CN111424107A - 一种检测四种念珠菌的camp引物组及试剂盒和应用 - Google Patents

一种检测四种念珠菌的camp引物组及试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测四种念珠菌的CAMP引物组及试剂盒和应用。所述CAMP引物组包括以下四组引物组中的一组或两组以上：针对白色念珠菌(Candida albicans，CA)的引物组、针对光滑念珠菌(Candida glabrata，CG)的引物组、针对近平滑念珠菌(Candida parapsilosis，CP)的引物组、针对热带念珠菌(Candida tropicalis，CT)的引物组。本发明基于CAMP技术，针对每种常见念珠菌的特异保守区域分别设计6条引物，包括序列主引物(NF/NR)、外引物(F2/R2)、内引物(LF/LR)。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中念珠菌的存在。本发明的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，将其制备成为试剂盒可实现对念珠菌快速准确的检测。

Description

一种检测四种念珠菌的CAMP引物组及试剂盒和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测四种念珠菌的CAMP引物组及试剂盒和应用。
背景技术
近年来，随着广谱抗生素、激素的滥用问题日益严重，各种介入性治疗的普遍开展，导致真菌感染特别是以念珠菌为代表引起的深部感染发病率在院内逐年增高。由于真菌感染的复杂性，已使之成为导致院内感染死亡的重要原因。
念珠菌是真菌中最为常见的条件致病菌之一，常寄生于人的皮肤、口腔、胃肠道、肛门和阴道粘膜等位置。已知的常见致病型念珠菌有白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯念珠菌、星状念珠菌等八种念珠菌，其中以白色念珠菌感染最为常见，可占全部念珠菌感染中的70％以上。当机体免疫机能下降时，容易引起念珠菌感染。
不同念珠菌种对抗生素的耐药性不同，若不区分菌种而采用统一的治疗方案容易对机体产生不同的影响。目前应用于临床的念珠菌检测方法包括三大类：形态学检测法、血清学检测法和分子生物学检测法。形态学检测法需要将该真菌培养一周甚至数周，通过形态观察来判断。此种方法对研究人员技术经验要求较高，且极大程度上限制了病情的早期治疗，易贻误最佳治疗时机；血清学检测法一般通过抗原和抗体检测，但念珠菌的抗原成分复杂，易产生假阳性结果。念珠菌感染患者多伴有免疫抑制，机体产生抗体需要一定反应时间，且抗体反应低下，可能导致假阴性结果。分子生物学的发展为深部真菌感染的早期诊断提供了条件，传统的聚合酶链反应(PCR)等分子技术具有高度的敏感性和特异性，显示出巨大的诊断潜力。但常规PCR检测法中包括了耗时的DNA提取实验，要求使用凝胶电泳或其他缓慢的扩增子检测步骤，这些步骤都会造成假阳性结果的风险，同时对操作人员的专业技术能力要求较高，且PCR仪价格昂贵，扩增时间长。因此，发明一种快速高效、操作简易、安全可靠且适用于现场操作的念珠菌检测试剂盒极为必要。
基于竞争性互补配对的核酸恒温扩增技术(Competitive annealing mediatedamplification of nucleic acids，CAMP)是替代环介导等温扩增(LAMP)的核酸等温扩增方法(见CN107446919A)。该方法主要利用2至6种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CAMP反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成，适合基层医疗机构及地方检验检疫部门的应用。并且，CAMP还可以大大缩短操作时间，减少样品污染机会，适合应用于念珠菌的快速检测。
发明内容
本发明的目的是，提供一种检测四种念珠菌的CAMP引物组及试剂盒和应用。旨在解决现有技术中检测方法复杂、成本高的技术问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种检测四种念珠菌的CAMP引物组，所述四种念珠菌为白色念珠菌(Candidaalbicans，CA)、光滑念珠菌(Candida glabrata，CG)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis，CP)和热带念珠菌(Candida tropicalis，CT)，所述CAMP引物组包括以下四组引物组中的一组或两组以上：
检测白色念珠菌的引物组包括三对引物，分别为：CA-NF：其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，CA-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；CA-LF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CA-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；以及，CA-F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CA-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
检测光滑念珠菌的引物组包括三对引物，分别为：CG-NF：其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，CG-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；CG-LF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CG-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；以及，CG-F2：其核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，CG-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
检测近平滑念珠菌的引物组包括三对引物，分别为：CP-NF：其核苷酸序列如SEQID NO.13所示，CP-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；CP-LF：其核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示，CP-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；以及，CP-F2：其核苷酸序列如SEQID NO.17所示，CP-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
检测热带念珠菌的引物组包括三对引物，分别为：CT-NF：其核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示，CT-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；CT-LF：其核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，CT-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；以及，CT-F2：其核苷酸序列如SEQID NO.23所示，CT-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
作为优选实施方案，所述CAMP引物组包括同时检测白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌的四组引物组。
本发明提供的CAMP引物组针对四种念珠菌的特异保守区域(靶基因)，白色念珠菌(Candida albicans，CA)的靶基因序列如SEQ ID NO.25所示、光滑念珠菌(Candidaglabrata，CG)的靶基因序列如SEQ ID NO.26所示、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis，CP)的靶基因序列如SEQ ID NO.27所示、热带念珠菌(Candida tropicalis，CT)的靶基因序列如SEQ ID NO.28所示。
每种念珠菌的引物组由6条引物组成：包括序列主引物(NF/NR)、外引物(F2/R2)、内引物(LF/LR)。其中，NF/NR为CAMP的主要引物，NF由靶基因中段的N区的互补片段Nc与5’端的F1区连接而成，NR由靶基因中段的N区和3’端的R1c区的互补片段R1连接而成。F2/R2分别为上下游外部引物，F2与靶基因F2区域相同，R2与靶基因的R2c区域互补(所述的靶基因区域在公开专利CN107446919A中有详细描述)。LF/LR分别为上下游内部引物。具体核苷酸序列如下表1所示：
表1引物序列
Figure BDA0002458138280000031
Figure BDA0002458138280000041
本发明还提供用于检测念珠菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述CAMP引物组。作为优选实施方案，可以将CAMP引物组放入超纯水中制成工作液。所述引物组工作液中含1～2μM的F2、R2、LF、LR引物及0.2～0.4μM的NF、NR引物的混合液。
根据本发明所述的试剂盒，其中，还包括CAMP反应液和CAMP显色液。进一步地，所述CAMP反应液包括：Bst聚合酶、CAMP反应缓冲液和超纯水。其中，CAMP反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100、甜菜碱和dNTP。
具体地，所述CAMP反应液体系中各组分如下：
CAMP反应液(25μL体系，溶剂为超纯水)：
1～80mM Tris-HCl pH8.8；
1～50mM KCl；
1～50mM(NH4)2SO4；
2～20mM MgSO4；
0.1～0.5％Triton X-100；
0.2～1M甜菜碱；
1～1.6mM dNTP；
5～10U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)。
CAMP显色液可优选Sybr green I，Eva green，羟基萘酚蓝(HNB)和铬黑T(EBT)等中的一种。
在进行检测时，可以使用10～15μL的引物组工作液与CAMP反应液组成25μL的检测混合液。CAMP显色液加入量可以是100～150μmol/L检测混合液。
本发明还提供了非疾病诊断目的的念珠菌检测方法，包括以下步骤：
1)取核酸样本、CAMP引物组工作液与CAMP反应液混合，制得扩增反应液；优选采用10～15μL的CAMP引物组工作液与CAMP反应液组成25μL的扩增反应液；
2)取制得的扩增反应液，60～65℃反应20～80min，优选63℃反应60min，根据显色结果判断样品是否含有白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌这四种念珠菌的任意一种或多种。
作为优选实施方案，所述CAMP引物组工作液中的引物浓度如下：
引物CA-NF与CA-NR的浓度均为1～2μM，引物CA-LF与CA-LR的浓度均为1～2μM，引物CA-F2与CA-R2的引物浓度均为0.2～0.4μM；
所述引物CG-NF与CG-NR的浓度均为1～2μM，引物CG-LF与CG-LR的浓度均为1～2μM，引物CG-F2与CG-R2的引物浓度为0.2～0.4μM；
所述引物CP-NF与CP-NR的浓度均为1～2μM，引物CP-LF与CP-LR的浓度均为1～2μM，引物CP-F2与CP-R2的引物浓度为0.2～0.4μM；
所述引物CT-NF与CT-NR的浓度均为1～2μM，引物CT-LF与CT-LR的浓度均为1～2μM，引物CT-F2与CT-R2的引物浓度为0.2～0.4μM。
本发明还提供了上述CAMP引物组以及试剂盒在非疾病诊断目的的念珠菌检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1，本发明基于CAMP技术，针对四种常见念珠菌的特异保守区域分别设计6条引物。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中念珠菌的存在。并且，由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，在CAMP反应所需时间短，进一步缩短了检测的时间，简化了操作。
2，由于本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对念珠菌的快速准确检测，因此，适用于念珠菌感染所导致公共卫生事件发生时，专业程度不高的海关、口岸、养殖场、屠宰场等地的现场快速检测。
3，本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，将其制备成为试剂盒可实现对念珠菌快速准确的检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图2为本发明实施例2中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图3为本发明实施例3中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图4为本发明实施例4中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图5为本发明实施例5中的凝胶电泳图。
图6为本发明实施例6中的单独基因检测结果示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1应用Eva Green验证对白色念珠菌CA的扩增反应
Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，Eva Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合(25μL)：
20mM Tris-HCl pH8.8；
10mM KCl；
10mM(NH4)2SO4；
14mM MgSO4；
0.1％Triton X-100；
1M甜菜碱；
1.25mM dNTP；
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)；
1X Eva Green(Biotum)；
引物：
1600nM CA-NF/SEQ ID NO.l；
1600nM CA-NR/SEQ ID NO.2；
800nM CA-LF/SEQ ID NO.3；
800nM CA-LR/SEQ ID NO.4；
200nM CA-F2/SEQ ID NO.5；
200nM CA-R2/SEQ ID NO.6；
靶基因:CA dsDNA/SEQ ID NO.25；
同时设置无靶的对照组。
设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例2应用Eva Green验证对光滑念珠菌CG的扩增反应
Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合(25μL)：
20mM Tris-HCl pH8.8；
10mM KCl；
10mM(NH4)2SO4；
14mM MgSO4；
0.1％Triton X-100；
1M甜菜碱；
1.25mM dNTP；
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)；
1X Eva Green(Biotum)；
引物：
1600nM CG-NF/SEQ ID NO.7；
1600nM CG-NR/SEQ ID NO.8；
800nM CG-LF/SEQ ID NO.9；
800nM CG-LR/SEQ ID NO.10；
200nM CG-F2/SEQ ID NO.11；
200nM CG-R2/SEQ ID NO.12；
靶基因:CG dsDNA/SEQ ID NO.26；
同时设置无靶的对照组。
设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例3应用Eva Green验证对近平滑念珠菌CP的扩增反应
EvaGreen同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合(25μL)：
20mM Tris-HCl pH8.8；
10mM KCl；
10mM(NH4)2SO4；
14mM MgSO4；
0.1％Triton X-100；
1M甜菜碱；
1.25mM dNTP；
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)；
1X Eva Green(Biotum)；
引物：
1600nM CP-NF/SEQ ID NO.13；
1600nM CP-NR/SEQ ID NO.14；
800nM CP-LF/SEQ ID NO.15；
800nM CP-LR/SEQ ID NO.16；
200nM CP-F2/SEQ ID NO.17；
200nM CP-R2/SEQ ID NO.18；
靶基因:CP dsDNA/SEQ ID NO.27；
同时设置无靶的对照组。
设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图3所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例4应用Eva Green验证对热带念珠菌CT的扩增反应
EvaGreen同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合(25μL)：
20mM Tris-HCl pH8.8；
10mM KCl；
10mM(NH4)2SO4；
14mM MgSO4；
0.1％Triton X-100；
1M甜菜碱；
1.25mM dNTP；
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)；
1X Eva Green(Biotum)；
引物：
1600nM CT-NF/SEQ ID NO.19；
1600nM CT-NR/SEQ ID NO.20；
800nM CT-LF/SEQ ID NO.21；
800nM CT-LR/SEQ ID NO.22；
200nM CT-F2/SEQ ID NO.23；
200nM CT-R2/SEQ ID NO.24；
靶基因:CT dsDNA/SEQ ID NO.28；
同时设置无靶的对照组。
设置ABI StepOne real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图4所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例5四种念珠菌基因目标片段扩增产物的凝胶电泳检测
将实施例1～4中获得的扩增产物经过回收之后进行凝胶电游检测进一步确定。样品于90mV在GelRed预染的(Biotum)1％琼脂糖凝胶(TAE溶解)电泳1小时。结果在图5中显示，各泳道的标记数字分别对应样品如下：
1：CA的CAMP扩增产物。
2：CA检测的无靶对照组。
3：CG的CAMP扩增产物。
4：CG检测的无靶对照组。
5：CP的CAMP扩增产物。
6：CP检测的无靶对照组。
7：CT的CAMP扩增产物。
8：CT检测的无靶对照组。
实施例6四种念珠菌基因目标片段的可视化检测
羟基萘酚蓝(HNB)是应用于CAMP技术中可视化检测的指示剂。其原理为：当发生核酸体外扩增反应时会产生大量不溶副产物焦磷酸镁，从而导致镁离子减少，而HNB为镁离子指示剂，故可监测有无扩增反应发生。当CAMP未发生扩增反应时，体系中镁离子浓度高，反应液呈紫色；当CAMP发生扩增反应时，体系中镁离子浓度低，反应液呈蓝色。
通过这些引物和可视化试剂进行四种念珠菌DNA检测的反应溶液的组合在下面所示。
反应溶液组合(25μL)：
20mM Tris-HCl pH8.8；
10mM KCl；
10mM(NH4)2SO4；
14mM MgSO4；
0.1％Triton X-100；
1M甜菜碱；
1.25mM dNTP；
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)；
120μM HNB；
以上为可视化检测的所共用的试剂，下述为针对各DNA片段所使用的引物及靶序列：
1)CA DNA检测引物：
1600nM CA-NF/SEQ ID NO.l；
1600nM CA-NR/SEQ ID NO.2；
800nM CA-LF/SEQ ID NO.3；
800nM CA-LR/SEQ ID NO.4；
200nM CA-F2/SEQ ID NO.5；
200nM CA-R2/SEQ ID NO.6；
靶基因:CA dsDNA/SEQ ID NO.25；
同时设置无靶的对照组。
2)CG DNA检测引物：
1600nM CG-NF/SEQ ID NO.7；
1600nM CG-NR/SEQ ID NO.8；
800nM CG-LF/SEQ ID NO.9；
800nM CG-LR/SEQ ID NO.10；
200nM CG-F2/SEQ ID NO.11；
200nM CG-R2/SEQ ID NO.12；
靶基因:CG dsDNA/SEQ ID NO.26；
同时设置无靶的对照组。
3)CP DNA检测引物：
1600nM CP-NF/SEQ ID NO.13；
1600nM CP-NR/SEQ ID NO.14；
800nM CP-LF/SEQ ID NO.15；
800nM CP-LR/SEQ ID NO.16；
200nM CP-F2/SEQ ID NO.17；
200nM CP-R2/SEQ ID NO.18；
靶基因:CP dsDNA/SEQ ID NO.27；
同时设置无靶的对照组。
4)CT DNA检测引物：
1600nM CT-NF/SEQ ID NO.19；
1600nM CT-NR/SEQ ID NO.20；
800nM CT-LF/SEQ ID NO.21；
800nM CT-LR/SEQ ID NO.22；
200nM CT-F2/SEQ ID NO.23；
200nM CT-R2/SEQ ID NO.24；
靶基因:CT dsDNA/SEQ ID NO.28；
同时设置无靶的对照组。
结果判断：蓝色为阳性，紫色为阴性。结果在图6中显示，各反应管的标记数字分别对应样品如下：
1：CA DNA检测的阳性结果
2：CA DNA检测无靶对照组的阴性结果。
3：CG DNA检测的阳性结果。
4：CG DNA检测无靶对照组的阴性结果。
5：CP DNA检测的阳性结果。
6：CP DNA检测无靶对照组的阴性结果。
7：CT DNA检测的阳性结果。
8：CT DNA检测无靶对照组的阴性结果。
本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 中科芯瑞（苏州）生物科技有限公司
<120> 一种检测四种念珠菌的CAMP引物组及试剂盒和应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
gcgttcaaag attcgatgtc tcttggttct cgcatc 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
catcgaatct ttgaacgcga aacgacgctc aaacag 36
<210> 3
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 3
cagcgaaatg cgatacgtaa t 21
<210> 4
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
ggaataccag agggcgcaat 20
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 5
gtcacaccag attattac 18
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<212> DNA
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<400> 6
ccaagtcgta ttgctcaac 19
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 7
gtgcgttcaa agattcgaga tgaagaacgc agcgaa 36
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 8
tcgaatcttt gaacgcacgt ttgagaagga aatgacgc 38
<210> 9
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<212> DNA
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<400> 9
gcgatacgta atgtgaat 18
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ggaataccag agggcgca 18
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actttcaaca atggatctc 19
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caagttaact caaaaacg 18
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<213> 引物(primer)
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cattatagct cgacccttcc ttgaataatg tcgggacc 38
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<213> 引物(primer)
<400> 14
gaagggtcga gctataatgt gacttctgag cctttcc 37
<210> 15
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<213> 引物(primer)
<400> 15
gtaacatttt ctccactc 18
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atgttgtccg tccacgtttg 20
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ggtaacttgt tgacttcttc 20
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<213> 引物(primer)
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cggtttgaaa gtgatcttgg tg 22
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gcgttcaaag attcgatgaa gaacgcagcg aaatgc 36
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
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catcgaatct ttgaacgcgg tttgagggag aaatgacg 38
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 21
gaattgcaga tattcgtg 18
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 22
gcatgccctt tggaatacc 19
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 23
caacggatct cttggttctc 20
<210> 24
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<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 24
caaacaaacc tagcgtattg 20
<210> 25
<211> 1061
<212> DNA
<213> 白色念珠菌(Candida albicans)
<400> 25
cgagtataag ccttggccga gaggtctggg aaatcttgtg aaactccgtc gtgctgggga 60
tagagcattg taattgttgc tcttcaacga ggaattccta gtaagcgcaa gtcatcagct 120
tgcgttgatt acgtccctgc cctttgtaca caccgcccgt cgctactacc gattgaatgg 180
cttagtgagg cctccggatt ggtttaggaa agggggcaac ctcattctgg aaccgagaag 240
ctggtcaaac ttggtcattt agaggaagta aaagtcgtaa caaggtttcc gtaggtgaac 300
ctgcggaagg atcattactg atttgcttaa ttgcaccaca tgtgtttttc tttgaaacaa 360
acttgctttg gcggtgggcc cagcctgccg ccagaggtct aaacttacaa ccaatttttt 420
atcaacttgt cacaccagat tattactaat agtcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 480
ttctcgcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atatgaattg cagatattcg 540
tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gccctctggt attccggagg gcatgcctgt 600
ttgagcgtcg tttctccctc aaaccgctgg gtttggtgtt gagcaatacg acttgggttt 660
gcttgaaaga cggtagtggt aaggcgggat cgctttgaca atggcttagg tctaaccaaa 720
aacattgctt gcggcggtaa cgtccaccac gtatatcttc aaactttgac ctcaaatcag 780
gtaggactac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga ggaaaagaaa ccaacaggga 840
ttgcctcagt agcggcgagt gaagcggcaa aagctcaaat ttgaaatctg gcgtctttgg 900
cgtccgagtt gtaatttgaa gaaggtatct ttgggcccgg ctcttgtcta tgttccttgg 960
aacaggacgt cacagagggt gagaatcccg tgcgatgaga tgacccgggt ctgtgtaaag 1020
ttccttcgac gagtcgagtt gttgggaatg cagctctaag t 1061
<210> 27
<211> 1095
<212> DNA
<213> 光滑念珠菌(Candida glabrata)
<400> 27
gaatcaccac ttagagctgc attcccaaca actcgactct tcgagcaccc tttacaaaga 60
actgacaccc tcgccacacg ggattctcac cctccatgac gtcctgttcc aaggaacata 120
ggcaaagtac agtcccaaag tggtactctc caaattacaa ctcgggcacc aaaggtacca 180
gatttcaaat ttgagctttt gccgcttcac tcgccgttac taaggcaatc ccagttggtt 240
tcttttcctc cgcttattga tatgcttaag ttcagcgggt aaccctacgt gatttgaggt 300
caaacttaaa gacgtctgtc tgcccagcac gcacaaaaca ctcacttatc cctccctaga 360
tcaacaccga gttggtaaaa cctaatacag tattaacccc cgccgctcgc gcaaacgagc 420
agcagattaa tagagaagct tgcgctcgtg tcccacatac tgatatggcc tacaatttca 480
agttaactca aaaacgagta tcactcacta ccaaacacaa tgtgtttgag aaggaaatga 540
cgctcaaaca ggcatgcccc ccggaatacc agagggcgca atgtgcgttc aaagattcga 600
tgattcacgg aattctgcaa ttcacattac gtatcgcatt tcgctgcgtt cttcatcgat 660
gcgagaacca agagatccat tgttgaaagt tttgaagttg ttttctacta aaagaaatct 720
tgtgttgact gaattagttt aaaaaaatat ttgtttgtgt ttgcatccac tgggagaact 780
cccccccgaa agagagcgtt cccccaacga acaaaagaat agtagtaaag taaactccac 840
tgtgtgtagt aattagaaag tgtcgagtcg tgtgataaaa cacctccttt ggaatagaga 900
gatccacgca cactcccagg tctttgtcgg ctccctcccc ccactgcaga acacccacca 960
accgcgcact taagcgcagg caggagaaat agcattcaca gcagagaaaa tattttagga 1020
gcctcctgag tgtctacact ggtcctcccc agagatgtct ctctccgagc tcagacaaat 1080
caataaattc ttaag 1095
<210> 27
<211> 956
<212> DNA
<213> 近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)
<400> 27
gggaccttca gacgaatccg actacctttc cgaagggtcg agctataatg aagactttag 60
ctctggaaag gctcagaagt caaagcaaaa gaaacagcca ctagcagaca cgtctttaaa 120
ctcatttagc aacgcgtcaa ccacttcaac ggggaaacct tcaaacgctt ctgagacata 180
tcaaaagcta tctcaattgg aacatatctt gaagagacca gatacttata tcggttcagt 240
tgagaaaact aaaatggaaa tgtggtgttt tgatgctgag tctgaatcta tgaaatttca 300
agaagtcaca attgtccctg gtctttacaa aatctttgac gagattttgg tgaatgccgc 360
tgataacaag ataagagacc cttccatgaa gaatatcaag gtgaggattg atcctgaaaa 420
taacgttatt caagtgttca acgatggtaa aggtattcct gtagaaatgc atacaaagga 480
gaaaatgtac attcctgagt tgatctttgg taacttgttg acttcttcca attatgatga 540
tgatcaaaaa aaggttactg gtggtagaaa tgggtttggt gctaagttat gtaacatttt 600
ctccactcaa tttgaggttg aaacggctga cttgaatacc ggcaagttgt acaaacaaac 660
gtggacggac aacatgacaa aagtcggcaa acccaagatt aatgcattaa aaacaaagaa 720
agaatacacc aagatcactt tcaaaccgga cttgagtaag tttgatatgg acagtttaga 780
cgaggatttg ttatctgttt tgcgaagaag ggtgtatgat ctttgtggta cggtaaagaa 840
ttgtaacatc tatctcaatg acaagcgatt gcccgtcact agcttcaaga gctatgttga 900
aatgtatgtt aaagcaatca aggagaggtc gccagagcca gaaggagaag gtgctc 956
<210> 28
<211> 559
<212> DNA
<213> 热带念珠菌(Candida tropicalis)
<400> 28
agcaatccta ccgccagagg ttataactaa accaaacttt ttatttacag tcaaacttga 60
tttattatta caatagtcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctcg catcgatgaa 120
gaacgcagcg aaatgcgata cgtaatatga attgcagata ttcgtgaatc atcgaatctt 180
tgaacgcaca ttgcgccctt tggtattcca aagggcatgc ctgtttgagc gtcatttctc 240
cctcaaaccc ccgggtttgg tgttgagcaa tacgctaggt ttgtttgaaa gaatttacgt 300
ggaaacttat tttaagcgac ttaggtttat ccaaaacgct tattttgcta gtggccacca 360
caatttattt cataactttg acctcaaatc aggtaggact acccgctgaa cttaagcata 420
tcaataagcg gaggaaaaga aaccaacagg gattgcctta gtagcggcga gtgaagcggc 480
aaaagctcaa atttgaaatc tggctctttc agagtccgag ttgtaatttg aagaaggtat 540
ctttgggtct ggctcttgt 559

Claims (10)

1.一种检测四种念珠菌的CAMP引物组，其特征在于，所述四种念珠菌为白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌，所述CAMP引物组包括以下四组引物组中的一组或两组以上：
检测白色念珠菌的引物组包括三对引物，分别为：CA-NF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CA-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；CA-LF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CA-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；以及，CA-F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CA-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
检测光滑念珠菌的引物组包括三对引物，分别为：CG-NF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CG-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；CG-LF：其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CG-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；以及，CG-F2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，CG-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
检测近平滑念珠菌的引物组包括三对引物，分别为：CP-NF：其核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，CP-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；CP-LF：其核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示，CP-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；以及，CP-F2：其核苷酸序列如SEQID NO.17所示，CP-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
检测热带念珠菌的引物组包括三对引物，分别为：CT-NF：其核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示，CT-NR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；CT-LF：其核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，CT-LR：其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；以及，CT-F2：其核苷酸序列如SEQID NO.23所示，CT-R2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
2.如权利要求1所述的检测四种念珠菌的CAMP引物组，其特征在于：所述CAMP引物组包括同时检测白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌的四组引物组。
3.一种用于检测念珠菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1或2所述的CAMP引物组。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括CAMP反应液和CAMP显色液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述CAMP反应液包括：Bst聚合酶、CAMP反应缓冲液和超纯水。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述CAMP反应液体系中各组分如下：
CAMP反应液(25μL体系，溶剂为超纯水)：
1～80mM Tris-HCl pH8.8；
1～50mM KCl；
1～50mM(NH4)2SO4；
2～20mM MgSO4；
0.1～0.5％Triton X-100；
0.2～1M甜菜碱；
1～1.6mM dNTP；
5～10U Bst DNA聚合酶。
7.一种非疾病诊断目的的念珠菌检测方法，包括以下步骤：
1)取核酸、CAMP引物组工作液与CAMP反应液混合，制得扩增反应液；
2)取制得的扩增反应液，60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌这四种念珠菌的任意一种或以上。
8.如权利要求7所述的念珠菌检测方法，其特征在于：所述CAMP引物组工作液中，
引物CA-NF与CA-NR的浓度均为1～2μM，引物CA-LF与CA-LR的浓度均为1～2μM，引物CA-F2与CA-R2的引物浓度均为0.2～0.4μM；
所述引物CG-NF与CG-NR的浓度均为1～2μM，引物CG-LF与CG-LR的浓度均为1～2μM，引物CG-F2与CG-R2的引物浓度为0.2～0.4μM；
所述引物CP-NF与CP-NR的浓度均为1～2μM，引物CP-LF与CP-LR的浓度均为1～2μM，引物CP-F2与CP-R2的引物浓度为0.2～0.4μM；
所述引物CT-NF与CT-NR的浓度均为1～2μM，引物CT-LF与CT-LR的浓度均为1～2μM，引物CT-F2与CT-R2的引物浓度为0.2～0.4μM。
9.权利要求1或2所述CAMP引物组在非疾病诊断目的的念珠菌检测中的应用。
10.权利要求3-6任一项所述试剂盒在非疾病诊断目的的念珠菌检测中的应用。
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