验证。合并所有人群的结果，发明人发现，rs17165136位点与冠心病的相关性更加显著，P值达到全基因组关联分析的阈值，即1.0*10^-8。这一结果进一步证实了单核苷酸多态性位点rs17165136与冠心病密切相关。

表20rs17165136位点在每个验证阶段人群中的结果

实施例3鉴定易感基因

与很多GWAS所发现SNP位点位于基因荒漠区不同，本申请所鉴定的rs17165136位点位于THSD7A内含子区，因此发明人假设THSD7A基因可能是冠心病的易感基因。并通过本实施例对其进行验证。

研究人群

THSD7A基因eQTL分析所用人群来自北京地区体检中心。参与实验的所有人群样品均给予书面通知，并由其本人或家属签署了知情同意书。实验操作遵照《赫尔辛基宣言》规定的伦理原则，由北京大学伦理委员会审核通过。

细胞培养

人胚胎肾细胞系HEK293A，由本实验保存；人原代脐静脉内皮细胞HUVEC由本实验室自行分离；人原代主动脉平滑肌细胞HASMC购自北京裕恒丰科技有限公司；其他细胞均来自北京大学分子医学研究所梁子才老师实验室。

实验试剂

一、表达数量性状位点(eQTL)实验所用试剂

二、细胞培养所用试剂

三、目的基因表达谱检测实验所用试剂

引物：

THSD7A-RT-PF，其中，THSD7A-RT-PF的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO:10所示：AAAGAGTGCCAGGTTTCCGA

THSD7A-RT-PR，其中THSD7A-RT-PR的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO:11所示：AACTGCCTGATGGTTCGTGTC

18S-SB-F，其中18S-SB-F的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO:12所示：CGGACAGGATTGACAGATTG

18S-SB-R，其中，18S-SB-R的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO:13所示：CAAATCGCTCCACCAACTAA

四、单核细胞炎症分子表达实验所用试剂

Lipo2000脂质体转染试剂

siRNA(上海吉玛制药技术有限公司)：

THSD7A-si-1，THSD7A-si-1的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO:14所示：

GAGGUUAUGUGCAUUAACATTUGUUAAUGCACAUAACCUCTT

THSD7A-si-2，其中THSD7A-si-2的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO:15 所示：

CCUCAAAGCCAAUGGACUUTT AAGUCCAUUGGCUUUGAGGTT

具体操作：

一、表达数量性状位点(eQTL)实验

1)用于提取RNA的抗凝血预处理：

抗凝血4ml倒入15ml离心管，4度3000g离心10min。抽血管用4ml 2*PBS涮洗后保留。弃血浆，剩余约2ml血细胞加1*PBS补至4ml，上下颠倒混匀倒入50ml离心管，再用步骤1中的2*PBS涮洗液涮洗15ml的离心管后倒入50ml离心管配成血液稀释液。

2)白细胞的分离：

取15ml离心管，加分离液4ml(2ml18％聚蔗糖，840μL泛影钠和212μL5*PBS，948μL水补至4ml)，充分涡旋，瞬离使液面平整。8ml全血稀释液用10ml移液管沿着15ml离心管壁轻轻加到分离液上，不能破坏两个液面的分界。配平后，25度700g离心1小时。小心取出离心管，注意保持各层之间的分离界面。PBS层与分离液间乳白色云雾状层即为白细胞层，立即将3ml滴管在预备的8ml 1.5*PBS中润洗，再直接吸取白细胞层约3ml加至一管预加8ml1.5*PBS的15ml离心管底部，滴管在此时的上层液中涮洗。上下颠倒混匀后(不能涡旋)，4度3000g离心10min。肉眼可见管底白色沉淀，吸弃上清。加1ml 1.5*PBS，4度3000g离心3min。吸弃上清，白色沉淀即为白细胞，即可进行下一步RNA提取。

3)Trizol方法提取RNA，溶于去离子甲酰胺，-80℃保存。

4)溶于甲酰胺的RNA用乙醇再沉淀。

5)RT-PCR。

6)用于提取全血DNA的血样进行全血DNA提取。

7)用LCR的方法进行基因分型。

二、目的基因表达谱检测实验

1)12种细胞用各自适用的培养基培养。

2)分别收取每种细胞的总RNA；RT-PCR检测目的基因的表达情况。

三、单核细胞炎症分子表达实验

1)THP-1细胞传代于6孔板。

2)按照lipo2000转染悬浮细胞说明书转染siRNA。

3)24小时后，收取细胞总RNA，RT-PCR检测目的基因的表达情况。

四、统计分析方法

两组数据间均值差异采用学生t分布(student’s)检验，双尾检验P<0.05为具有显著性差异。

实验结果

一、THSD7A基因在多种细胞中的表达模式

参与动脉粥样硬化病理过程的细胞主要包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血液中的单核细胞等，而目标基因在疾病相关的组织细胞中表达是其在疾病发病过程中发挥功能的必要条件，因此，发明人第一步是检测目标基因在这些细胞中是否有表达。发明人收集了包括人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，人主动脉平滑肌细胞(HASMC)，人单核细胞系(THP-1)在内的共12种细胞。用RT-PCR检测的THSD7A基因在12种细胞中的表达情况，18s作为内参。其中，HWB为人血液白细胞；A549为人肺腺癌细胞；HASMC为人主动脉平滑肌细胞；HCT116为人结肠癌细胞；HEK为人胚胎肾细胞；Hela为人宫颈癌细胞；HEPG2为人肝癌细胞；HUVEC为人脐静脉内皮细胞；Jurket为人白血病T细胞；MCF-7为人乳腺癌细胞；THP-1为人单核细胞；U251为人星形胶质瘤细胞。图4为目标基因表达谱的示意图，如图4所示，THSD7A基因在人血液白细胞以及与动脉粥样硬化病理过程相关的细胞类型如内皮细胞(HUVEC)，动脉平滑肌细胞(HASMC)和单核细胞(THP-1)中表达。

二、THSD7A基因表达水平与rs9486729位点分型结果相关联

eQTL实验是关联易感位点和易感基因的重要途径。发明人对THSD7A在白细胞中进行eQTL分析。发明人收集了近300份随机人群血液样本，每份样本分别进行DNA和RNA提取。按照DNA的分型结果，根据是否携带低频等位基因发明人将人群分为两组。由于相关位点的低频等位基因(MAF)较低，所以携带低频等位基因组人较少。为了避免两组分层因素的影响，发明人将人数较多的组对较少的组进行匹配。匹配指标的优先级顺序为性别、年龄、BMI。之后，通过测序和实时PCR检验了每个样品rs17165136分型与THSD7A基因表达之间相关性，以检测目的基因表达水平。图5为THSD7A基因eQTL结果示意图，其中，横轴为分型结果，纵轴为表达结果。标化Ct为标准品ΔCt值减 样品ΔCt值，越大则表达水平越高。如附图5所示：携带rs17165136低频等位基因组THSD7A基因表达较低，P值为0.022。

THSD7A基因在动脉粥样硬化相关细胞HUVEC和THP-1中的表达较高。发明人研究了该基因是否参与这两种细胞与动脉粥样硬化形成相关的功能。图6a、图6b分别表示了用实时PCR检测转染THSD7A的siRNA后THP-1表达粘附分子的变化趋势。(其中，图6a-6b中NC为对照组；siTHSD7A-1为第一个siRNA；siTHSD7A-2为第二个siRNA；结果为三次实验的平均值和标准差；“﹡”表示与NC组相比有显著性差异。)如图6a所示，在THP-1单核细胞中敲低THSD7A基因后，THP-1细胞间粘附分子(ICAM)的表达显著降低；如图6b所示，在THP-1单核细胞中敲低THSD7A基因后，THP-1细胞粘附分子L-选择素(L-Selectin)的表达显著降低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 田小利

李扬

<120> THSD7A基因序列及表达改变检测及其在冠心病预测中的应用

<130> 申请号为201510029413.7的专利文献

<150> 201510029413.7

<151> 2015-01-21

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 单核苷酸多态性位点rs17165136，n=a或g

<400> 1

tgaaggtcct taaacacttc tatgcntgga ataacactta taagtatttt a 51

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 单核苷酸多态性位点rs6957230，n=c或t

<400> 2

tactcttgga gtgtcaccaa atcatnctgg gcaggatttt tcttctcttc t 51

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 单核苷酸多态性位点rs17165141，n=c或t

<400> 3

gctagcttgg tatcaaaaca atggantgct tattcttcta aggtgacatt t 51

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 单核苷酸多态性位点rs17165148，n=c或t

<400> 4

ttagatttat aactgtgagc actccntggt tgaaagaaat cagaagtaat a 51

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 单核苷酸多态性位点rs16877182，n=c或t

<400> 5

attcaatcaa attttaaagt tggtantaat tatacttgtt attggaatgt a 51

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 单核苷酸多态性位点rs10499406，n=a或g

<400> 6

tacatgcttg tctcatcgaa atattntaca gttaaatata acctatgtca t 51

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 单核苷酸多态性位点rs16877184，n=a或g

<400> 7

taacaacttt tagagaaagg caaggnaaaa tacgccgtat acattctaaa a 51

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 单核苷酸多态性位点rs7341453，n=a或g

<400> 8

tgtgcagaga atatagaaag aataanggaa ggcaatagaa gaaataataa c 51

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 单核苷酸多态性位点rs10499401，n=a或g

<400> 9

ttggagatca cttttgacca tacccntcgc taattaccta aatacgccag t 51

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> THSD7A基因的上游引物

<400> 10

aaagagtgcc aggtttccga 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> THSD7A基因的下游引物

<400> 11

aactgcctga tggttcgtgt c 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 18S rRNA基因的上游引物

<400> 12

cggacaggat tgacagattg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 18S rRNA基因的下游引物

<400> 13

caaatcgctc caccaactaa 20

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> THSD7A基因的siRNA中的一个片段

<400> 14

gagguuaugu gcauuaacat tuguuaaugc acauaaccuc tt 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> THSD7A基因的siRNA的另一个片段

<400> 15

ccucaaagcc aauggacuut taaguccauu ggcuuugagg tt 42

Claims (5)

1.分离的核酸分子组合物在制备用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性方面的产品中的应用，所述核酸分子组合物包括SEQ ID NO:1所示核酸分子，并且包括SEQ ID NO:2-9所示核酸分子中的一个或者多个；

所述SEQ ID NO:1所示的核酸分子具有THSD7A基因上的单核苷酸多态性(SNP)位点rs17165136，且单核苷酸n为A的携带者患冠心病的风险高于等位基因G；

所述SEQ ID NO:2-9所示核酸分子分别具有与所述SNP位点rs17165136连锁的SNP位点，其中：

(1)SEQ ID NO:2所示核酸分子具有单核苷酸多态性(SNP)位点rs6957230，其中单核苷酸n为C的携带者患冠心病的风险高于等位基因T；

(2)SEQ ID NO:3所示核酸分子具有单核苷酸多态性(SNP)位点rs17165141，其中单核苷酸n为T的携带者患冠心病的风险高于等位基因C；

(3)SEQ ID NO:4所示核酸分子具有单核苷酸多态性(SNP)位点rs17165148，其中单核苷酸n为T的携带者患冠心病的风险高于等位基因C；

(4)SEQ ID NO:5所示核酸分子具有单核苷酸多态性(SNP)位点rs16877182，单核苷酸n为C的携带者患冠心病的风险高于等位基因T；

(5)SEQ ID NO:6所示核酸分子具有单核苷酸多态性(SNP)位点rs10499406，其中单核苷酸n为T的携带者患冠心病的风险高于等位基因C；

(6)SEQ ID NO:7所示核酸分子具有单核苷酸多态性(SNP)位点rs16877184，其中单核苷酸n为A的携带者患冠心病的风险高于等位基因G；

(7)SEQ ID NO:8所示核酸分子具有单核苷酸多态性(SNP)位点rs7341453，其中单核苷酸n为G的携带者患冠心病的风险高于等位基因A；

(8)SEQ ID NO:9所示核酸分子具有单核苷酸多态性(SNP)位点rs10499401，其中单核苷酸n为T的携带者患冠心病的风险高于等位基因C。

2.核酸亲和配体组合物在制备用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性方面的产品中的应用，所述核酸亲和配体组合物包含SEQ ID NO:1所示核酸分子的片段的核酸亲和配体，所述SEQ ID NO:1所示核酸分子的片段具有SNP位点rs17165136；并且包含下述核酸分子的片段的核酸亲和配体：SEQ ID NO:2-9所示核酸分子中的一个或者多个；

其中，SEQ ID NO:2-9所示核酸分子的片段分别依次具有SNP位点rs6957230、rs17165141、rs17165148、rs16877182、rs10499406、rs16877184、rs7341453、rs10499401。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品还包括试剂盒，所述试剂盒还包括辅助成分，所述辅助成分包括：PCR缓冲液、dNTP、聚合酶、二价阳离子或一价阳离子、杂交溶液。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其中所述核酸亲和配体是特异于所述核酸分子的片段的寡核苷酸。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述寡核苷酸具有与所述核酸分子的片段的核苷酸互补的碱基。

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