CN111394504A - 一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法，其中包括引物组、2×Taq Mix和ddH2O；其检测方法包括以下步骤：步骤一：待测样本的获取；步骤二：PCR反应液的配置：分为待测组和阴性对照组；步骤三：PCR扩增；步骤四：跑胶回收；步骤五：纯化和测序；步骤六：比对。该检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法除了适用于细菌培养物的常规多重耐药基因检测外，还可以无需培养直接检测感染患者血浆中的可培养菌或不可培养细菌的耐药基因；可对超微量核酸样本实现定量检测功能，检测灵敏度可低至10拷贝以下，灵敏度高，该反应可以在恒温条件下进行，操作简便，不需要昂贵的仪器设备，成本较低。

Description

一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物耐药基因检测技术领域，具体涉及一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法。
背景技术
念珠菌性阴道炎，又称外阴阴道念珠菌病(Vulvovaginal candidiasis，VVC)是妇产科的常见病，在各年龄段育龄妇女中都普遍存在的一种生殖系统感染，75％的女性一生中至少患过一次霉菌性阴道炎。
白色念珠菌(C.albicans)是念珠菌性阴道炎最常见的致病菌，约占70～90％。同一宿主可以携带多种念珠菌，而不同基因型的同种念珠菌可以定植在宿主的相同或者不同部位。近年来，随着抗生素等广泛应用，念珠菌性阴道炎的病原菌菌谱也发生了改变。光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.krusei)、热带念珠菌(C.tropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosi)等非白色念珠菌引起念珠菌性阴道炎的病例逐渐增多。
白色念珠菌对唑类药物的耐药机制：药物作用靶位变化：ERG11基因的突变、ERG11基因过度表达、ERG11基因拷贝数增加；药物外排增加：CDR1、CDR2和MDR1基因表达增加；细胞的应激反应：EGR失活、钙调蛋白活化蛋白激酶、生物膜的形成。其中生物膜的形成导致高度耐药性。
在现在白色念珠菌耐药基因的检测方法多为菌培养法、显微镜检法和血清学实验检测，其中菌培养法分离周期长，过程繁琐，不利于早期的快速诊断；显微镜检法虽然快速方便，但容易漏检，阳性率不高，且部分菌种间不易区分；血清学实验检测，对于轻度和局部感染的检测不够灵敏。所以我们需要一款检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法来解决上述问题，满足人们的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒，其中包括引物组、2×Taq Mix和ddH2O；
引物组如下：
用于检测白色念珠菌的ERG11的引物：
F：5’-ATGGCTATTGTTGAAACTGTCATT-3’；
R：3’-TTCATAAGGTTGTTGACCATTATG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为140bp；
用于检测白色念珠菌的CDR1的引物：
F：5’-TTGTTGGAAGACATGAAGATGCTG-3’；
R：3’-CTTCCAACAAAGGTACGTCTTCCA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为280bp；
用于检测白色念珠菌的CDR2的引物:
F：5’-CTGCCAAAGTGCCACGTTGGGCCC-3’；
R：3’-CATCTCAAACTCCTCTACCAGGTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为346bp；
用于检测白色念珠菌的MDR1的引物:
F：5’-ATGTCATTTTTTGATTCTTTACGT-3’；
R：3’-GTTCACTCTATCAGAATGCCCTTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为204bp；
用于检测白色念珠菌的ADH1的引物:
F：5’-AGATCACGTGTGGGATCAGCTGAC-3’；
R：3’-GCTCACCCAGGACACCTTCAGCACT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为271bp；
用于检测白色念珠菌的CAP1的引物:
F：5’-CCAGATCAACCGCGACATCGAATT-3’；
R：3’-CTCGAGCCGAGTGAGCCCGTTCGC-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp；
用于检测白色念珠菌的FLU1的引物:
F：5’-ATGAATAACAATACCAACAG-3’；
R：3’-AGCTTTGTACATTGAGATTA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp。
优选的，所述2×Taq Mix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料。
一种白色念珠菌耐药基因的检测方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取；
步骤二：PCR反应液的配置：待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、样本2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与预期条带大小相同的进行回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与将测序得到的序列与基因组序列进行比对，如果序列比对正确，则指示该样品中存在该白色念珠菌的耐药基因。
优选的，所述步骤三中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，10s，循环次数为40次；72℃，10min。
优选的，所述步骤六中所述序列比对的相似度在95％以上为同一个基因。
本发明的技术效果和优点：该检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒及检测方法除了适用于细菌培养物的常规多重耐药基因检测外，还可以无需培养直接检测感染患者血浆中的可培养菌或不可培养细菌的耐药基因；可对超微量核酸样本实现定量检测功能，检测灵敏度可低至10拷贝以下，灵敏度高，该反应可以在恒温条件下进行，操作简便，不需要昂贵的仪器设备，成本较低。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒，其中包括引物组、2×Taq Mix和ddH2O，2×Taq Mix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料；
引物组如下：
用于检测白色念珠菌的ERG11的引物：
F：5’-ATGGCTATTGTTGAAACTGTCATT-3’；
R：3’-TTCATAAGGTTGTTGACCATTATG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为140bp；
用于检测白色念珠菌的CDR1的引物：
F：5’-TTGTTGGAAGACATGAAGATGCTG-3’；
R：3’-CTTCCAACAAAGGTACGTCTTCCA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为280bp；
用于检测白色念珠菌的CDR2的引物:
F：5’-CTGCCAAAGTGCCACGTTGGGCCC-3’；
R：3’-CATCTCAAACTCCTCTACCAGGTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为346bp；
用于检测白色念珠菌的MDR1的引物:
F：5’-ATGTCATTTTTTGATTCTTTACGT-3’；
R：3’-GTTCACTCTATCAGAATGCCCTTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为204bp；
用于检测白色念珠菌的ADH1的引物:
F：5’-AGATCACGTGTGGGATCAGCTGAC-3’；
R：3’-GCTCACCCAGGACACCTTCAGCACT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为271bp；
用于检测白色念珠菌的CAP1的引物:
F：5’-CCAGATCAACCGCGACATCGAATT-3’；
R：3’-CTCGAGCCGAGTGAGCCCGTTCGC-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp；
用于检测白色念珠菌的FLU1的引物:
F：5’-ATGAATAACAATACCAACAG-3’；
R：3’-AGCTTTGTACATTGAGATTA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp。
一种白色念珠菌耐药基因的检测方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取；
步骤二：PCR反应液的配置：待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、样本2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数，反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，10s，循环次数为40次；72℃，10min；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与预期条带大小相同的进行回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与将测序得到的序列与基因组序列进行比对，如果序列比对正确，则指示该样品中存在该白色念珠菌的耐药基因，序列比对的相似度在95％以上为同一个基因。
实施例二：
一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒，其中包括引物组、2×Taq Mix和ddH2O，2×Taq Mix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料；
引物组如下：
用于检测白色念珠菌的ERG11的引物：
F：5’-ATGGCTATTGTTGAAACTGTCATT-3’；
R：3’-TTCATAAGGTTGTTGACCATTATG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为140bp；
用于检测白色念珠菌的CDR1的引物：
F：5’-TTGTTGGAAGACATGAAGATGCTG-3’；
R：3’-CTTCCAACAAAGGTACGTCTTCCA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为280bp；
用于检测白色念珠菌的CDR2的引物:
F：5’-CTGCCAAAGTGCCACGTTGGGCCC-3’；
R：3’-CATCTCAAACTCCTCTACCAGGTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为346bp；
用于检测白色念珠菌的MDR1的引物:
F：5’-ATGTCATTTTTTGATTCTTTACGT-3’；
R：3’-GTTCACTCTATCAGAATGCCCTTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为204bp；
用于检测白色念珠菌的ADH1的引物:
F：5’-AGATCACGTGTGGGATCAGCTGAC-3’；
R：3’-GCTCACCCAGGACACCTTCAGCACT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为271bp；
用于检测白色念珠菌的CAP1的引物:
F：5’-CCAGATCAACCGCGACATCGAATT-3’；
R：3’-CTCGAGCCGAGTGAGCCCGTTCGC-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp；
用于检测白色念珠菌的FLU1的引物:
F：5’-ATGAATAACAATACCAACAG-3’；
R：3’-AGCTTTGTACATTGAGATTA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp。
一种白色念珠菌耐药基因的检测方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取；
步骤二：PCR反应液的配置：待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 30μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、样本2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数，反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，10s，循环次数为40次；72℃，10min；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与预期条带大小相同的进行回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与将测序得到的序列与基因组序列进行比对，如果序列比对正确，则指示该样品中存在该白色念珠菌的耐药基因，序列比对的相似度在95％以上为同一个基因。
实施例三：
一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒，其中包括引物组、2×Taq Mix和ddH2O，2×Taq Mix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料；
引物组如下：
用于检测白色念珠菌的ERG11的引物：
F：5’-ATGGCTATTGTTGAAACTGTCATT-3’；
R：3’-TTCATAAGGTTGTTGACCATTATG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为140bp；
用于检测白色念珠菌的CDR1的引物：
F：5’-TTGTTGGAAGACATGAAGATGCTG-3’；
R：3’-CTTCCAACAAAGGTACGTCTTCCA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为280bp；
用于检测白色念珠菌的CDR2的引物:
F：5’-CTGCCAAAGTGCCACGTTGGGCCC-3’；
R：3’-CATCTCAAACTCCTCTACCAGGTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为346bp；
用于检测白色念珠菌的MDR1的引物:
F：5’-ATGTCATTTTTTGATTCTTTACGT-3’；
R：3’-GTTCACTCTATCAGAATGCCCTTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为204bp；
用于检测白色念珠菌的ADH1的引物:
F：5’-AGATCACGTGTGGGATCAGCTGAC-3’；
R：3’-GCTCACCCAGGACACCTTCAGCACT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为271bp；
用于检测白色念珠菌的CAP1的引物:
F：5’-CCAGATCAACCGCGACATCGAATT-3’；
R：3’-CTCGAGCCGAGTGAGCCCGTTCGC-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp；
用于检测白色念珠菌的FLU1的引物:
F：5’-ATGAATAACAATACCAACAG-3’；
R：3’-AGCTTTGTACATTGAGATTA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp。
一种白色念珠菌耐药基因的检测方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取；
步骤二：PCR反应液的配置：待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 35μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、样本2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数，反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，10s，循环次数为40次；72℃，10min；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与预期条带大小相同的进行回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与将测序得到的序列与基因组序列进行比对，如果序列比对正确，则指示该样品中存在该白色念珠菌的耐药基因，序列比对的相似度在95％以上为同一个基因。
其中样本DNA提取具体操作步骤为：将临床全血样本(约10mL)1600g离心15min，取上层血浆于新的50mL离心管中，注意不要吸到下层的血液，每管5mL血浆；
向分离出的血浆样品中加入500ul蛋白酶K和4mL的Buffer ACL以及1ul 1ug/ul的Carrier RNA，涡旋30s，将离心管置于60℃水浴锅孵育30min；
加入9mL Buffer ACB,涡旋30s，冰浴5min；
使用真空泵将所有样品过柱，关掉真空泵，释放压力为0Mbar；
打开盖子加入600ul Buffer ACW1，真空泵过柱后关掉真空泵，释放压力为0Mbar；
加入750ul Buffer ACW2，真空泵过柱后关掉真空泵，释放压力为0Mbar；
向加入750ul无水乙醇，真空泵过柱后关掉真空泵，释放压力为0Mbar；
取下吸附柱放入2mL收集管，14000rpm常温离心3min；
将吸附柱放入新的1.5mL离心管，开盖，干燥10min；
加入50ulRNase-free ddH2O(56℃预热)，56℃孵育5min；
14000rpm常温离心1min；
将离心下来的溶液再次上柱，二次洗脱，56℃孵育5min，14000rpm常温离心1min；
产物24h内进行下游实验，可2-8℃保存，长时间请-25℃～-15℃保存。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒，其中包括引物组、2×Taq Mix和ddH2O；
引物组如下：
用于检测白色念珠菌的ERG11的引物：
F：5’-ATGGCTATTGTTGAAACTGTCATT-3’；
R：3’-TTCATAAGGTTGTTGACCATTATG-5’；
引物所扩增的目的片段长度为140bp；
用于检测白色念珠菌的CDR1的引物：
F：5’-TTGTTGGAAGACATGAAGATGCTG-3’；
R：3’-CTTCCAACAAAGGTACGTCTTCCA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为280bp；
用于检测白色念珠菌的CDR2的引物:
F：5’-CTGCCAAAGTGCCACGTTGGGCCC-3’；
R：3’-CATCTCAAACTCCTCTACCAGGTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为346bp；
用于检测白色念珠菌的MDR1的引物:
F：5’-ATGTCATTTTTTGATTCTTTACGT-3’；
R：3’-GTTCACTCTATCAGAATGCCCTTT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为204bp；
用于检测白色念珠菌的ADH1的引物:
F：5’-AGATCACGTGTGGGATCAGCTGAC-3’；
R：3’-GCTCACCCAGGACACCTTCAGCACT-5’；
引物所扩增的目的片段长度为271bp；
用于检测白色念珠菌的CAP1的引物:
F：5’-CCAGATCAACCGCGACATCGAATT-3’；
R：3’-CTCGAGCCGAGTGAGCCCGTTCGC-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp；
用于检测白色念珠菌的FLU1的引物:
F：5’-ATGAATAACAATACCAACAG-3’；
R：3’-AGCTTTGTACATTGAGATTA-5’；
引物所扩增的目的片段长度为205bp。
2.根据权利要求1所述的一种检测白色念珠菌耐药基因的试剂盒，其特征在于：所述2×Taq Mix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料。
3.一种根据权利要求1所述的白色念珠菌耐药基因的检测方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取；
步骤二：PCR反应液的配置：待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、样本2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、各引物组的混合液F 6μL、R 6μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与预期条带大小相同的进行回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与将测序得到的序列与基因组序列进行比对，如果序列比对正确，则指示该样品中存在该白色念珠菌的耐药基因。
4.根据权利要求3所述的一种白色念珠菌耐药基因的检测方法，其特征在于：所述步骤三中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，10s，循环次数为40次；72℃，10min。
5.根据权利要求3所述的一种白色念珠菌耐药基因的检测方法，其特征在于：所述步骤六中所述序列比对的相似度在95％以上为同一个基因。
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