CN113249451A

CN113249451A - 一种白念珠菌耐药突变靶点的鉴定方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN113249451A
Application number: CN202110756308.9A
Authority: CN
Inventors: 李姝丽; 王志贤; 张傲; 白雪秋; 阎香言; 吴秀祯; 盛长忠; 粟艳; 周泽奇
Original assignee: Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Current assignee: Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本发明提供了一种白念珠菌耐药突变靶点的鉴定方法及检测试剂盒。所述鉴定方法包括：(1)针对至少两个白念珠菌耐药突变靶点制备检测探针，并根据所述检测探针合成扩增引物对；(2)使用所述扩增引物对和检测探针对待测样品进行实时荧光定量PCR扩增反应；(3)在所述实时荧光定量PCR扩增反应后进行溶解曲线分析，根据所述检测探针的熔点判断所述待测样品的耐药突变靶点的突变情况。所述检测试剂盒利用该鉴定方法对白念珠菌唑类耐药的基因突变进行检测，快速锁定耐药突变靶点，为临床的治疗提供有力的支持。

Description

一种白念珠菌耐药突变靶点的鉴定方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于真菌的分子生物学检测领域，具体涉及一种白念珠菌耐药突变靶点的鉴定方法及检测试剂盒。

背景技术

白念珠菌(Candida albicans)又称白假丝酵母菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。

白念珠菌对唑类药物的耐药机制包括：(1)药物作用靶位变化：ERG11基因的突变、ERG11基因过度表达、ERG11基因拷贝数增加；(2)药物外排增加：CDR1、CDR2和MDR1基因表达增加；(3)细胞的应激反应：EGR失活、钙调蛋白活化蛋白激酶、生物膜的形成。其中生物膜的形成导致高度耐药性。

目前，白色念珠菌耐药基因的检测方法多为菌培养法、显微镜检法和血清学实验检测，其中，菌培养法分离周期长，过程繁琐，不利于早期的快速诊断；显微镜检法虽然快速方便，但容易漏检，阳性率不高，且部分菌种间不易区分；血清学实验检测，对于轻度和局部感染的检测不够灵敏。

因此，需要一款检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法来解决上述问题，满足人们的需求。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种白念珠菌耐药突变靶点的鉴定方法及检测试剂盒。所述鉴定方法是分子生物学方法在检测领域的应用，利用核酸提取技术提出检测样本中的病原体核酸，通过PCR技术对特异性的病原体核酸片段进行扩增，利用特异性的带有荧光信号的探针对检测片段进行检测，通过检测溶解曲线的Tm值判断检测样本中的病原体是否发生基因突变。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种白念珠菌耐药突变靶点的鉴定方法，所述鉴定方法包括如下步骤：

(1)针对至少两个白念珠菌耐药突变靶点制备检测探针，并根据所述检测探针合成扩增引物对；

(2)使用所述扩增引物对和检测探针对待测样品进行实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)在所述实时荧光定量PCR扩增反应后进行溶解曲线分析，根据所述检测探针的熔点判断所述待测样品的耐药突变靶点的突变情况。

本发明提供一种基于探针溶解曲线分析的白念珠菌唑类耐药多重PCR检测方法，采用多重PCR同时扩增白念珠菌唑类耐药突变基因ERG11的不同靶基因序列，再通过特殊设计的Taqman探针溶解曲线分析鉴定，实现对于至少两种常见的白念珠菌唑类耐药靶点的多重检测。

作为本发明优选的技术方案，所述白念珠菌耐药突变靶点选自ERG11基因的三个热点突变区，包括HS1区、HS2区或HS3区；

优选地，所述白念珠菌耐药突变靶点包括HS1区的Y132F(其相应的碱基突变位点为A395T)、K143R(其相应的碱基突变位点为A428G)；HS2区的D278N(其相应的碱基突变位点为G832A)；HS3区的G450E(其相应的碱基突变位点为G1349A)。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。

Y132F靶点探针为5'-CAGTTTTCGGTAAAGGGGTTATTTATGAT-3'(SEQ ID NO.1)

K143R靶点探针为5'-CCAGATTAATGGAACAAAAAAAATTTGCTA-3'(SEQ ID NO.2)

D278N靶点探针为5'-TGATTTAATTGATTCCTTATTGATTCATTCA-3'(SEQ ID NO.3)

G450E靶点探针为5'-ATGAAGTTGATTATGGGTTTGGGAAAG-3'(SEQ ID NO.4)。

优选地，步骤(1)所述检测探针携带荧光基团和淬灭基团。

优选地，所述荧光基团包括ALEX-350、Alexa Fluor 488、CY3、FAM、VIC、TET、CALGold540、JOE、HEX、CALFluorOrange560、TAMRA、CALFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TexasRed、CALFluorRed635、Quasar670、CY5、CY5.5、LC RED640或Quasar705中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述淬灭基团包括TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Eclipse中的任意一种或至少两种的组合。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述扩增引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.5～10所示。

优选地，所述扩增引物对中SEQ ID NO.5和6用于扩增Y132F和K143R靶点，所述扩增引物对中SEQ ID NO.7和8用于扩增D278N靶点，所述扩增引物对中SEQ ID NO.9和10用于扩增G450E靶点。

Y132F、K143R靶点的上游引物为5'-GATGCTTATAAACATTTAAC-3'(SEQ ID NO.5)

Y132F、K143R靶点的下游引物为5'-GGAACATATCTTTTAAATGA-3'(SEQ ID NO.6)

D278N靶点的上游引物为5'-GGTGATATTGATCCAAATC-3'(SEQ ID NO.7)

D278N靶点的下游引物为5'-CACCCATAAGAATACCAA-3'(SEQ ID NO.8)

G450E靶点的上游引物为5'-CCTGAAGATTTTGATCCA-3'(SEQ ID NO.9)

G450E靶点的下游引物为5'-GTTCCTAATTGAACATAAGC-3'(SEQ ID NO.10)

作为本发明优选的技术方案，所述实时荧光定量PCR扩增反应为不对称实时荧光定量PCR反应。

优选地，步骤(2)所述扩增引物对中各条引物的浓度相同或不同，其中，各条上游引物的浓度为50～500nM，例如可以是50nM、80nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM等；各条下游引物的浓度为0.5～25μM，例如可以是0.5μM、0.8μM、1μM、5μM、10μM、15μM、20μM或25μM等。

优选地，所述扩增引物对中上游引物与下游引物的浓度比为1:(10～50)；例如可以是1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50等。

作为对本发明的进一步改进，可通过进一步增加上下游引物的比例，提高与探针互补的目的片段的产量，放大溶解曲线的信号。

本发明中还可通过进一步增加靶点的数目，提高耐药检测的覆盖率。

优选地，所述检测探针中各条探针的浓度相同或不同，所述各条探针的浓度为50～500nM，例如可以是50nM、80nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM等。

本发明中，PCR反应液包括Taq酶、dNTP、MgCl₂、DMSO和缓冲液。

优选地，所述Taq酶的终浓度为0.5～5U，例如可以是0.5U、0.8U、1U、1.2U、1.5U、1.8U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U或5U。

优选地，所述dNTP的终浓度为0.1～5mM，例如可以是0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.8mM、1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM、2mM、2.5mM、2.8mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、4.8mM或5mM。

优选地，所述MgCl₂的终浓度为0.8～10mM，例如可以是0.8mM、1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM或10mM。

优选地，所述模板的终浓度为0.1pg～10ng，例如可以是0.1pg、0.5pg、1pg、2pg、5pg、10pg、20pg、30pg、50pg、60pg、80pg、90pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、6ng、7ng、8ng、9ng或10ng，优选为0.5ng-2ng。

优选地，所述DMSO的质量百分比为1～15％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。

优选地，所述缓冲液包括Tris-HCl和KCl。

优选地，所述Tris-HCl在缓冲液中的浓度为15～20mM，例如可以是15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。

优选地，所述KCl在缓冲液中的浓度为100-200mM，例如可以是100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。

优选地，所述实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件包括：

第一阶段，95℃加热10min；第二阶段，95℃下10s，55℃下40s并进行45个循环；第三阶段，温度由35℃升温至95℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。

所述鉴定方法中，PCR扩增的反应成分如下表1所示：

表1 PCR反应体系

组分	剂量
		Taq聚合酶	0.5～5U
dNTP	0.1～5mM
		上游引物	50～500nM×N
下游引物	0.5～25μM×N
		探针混合物	50～500nM×N
MgCl<sub>2</sub>	0.8～10mM
		Tris-HCl	15～20mM
模板	0.1pg-10ng
		DMSO	1～15％
总体积	10～100μL

其中，N表示引物数量或探针数量。

作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述溶解曲线分析的结果如下：

Y132F靶点，野生型的溶解温度范围为60.0℃～61.0℃，突变型的溶解温度范围为55.5℃～56.5℃，野生型和突变型的溶解温度差值范围为3.5℃～5.5℃；

K143R靶点，野生型的溶解温度范围为61.0℃～62.0℃，突变型的溶解温度范围为56.0℃～57.0℃，野生型和突变型的溶解温度差值范围为4℃～6℃；

D278N靶点，野生型的溶解温度范围为60.0℃～61.0℃，突变型的溶解温度范围为55.0℃～56.0℃，野生型和突变型的溶解温度差值范围为4℃～6℃；

G450E靶点，野生型的溶解温度范围为65.0℃～66.0℃，突变型的溶解温度范围为61.0℃～62.0℃，野生型和突变型的溶解温度差值范围为3℃～5℃。

本发明中，溶解温度会受反应体系，如酶混合液、dNTP浓度、缓冲液中金属离子浓度或者上下游引物的比例改变而改变，但野生型和突变型的熔解温度差值变化较小，通常小于1℃；本发明所述的白念株菌唑类耐药分子检测试剂盒，主要通过比较野生型和突变型的溶解温度变化来鉴定相应位点是否发生突变。

第二方面，本发明还提供一种使用第一方面所述的鉴定方法检测白念珠菌耐药突变靶点的试剂盒，所述试剂盒包括引物探针组合、阴性对照品、阳性对照品、质控品和PCR反应液；其中，所述引物探针组合包括用于扩增和检测突变位点Y132F、K143R、D278N和G450E的引物对和探针。

所述试剂盒鉴定白念珠菌耐药突变靶点的方法即为第一方面所述的鉴定方法。

本发明的目的在于提供一种同时检测白念珠菌唑类耐药相关基因-ERG11的4个突变靶点的荧光定量PCR试剂盒，与现有技术相比，该方法无需培养，利用临床样本或分离菌株作为检材，一次检测确定是否为耐药突变，同时锁定耐药突变靶点，快速准确，对临床的治疗提供有力的支持。

优选地，所述检测Y132F的检测探针的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述检测K143R的检测探针的序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述检测D278N的检测探针的序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述检测G450E的检测探针的序列如SEQ ID NO.4所示。

作为本发明优选的技术方案，所述扩增Y132F和K143R的引物对的序列如SEQ IDNO.5和6所示。

优选地，所述扩增D278N的引物对的序列如SEQ ID NO.7和8所示。

优选地，所述扩增G450E的引物对的序列如SEQ ID NO.9和10所示。

作为本发明优选的技术方案，所述阳性对照品包括含有白念珠菌唑类耐药突变DNA序列的质粒。

优选地，所述阳性对照品包括：含有Y132F和K143R基因突变DNA序列的质粒、含有D278N基因突变DNA序列的质粒和含有G450E基因突变DNA序列的质粒。

含有Y132F、K143R基因突变DNA序列的质粒，所述Y132F、K143R基因突变基因片段的序列如下所示(SEQ ID NO.11)：

GCAGCTTCATATGGTCAACAACCTTATGAATTTTTCGAATCATGTCGTCAAAAGTATGGTGATGTATTTTCATTTATGTTATTAGGGAAAATTATGACGGTTTATTTAGGTCCAAAAGGTCATGAATTTGTTTTTAATGCTAAATTATCTGATGTTTCTGCTGAAGATGCTTATAAACATTTAACTACTCCAGTTTTCGGTAAAGGGGTTATTTTTGATTGTCCAAATTCCAGATTAATGGAACAAAGAAAATTTGCTAAATTTGCTTTGACTACTGATTCATTTAAAAGATATGTTCCTAAGATTAGAGAAGAAATTTTGAATTATTTTGTTACTGATGAAAGTTTCAAATTGAAAGAAAAAACTCATGGGGTTGCCAATGTTATGAAAACTCAACCAGAAATTACTATTTTCACTGCTTCAAGATCTTTATTTGGTGATGAAATGAGAAGAATTTTTGACCGTTCATTTGCTCAACTA

含有D278N基因突变DNA序列的质粒，所述D278N基因突变基因片段的序列如下所示(SEQ ID NO.12)：

TCAAGATCTTTATTTGGTGATGAAATGAGAAGAATTTTTGACCGTTCATTTGCTCAACTATATTCTGATTTAGATAAAGGTTTTACCCCTATTAATTTTGTTTTCCCTAATTTACCTTTACCTCATTATTGGAGACGTGATGCTGCTCAAAAGAAAATCTCTGCTACTTATATGAAAGAAATTAAACTGAGAAGAGAACGTGGTGATATTGATCCAAATCGTGATTTAATTAATTCCTTATTGATTCATTCAACTTATAAAGATGGTGTGAAAATGACTGATCAAGAAATTGCTAATCTTTTAATTGGTATTCTTATGGGTGGTCAACATACTTCTGCTTCTACTTCTGCTTGGTTCTTGTTACATTTAGGTGAAAAACCTCATTTACAAGATGTTATTTATCAAGAAGTTGTTGAATTATTGAAAGAAAAAGGTGGTGATTTGAATGATTTGACTTATGAAGATTTACAAAAATTACCA

含有G450E基因突变DNA序列的质粒，所述G450E基因突变基因片段的序列如下所示(SEQ ID NO.13)：

TCAGTCAATAACACTATTAAGGAAACTCTCAGAATGCATATGCCATTACATTCTATTTTTAGAAAAGTTACTAACCCATTAAGAATCCCTGAAACCAATTATATTGTTCCAAAAGGTCATTATGTTTTAGTTTCTCCAGGTTATGCTCATACTAGTGAAAGATATTTTGATAACCCTGAAGATTTTGATCCAACTAGATGGGATACTGCTGCTGCCAAAGCTAATTCTGTTTCATTTAACTCTTCTGATGAAGTTGATTATGGGTTTGAGAAAGTTTCTAAAGGGGTTTCTTCACCTTATTTACCATTTGGTGGTGGTAGACATAGATGTATTGGGGAACAATTTGCTTATGTTCAATTAGGAACCATTTTAACTACTTTTGTTTATAATTTAAGATGGACTATTGATGGTTATAAAGTGCCTGACCCTGATTATAGTTCAATGGTGGTTTTACCTACTGAACCAGCAGAAATCATTTGG

优选地，所述含有Y132F和K143R基因突变DNA序列的质粒、含有D278N基因突变DNA序列的质粒和含有G450E基因突变DNA序列的质粒为1:(0.5～1.5):(0.5～1.5)，例如可以是1:0.5:0.5、1:0.8:0.5、1:1:0.5、1:1.5:0.5、1:0.5:0.8、1:0.5:1、1:0.5:1.5、1:0.8:0.8、1:1:1、1:1.5:1或1:1.5:1.5等，优选为1:1:1。

作为本发明优选的技术方案，所述阴性对照品为含有检测靶序列的野生型白念株菌DNA片段的质粒。

优选地，所述阴性对照品为含有野生型ERG11基因的质粒；

含有野生型ERG11基因的质粒，所述野生型ERG11基因序列如下所示(SEQ IDNO.14)：

ATGGCTATTGTTGAAACTGTCATTGATGGCATTAATTATTTTTTGTCCCTTAGTGTTACACAACAGATCAGTATATTATTAGGGGTTCCATTTGTTTACAACTTAGTATGGCAATATTTATATTCATTAAGAAAAGATAGAGCTCCATTAGTGTTTTATTGGATTCCTTGGTTTGGTTCTGCAGCTTCATATGGTCAACAACCTTATGAATTTTTCGAATCATGTCGTCAAAAGTATGGTGATGTATTTTCATTTATGTTATTAGGGAAAATTATGACGGTTTATTTAGGTCCAAAAGGTCATGAATTTGTTTTTAATGCTAAATTATCTGATGTTTCTGCTGAAGATGCTTATAAACATTTAACTACTCCAGTTTTCGGTAAAGGGGTTATTTATGATTGTCCAAATTCCAGATTAATGGAACAAAAAAAATTTGCTAAATTTGCTTTGACTACTGATTCATTTAAAAGATATGTTCCTAAGATTAGAGAAGAAATTTTGAATTATTTTGTTACTGATGAAAGTTTCAAATTGAAAGAAAAAACTCATGGGGTTGCCAATGTTATGAAAACTCAACCAGAAATTACTATTTTCACTGCTTCAAGATCTTTATTTGGTGATGAAATGAGAAGAATTTTTGACCGTTCATTTGCTCAACTATATTCTGATTTAGATAAAGGTTTTACCCCTATTAATTTTGTTTTCCCTAATTTACCTTTACCTCATTATTGGAGACGTGATGCTGCTCAAAAGAAAATCTCTGCTACTTATATGAAAGAAATTAAACTGAGAAGAGAACGTGGTGATATTGATCCAAATCGTGATTTAATTGATTCCTTATTGATTCATTCAACTTATAAAGATGGTGTGAAAATGACTGATCAAGAAATTGCTAATCTTTTAATTGGTATTCTTATGGGTGGTCAACATACTTCTGCTTCTACTTCTGCTTGGTTCTTGTTACATTTAGGTGAAAAACCTCATTTACAAGATGTTATTTATCAAGAAGTTGTTGAATTATTGAAAGAAAAAGGTGGTGATTTGAATGATTTGACTTATGAAGATTTACAAAAATTACCATCAGTCAATAACACTATTAAGGAAACTCTCAGAATGCATATGCCATTACATTCTATTTTTAGAAAAGTTACTAACCCATTAAGAATCCCTGAAACCAATTATATTGTTCCAAAAGGTCATTATGTTTTAGTTTCTCCAGGTTATGCTCATACTAGTGAAAGATATTTTGATAACCCTGAAGATTTTGATCCAACTAGATGGGATACTGCTGCTGCCAAAGCTAATTCTGTTTCATTTAACTCTTCTGATGAAGTTGATTATGGGTTTGGGAAAGTTTCTAAAGGGGTTTCTTCACCTTATTTACCATTTGGTGGTGGTAGACATAGATGTATTGGGGAACAATTTGCTTATGTTCAATTAGGAACCATTTTAACTACTTTTGTTTATAATTTAAGATGGACTATTGATGGTTATAAAGTGCCTGACCCTGATTATAGTTCAATGGTGGTTTTACCTACTGAACCAGCAGAAATCATTTGGGAAAAAAGAGAAACTTGTATGTTTTAA

本发明中，所述质控品可以是任意的DNA片段，例如，所述质控品可以是含有扩增拟南芥DNA片段的引物对和探针。

第三方面，如第一方面所述的鉴定方法或如第二方面所述的试剂盒在白念珠菌突变检测或分型中的应用。

需要注意的是，本发明中所述“样本”或“检材”是指需要进行白念珠菌突变检测的物质，其可以来自于个体(如人或动物)，也可以是其它来源的，例如一些经处理或未经处理的实验室材料，或人工合成的测试品。应理解，对“样本”或“检材”的检测并非仅涉及诊断或治疗目的，还可涉及其它非诊断或治疗目的。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明中提供一种基于探针溶解曲线分析的白念珠菌唑类耐药多重PCR检测方法，其中，寡核苷酸探针溶解曲线分析可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行，无需开管操作，也可以在普通PCR进行扩增后转移到实时荧光PCR仪进行分析。同时，Taqman探针属于水解探针，在PCR扩增过程中被消耗；本发明中，通过在反应体系中加入过量的Taqman探针，利用扩增结束后剩余的探针与扩增产物进行溶解曲线分析，寡核苷酸探针溶解曲线分析属于非消耗性的检测，在分析结束后，样本保持PCR后的状态，并且可以多次重复分析；探针溶解曲线方法能够同时分析和检测多种白念珠菌耐药突变靶点，根据Taqman探针熔点的变化可在同一反应体系中区分多种白念珠菌耐药突变的特异靶序列。

(2)本发明提供的白念珠菌耐药突变靶点的检测试剂盒，利用所述鉴定方法，结合实时荧光定量不对称PCR反应，能够一次检测突变位点Y132F、K143R、D278N和G450E，利用特异性的带有荧光信号的探针对检测片段进行检测，通过检测溶解曲线的Tm值变化判断检测样本中的病原体是否发生基因突变，所述试剂盒及鉴定方法能够快速锁定耐药突变靶点，为临床的治疗提供有力的支持。

附图说明

图1为Y132F靶点野生型和突变型对应的溶解曲线。

图2为Y143R靶点野生型和突变型对应的溶解曲线。

图3为D278N靶点野生型和突变型对应的溶解曲线。

图4为G450E靶点野生型和突变型对应的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1

本实施例提供一种探针溶解曲线法检测白念珠菌的不同耐药基因突变的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)在导致白念珠菌唑类耐药的常见基因突变中，选择ERG11基因的三个热点突变区中的4个突变热点作为检测靶点：分别是HS1区的Y132F、K143R；HS2区的D278N；HS3区的G450E；

针对4个靶点设计并制备4条Taqman探针，同时根据探针序列在外围分别设计一对引物序列，包括一条上游引物和一条下游引物；

其中Y132F、K143R靶点的两条探针共用一对引物序列。

(2)用设计的引物和检测探针对特异性靶点进行实时荧光定量不对称PCR扩增反应；

所述PCR扩增的反应成分如下表2所示：

表2 PCR反应体系

将上述反应体系放入实时荧光PCR仪，进行PCR扩增反应，具体条件如下所示：第一阶段：95℃预变性10min；1个循环；

第二阶段：95℃变性10s，55℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；

第三阶段：95℃1min，35℃2min；温度由50℃升温至95℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。

(3)在实时荧光定量PCR扩增反应后进行溶解曲线分析，根据Taqman探针熔点的变化来判断待检测样品中是否存在基因突变。

实施例2

本实施例提供一种白念珠菌耐药突变靶点的检测试剂盒，包括引物探针组合、阴性对照品、阳性对照品、内部控制品和PCR反应液。

(1)所述引物探针组合参见实施例1中步骤(1)所述进行设计，所得探针的具体序列如下：Y132F靶点探针为：

5'-FAM-CAGTTTTCGGTAAAGGGGTTATTTATGAT-BHQ1-3'(SEQ ID NO.1)

K143R靶点探针为5'-ROX-CCAGATTAATGGAACAAAAAAAATTTGCTABHQ2-3'(SEQ IDNO.2)；

D278N靶点探针为：

5'-HEX-TGATTTAATTGATTCCTTATTGATTCATTCA-BHQ1-3'(SEQ ID NO.3)

G450E靶点探针为5'-CY5-ATGAAGTTGATTATGGGTTTGGGAAAG-BHQ2-3'(SEQ IDNO.4)

所得引物的具体序列如下：

Y132F、K143R靶点的上游引物为5'-GATGCTTATAAACATTTAAC-3'(SEQ ID NO.5)

Y132F、K143R靶点的下游引物为5'-GGAACATATCTTTTAAATGA-3'(SEQ ID NO.6)

D278N靶点的上游引物为5'-GGTGATATTGATCCAAATC-3'(SEQ ID NO.7)

D278N靶点的下游引物为5'-CACCCATAAGAATACCAA-3'(SEQ ID NO.8)

G450E靶点的上游引物为5'-CCTGAAGATTTTGATCCA-3'(SEQ ID NO.9)

G450E靶点的下游引物为5'-GTTCCTAATTGAACATAAGC-3'(SEQ ID NO.10)

(2)阴性对照品为含有检测靶序列的野生型白念珠菌DNA片段(ERG11基因，编号GenBank：NC_032093.1)的质粒PUC57-ERG11，所述白念珠菌DNA片段的序列如(SEQ IDNO.14)所示。

(3)阳性对照品包括含有Y132F和K143R基因突变DNA序列的质粒、含有D278N基因突变DNA序列的质粒和含有G450E基因突变DNA序列的质粒。其中，基因突变基因片段的序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。

内部质控(Internal Control)包括为内部控制设计的上游引物和下游引物各一条，对应的探针一条，序列如下：

内部控制上游引物(SEQ ID NO.15)为5'-CTGTGAATGCCATTTCTC-3'；

内部控制下游引物(SEQ ID NO.16)为5'-ACACCTCCTTTGGAATAG-3'；

内部控制探针(SEQ ID NO.17)为：

5'-FAM-CCTAACCTACCCGCCTTGGATATT-BHQ1-3'；

利用上述试剂盒检测带有不同耐药基因突变的样本，按照实施例1所述的方法检测得到的Tm值如下表3所示；

表3四个检测靶点野生型/突变型退火温度Tm值范围对照表

综上所述，本发明提供的引物探针组合、试剂盒以及试剂盒的使用方法，能够同时检测白念珠菌唑类耐药相关基因的4个突变靶点，该方法无需培养，一次检测即可确定是否为耐药突变，同时锁定耐药突变靶点，快速准确，为临床的治疗提供有力的支持。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 丹娜（天津）生物科技股份有限公司

<120> 一种白念珠菌耐药突变靶点的鉴定方法及检测试剂盒

<130> 20210519

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cagttttcgg taaaggggtt atttatgat 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ccagattaat ggaacaaaaa aaatttgcta 30

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgatttaatt gattccttat tgattcattc a 31

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgaagttga ttatgggttt gggaaag 27

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gatgcttata aacatttaac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ggaacatatc ttttaaatga 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ggtgatattg atccaaatc 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cacccataag aataccaa 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cctgaagatt ttgatcca 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gttcctaatt gaacataagc 20

<210> 11

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gcagcttcat atggtcaaca accttatgaa tttttcgaat catgtcgtca aaagtatggt 60

gatgtatttt catttatgtt attagggaaa attatgacgg tttatttagg tccaaaaggt 120

catgaatttg tttttaatgc taaattatct gatgtttctg ctgaagatgc ttataaacat 180

ttaactactc cagttttcgg taaaggggtt atttttgatt gtccaaattc cagattaatg 240

gaacaaagaa aatttgctaa atttgctttg actactgatt catttaaaag atatgttcct 300

aagattagag aagaaatttt gaattatttt gttactgatg aaagtttcaa attgaaagaa 360

aaaactcatg gggttgccaa tgttatgaaa actcaaccag aaattactat tttcactgct 420

tcaagatctt tatttggtga tgaaatgaga agaatttttg accgttcatt tgctcaacta 480

<210> 12

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tcaagatctt tatttggtga tgaaatgaga agaatttttg accgttcatt tgctcaacta 60

tattctgatt tagataaagg ttttacccct attaattttg ttttccctaa tttaccttta 120

cctcattatt ggagacgtga tgctgctcaa aagaaaatct ctgctactta tatgaaagaa 180

attaaactga gaagagaacg tggtgatatt gatccaaatc gtgatttaat taattcctta 240

ttgattcatt caacttataa agatggtgtg aaaatgactg atcaagaaat tgctaatctt 300

ttaattggta ttcttatggg tggtcaacat acttctgctt ctacttctgc ttggttcttg 360

ttacatttag gtgaaaaacc tcatttacaa gatgttattt atcaagaagt tgttgaatta 420

ttgaaagaaa aaggtggtga tttgaatgat ttgacttatg aagatttaca aaaattacca 480

<210> 13

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

tcagtcaata acactattaa ggaaactctc agaatgcata tgccattaca ttctattttt 60

agaaaagtta ctaacccatt aagaatccct gaaaccaatt atattgttcc aaaaggtcat 120

tatgttttag tttctccagg ttatgctcat actagtgaaa gatattttga taaccctgaa 180

gattttgatc caactagatg ggatactgct gctgccaaag ctaattctgt ttcatttaac 240

tcttctgatg aagttgatta tgggtttgag aaagtttcta aaggggtttc ttcaccttat 300

ttaccatttg gtggtggtag acatagatgt attggggaac aatttgctta tgttcaatta 360

ggaaccattt taactacttt tgtttataat ttaagatgga ctattgatgg ttataaagtg 420

cctgaccctg attatagttc aatggtggtt ttacctactg aaccagcaga aatcatttgg 480

<210> 14

<211> 1587

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

atggctattg ttgaaactgt cattgatggc attaattatt ttttgtccct tagtgttaca 60

caacagatca gtatattatt aggggttcca tttgtttaca acttagtatg gcaatattta 120

tattcattaa gaaaagatag agctccatta gtgttttatt ggattccttg gtttggttct 180

gcagcttcat atggtcaaca accttatgaa tttttcgaat catgtcgtca aaagtatggt 240

gatgtatttt catttatgtt attagggaaa attatgacgg tttatttagg tccaaaaggt 300

catgaatttg tttttaatgc taaattatct gatgtttctg ctgaagatgc ttataaacat 360

ttaactactc cagttttcgg taaaggggtt atttatgatt gtccaaattc cagattaatg 420

gaacaaaaaa aatttgctaa atttgctttg actactgatt catttaaaag atatgttcct 480

aagattagag aagaaatttt gaattatttt gttactgatg aaagtttcaa attgaaagaa 540

aaaactcatg gggttgccaa tgttatgaaa actcaaccag aaattactat tttcactgct 600

tcaagatctt tatttggtga tgaaatgaga agaatttttg accgttcatt tgctcaacta 660

tattctgatt tagataaagg ttttacccct attaattttg ttttccctaa tttaccttta 720

cctcattatt ggagacgtga tgctgctcaa aagaaaatct ctgctactta tatgaaagaa 780

attaaactga gaagagaacg tggtgatatt gatccaaatc gtgatttaat tgattcctta 840

ttgattcatt caacttataa agatggtgtg aaaatgactg atcaagaaat tgctaatctt 900

ttaattggta ttcttatggg tggtcaacat acttctgctt ctacttctgc ttggttcttg 960

ttacatttag gtgaaaaacc tcatttacaa gatgttattt atcaagaagt tgttgaatta 1020

ttgaaagaaa aaggtggtga tttgaatgat ttgacttatg aagatttaca aaaattacca 1080

tcagtcaata acactattaa ggaaactctc agaatgcata tgccattaca ttctattttt 1140

agaaaagtta ctaacccatt aagaatccct gaaaccaatt atattgttcc aaaaggtcat 1200

tatgttttag tttctccagg ttatgctcat actagtgaaa gatattttga taaccctgaa 1260

gattttgatc caactagatg ggatactgct gctgccaaag ctaattctgt ttcatttaac 1320

tcttctgatg aagttgatta tgggtttggg aaagtttcta aaggggtttc ttcaccttat 1380

ttaccatttg gtggtggtag acatagatgt attggggaac aatttgctta tgttcaatta 1440

ggaaccattt taactacttt tgtttataat ttaagatgga ctattgatgg ttataaagtg 1500

cctgaccctg attatagttc aatggtggtt ttacctactg aaccagcaga aatcatttgg 1560

gaaaaaagag aaacttgtat gttttaa 1587

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ctgtgaatgc catttctc 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

acacctcctt tggaatag 18

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cctaacctac ccgccttgga tatt 24

Claims

1.一种白念珠菌耐药突变靶点的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述白念珠菌耐药突变靶点选自ERG11基因的三个热点突变区，包括HS1区、HS2区或HS3区中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述白念珠菌耐药突变靶点包括Y132F、K143R、D278N或G450E中的任意两种或三种以上的组合。

3.根据权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；

优选地，步骤(1)所述检测探针携带荧光基团和淬灭基团；

优选地，所述荧光基团包括ALEX-350、Alexa Fluor 488、CY3、FAM、VIC、TET、CALGold540、JOE、HEX、CALFluorOrange560、TAMRA、CALFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TexasRed、CALFluorRed635、Quasar670、CY5、CY5.5、LC RED640或Quasar705中的任意一种或至少两种的组合；

4.根据权利要求1～3任一项所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)所述扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～10所示；

5.根据权利要求1～4任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增反应为不对称荧光定量PCR扩增反应；

优选地，步骤(2)所述扩增引物对中各条引物的浓度相同或不同，所述扩增引物对中的上游引物的浓度为50～500nM，下游引物的浓度为0.5～25μM；

优选地，所述扩增引物对中的上游引物与下游引物的浓度比为1:(10～50)；

优选地，所述检测探针中各条探针的浓度相同或不同，所述各条探针的浓度为50～500nM；

优选地，所述实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件包括：

6.根据权利要求1～5任一项所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述溶解曲线分析的结果如下：

7.一种利用如权利要求1～6任一项所述的鉴定方法检测白念珠菌耐药突变靶点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物探针组合、阴性对照品、阳性对照品、质控品和PCR反应液；

其中，所述引物探针组合包括用于扩增和检测突变位点Y132F、K143R、D278N和G450E的引物对和探针。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测Y132F的检测探针的序列如SEQID NO.1所示；

优选地，所述检测K143R的检测探针的序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述检测D278N的检测探针的序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述检测G450E的检测探针的序列如SEQ ID NO.4所示；

优选地，所述扩增Y132F和K143R的引物对的序列如SEQ ID NO.5和6所示；

优选地，所述扩增D278N的引物对的序列如SEQ ID NO.7和8所示；

优选地，所述扩增G450E的引物对的序列如SEQ ID NO.9和10所示。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括含有白念珠菌唑类耐药突变DNA序列的质粒；

优选地，所述阳性对照品包括：含有Y132F和K143R基因突变DNA序列的质粒、含有D278N基因突变DNA序列的质粒和含有G450E基因突变DNA序列的质粒；

优选地，所述含有Y132F和K143R基因突变DNA序列的质粒、含有D278N基因突变DNA序列的质粒和含有G450E基因突变DNA序列的质粒为1:(0.5～1.5):(0.5～1.5)，优选为1:1:1；

优选地，所述阴性对照品为含有检测靶序列的野生型白念株菌DNA片段的质粒。

10.如权利要求1～6任一项所述的鉴定方法或如权利要求7～9任一项所述的试剂盒在白念珠菌突变检测或分型中的应用。