JP2002504817A

JP2002504817A - 真菌の検出および同定のための核酸プローブ

Info

Publication number: JP2002504817A
Application number: JP50195399A
Authority: JP
Inventors: エス．サンドュ，ガープリート; シー．クライン，ブルース
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2002-02-12
Also published as: AU7349198A; EP0985051A1; WO1998055649A1; US6180339B1

Abstract

(57)【要約】ヒトおよび動物における疾患、ならびに食物および飲料の腐敗を引き起こす真菌を検出するための核酸プローブおよびプライマーが記載される。これらのプローブは、臨床的、環境的、または食物試料中の真菌の大部分から、rRNA、rDNA、またはポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し得る。Paracoccidioides brasiliensisおよびPneumocystis cariniiに特異的な、核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブもまた、記載される。

Description

【発明の詳細な説明】真菌の検出および同定のための核酸プローブ発明の分野本明細書中に記載され、請求される本発明は、臨床試料、食物試料、環境試料、および他の試料中の多くの異なる真菌生物の検出を可能にする２つの核酸プローブの設計および組成に関する。本明細書中に記載され、請求される本発明はまた、臨床試料、食物試料、環境試料、および他の試料中のAcremonium sp.、Aspe rgillus clavatus、Aspergillus flavus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus glaucus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus ochraceus 、Aspergillus terreus、Aspergillus unguis、Aspergillus ustus、Beauveria sp.、Bipolaris sp.、Blastoschizomyces sp.、Blastomyces dermatitidis、Can dida albicans、Candida glabrata、Candida guilliermondii、Candida kefyr、 Candida krusei、Candida lusitaniae、Candida parapsilosis、Candida tropic alis、Chrysosporium sp.、Cladosporium sp.、Coccidioides immitis、Cryptoc occus neoformans var gattii血清型B、Cryptococcus neoformans血清型A、Cryp tococcus laurentii、Cryptococcus terreus、Curvularia sp.、Fusarium sp.、 Filobasidium capsuligenum、Filobasidiella（Cryptococcus）neoformans var bacillispora血清型C、Filobasidiella（Cryptococcus）neoformans var neofor mans血清型D、Filobasidium uniguttulatum、Geotrichum sp.、Histoplasma cap sulatum、Malbranchea sp.、Mucor sp.、Paecilomyces sp.、Paracoccidioides brasiliensis、Penicillium species、Pneumocystis carinii．Pseudallescheri a boydii、Rhizopus sp.、Sporothrix schenkii、Scopulariopsis brevicaulis sp.、Scopulariopsis brumpti、Saccharomyces cerevisiae、およびTrichosporo n beigeliiの特異的な検出および同定を可能にするプローブの設計および組成に関する。真菌は、普遍的に分布している真核生物の微生物である。天然の真菌は植物材料の分解に大きな役割を果たしているが、それらはまた、食物、飲料、および薬学的調製物の腐敗を担う。微生物学者によって記載され、評価された100,000種の真菌以外に、約150種がヒトや動物に対して病原性である。AIDSの発生の増加および血液学的な悪性腫瘍ならびに器官移植の新しい処置の開発により、免疫力がない患者の数が増加した。これらの患者は、真菌感染を発症する危険性が高く、迅速に診断および処置されない場合は、死亡するのは時間の問題である。抗真菌剤の数は限られており、そして患者に対する毒性の副作用は、比較し得る抗細菌治療の副作用よりもはるかに高い。真菌感染の迅速な診断および処置の開始は、これらの患者において重要である。Kwon-ChungおよびBennettによる著作は、S arosiおよびDaviesの著作とともに、真菌の医学的な重要性の概観を提供する。真菌生物は、形態学的および栄養学的特徴によって同定される。真菌を、培養で増殖させるには、どの場所でも２日から数週間かかり得、そしてしばしば同じ生物が増殖条件に依存して根本的に異なる形態を取り得る。これは、古典的に訓練を受けた専門家にとってでさえ、タイミングの良い同定を困難にし、そして属や種の迅速な同定が医学的な利点である場合、患者の処置を妨害する。主要な病原性真菌の発生および分布は、地理的な位置によって変化する。Aspe rgillus fumigatus、Blastomyces dermatitidis、Candida albicans、Coccidiod es immitis、cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、Paracoccidi oides brasiliensis．Pseudallescheria boydii、およびSporothrix schenkiiは糸状菌感染を導くいくつかの原因を示す。 Aspergillus fumigatusは、病院で処置される全身的な真菌感染の上位３つの原因の１つである。これは通常、器官移植、急性白血病、およびやけどを有する患者を冒し、そして迅速に診断されない場合には、急速に致命的になり得る。土壌、空気および水中に存在する150種を超えるAspergillus種とともに、Aspergil lus fumigatusの正確な検出は非常に重要になっている。Aspergillus clavatus. 、Aspergillus flavus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus glaucus、Asperg illus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus ochraceus、Aspergillus te rreus、Aspergillus unguisおよびAspergillus ustusは、臨床検体に見られるAs pergillus種の大部分を示し、そしてそれらの存在は、診断的な困難さを引き起こし得る。Aspergillus flavus、Aspergillus fumigatus、およびAspergillus n ig erは、ヒトにおける疾患と関連があり、Aspergillus fumigatusは北アメリカにおける優勢な病原体である。Aspergillus fumigatusに対するいくつかの免疫的試験が存在するが、これらは感度および特異性が限られてきた。Asp f1抗原遺伝の増幅およびリボソーム遺伝子間スペーサー（Spreadburyら）に基づくAspergil lus fumigatusに対するポリメラーゼ連鎖反応に基づく試験法の開発の報告もまた存在する。Spreadbury技術は、大サブユニットrRNA/遺伝子間スペーサー領域にわたる401bpフラグメントのPCR増幅に基づく。これは、Aspergillus fumigatu s由来のDNAのみを特異的に増幅するプライマーの対に依存し、そして他の真菌の同定には利用性がない。 Blastomyces dermatitidisは土壌、通常鳥のふんおよび動物のふんに存在する。感染はしばしば建築現場において起こり、免疫力のない患者において肺浸潤および間質性肺炎は、通常致命的である。培養による診断には何週間も要し得、生物は時々他の真菌に間違われる。現存する免疫的診断試験は頼りにならず、そして迅速かつ信頼性のあるDNAに基づく診断試験の必要性が存在する。同様に、His toplasma capsulatumは土壌に存在し、北アメリカの人口の少なくとも20％に感染していることが知られている。大部分の感染は肺において始まり、自発的に溶解するが、時折他の器官に拡がり得る。ヒストプラズマ症を示すAIDSの患者は増加している。感染後最初の４〜６週間の間は免疫的試験がしばしば陰性なので、診断は困難である。Coccidioides immitisは、アメリカ合衆国の南西部の土壌中に豊富に見い出される。砂あらし、農場、建物の建設、地震およびハイキングでさえ、疾患の発生に関連している。肺感染、続いて空洞化および広がった粟粒性のコクシジオイデス真菌症が見られる。脳膜炎は通常致命的であり、そして他の真菌と同様に、死亡率は衰弱した宿主において最も高い。Cryptococcus neoform ansの４つの血清型は、ヒトにおいて疾患を引き起こす。これらは、Cryptococcu s neoformans血清型A、Cryptococcus neoformans var gattii血清型B、Filobasi diella（Cryptococcus）neoformans var bacillispora血清型CおよびFilobasidi ella（Cryptococcus）neoformans var neoformans血清型Dである。この疾患の発生率は急速に増加しつつあり、HIVに感染した10％までの人がクリプトコックス症を発症する。４つすべての血清型を検出し得るDNAプローブが、初期の診断およびクリプトコッカスの髄膜炎のような生命に脅威となる感染に対する処置に必要とされる。Stockmanらによる報告は、18S rRNAに基づくHistoplasm a、Blastomyces、CoccidioidesおよびCryptococcusに対する市販の試験法（Gen- Probe，Inc.，San Diego，CA）を議論している。著者らは、87.8から100％の範囲の感度および100％の特異性を報告する。これらのプローブの１つの欠点は、これらが真菌培養物から抽出したrRNAにおいて使用されることである。いくつかの真菌が培養において増殖に３週間までを要し得るので、この技術は培養物が使用可能になるまで、診断を迅速化するために使用し得ない。 Candida albicansは、ヒトにおいて最も一般的な真菌感染の原因の１つである。Candida albicansは、健常個体の呼吸器、胃腸、および女性の生殖器の管に存在し、ステロイドまたは化学療法において衰弱した個体において日和見感染の病原体として作用する。糖尿病および内在性のカテーテルは、他の感染しやすくする原因である。免疫力がない宿主は、急速な真菌の造血的な拡がりを示す。処置していない場合の疾患率および死亡率は高い。Candida glabrata、Candida guil liermondii、Candida kefyr、Candida krusei、Candida lusitanlae、Candida p arapsilosis、Candida tropicalisもまた、ヒトにおいて疾患を引き起こすことが知られている。これらの個々の種を同定し得るDNAプローブは、複合的な血液培地および時間のかかる生化学的な種形成の必要を除去する。 Paracoccidioidomycosisは、根深い全身性のヒトの感染症であり、中央アメリカおよび南アメリカにおける主要な健康の問題である。この疾患は、温度的に二形成の真菌である、Paracoccidioides brasiliensisによって引き起こされる。古典的に、診断は、多数の芽の特殊な「パイロットホイール（pilots wheel）」形態学を有する酵母細胞を検出することによってなされてきた。不運にも、このような形態は臨床材料において常に観察されるものでなない。組織学的に、この種の酵母の形態は、ときどきHistoplasma capsulatum、Blastomyces dermatitid is、Coccidioides immitis、およびP．loboiの形態と区別されにくい。P．brasi liensisは、診断にもなる糖タンパク質抗原を産生し、この抗原は、P．loboiによってもまた産生される。P．brasiliensisは、インビトロで培養され得る；しかし、P．loboiは培養され得ない。P．brasiliensisは、生物中でゆっくりと増殖し、同定には１〜３週間の培養を要し得る。明確に、P．brasiliensisに対する種特異的なプローブの存在は、迅速な検出および同定のために顕著な価値を有するものである。 Pneumocystis cariniiは、免疫力がない患者に感染する一般的かつ主要な日和見感染の病原体の真菌である。感染を防止するための予防的な処置をしなかった場合、80％より多いHIV感染患者が、P．carinii肺炎を発症する。それゆえこの真菌は、AIDS患者における疾患率および死亡率の最も重要な原因の１つとして広く認識されている。今日までに、６つの異なる遺伝子標的を指向するポリメラーゼ連鎖反応プライマーが開発されている。これらは5Sおよび18rDNA遺伝子を含み、リボソーム遺伝子間の遺伝子内転写スペーサー配列、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、およびミトコンドリアの大リボソームrDNA遺伝子を含む。しかし、プライマーの各々のセットは、最適に機能するために独特かつ特異的なPCR条件のセットを必要とする（Luら、J．Clin．Microbial．33:2785-2788，1 995）。分子技術の最近の進歩は、リボソーム遺伝子のDNA配列に基づく微生物の検出および同定のアプローチに導いた。一般的に使用される検出技術は、ポリメラーゼ連鎖反応によるリボソームDNA（rDNA）遺伝子の直接的な増幅、またはリボソームRNA（rRNA）の相補的DNA（cDNA）への逆転写、および引き続くcDNAのポリメラーゼ連鎖反応のいずれかを含む。リボソームは、メッセンジャーRNAのタンパク質への翻訳において機能する独特なrRNAおよびタンパク質種の複合物である。進化の研究は、単一の生物からすべての現存する生命が進化してきたという説明と一致している。従って、すべての細胞生物はrRNAを含み、そしてこれらのrRNA は進化に関係している。進化の過程は、各々の生物の種がそのリボソーム遺伝子において独特の配列の領域を有するようなものである。このような独特な種特異的な領域の存在は、ハイブリダイゼーション条件下で、真菌の１つの種のみに由来のポリメラーゼ連鎖反応増幅DNAに特異的に結合し、そして同定するDNAプローブの設計を可能にする。この適用の目的のために、用語「プライマー」は、鋳型指向性の重合化によって伸長され得るヌクレオチド配列を意味するために使用され、そして「プローブ」は、ハイブリダイゼーションによってその相補的な配列を検出し得るヌクレオチド配列を意味するために使用される。また、この適用の目的のために、句「ヌクレオチド配列」は、DNAもしくはRNA形態、またはその改変体のいずれかを含むことを意味する。さらに、当業者はプライマー配列がプローブとして使用され得ること、およびその逆を認識する。目的の特異的な核酸配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションの使用はまた、Kohne（米国特許第4,851,330号、7/1989）によって記載される。原核生物および真核生物において、リボソームRNAおよび対応するrDNA遺伝子は、RNAのサイズによって同定される。サイズは、沈降速度またはS値に関して関連している。従って、原核生物の場合、その値は5S、16S、および23Sであり；真核生物の場合、その値は5S、5.8S、18S、および28Sである。すべてのリボソームが、細胞の生存能力に必須である同一の機能を行うため、リボソーム配列は広く保存されているが、各々のリボソーム種の特定の領域はなお、機能に影響を与えない、より多くの変化をこうむる。同じ属のメンバーの中の異なる種の同定を可能にするのは、これらの超可変領域である。参考文献に記されているように、5S 、18S、および5.8Sと28SのrDNAとの間の遺伝子間スペーサーが、真菌の検出および同定に使用された報告がいくつか存在する（Holmesら、Hopferら、Lottら、Ma iwaldら、Makimuraら、Mitchellら、Nakamuraら）。Holmesらは、5S rDNAおよび隣接する非転写スペーサー領域の同時増幅に基づくPCR試験を記載する。これは、Candida albicansおよび他のCandida種を、個々の生物を同定することなく検出する。HopferらおよびMaiwaldらは、両方ともがCandida sp.、Aspergillus fu migatus、Cryptococcus neoformansおよびTrichosporon sp．を含むいくつかの真菌由来の18S rDNAを増幅するためにユニバーサルプライマーを使用する。これらのアンプリコンは制限酵素によって消化され、そして切断フラグメントはゲル電気泳動によってサイズを調べられる。この制限フラグメント長の多型パターンは、すべてではないにしても大部分の生物の同定を可能にする。この技術は、純粋な真菌培養物由来の増幅されたDNAにも使用され得る。唾液のような臨床試料は、通常多くの真菌生物を含むので、この技術は診断においてほとんど有用性を有さない。なぜなら、真菌の混合物から得られる多数の重複するフラグメントは、ほとんど解釈が不可能であるからである。Lottらは、5.8S RNAおよび内在性転写スペーサー（ITS2）を使用して、Candida albicansおよび関連するCandida種を同定および種決定する。Makimuraは、25の医学的に重要な真菌の18S rDNA由来の68 7bpフラグメントを増幅し、そして臨床的試料におけるCandida albicansの診断においてこれらを使用する。MitchellはネステッドPCRを使用して5.8Sおよび内在性転写スペーサー（ITS）を増幅してCryptococcus neoformansを同定する。増幅DNAの同一性の証明のための引き続く試験はなされていない。Nakamuraらは、肺のAspergillus fumigatusの感染を検出するために18Sプライマーを使用する。これらの参考文献中に与えられる大部分のプロトコールは、臨床検体からの極端に限られた数の真菌を検出するために使用され得るのみである。Hopferらおよび Maiwaldらは、純粋な培養物由来の多数の生物を同定し得るが、最も良好な場合でも多数の真菌を含む臨床検体に対する有用性は限られている。真菌における18S小サブユニットリボソームRNA配列の検出のために開発されたプローブについての米国特許は、Weisburgらに与えられた。これらのプローブは、多くの種由来の真菌を検出するが、任意の単一の種を同定するために容易には使用され得ない。16Sリボソーム配列に基づく細菌Staphylococcus aureusの特異的な検出のために開発されたプローブについての米国特許はまた、Millimanらに与えられた。Hoganら（欧州特許出願第0,272,009号）は、18S rRNAについての１つの真菌プローブ、および28S rRNA配列についての３つの真菌プローブを記載する。これらの28Sプローブの内の２つは、いくつかの異なる真菌を検出するが、第３のプローブは、10の真菌の限られたパネルからのCandida kruseiを検出する。Hoganらによって記載される28Sプローブのいずれもが、本発明に記載されるプローブのいずれとも関連しない。本発明において請求されるすべてのプローブは、28S遺伝子の最初の900塩基対内にマッピングされ得る。Hoganらによって記載されるプローブは、28S配列上の1000塩基対と2000塩基対（これらの数字はSacch aromyces cerevisiaeの28S rRNA遺伝子の一次配列に適合し得る、Genbank登録番号：J01355）の間のさらなる３’に位置する。Leclercらは、彼らによって配列決定されたいくつかの真菌28S遺伝子の部分DNA配列に基づく真菌間の系統学的な関連性を分析した報告を公表した。Leclercによって配列決定されたと主張されるいくつかの生物は、本発明者らによって配列決定されたいくつかの生物と同じである。これらは、Sporothrix schenckii、Pseudallescheria boydii、Blastomyces dermatitidis、Histoplasma capsulatumおよびChrysosporium sp．である。Lec lercらは、彼らの報告においていかなる配列データも公表しておらす、そして本発明者らの最良の知識をもってしても、彼らはこれらの配列を利用可能に公表していない。彼らの配列決定プライマー401（TCCCTTTCAA CAATTTCACG）の逆方向相補的配列は、本発明者らの配列番号１（GTGAAATTGT TGAAAGGGAA）と19ヌクレオチド重複し、そして彼らの配列決定プライマー636（GGTCCGTGTT TCAAGACGG）は、本発明者らの配列番号２（GACTCCTTGG TCCGTGTT）と10ヌクレオチド重複する。本発明者らは、種特異的な診断プローブの開発のための標的として使用される、真菌の28S rRNA遺伝子由来の可変領域の文献が報告されていないことを承知している。上記のように、真菌の分子検出のための大部分の存在する技術は、１つの真菌種のみのPCR増幅のための高度に特異的なプライマーの使用に依存する。多数の生物からのDNAのPCR増幅のための「ユニバーサル」プライマーの使用は、真菌の純粋な培養物にのみ有用なPCR後アンプリコン同定技術を使用する。これらの技術は、多数の真菌生物を含む臨床検体の真菌を同定し得ない。本発明者らの最初の目的は、28S遺伝子に対する「ユニバーサル」プライマーを開発することであった。これらのプライマーは、PCRにおいて大部分の真菌由来の28S rDNAを増幅し得る。本発明者らの次の目的は、本発明者らの「ユニバーサル」28Sアンプリコンを分析するために使用される、目的の真菌の種特異的プローブを開発することであった。これらの種特異的プローブは、混合された真菌種を含む状況においてさえ、目的の真菌の存在を検出し得る。本発明の１つの局面は、大部分の真菌のDNAまたはRNA由来の28S配列を検出し得る核酸プライマーを提供することである。これらのプライマーは、臨床試料、食物試料、環境試料または他の試料中に存在する任意の真菌由来の28S配列を、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅するための「ユニバーサル」プライマーとして使用され得る。これらの「ユニバーサル」プライマーはまた、増幅されたDNA を配列決定するために使用される。得られた配列は、公知の真菌の配列のデータベースと比較することによって、真菌を同定するために使用され得る。本発明の第２の局面は、核酸ハイブリダイゼーションによって、病原体Asperg illus fumigatus、Blastomyces dermatitidis、Candida albicans、Coccidioide s immitis、Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、Aspergillus flavus、Aspergillus glaucus、Aspergillus niger、Aspergillus terreus、Can dida glabrata、Candida guilliermondii、Candida kefyr、Candida krusei、Ca ndida lusitaniae、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Paracoccidio ides brasiliensis、Pneumocystis carinii、Psudallescheria boydii、Sporoth rix schenckiiおよび他の種（表１および表２）を検出および同定し得る核酸プローブを、いくつかの異なる形式のいずれかの使用によって、提供することである。さらに、ヌクレオチド配列情報が、DNA配列比較（表３）によって、またはさらなるプローブの構築によって、これらの病原体および他の真菌を同定するために提供される。発明の要旨ヒトおよび動物における疾患、ならびに食物および飲料の腐敗を引き起こす真菌を検出するための核酸プローブおよびプライマーが記載される。これらのプローブは、臨床試料、環境試料、または食物試料中の真菌の大部分から、rRNA、rD NA、またはポリメラーゼ連鎖反応産物を検出し得る。Aspergillus fumigatus、B lastomyces dermatitidis、Candida albicans、Coccidioides immitis、Cryptoc occus neoformans、Histoplasma capsulatum、Aspergillus flavus、Aspergillu s glaucus、Aspergillus niger、Aspergillus terreus、Candida glabrata、Can dida guilliermondii、Candida kefyr、Candida krusei、Candida lusitaniae、 Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Paracoccidioides brasillinsis 、Pneumocystis Carinii、Psudallescheria boydii、Sporothrix schenkiiおよび他の種に特異的な、核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブもまた記載される（表１および表３）。図１は、真菌の28Sサブユニット上の記載される配列の相対的位置を示す。発明の詳細本発明者らの第一の目的は、臨床試料中に存在する可能性の高い全ての真菌から28S遺伝子を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応における使用のための核酸プライマーを開発することであった。次いで、この増幅DNAは、いくつかの異なる種特異的プローブを用いてプローブし易い。これらの種特異的プローブの各々は、ハイブリダイゼーション条件下で、真菌の１つの種のみからの28SリボゾームDNAにアニーリングし、それにより臨床試料中に存在する真菌の種を検出および同定する。28S遺伝子が、標的として選択された。なぜなら、真菌の間で保存された領域を有し、そしてこれらは、「ユニバーサル」真菌プローブのための潜在的なアニーリング部位を提供するからである。リボソーム28S遺伝子はまた、種特異的プローブのための部位を提供するのに十分独特である超可変領域を有することが予想された。大きなrRNA遺伝子は、原核生物において23S rRNA遺伝子、そして真核生物において28Sと呼ばれる。この命名は、長さ、従ってこれらのrRN A分子の沈降係数に基づいている。真菌の大きなサブユニットrRNAは、異なる生物間でサイズが変化し、そしてしばしば25S、26S、または28Sとして言及される。真菌は、真核生物であるので、そしてこの出願において一貫性を維持するために、本発明者らは、真菌の大きなサブユニットrRNAを28Sr RNAと呼ぶ。 Cryptococcus neoformans、２つのCandida albicans、Saccharomyces cerevis iae、および２つのSchizosaccharomyces pombe 28S遺伝子由来の公開された配列は、約3.5キロベース長である(Genbank登録番号：L14068、L28817、X70659、Jo1 355、Z19136、およびZ19578)。これらの４つの配列は、整列され、そして配列可変性の領域は、これらの遺伝子の5’末端から200と700との間の位置にクラスター化していることが見出された。最初の開始点として、２つの核酸プライマーP1 (ATCAATAAGC GGAGGAAAAG)(配列番号79)およびP2（CTCTGGCTTC ACCCTATTC）（配列番号80）（図１を参照のこと）（上記の４つ全ての生物のそしてヒトのではない28S配列(GenBank登録番号：M11167)にハイブリダイズし得る）が設計され、そしてMayo Clinic真菌コレクションから入手した以下の34の真菌に由来するこの超可変領域にわたるDNAの約800塩基対を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応において、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で使用された：Acremonium種、Aspergillus clavatus、Aspergillus fumigatus、Aspergi llus glaucus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus ochra ceus、Aspergillus terreus、Aspergillus unguis、Aspergillus ustus、Beauva ria種、Bipolaris種、Blastomyces dermatitidis、Candida albicans、Candida glabrata、Candida guilliermondii、Candida kefyr、Candida krusei、Candida lusitaniae、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Chrysosporium種、 Cladosporium種、Coccidioides immitis、Cryptococcus neoformans血清型Ａ、C urvularia種、Geotrichum種、Histoplasma capsulatum、Mucor種、Penicillium 種、Pseudallescheria boydii、Saccharomyces Cerevisiae、Sporothrix schenk ii、およびTrichosporon beigelii。 DNAは、上記の真菌から以下の方法によって抽出された。白金耳一杯の真菌の培養物を、滅菌接種白金耳を使用して培養プレートから掻き落とした。真菌に、 1.5ml Sarsted（Newton，North Carolina）スクリューカップ微量遠心管中において、1ミリリットルの滅菌水を添加した。この管を、20分間沸騰水浴中に置いて、真菌を溶解し、そして細胞からDNAを放出させた。この全細胞溶解物の２マイクロリットルを、PCRにおいて使用して、28S rDNAを増幅した。全てのPCR増幅を、50μl反応容量中で、Perkin-Elmer(Norwalk，CT)の0.5ml薄壁ポリプロピレン管およびPerkin-Elmerサーマルサイクラーを使用して、ホットスタート反応として行った。管に最初に添加した試薬は、2.5μlの10×PCR緩衝液(100mM tris p H8.3、500mM KCl，15mM MgCl₂)、5.0μlの50％グリセロール/1mMクレゾールレッド、8.0μlのdNTPミックス(各1.25mMのdATP、dGTP、dTTP、およびdCTP)、12ピコモルの各核酸プライマー、および25μlの容量にするための滅菌水であった。ワックスビーズ（Ampliwax Gem-100，Perkin-Elmer）を添加し、そして管を1分間7 7℃まで加熱し、そしてワックスバリアを形成するために室温まで冷却した。2.5 μlの10×PCR緩衝液、5.0μlの50％グリセロール/1mMクレゾールレッド、0.2μl のTaqポリメラーゼ（AmpliTaq 5U/μl、Perkin-Elmer）および15.3μlの滅菌水を、上記の真菌全細胞溶解物由来の2.0μlのDNAとともに管に添加した。50サイクルのサーマルサイクリングを、94℃−30秒、40℃−1分、72℃−2分で行った。増幅したDNAを、電気泳動し、そして低融解アガロースゲルから、tris緩衝化フェノール(pH8.0)、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：１、容量による）、および３回のエーテル抽出、続いてイソプロパノール沈殿および70％エタノールウォッシュによって精製した。本発明者らは、完全に、上記の生物から増幅したDNAの両方の鎖を配列決定した。全ての配列決定を、Applied Biosystems 373Aシークエンサー上で行った。生成された配列中の全てのヌクレオチドを、評価し、そして第二鎖配列からの相補ヌクレオチドを試験することによって確認した。本発明者らは、今や、医学的に重要な真菌の広範なコレクションに由来する28S rDNAの可変領域にわたる核酸配列からなる新規のデータベースを作製した。 Candida albicans、Cryptococcus neoformans、およびSaccharomyces cerevis iae 28S遺伝子についての完全な配列は、以前に公開されており、そしてGenBank に寄託されているが、これら３つの生物間の配列同一性の任意の領域が、全ての目的の真菌間でもまた保存されているか否かは、明らかでなくまた規定されてもいない。本発明者らの新規の28Sデータベースにおける全ての真菌由来のDNA配列は、「ユニバーサル」28Sプローブを開発するために分析されなけれなならなかった。全ての配列は、「ユニバーサル」プローブとして使用するための類似性の領域を同定するために、最適な相対的アラインメントを同定するための広範な操作に供された。選択されたプローブ配列は、ほとんどの真菌種由来の28S遺伝子に存在するという条件のほかに、いくつかの重要な基準を満たさなければならなかった。各プローブ配列は、適切なサーマルプロフィール、二次構造、およびDNA 増幅反応における有用性を必要とした。これらのプローブは、真菌の純粋な培養物、ならびに臨床的検体の場合のように多数の供給源由来のDNAの存在下でのPCR 増幅に利用するために最適化された。プローブはまた、増幅されたDNAの直接的な配列決定を容易にするために設計された。本発明者らの分析は、（配列番号１）および（配列番号２）に列挙されるオリゴヌクレオチドプローブの発見に導いた。（それらの位置については、図１を参照のこと）。これらの２つのプローブ（（配列番号１）および（配列番号２））の首尾よい同定は、大部分の真菌由来の28S rRNAおよびrDNAにハイブリダイズし、そして検出する核酸プローブを開発するという本発明者らの第一の目的を完了させた（図１および表１）。本出願において後に示されるように、本発明者らの「ユニバーサル」プローブを使用して生成した新規の配列情報により、本発明者らは、21の異なる疾患誘発真菌を同定し得る種特異的プローブ（（配列番号３）から（配列番号23）、（配列番号75 ）、および（配列番号76））を開発することができた。表１： 28S核酸配列におけるプローブ（配列番号１および配列番号２）についてのハイブリダイゼーション部位の存在。プローブ（配列番号１および配列番号２）は、以下の51の生物に由来するこの可変領域にわたるDNAを首尾良く増幅（表2）および配列決定（表3）するために使用された：このリストは、Cryptococcus neoformansの４つ全ての血清型(A、B、C、およびD )を含む。プローブ（配列番号１および配列番号２）を使用して生成したこの配列情報は、真菌の28S配列からなる本発明者らのデータベースのサイズを拡大させた。全ての増幅されたDNAは、生成されたデータの精度を確実にするために各生物の最低２つの異なる単離体からの両方の鎖にわたって配列決定された。表２：プローブ（配列番号１および配列番号２）での28S rDNAのポリメラーゼ連鎖反応増幅。本発明者らによって配列決定された真菌のこのリストは、ヒトにおける皮下および深部(deep)糸状菌感染のほとんどの場合の原因である生物を表し、そしてまた、臨床的な単離体において一般に遭遇する雑菌（非病原性真菌）を含む。２つのプローブ（配列番号１および配列番号２）は、上記の全ての真菌由来の28S rD NAにハイブリダイズし、これらは、臨床的検体に存在する可能性のある真菌の大部分の存在を診断し得る。これらは、ユニバーサルに検出する真菌についてのプライマーであると考えられている。配列番号１および配列番号２に列挙されるプローブはまた、GenBankに列挙される、539の細菌の23S遺伝子の間でのハイブリダイゼーション部位の検索によって、細菌由来の23S配列にハイブリダイズし、そして増幅（ポリメラーゼ連鎖反応において）するその潜在的な能力についてチェックされた。細菌の23S rDNAは、配列番号１および配列番号２についての適切なハイブリダイゼーション部位を有さず、そしてこれら２つのプローブは、ストリンジェントな条件下で細菌DNA を増幅し得ない。本発明者らの第二の目的は、ハイブリダイゼーション条件下で、以下のものを検出する種特異的プローブを開発することである：本発明者らは、本発明者らが配列決定した全ての生物の多配列アラインメントを作成するための真菌28S核酸配列の本発明者らのデータベースを使用した。全ての個々の配列を、目的の真菌にのみ存在し、そして全ての他の真菌には存在しない配列の独特の領域を発見するために、本発明者らのデータベースにおける全ての他の配列との広範な比較に供した。配列の独特のストレッチが同定された場合、これらはサーマルプロフィールおよび二次構造についてさらに分析された。本発明者らによって構築された各プローブは、ハイブリダイゼーション条件下で、唯一の特定の標的真菌の独特の領域からの核酸配列に特異的にハイブリダイズし、そしてそれを検出する。当業者は、一本鎖DNA配列の特定化は、相補DNA配列および２つの等価なRNA配列の有用性を意味することを認識する。さらに、核酸（すなわち、塩基、糖、または骨格）を含む任意の部分の改変を取り込んだ配列は、配列の機能的等価物である。これらのさらなる配列は、プローブまたはプライマーとして潜在的に作用し得ることがまた認識されるべきである。最後に、当業者は、広範なDNA配列の比較が、生物を種分化するのに十分な可変性および独自性を提供することを認識する（表３）。これらの種特異的合成プローブの核酸配列は、配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76に列挙される。Cryptococcus neoformansに特異的な２つのプローブ、Sporothrix schenckiiに特異的な２つのプローブ、およびAspe rgillus fumigatus、Blastomyces dermatitidis、Candida albicans、Coccidioi des immitis、Histoplasma capsulatum、Aspergillus flavus、Aspergillus gla ucus、Aspergillus niger、Aspergillus terreus、Candida glabrata、Candida guilliermondii、Candida kefyr、Candida krusei、Candida lusitaniae、Candi da parapsilosis、Candida tropicalis、Paracoccidioides brasiliensis、Pneu mocystis carinii、およびPseudallescheria boydii 28S rRNAおよびrDNAについて各１つのプローブが存在する（表４〜８およびさらに以下の考察を参照のこと）。本発明者により開発された全ての種特異的プローブは新規であり、そして本発明者らの最良の知識では、文献に報告されていない。本発明者らにより配列決定された全ての28S遺伝子は、分析した種々の種の間で異なるいくつかの領域を有していたが、この領域は、種特異的プローブとして、ハイブリダイゼーションが明らかではない条件下で最も良く機能する。各28S配列の大規模な分析は、いくつかの潜在的なプローブ部位を生じた。これらは、各プローブについて最適な特有の部位の選択を可能にするために、試験条件下で最適なハイブリダイゼーション特性を得る必要性に基づいて詳細に研究された。次いで、本発明者らにより開発された全てのプローブ配列の非常に特異的なハイブリダイゼーション特性は、実験結果によって確証された。Candida albicansならびに血清型ＡおよびＢのCr yptococcus neoformans 28S遺伝子についてのGenBankの配列（GenBank登録番号L 14067およびL14068）における以前の存在は、それ自体では、当業者でさえも、これらの２つの生物のいずれかについての特異的プローブの開発を可能にするのに十分ではなかった。本発明者らが、以下に列挙した他のものと交差反応しない、これらの２つの真菌生物についての種特異的プローブを開発するための潜在的な領域を同定し得る以前には、本発明者らは、以下から新規な28S配列を得なければならなかった： Chomczynskiの技術（以下の実施例２を参照のこと）についての本発明者らの改変は、本発明者らが、供給源とは無関係に任意の臨床標本（試験した種々の臨床標本については表10を参照のこと）から３時間以内にDNAを得ることを可能にする。PCR増幅およびその後のプロービングは、24時間以内に容易に達成され得る。それゆえ、最終同定は、伝統的な方法では数日または数週間が必要とされるのとは対照的に１日で可能である。診断のこの速度および感度は、原因が決定されていない真菌性疾患と戦っている衰弱した患者における生存と死との差を成し得る。迅速な診断は、患者が未知の真菌で倒れるのを数日間または数週間待つのではなく、医者が直ちに彼らの療法を同定された原因真菌の処置に指向させるのを可能にする。本発明者らのプローブは、その高レベルの特異性によって、混合真菌感染においてさえも正確な標的生物を拾う能力を有する。HopferらおよびMaiwaldらの方法は、混合真菌感染における個々の種の同定を可能にしない。なぜなら、制限フラグメント長多型の結果は、複数の生物が制限フラグメントに寄与する場合には解釈することがほぼ不可能であるからである。それゆえ、彼らの方法は、純粋培養物に対してしか用いられ得ず、そしてこれはまた、診断時間を節約しない。なぜなら、真菌をまず培養において増殖させねばならないからである。本発明者らにより開発されたプローブは、DNAの１つだけのPCR増幅フラグメントに対する複数のプローブの使用により、多数の病原性真菌の迅速な種の同定を可能にする。本発明者らの改変DNA抽出技術および本発明者らが混合生物の場合に正確に診断する能力と結びついて、このストラテジーは、最少量の時間において最大量の診断情報を提供し得る。この診断ストラテジーはまた、自動化しやすく、自動化は時間、費用、および労力をさらに大いに節約することになり得る。この開示において請求される配列および配列の相補体は、これらの配列への任意の改変を伴って、いくつかの存在する方法論に基づく真菌の同定のためのアッセイにおいて、ならびにこの技術の将来の改良および改変物において潜在的に利用され得る。これらの技術は、ハイブリダイゼーション、連結、重合、解重合、配列決定、化学分解、酵素消化、電気泳動、クロマトグラフィー、および増幅に基づくアッセイを含むがこれらに限定されない。さらに、全てのこのような改変は、最終的に、本願において請求される配列（配列番号１）〜（配列番号23）、（配列番号75）および（配列番号76）を認識または利用する、いくつかの選択もしくは増幅プロセス、いくつかのリガンドまたはいくつかの核酸部分に基づく。このような改変は、種々の線型または指数関数的標的増幅スキームの使用（例えば、任意の多数の形態のPCR、リガーゼ連鎖反応、Q-βレプリアーゼ（Q-beta re pliase）など）；（配列番号３）〜（配列番号23）、（配列番号75）および（配列番号76）の群から選択されるプローブを用いる、純粋な真菌培養物から精製または抽出した種特異的核酸の直接検出；（配列番号１）〜（配列番号23）、（配列番号75）および（配列番号76）の相補的DNA形態の使用；これらの配列およびそれらの相補体のRNA形態の使用；ならびに種々の標識（核酸配列、タンパク質、アクリジニウムエステルのようなシグナル生成リガンド、および/または常磁性粒子を含む）からの１以上のレポーター部分の付加によるこれらのDNAまたはR NA配列の誘導体の使用を含むがこれらに限定されない。これらの技術は、標的または検出分子のいずれかとして用いられるDNA、RNA、または改変された誘導体を用いて利用され得る。 25個の配列（配列番号１〜配列番号23、配列番号75および配列番号76）に加えて、本発明者らはまた、さらに53個の配列（配列番号24〜配列番号74、配列番号 77および配列番号78）を記載する。これらの53個の配列は、配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76を含み、そして参照S.cerevisiae 28S rRN Ａ遺伝子の塩基番号431に対応する座標１を有する複数の配列アラインメント（表３）として示される（数字は、S．cerevisiae 28S rRNA遺伝子の一次配列と比較される。GenBank登録番号：J02355）。これらの配列を、種々の真菌からの28S rDNAを配列番号１および配列番号２のプライマーを用いて増幅し、そして配列決定することにより得た。（配列番号１は、参照S.cerevisiae遺伝子の座標403 〜422に対応し、そして配列番号２は座標645〜662に対応する。）これらの整列された配列の分析は、本発明者らが種特異的プローブである配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76を開発するのを可能にした。そしてこれらのプローブについての部位は、下線を付して示す。これらの53個の整列された配列は、当業者が、10〜50ヌクレオチド長のさらなる種特異的ハイブリダイゼーションプローブを開発するのを可能にするのに十分な可変性を含む。同様に、200+ヌクレオチド長全体を含む、より長い種特異的ハイブリダイゼーションプローブもまた、想像され得る。種の同定はまた、配列番号１および配列番号２のプライマーを用いて増幅した任意のDNAの直接DNA配列決定により達成され得る。誘導した配列が、配列番号24〜配列番号74、配列番号77、および配列番号 78の任意の配列のほぼ98％以上にマッチした場合、この生物の正体が確認され得る。従って、本発明者らは、配列番号24〜配列番号74、配列番号77、および配列番号78の一部が、属以上のレベルで系統発生学的に整列された真菌群に特異的であり得ることを認識する。配列番号24〜配列番号74、配列番号77、および配列番号78、それらの相補体はまた、これらの配列に対する任意の改変を伴って、配列番号1〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76について上記に記載したように、存在する方法論および将来の技術に基づく真菌の同定についてのアッセイにおいて潜在的に利用され得る。表３：（配列番号24）〜（配列番号74）、（配列番号77）、および（配列番号78）についての複数の配列アラインメント表３に対する説明：複数の配列アラインメントは、配列番号１および配列番号２のプライマーを用いて増幅した28SリボゾームRNA遺伝子の配列を示す。23個の種特異的プローブ（配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76）を下線を付して示す。同じ生物の２つの単離株間の重要でない配列の改変は、適切なコードにより示される（以下の解読を参照のこと）。Rhizopus種間の重要な相違は、アラインメント中に３つの別々のRhizopus配列を含めることにより示される。（この図における生物は、それらの配列関連性に従って列挙される。）記号に対する解読： (.)アラインメントを容易にするための配列におけるギャップ (Ｒ)ＡまたはＧ (Ｗ)ＡまたはＴ (Ｙ)ＴまたはＣ (Ｍ)ＡまたはＣ (Ｋ)ＴまたはＧ (Ｓ)ＧまたはＣ (Ｂ)Ｔ、Ｇ、またはＣ任意の名称の配列を利用する本発明のさらなる改変は、当業者に明らかである。以下の実施例は、本発明の種々の局面を例示するが、その有用性を限定することを意図しない。実施例１．配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76のプローブのハイブリダイゼーション特異性についての試験。配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76に列挙したプローブを、それらの標的生物に対する特異性について試験した。Candida albicansについての配列番号５のプローブは、Mayo Clinicコレクションから取得した真菌のパネルに対して試験した最初のプローブであった。以下からの28S rDNAを、配列番号１および配列番号２のオリゴヌクレオチドプローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応において増幅した：全てのPCR増幅を、ホットスタート反応として50μlの反応容量において、Perkin -Elmer（Norwalk，CT）0.5ml薄壁ポリプロピレンチューブおよびPerkin-Elmerサーマルサイクラーを用いて実施した。チューブに最初に添加した試薬は、2.5μl の10×PCR緩衝液（100mM tris pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂）、5.0μlの50％グリセロール/１mMクレゾールレッド、8.0μlのdNTP混合物（各々1.25mMのdATP 、dGTP、dTTP、およびdCTP）、各々11ピコモルの核酸プライマー、および25μl の容量にするための滅菌水であった。ワックスビーズ（Ampliwax Gem=100、Perk in-Elmer）を添加し、そしてチューブを77℃まで30秒間加熱し、そして室温まで冷却してワックスのバリアを形成させた。2.5μlの10×PCR緩衝液、5.0μlの50 ％グリセロール/１mMクレゾールレッド、0.2μl Taqポリメラーゼ（AmpliTaq 5U /μl、Perkin-Elmer）、および15.3μlの滅菌水を、上記の真菌の細胞全体の煮沸溶解産物からの2.0μlのDNAとともにチューブに添加した。50サイクルのサーマルサイクリングを、94℃-30秒間、50℃-１分間、72℃-２分間で実施した。各試料からの５μlのポリメラーゼ連鎖反応混合物を、５％ポリアクリルアミドゲルに泳動して、上記に列挙した各真菌からの28S rDNAの首尾良い増幅を視覚的に確認した。増幅した28S rDNAの残りの40μlを、１Ｎ NaOH中で変性させ、そしてこの変性したrDNAの半分を、0.5Ｎ NaOH中で平衡化した正に荷電したポリスルホンベースのメンブレン上にスロットブロットした。このメンブレンを15分間風乾し、そして80℃にて30分間、減圧オーブン中でベーキングした。各種から増幅されたrDNAをここで結合し、そしてメンブレン上に別々のスポットで固定化した。メンブレン上の遊離の結合部位を、メンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液（100mlのハイブリダイゼーション緩衝液を、１ｇの脱脂粉乳、６ｇのNaH₂PO₄、７ｇのSDS、200μlの0.5M EDTAを用いて作製し、そしてNaOHでpH7.2に調整した）中で40℃にて３時間インキュベートすることによりブロッキングした。Candida al bicans（配列番号５）についての特異的プローブを、³²P ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射性リンで末端標識した。50ピコモルのこのプローブを、70mlのハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、そしてメンブレンを40℃ にて一晩プローブした。メンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液中で40℃にて15分間洗浄し、次いで２×SSC中で40℃にて15分間洗浄した。次いで、メンブレンをＸ線フィルムに少なくとも１時間曝露した。配列番号５のオリゴヌクレオチドプローブは、Candida albicansから増幅された28S rDNAにのみハイブリダイズした（表４を参照のこと）。これらのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号５のプローブは、Candida albicansに極めて特異的である。配列番号５のオリゴヌクレオチドプローブの配列は、他の種のCandidaの配列とは、ほんの１または２塩基が異なるが、これらのミスマッチは、安定なハイブリッドが他のCand ida種で形成されるのを防止するために十分である。配列番号３〜配列番号23のプローブを、Candida albicansの配列番号５のプローブについて上記に記載したように、先の段落に列挙した真菌の同じパネルに対して特異性について試験した。Candida albicansの配列番号５のプローブでプローブした正に荷電したポリスルホンベースのメンブレンを、0.5Ｎ NaOH中で40℃ にて10分間洗浄して全ての結合したCandida albicansプローブを除去した。メンブレンを、配列番号３〜配列番号23に列挙した全てのプローブで連続的にプローブした。続いて試験した各々のプローブについて、メンブレンを、少なくとも30 分間ブロックし、プローブハイブリダイゼーションを、40〜42℃にて少なくとも３時間実施し、そしてハイブリダイゼーション後の洗浄を、２×SSC中で20分間行なった。メンブレンを、プロービングの間に、0.5〜1.0Ｎ NaOH中で40〜42℃ での洗浄により剥がした。結果を表４〜７に列挙する。配列番号75および配列番号76のプローブを、改変されたパネルの真菌に対する特異性について、ちようど記載した手順を用いて試験した。試験した特定の生物および得られた結果を表８に列挙する。表４〜表８に示すように、配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76に列挙した各プローブは、１つの標的真菌の28S核酸配列のみに特異的にハイブリダイズする。この特異性は、混合真菌生物を含有する臨床標本中の所定の種の真菌を、高レベルの信頼性で同定するために必須である。これらの表に列挙した生物は、臨床試料から通常単離される大多数の生物を示す。本発明者らは、合計21個の個々の生物を同定する23個の種特異的プローブ（配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76）を開発したが、試験パネルに列挙したさらなる生物を用いて、本発明者らのプローブが、臨床標本中に存在しそうな他の真菌との交差反応性を全く有さないことを確実にした。この非常に多数の病原体を正確かつ高い信頼性で診断する能力および種のレベルで同定する能力は、他のいずれの報告も匹敵しない。本発明者らが、一対の「ユニバーサル（Universa l）」プローブ（配列番号１および配列番号２）により増幅されたDNAをプロービングすることによりこれを達成し得るという事実は、23個の異なるプローブ（配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76）を用いて単一の増幅された標的を試験する能力を提供することにより、時間、費用、および労力を節約するので非常に有利である。 GenBank検索を、類似の遺伝子配列がこのデータベースに存在するか否かを決定するために、配列番号３〜配列番号23、配列番号75、および配列番号76に列挙した全てのプローブを用いて実施した。Candida albicans、Cryptococcus neofo rmansについての28S配列は既にGenBankに存在し、そして期待されたように、Can dida albicansおよびCryptococcus neoformansについてのプローブは、これらの２つの生物からの28S配列を正確に同定した。10個の他のプローブはまた、28S遺伝子と関連しない種々の遺伝子からのDNA配列と一致した（表９）。なぜなら、短いストレッチの配列同一性は、しばしば、同じまたは異なる生物由来の関連しない遺伝子において、任意の問合せ配列について見出され得るので、これは、期待された。この観察は、当業者に公知である。全ての場合において、プローブ配列にマッチした配列は、28S rRNA遺伝子内に位置しなかった。本発明者らのプローブを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応において本発明者らの配列番号１および配列番号２のプローブを用いて以前に増幅した28S DNAを分析した。ストリンジェントな条件下で、これらの２個のプローブは、真菌の28S rRNA遺伝子由来のDNA のみを増幅する。それゆえ、表９に列挙した非28S遺伝子から増幅したDNAは、配列番号３〜配列番号23のプローブのハイブリダイゼーションに利用可能ではない。非28Sの増幅されない遺伝子における関連配列の存在は検出されず、従って、本発明者らの検出および同定ストラテジーの感度にも特異性にも何の影響も有さない。表４：配列番号３〜配列番号８のプローブを使用した種特異的な28S配列の検出表５：配列番号９〜配列番号14のプローブを使用した種特異的な28S配列の検出表６：配列番号15〜配列番号20のプローブを使用した種特異的な28S配列の検出表７：配列番号21〜配列番号23のプローブを使用した種特異的な28S配列の検出表８：配列番号75〜配列番号76のプローブを使用した種特異的な28S配列の検出表９： GenBank検索は、配列番号３〜配列番号23、配列番号75および配列番号76のプローブに100%同一性を有する、他の生物からの列挙する遺伝子をもたらす。 ^*記:本明細書において上記で議論したように、28Sに関連しない遺伝子における配列番号３〜配列番号23、配列番号75および配列番号76のプローブに類似した配列の存在は、本発明者らの診断上のストラテジーの特異性にも感度にもいかなる影響も有さない。本発明者らの種特異的プローブは、（以前に配列番号１および配列番号２の本発明者らのプローブを使用してポリメラーゼ連鎖反応中において増幅された）28S DNAの分析に使用される。この２つのプローブは、カラム#4(GE NE MATCHED)中で28S以外のいかなる遺伝子からもDNAを増幅せず、それ故、28Sでないこれらの遺伝子から増幅されるDNAは、配列番号３〜配列番号23、配列番号7 5および配列番号76のプローブのハイブリダイゼーションに利用可能ではない。実施例２．特定の真菌生物についての臨床標本を試験するための実施例１の方法の使用健康な個体の気道および消化管より得られた臨床試料は、ほとんどいつも、いくらかの真菌の微生物叢をふくむ。これらの真菌の殆どは病原性でないが、病原性真菌についての伝統的な免疫化学的診断テストで偽陽性を与え得る。本発明者らは、痰および切開ドレナージ管から椎間円板および肺生検に及ぶ多様な供給源から、44臨床標本を得た。伝統的なスメアおよび培養の結果は、全44 標本が少なくとも１タイプの真菌を含んでいることを示した。本発明者らのプローブの効力をテストするために、本発明者らは全44臨床試料からDNAを抽出し、そして配列番号１および２のプローブをポリメラーゼ連鎖反応に使用し、これらの試料中にある真菌の28S配列を増幅した。 ChomczynskiおよびSacchiの技術（細胞および組織からRNAを優先的に抽出するための酸性グアジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルムの使用を本来記述する）についての本発明者らの改変物により、全臨床試料からDNAを抽出した。本発明者らは室温での細胞溶解を煮沸溶解に取り替え、酸性グアジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出物をアルカリフェエノール-グアジニジンチオシアネートに取り替え、細胞からDNAを優先的に抽出した。o-リングシールを備えた1.5ml Sarsted(Newton、North Carolina)ポリプロピレンスクリューキャップチューブを抽出に使用した。200ulの標本を500ulのGPT試薬50mM tr is upH8.3に溶解した6Mグアジニジンチオシアネート、tris pH8.0中で緩衝化した等容量のフェノールと混合した)に添加した。これをボルテックスで混合し、直ちに沸騰中のウォーターバスに15分間置いた。チューブを５秒間微量遠心分離機で遠心分離し、そして250ulのクロロホルム／イソアミルアルコール(容量比24 :1)を添加し、ボルテックスで混合した。液相は10分間の遠心分離で分離され、そして450ulの水相（上相）を新しいチューブに移した。水相を500ulの100%イソプロパノールと混合し、そして少なくとも1時間-20℃に置いた。この期間の終わりに、チューブを15分間遠心分離し、そして核酸ペレットを乱すことなく上清を除去した。500ulの氷冷70%エタノールを使用してペレットを洗浄し、２回穏やかに反転することにより微量のGPT試薬を取り除き、次に５分間遠心分離をした。エタノールを除去し、ペレットを10分間speed vac中で乾燥させた。ペレットを2 5ulの無菌脱イオン水で再懸濁し、そして5ulを50ul PCR増幅に使用した。実施例１に記述した配列番号１および配列番号２のプローブについての温度サイクル条件を使用したホットスタート反応として、PCRを実施した。ゲル電気泳動は、配列番号１および配列番号２のプローブは全44標本から首尾よくDNAを増幅することを示した。各標本から増幅したDNAを、正に荷電したボリスルホンベースの膜に移した。本発明者らは配列番号３、配列番号５、配列番号６および配列番号７の本発明者らの種特異的プローブを放射性標識し、そして連続的に膜をプローブし、Asperg illus fumigatus、Candida albicans、Coccidioides immitisおよびCryptococcu s neoformansのそれぞれから28S rDNAの存在についてテストした。膜ブロッキング、プローブハイブリダイゼーションおよび洗浄を実施例１に記述されたとおり正確に行った。結果を表10に示す。偽陽性は観察されなかった。このことは、テストされた臨床標本におけるこの４プローブに関して100%の特異性を示している。Aspergillus fumigatusについての12のうち10の培養陽性試料、およびCandida albicansの13のうち11の試料が同定された。このことは、これらの２つのプローブについて約85%の検出感度を示している。さらに２つのうち２つのCoccidioides immitisおよび２つのうち２つのCryptococcus neoformansが正確に同定された(100%の検出感度)。これらの結果に見られるように、本発明で記述されたプローブは優れた効力を有して多種多様な臨床標本に使用され得る。表10．種特異的なプローブを使用した臨床標本中の、Aspergillus fumigatus、Candida albicans、Coccidioides immitis、およびCryptococcus neoformansの検出。実施例３．未知の真菌の生物の、DNA配列に基づく同定本発明者らのプローブの別の有用性は、真菌の純粋培養物の迅速なDNA配列に基づく同定にある。配列番号１および配列番号２のプローブをポリメラーゼ連鎖反応で使用し、未知の真菌から28S rDNAを増輻する。次いで、配列番号１または配列番号２のプローブを配列決定プライマーとして使用し、未知の真菌に属する、この増幅した28S DNAからDNA配列を得る。このDNA配列を、本発明者らのデータベース中の真菌の28S DNA配列と比較し、配列番号３から配列番号78のうち任意の一つのプローブ配列との配列の一致または重複により、真菌類の正体が確認される。この技術は直接、臨床試料に使用し得ない。なぜなら、これらは通常ひとつより多くの真菌からのDNAを含むからである。作製したDNA配列は幾つかの生物体の重複する配列から成る。この技術は、一種類の真菌のみを含む、培養皿、臨床標本、食品、医薬品、環境試料もしくは他の試料上の単一の真菌のコロニーの迅速かつ信頼の置ける同定において有用性を有する。実施例４．標的DNAまたはRNAの捕獲および同定本発明の開示に記述された全てのプライマーおよびプローブを、任意の検出可能なレポーターもしくはシグナル部分（ラジオアイソトープ、酵素、抗原、抗体、化学発光試薬および蛍光化学製品を含むがこれに限らない）を使用して標識し得る。その上、これらのプローブをその目的の物質を変えることなく、制限部位または他の有用な配列を取り込むように設計されたヌクレオチドの末端付加により、改変し得る。これらのプローブをまた、捕獲部分(常磁性粒子、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン(dioxgenin)、抗原、抗体を含むがこれに限らない)の付加により改変し得るか、または、これらのプローブおよびこのプローブにハイブリダイズする任意のDNAもしくはRNAの固相捕獲および精製を補助するマイクロタイタートレーの壁に付着され得る。フルオレセインはシグナル部分および捕獲部分として使用され得るが、捕獲部位は抗フルオレセイン抗体との相互作用による。これらの改変の代表的な有用性は次のとおりである。配列番号１および配列番号２のプライマーは、以前に記述したとおりに、試料から28S rDNA（存在するならば）を増幅するために利用される。プライマーを、その５’末端にビオチン部分を含むように改変する。ストレプトアビジン固相（例えば、常磁性粒子）を、反応混合物からのPCR産物（存在するならば）の分離に使用する。増幅する標的は、検出可能な部分に付着した第三のプローブ（（配列番号３）〜（配列番号78 ）またはそれらの相補体）に引き続いてハイブリダイズされて、所定の試料中にどの種の真菌が存在するかを決定し得る。それぞれ異なる検出可能な部分で標識された複数のプローブを、増幅した標的を分析するために一度に使用し得る。あるいは、配列番号１および配列番号２のプライマーを、上記のとおりに試料から28S rDNA（存在するならば）を増幅するために利用する。別々の反応において個々に、配列番号１または配列番号２のいずれかを常磁性粒子のような固相捕獲部分への付着によって改変し、そして配列番号３〜配列番号78（またはそれらの相補体）を検出可能な部分の付加により改変する。交互に、単位複製配列中に配列番号１および配列番号２により範囲が示される任意の配列（配列番号３〜配列番号78を含むがこれに限定されない）を、捕獲プローブの設計に使用し得る。固相に付着されたプローブ（配列番号１および配列番号２）のひとつ、もしくは任意の他の適切に設計された配列、および検出可能な部分（配列番号３〜配列番号78、またはそれらの相補体）への付着により改変されたプローブのひとつは、溶液中で、PCR産物（生成しているならば）に互いにハイブリダイズする。存在するならば、ハイブリッドは溶液から捕獲され、検出部分に適切な方法で分析される。ハイブリダイズしたプローブの検出は、どの種の真菌が所定の試料中に存在したかを示す。多数のプローブは、それぞれ異なる検出可能な部分で標識され、増幅した標的を分析するために一度に使用し得る。実施例５．真菌DNAの種特異的増幅本発明において記述されたプローブの他の有用性は、核酸増幅反応による特定の真菌種の直接検出におけるプライマーとしての用法にある。この実施様態において、一方のプライマーは（配列番号１）または（配列番号２）のように、普遍的なものであり、そして他方は（配列番号３）〜（配列番号23）、（配列番号75 ）および（配列番号76）もしくはそれらの相補体からなる群より選択される種特異的なプライマーである。このアプローチの一つのバリエーションは、種特異的プライマーの近傍に位置する任意の機能的な配列を使用した（配列番号１）または（配列番号２）の置換である。このアプローチの別のバリエーションは、配列番号24〜配列番号74、配列番号77、および配列番号78からの任意の適切な種特異的なプライマー対の選択である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．Paracoccidioides brasiliensisに対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブであって、該プローブは、配列番号７５またはその相補物のヌクレオチド残基配列を有する、プローブ。２．Pneumocystis cariniiに対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブであって、該プローブは、配列番号７６またはその相補物のヌクレオチド残基配列を有する、プローブ。３．Paracoccidioides brasiliensisおよびPneumocystis cariniiからなる真菌種の群から選択される１つ以上の真菌種が真菌の試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、該方法が以下の工程：ａ）該試料に含まれる真菌からの核酸物質を抽出する工程；ｂ）２つの公知のオリゴヌクレオチドプライマーを添加する工程、ここで該プライマーの片方が配列番号１または配列番号２であり、該プライマーが該群の真菌種に存在する28S rDNAまたはrRNA上の超可変領域を夾叉する、工程；ｃ）該プライマー間で配列を増幅する工程；およびｄ）該プライマーによって夾叉された超可変領域の一部に指向される１つ以上の標識化プローブを使用する工程であって、各々の該標識化プローブは、各々の該標識化プローブによって同定される該真菌種が該試料中に存在するかどうかを決定するために、該群由来の１つの該真菌種に特異的である、工程、を包含する、方法。４．前記増幅工程において、増幅手順がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３に記載の方法。５．前記１つ以上のプローブが、配列番号７５および配列番号７６からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。６．前記工程（ｄ）において、１つより多いプローブが使用され、前記各々のプローブが、（ａ）異なるシグナル部分または（ｂ）前記プローブの分離を可能にする部分と結合される、請求項３に記載の方法。７．Paracoccidioides brasiliensisおよびPneumocystis cariniiからなる真菌種の群から選択される１つ以上の真菌種が、真菌の試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、該方法が以下の工程：ａ）該試料に含まれる真菌からの核酸物質を抽出する工程；ｂ）配列番号１、配列番号２およびその相補体からなる群から選択されるユニバーサル真菌プローブを添加する工程；ｃ）１つ以上の第２のプローブを使用する工程であって、各々の該第２のプローブは、該群に由来する該真菌種の１つに特異的であり、ここで該１つ以上の第２のプローブがそれぞれ、配列番号７５、配列番号７６およびその相補体からなる群から選択されるヌクレオチド残基配列を有する、工程；およびｄ）各々の該第２のプローブによって同定される該真菌種が該試料中に存在するかどうかを決定する工程、を包含する方法であって、ここで少なくとも１つの該プローブが、単一の部分に結合され、そして少なくとも１つの該プローブが、該プローブの分離を可能にする部分に結合されている、方法。８．Paracoccidioides brasiliensisおよびPneumocystis cariniiからなる真菌種の群から選択される１つ以上の真菌種が真菌の試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、該方法が以下の工程：ａ）該試料に含まれる真菌からの核酸物質を抽出する工程；およびｂ）１つ以上の標識化プローブを使用する工程であって、各々の該標識化プローブは、各々の該標識化プローブによって同定される該真菌種が該試料中に存在するかどうかを決定するために、該群由来の１つの該真菌種に特異的であり、ここで該１つ以上の標識化プローブは、それぞれ、配列番号７５、配列番号７６およびその相補体からなる群から選択されるヌクレオチド残基配列を有する、工程；を包含する、方法。９．配列番号７７またはその相補体のヌクレオチド残基配列を有する、Paracocc idioides brasiliensisに対する種特異的参照オリゴヌクレオチド。１０．配列番号７８またはその相補体のヌクレオチド残基配列を有する、Pneumo cystis cariniiに対する種特異的参照オリゴヌクレオチド。１１．Paracoccidioides brasiliensisおよびPneumocystis cariniiからなる真菌種の群から選択される１つ以上の真菌種が、真菌の試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、該方法が以下の工程：ａ）該試料に含まれる真菌から核酸物質を抽出する工程；ｂ）２つの公知のオリゴヌクレオチドプライマーを添加する工程であって、ここで該プライマーの１つは配列番号１または配列番号２であり、該プライマーは該群の真菌種に存在する28S rDNAまたはrRNA上の超可変領域を夾叉する、工程；ｃ）該プライマー間で配列を増幅する工程；およびｄ）該プライマーによって夾叉された超可変領域の一部に指向される１つ以上の標識化プローブを使用する工程であって、各々の該標識化プローブは、該群由来の１つの該真菌種に特異的であり、ここで各々の該１つ以上の標識化プローブは、各々の該標識化プローブによって同定される該真菌種が該試料中に存在するかどうかを決定するために、該超可変領域中で種に独特なヌクレオチド配列に対して完全に相補的であり、ここでさらに該１つ以上の標識化プローブは、それぞれ、配列番号７７および配列番号７８ならびにその相補体からなる群から選択される配列由来の１０から５０の連続したヌクレオチド残基からなるヌクレオチド残基配列を有する、工程、を包含する、方法。１２．前記増幅手順がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１１に記載の方法。１３．１つより多い第３のプローブが使用され、各々該第３のプローブは、異なるシグナル部分または該第３のプローブの分離を可能にする部分に結合される、請求項１１に記載の方法。１４．Paracoccidioides brasiliensisおよびPneumocystis cariniiからなる真菌種の群から選択される１つ以上の真菌種が、真菌の試料中に存在するかどうかを決定する方法であって、該方法が以下の工程：ａ）該試料に含まれる真菌からの核酸物質を抽出する工程；ｂ）配列番号１、配列番号２およびその相補体からなる群から選択されるユニバーサル真菌プローブを添加する工程；ｃ）１つ以上の第２のプローブを使用する工程であって、各々の該第２のプローブは、該群に由来する該真菌種の１つに特異的であり、ここで各々の該１つ以上の第２のプローブは、該超可変領域中で種に独特なヌクレオチド配列に対して十分に相補的であり、ここでさらに該１つ以上の第２のプローブは、それぞれ、配列番号７７および配列番号７８ならびにその相補体からなる群から選択される配列由来の１０から５０の連続したヌクレオチド残基からなるヌクレオチド残基配列を有する、工程；およびｄ）各々の該第２のプローブによって同定される該真菌種が該試料中に存在するかどうかを決定する工程、を包含する方法であって、ここで少なくとも１つの該プローブが、単一の部分に結合され、そして少なくとも１つの該プローブが、該プローブの分離を可能にする部分に結合されている、方法。１５．真菌に対するオリゴヌクレオチドプローブ/プライマーであって、該プローブが、配列番号７９またはその相補体のヌクレオチド残基配列を有する、真菌に対するオリゴヌクレオチドプローブ/プライマー。１６．真菌に対するオリゴヌクレオチドプローブ/プライマーであって、該プローブが、配列番号８０またはその相補体のヌクレオチド残基配列を有する、真菌に対するオリゴヌクレオチドプローブ/プライマー。