CN110628940A - 一种基于液滴数字pcr检测四种念珠菌的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物领域，具体涉及一种基于液滴数字PCR检测四种念珠菌的试剂盒。首先公开了一种用于同时检测四种念珠菌的引物探针组合，包括四组核苷酸序列，分别为组合物一、组合物二、组合物三和组合物四，所述引物探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑12所示。本发明基于液滴数字PCR技术，设计了四种念珠菌特异性的引物和探针序列，并发明了相关试剂盒，该试剂盒能够直接一次检测确定四种念珠菌分类学上的种，准确性高，未来可广泛应用于科研或医学等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种基于液滴数字PCR检测四种念珠菌的试剂盒。
背景技术
念珠菌属于真菌界—半知菌亚门—芽孢菌纲—隐球酵母目—隐球酵母科，是双相型单细胞酵母菌。念珠菌是一种芽生的酵母状真菌，一种典型的条件致病菌。已知可以致病的常见念珠菌有：白念(candida albican)、热带(Candida tropicalis)、近平滑(Candida.parapsilosis)、克鲁斯(Candida krusei)、星状(Candida stellatoidea)、季也蒙(Candida guilliermondii)和光滑念珠菌(Candida.glabrata)等八种在人体中，无症状时常表现为酵母细胞型；侵犯组织和出现症状时常表现菌丝型。
近年来，由于广谱抗生素的广泛应用，肿瘤化疗、器官移植的开展以及免疫力低下患者尤其是艾滋病患者的增多，由真菌尤其是念珠菌引起的深部感染机会日益增多。
因此，念珠菌的早期诊断至关重要。念珠菌的检测和鉴定方法主要以形态学为依据，即通过培养或直接镜检阳性为指标。直接镜检的方法简单，但无法鉴定到菌种且阳性率低。
申请号为201110417477.6的专利公开了一种通过分子信标探针来检测白色念珠菌的试剂盒；申请号为201410017428.7的专利公开了一种提供核酸释放剂和检测白色念珠菌的试剂盒；申请号为200910098559.1的专利公开了一种荧光定量PCR检测肠道近平滑念珠菌的试剂盒；申请号为200910098556.8和申请号为201610589461.6的专利公开了一种荧光定量PCR检测克柔念珠菌的试剂盒；申请号为201510011617.8的专利公开了一种检测光滑念珠菌的试剂盒；申请号为201410017251.0、申请号为201710172567.0和申请号为201310206320.8的专利公开了一种检测隐球菌的试剂盒。以上几篇专利均是单一菌种检测技术，而且仅仅是通过CT值来进行判读结果，不能同时对多个菌同时进行检测。申请号为201610765955.5的专利则公开了通过分别设计三对引物、三条探针，采用荧光定量PCR法对白色念珠菌、隐球菌、曲霉菌进行检测，由于近年来非白色念珠菌病感染率明显高于白色念珠菌感染，该专利的检测范围明显较窄；申请号为200910038182.0的专利公开了一种针对氟康唑敏感度不同的念珠菌检测试剂盒，具体检测四种或四种以上的念珠菌；申请号为201410820825.8的专利公开了通过比对白色假丝酵母、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克柔假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、黄曲霉、烟曲霉、土曲霉、新生隐球菌、米根霉、卷枝毛霉的保守序列，设计三条引物、两条探针，荧光定量PCR检测念珠菌、隐球菌和曲霉，此方法虽然可以检测八种念珠菌，但只可检测到属，并不能具体检测到哪一种的感染；申请号为201710691369.5的专利公开了通过设计两对引物、两条探针，多重荧光定量PCR检测隐球菌和曲霉菌属。
数字PCR即Digital PCR(dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。与传统的荧光定量PCR相比，数字PCR直接检测目标序列的拷贝数，实现真正意义上的绝对定量，检测过程无需对照样品和标准曲线，具有前所未有的灵敏度、准确性、特异性和精确性。使用数字PCR技术结合多种引物探针同时进行多种念珠菌检测还未被报道过。
发明内容
本发明的目的在于发明一种基于液滴数字PCR技术同时检测多种常见念珠菌的方法，以解决现有技术中不能同时检测多种念珠菌、只能检测到属或精确性不够等问题。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种用于同时检测四种念珠菌的引物探针组合，包括四组核苷酸序列，分别为组合物一、组合物二、组合物三和组合物四；
所述组合物一包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的上游引物序列1、下游引物序列2和探针序列3；
所述组合物二包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的上游引物序列4、下游引物序列5和探针序列6；
所述组合物三包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的上游引物序列7、下游引物序列8和探针序列9；
所述组合物四包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的上游引物序列10、下游引物序列11和探针序列12。
优选的，所述引物探针组合用于基于数字PCR技术的试剂盒。
优选的，所述组合物一、组合物二、组合物三和组合物四分别用于检测白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌。
优选的，所述探针序列3、探针序列6、探针序列9、探针序列12的两端均分别设置有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
在本发明的一些具体实施例中，探针序列3的两端分别设置有基团FAM和MGB。
在本发明的一些具体实施例中，探针序列6的两端分别设置有基团VIC和MGB。
在本发明的一些具体实施例中，探针序列9的两端分别设置有基团ROX和MGB。
在本发明的一些具体实施例中，探针序列12的两端分别设置有基团CY5和MGB。
应当理解，本发明中的荧光报告基团和荧光淬灭基团并不限于以上几种，本领域技术人员可以根据需要选择任意合适的基团，且均在本发明的保护范围之内。
本发明第二个方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括数字PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品，数字PCR反应液包括上述的引物探针组合。
优选的，所述试剂盒用于液滴数字PCR体系。
更优选的，所述试剂盒的PCR反应条件为：
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：95℃，15s；60℃，60s；40个循环。
优选的，所述试剂盒还包括样品DNA、2×PCR Mix和水。
更优选的，PCR体系每15μL包括：引物探针组合1μL，样品DNA 2μL，2×PCR Mix 7.5μL，水4.5μL。
本发明第三个方面公开了上述试剂盒在念珠菌检测中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明基于液滴数字PCR技术，设计了四种念珠菌特异性的引物和探针序列，并发明了相关试剂盒，该试剂盒能够直接一次检测确定四种念珠菌分类学上的种，准确性高，未来可广泛应用于科研或医学等领域。
附图说明
图1为本发明实施例中空白对照的荧光通道扩增原始图(左上图为FAM荧光通道，左下图为ROX荧光通道，右上图为VIC荧光通道，右下图为C Y5荧光通道)；
图2为本发明实施例中白色念珠菌荧光通道扩增原始图(左上图为FAM荧光通道，左下图为ROX荧光通道，右上图为VIC荧光通道，右下图为C Y5荧光通道)；
图3为本发明实施例中光滑念珠菌荧光通道扩增原始图(左上图为FAM荧光通道，左下图为ROX荧光通道，右上图为VIC荧光通道，右下图为C Y5荧光通道)；
图4为本发明实施例中近平滑念珠菌荧光通道扩增原始图(左上图为FAM荧光通道，左下图为ROX荧光通道，右上图为VIC荧光通道，右下图为C Y5荧光通道)；
图5为本发明实施例中热带念珠菌荧光通道扩增原始图(左上图为FAM荧光通道，左下图为ROX荧光通道，右上图为VIC荧光通道，右下图为C Y5荧光通道)；
图6为本发明实施例中季也蒙念珠菌荧光通道扩增原始图(左上图为FAM荧光通道，左下图为ROX荧光通道，右上图为VIC荧光通道，右下图为C Y5荧光通道)；
图7为本发明实施例中克柔念珠菌荧光通道扩增原始图(左上图为FAM荧光通道，左下图为ROX荧光通道，右上图为VIC荧光通道，右下图为C Y5荧光通道)；
图8为本发明实施例中酿酒酵母菌荧光通道扩增原始图(左上图为FAM荧光通道，左下图为ROX荧光通道，右上图为VIC荧光通道，右下图为C Y5荧光通道)；
图9为本发明实施例中皱褶念珠菌荧光通道扩增原始图(左上图为FAM荧光通道，左下图为ROX荧光通道，右上图为VIC荧光通道，右下图为C Y5荧光通道)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种基于液滴数字PCR进行念珠菌检测的方法，具体包括以下步骤：
1.引物探针设计
首先设计引物和探针序列，如表1所示。
表1
备注：R为A和G的简并碱基，S为C和G的简并碱基，Y为C和T的简并碱基。
2.样品来源
四种阳性真菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌)和四种阴性真菌(季也蒙念珠菌、克柔念珠菌、酿酒酵母菌、皱褶念珠菌)外购，经过真菌基因组DNA抽提试剂盒抽提基因组DNA，-20℃保存备用。另外准备一组空白对照(含有人基因组DNA的缓冲液)。
3.液滴数字PCR检测
3.1建立液滴数字PCR体系，如表2所示。
表2
| 试剂名称 | 体积(μL) | 终浓度 |
| 2×PCR Mix | 7.5 | 1× |
| 引物探针混合液 | 1 | 1× |
| DNA | 2 | |
| 水 | 补足至15μL |
3.2液滴数字PCR扩增条件：
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：95℃，15s；60℃，60s；40个循环。
3.3实验结果如图1-图9所示，从图中可以得出看出：空白对照的特异性正常；四种阳性菌在对应的荧光通道都能检测到阳性信号；四种阴性菌在所有的荧光通道都没有阳性信号。
本实施例公开的引物探针组合可以直接一次检测确定四种念珠菌分类学上的种，准确性高，而无需经过血液培养，未来可广泛应用于科研或医学等领域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 一种基于液滴数字PCR检测四种念株菌的试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcccaacag caactagcga agt 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaagccattt gttgtgatgt ttg 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgttatcc caactacaaa c 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagtttcttc gacaacgggt actac 25
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcctccggca ccacatg 17
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actaccagca gatgcg 16
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtggcgtca ttgtgtaaca aa 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attgtgttgt ttcaccgatg tt 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttagtatcgg aagaactca 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catccattgg ttgatttttc ca 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggatcgaca aaaagaaaaa gga 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagtatgtat tctttaacac gttg 24
Claims (10)
1.一种用于同时检测四种念珠菌的引物探针组合，包括四组核苷酸序列，分别为组合物一、组合物二、组合物三和组合物四；
所述组合物一包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的上游引物序列1、下游引物序列2和探针序列3；
所述组合物二包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的上游引物序列4、下游引物序列5和探针序列6；
所述组合物三包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的上游引物序列7、下游引物序列8和探针序列9；
所述组合物四包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的上游引物序列10、下游引物序列11和探针序列12。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合用于基于数字PCR技术的试剂盒。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述组合物一、组合物二、组合物三和组合物四分别用于检测白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌。
4.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针序列3、探针序列6、探针序列9、探针序列12的两端均分别设置有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
5.一种试剂盒，所述试剂盒包括数字PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品，数字PCR反应液包括权利要求1-4任一项所述的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于液滴数字PCR体系。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR反应条件为：
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：95℃，15s；60℃，60s；40个循环。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品DNA、2×PCR Mix和水。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在使用时，PCR体系每15μL包括：引物探针组合1μL，样品DNA 2μL，2×PCR Mix 7.5μL，水4.5μL。
10.根据权利要求5-9任一项所述的试剂盒在念珠菌检测中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Xia Jiang Inventor after: Zhu Haitao Inventor after: Li Xuxin Inventor before: Zhu Haitao Inventor before: Li Xuxin Inventor before: Xia Jiang |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |