CN108034745A

CN108034745A - 一种同时检测四种念珠菌的引物探针组合和试剂盒

Info

Publication number: CN108034745A
Application number: CN201711395514.1A
Authority: CN
Inventors: 方园; 任云; 欧阳云; 冯莹
Original assignee: Hangzhou Blue Biology Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Blue Biology Technology Co Ltd
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: CN108034745B

Abstract

本发明提供了本发明提供了一种检测四种念珠菌的引物探针组合，属于微生物检测技术领域，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所示下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团的如SEQ ID No.3所示的序列。本发明提供的一对引物一条探针特异性地同时检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌四种念珠菌。

Description

一种同时检测四种念珠菌的引物探针组合和试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测四种念珠菌的引物探针组合和试剂盒。

背景技术

念珠菌包括大约150种不产生芽孢的酵母菌，是真菌中最常见的条件致病菌，其中对人有致病作用的有白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、星形念珠菌和克柔念珠菌。其中白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌占临床医学样本中的80％以上。念珠菌常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠粘膜等处，当机体免疫机能低下或正常寄居部位的微生态环境失调，容易引起念珠菌病。念珠菌可引起皮肤粘膜浅层或深部感染，浅层感染主要包括：口腔炎、阴道炎、龟头炎、膀胱炎等；深部感染时可感染包括心、肝、脾、肺、肾、脑、血液、胃肠、骨骼等。念珠菌深部感染的预后差，死亡率高。广谱抗生素、免疫抑制剂、导管插管、腹膜透析、放射治疗和HIV等均可使深部念珠菌感染病例增多。

目前常规采用荧光探针法(TaqMan法)检测念珠菌，用一对引物加一条探针，决定了其特异性非常高，基本上不存在非特异性扩增，解决了交叉反应的难题，但是一对引物加一条探针只能够检测一种念珠菌。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测四种念珠菌的引物探针组合，能够同时检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测四种念珠菌的引物探针组合，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；

所述探针为标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团的如SEQ ID No.3所示的序列。

本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合、阴性对照品、阳性对照品和PCR反应液。

优选的，所述试剂盒中包括：浓度为8～12μM的上游引物15～25μL，浓度为8～12μM的下游引物15～25μL，浓度为8～12μM的探针8～15μL，浓度为800～1200ng/mL的阴性对照品10～20μL，质粒总浓度为15～25ng/mL的阳性对照品10～20μL，PCR反应液的量为200～250μL。

优选的，所述阴性对照品为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述阳性对照品包括含有白色念珠菌DNA序列的质粒、含有热带念珠菌DNA序列的质粒、含有近平滑念珠菌DNA序列的质粒和含有光滑念珠菌DNA序列的质粒，所述含有白色念珠菌DNA序列的质粒与含有热带念珠菌DNA序列的质粒、含有近平滑念珠菌DNA序列的质粒和含有光滑念珠菌DNA序列的质粒的质量比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)；

所述白色念珠菌DNA序列如SEQ ID No.5所示；

所述热带念珠菌DNA序列如SEQ ID No.6所示；

所述近平滑念珠菌DNA序列如SEQ ID No.7所示；

所述光滑念珠菌DNA序列如SEQ ID No.8所示。

优选的，所述PCR反应液包括400～500μM的dNTP、0.1～0.2U/μL的Taq酶、0.1～0.2U/μL的UNG酶、0.1～0.25μM的参比荧光ROX、3～6mM的MgCl₂和缓冲液，所述缓冲液包括10～20mM的Tris-HCl、100～200mM的KCl，所述Tris-HCl的pH值为8。

优选的，所述试剂盒在使用时，PCR反应体系每20μL包括：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，PCR反应液10μL，ddH₂O 4.5μL，样品、阳性对照品或阴性对照品4μL。

优选的，所述试剂盒在使用时，PCR反应条件包括：

第一阶段：50℃，2min；1个循环；

第二阶段：95℃，10min；1个循环；

第三阶段：95℃，15s；56℃，30s；40个循环。

本发明提供了一种检测四种念珠菌的引物探针组合，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所示下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团的如SEQ ID No.3所示的序列。

本发明根据白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌四种念珠菌的同源保守基因组DNA片段设计特异引物及荧光标记的探针，通过检测荧光信号的强度和扩增曲线的形状来判定是否有特异性的PCR产物形成，进而判断所测样本中是否含有白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌的DNA片段，以此来判断样品中是否含有白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌。

本发明实施例的结果显示：本发明提供的一对引物一条探针特异性地同时检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌四种念珠菌；在检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌的同时，与临床其他常见真菌、细菌无交叉反应，即特异性强，在检测上述四种念珠菌时无交叉反应；可以检测到DNA含量在0.00001ng/μl-0.000001ng/μl的样本中的白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌，即灵敏度高，总符合率为97.47％。

本发明的方法除了能够定性检测还能够定量检测四种真菌，图1所示的核酸扩增曲线以及图2所示的核酸扩增后所产生的标准曲线，一方面用于测定本试剂盒的引物和探针可以检测的核酸的浓度范围和最低检测限度以及在所扩增的线性程度(比如R²所示)和扩增效率(比如Eff％所示)，另一方面此标准曲线可以用与定量检测所测样本中靶基因的含量。在定量检测过程中将已知含量的标准品(含靶基因的克隆质粒)呈10倍连续梯度稀释成5至7个浓度进行PCR扩增，同时在另外的管子里进行样本的PCR扩增，所扩增的样本的Ct值在标准扩增曲线的线性扩增区域之内，就可以根据标准曲线各点的含量计算出样本中靶基因的含量，可以用于反映这四种真菌感染的量以及做动态检测时的疗效观察。

附图说明

图1为实施例5中定量检测方法的标准的荧光PCR扩增曲线图(AmplificationPlot)；

图2为由上述图1所进行的标准扩增曲线的标准曲线图(Standard Curve)，其中横轴是目的DNA的含量(Quantity)，纵轴是Ct值。

具体实施方式

本发明提供了一种同时检测四种念珠菌的引物探针组合，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所示下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团的如SEQ ID No.3所示的序列。

在本发明中，所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，具体序列如下所示：

上游引物：5'-TCAAAACTTTCAACAACGGATCTC-3'；

所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，具体序列如下所示：

下游引物：5'-CGCATTTCGCTGCGTTCT-3'。

在本发明中，所述引物根据白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌的核糖体RNA的基因组DNA的序列，筛选能够通用检测这四种念珠菌且与其他物种不同源的靶序列设计得到的，所述靶序列的核苷酸序列如下：

白色念珠菌靶序列(61bp)如SEQ ID No.9所示，来源于白色念珠菌的核糖体rRNA的小亚基18S的保守的核酸区域的序列，具体序列如下所示：

TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG；

热带念珠菌靶序列(61bp)如SEQ ID No.10所示，来源于热带念珠菌的核糖体rRNA的小亚基18S的保守的核酸区域的序列，具体序列如下所示：

TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG；

光滑念珠菌靶序列(61bp)如SEQ ID No.11所示，来源于光滑念珠菌的核糖体rRNA的小亚基18S的保守的核酸区域的序列，具体序列如下所示：

TCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG；

近平滑念珠菌靶序列(61bp)如SEQ ID No.12所示，来源于近平滑念珠菌的核糖体rRNA的小亚基18S的保守的核酸区域的序列，具体序列如下所示：

TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG。

以上四种念珠菌的核糖体rRNA的小亚基18S的保守的核酸区域的序列存在高度的同源性(>98％)，因此，所设计的引物和探针可以同时检测所有四种念珠菌。

在本发明中，针对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌的靶序列，设计用于荧光PCR检测这四种念珠菌的特异性引物委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。

在本发明中，针对上述技术方案所述的引物序列及靶序列，设计与四种念珠菌序列特异性结合的荧光探针，所述探针由上海捷瑞生物技术有限公司合成。

本发明中上述引物和探针的设计优选是将上述四种念珠菌共同的同源序列输入到Primer Express软件中，用该软件同时将引物和探针设计出来，使引物和探针能够高度匹配；可以在软件所给出的许多引物和探针设计中优选出最佳条件的引物和探针。

在本发明中，所述探针为标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团的如SEQ ID No.3所示的序列，具体序列如下所示：

探针：5'-TGGTTCTCGCATCGAT-3'。

在本发明中，所述探针5'端标记的报告荧光基团优选包括FAM或VIC，所述探针3'末端标记淬灭荧光基团优选包括BHQ或TAMRA。

本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物探针组合、阴性对照品、阳性对照品和PCR反应液。

在本发明中，所述试剂盒中优选包括浓度为8～12μM的上游引物15～25μL，更优选浓度为9～11μM的上游引物18～23μL，最优选浓度为10μM的上游引物22μL。在本发明中，所述上游引物的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述试剂盒中优选包括浓度为8～12μM的下游引物15～25μL，更优选浓度为9～11μM的下游引物18～23μL，最优选浓度为10μM的下游引物22μL。在本发明中，所述下游引物的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述试剂盒中优选包括浓度为8～12μM的探针8～15μL，更优选浓度为9～11μM的探针10～12μL，最优选浓度为10μM的探针11μL。在本发明中，所述探针的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述阴性对照品为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述阴性对照品的浓度优选为800～1200ng/mL，更优选为900～1100ng/mL，最优选为1000ng/mL。在本发明中，所述阴性对照品的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述含有拟南芥DNA片段的质粒的构建方法优选包括以下步骤：

提取拟南芥基因组DNA；

以所述拟南芥基因组DNA为模版进行PCR扩增，得到拟南芥DNA片段；

将所述拟南芥DNA片段连入pTG19-T载体中，筛选阳性克隆，得到含有拟南芥DNA片段的质粒。

在本发明中，所述提取基因组DNA的方法采用本领域技术人员熟知的基因组DNA提取方法即可。在本发明中，所述筛选阳性克隆的方法采用本领域技术人员熟知的方法即可。

在本发明中，所述PCR扩增拟南芥DNA片段的引物优选为：拟南芥上游引物和拟南芥下游引物；所述拟南芥上游引物的序列如SEQ ID No.13所示，具体序列为：5'-AATCGCCAAGCCAAATTCACAC-3'；

所述拟南芥下游引物的序列如SEQ ID No.14所示，具体序列为：5'-CATGATTCAGCGATTTTCTTTACG-3'。

在本发明中，所述PCR扩增拟南芥DNA片段的体系优选为：5X缓冲液4μl(50mMTris-HCl[pH 8.5],50mM NaCl,0.5mg/ml BSA)；25mM MgCl 1.6μl；10mM dNTP 0.5μl；10μMPrimer-F 0.5μl；10μM Primer-R 0.5μl；基因组DNA 1ng；5U/μl Taq酶0.25μl；消毒的超纯水加至20μl。

在本发明中，所述PCR扩增拟南芥DNA片段的扩增条件优选为：95℃4min；95℃30s,51℃30s,72℃60s 35个循环；72℃5min；12℃∝。

在本发明中，所述拟南芥DNA片段连入pTG19-T载体的方法优选包括：pTG19-T(25ng/μl)1μl；新鲜PCR产物4μl；10xT4Buffer1μl；T4DNA Ligase2.5 units；ddH₂O加至10μl。上述试剂混匀并离心，在16℃连接1小时，将连接反应物10μl转化100μl感受态细胞，冰浴20分钟，42℃热激45秒钟后，再在冰浴中放置2分钟，加入500μL SOC或LB培养基，在37℃震荡培养60分钟，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选单个白色菌落，用酶切法或PCR法进行鉴定插入片段，最后将PCR产物送测序确认克隆的目的基因片段。

在本发明中，所述拟南芥DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示，具体序列如下所示：

AATCGCCAAGCCAAATTCACACTTCAGTATGACTTGTGTCTTTCCAGGAAGGAATTTCTCAACCTCACTTTTTTCCTTCTCAGTAGAAACGGCCTTATGACCTGAAAGTGACATTAACATCAAGTATCATGCATAACGCATTTTCTATAAAAGAAAAAGGGTCTAAACCAAAAAAAGGTGCATAATAAACCCACATGATGCAGACGGTTAATAATCAACAGCTCCTCTTCATCTGTAAGACTGGCACTACCACATTCTGCGAATGGAGTATTAAACCATTCTTCGAAATTATGAATTGAGTTAAAGATGTGAGGAAGAAGAAAATTAAGCAGCGACCATAGTTCTTGCAGACTGTTCTGTATGGGAGTTCCAGTTAATAGAAGTCTGCGCTTAATCCGGTAGCTGCATCCAGGACAAATTAGTGTAAGCAAAATGTCTTTAAATTTCCTTTGTGACAGTATCTTTAAGAGATAAATCAGAGTAACAACTAATTAACACCATTCACTTCAGACTTCATCAAGCTAATGCGTAAAAAGGCATGTCTAAACATCTTTAAGAAACTAGATACAGTCTACTCAAAGACCAGAGTAACATACAGAAACATACCCAGTTCCTAGAGTCTTTGCGAGAGCACATTCATGGTTCTTCAGACGATGTCCTTCATCAACAATCATGTAGTTCCAGTCAATTTTCTTCAAAAATGCTTTATCTCTCATGATAAGATCGTAGTGGGTTATCAACACATTAAATTTTCCTCCTGCTATTCTTGCTCTTATTTCAGTTCTTTTCTCCTTTGATCCATCGTAAAGAAAATCGCTGAATCATG。

在本发明中，所述阳性对照品中质粒的总浓度优选为15～25ng/mL，更优选为18～22ng/mL，最优选为20ng/mL。

在本发明中，所述阳性对照品优选包括含有白色念珠菌DNA序列的质粒、含有热带念珠菌DNA序列的质粒、含有近平滑念珠菌DNA序列的质粒和含有光滑念珠菌DNA序列的质粒；所述含有白色念珠菌DNA序列的质粒与含有热带念珠菌DNA序列的质粒、含有近平滑念珠菌DNA序列的质粒和含有光滑念珠菌DNA序列的质粒的质量比优选为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)，更优选为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)，最优选为1:1:1:1。

在本发明中，所述含有白色念珠菌DNA序列的质粒的构建方法优选包括以下步骤：

提取白色念珠菌基因组DNA；

以所述白色念珠菌基因组DNA为模版进行PCR扩增，得到白色念珠菌DNA序列；

将所述白色念珠菌DNA序列连入pTG19-T载体中，再转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证，验证后提取质粒，得到含有白色念珠菌DNA序列的质粒。

在本发明中，所述PCR扩增白色念珠菌DNA序列的引物优选为：白色念珠菌上游引物和白色念珠菌下游引物，所述白色念珠菌上游引物的序列如SEQ ID No.15所示，具体序列为：

5'-CAGCTTGCTGTGATTACGTCCCTGCCCTTTG-3'；

所述白色念珠菌下游引物的序列如SEQ ID No.16所示，具体序列为：

5'-CATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCT-3'。

在本发明中，所述PCR扩增白色念珠菌DNA序列的体系优选为：5X缓冲液4μl(50mMTris-HCl[pH 8.5],50mM NaCl,0.5mg/ml BSA)；25mM MgCl1.6μl；10mM dNTP 0.5μl；10μMPrimer-F 0.5μl；10μM Primer-R 0.5μl；基因组DNA 1ng；5U/μl Taq酶0.25μl；消毒的超纯水加至20μl。

在本发明中，所述PCR扩增白色念珠菌DNA序列的扩增条件优选为95℃4min；95℃30s,51℃30s,72℃60s 35个循环；72℃5min；12℃∝。。

在本发明中，所述白色念珠菌DNA片段连入pTG19-T载体的方法优选包括：pTG19-T(25ng/μl)1μl；新鲜PCR产物4μl；10xT4Buffer1μl；T4DNA Ligase2.5units；ddH2O加至10μl。上述试剂混匀并离心，在16℃连接1小时，将连接反应物10μl转化100μl感受态细胞，冰浴20分钟，42℃热激45秒钟后，再在冰浴中放置2分钟，加入500μL SOC或LB培养基，在37℃震荡培养60分钟，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选单个白色菌落，用酶切法或PCR法进行鉴定插入片段，最后将PCR产物送测序确认克隆的目的基因片段。

在本发明中，所述白色念珠菌DNA序列如SEQ ID No.5所示，具体为：

CAGCTTGCTGTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTGCACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTCCGGATTGGTTTAGGAAAGGGGGCAACCTCATTCTGGAACCGAGAAGCTGGTCAAACTTTGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGATTTGCTTAATTGCACCACATGTGTTTTTCTTTGAAACAAACTTGCTTTGGCGGTGGGCCCAGCCTGCCGCCAGAGGTCTAAACTTACAACCAATTTTTTATCAACTTGTCACACCAGATTATTACTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCTCCCTCAAACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTTGCTTGAAAGACGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCTAACCAAAAACATTGCTTGCGGCGGTAACGTCCACCACGTATATCTTCAAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTTGGCGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGGCCCGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGACCCGGGTCTGTGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAACTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATG。

本发明参照含有白色念珠菌DNA序列的质粒的构建方法构建得到含有热带念珠菌DNA序列的质粒、含有近平滑念珠菌DNA序列的质粒和含有光滑念珠菌DNA序列的质粒，在此不再赘述。

在本发明中，所述PCR扩增热带念珠菌DNA序列的引物优选为：热带念珠菌上游引物和热带念珠菌下游引物，所述热带念珠菌上游引物的序列如SEQ ID No.17所示，具体序列为：

5'-TGGGAAATCTTGTGAAACTCCGTCGTG-3'；

所述热带念珠菌下游引物的序列如SEQ ID No.18所示，具体序列为：

5'-TCTCATCGCACGGGATTCTCAC-3'。

在本发明中，所述热带念珠菌DNA序列如SEQ ID No.6所示，具体为：

TGGGAAATCTTGTGAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGTAATTGTTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCTTCCGGATTGGTTTAGGAAAGGGGGCAACTCCATTCTGGAACCGAGAAGCTAGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGATTTGCTTAATTGCACCACATGTGTTTTTTATTGAACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATCCTACCGCCAGAGGTTATAACTAAACCAAACTTTTTATTTACAGTCAAACTTGATTTATTATTACAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATCCAAAAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTTTCAGAGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGA。

在本发明中，所述PCR扩增光滑念珠菌DNA序列的引物优选为：光滑念珠菌上游引物和光滑念珠菌下游引物，所述光滑念珠菌上游引物的序列如SEQ ID No.19所示，具体序列为5'-CGCTCGTGTCCCACATACTGA-3'，所述光滑念珠菌下游引物的序列如SEQ ID No.20所示，具体序列为5'-CGGAGCCAGCGAGTCTAACC-3'。

在本发明中，所述光滑念珠菌DNA序列如SEQ ID No.8所示，具体为：

CGCTCGTGTCCCACATACTGATATGGCCTACAATTTCAAGTTAACTCAAAAACGAGTATCACTCACTACCAAACACAATGTGTTTGAGAAGGAAATGACGCTCAAACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGAAGTTGTTTTCTACTAAAAGAAATCTTGTGTTGACTGAATTAGTTTAAAAAAATATTTGTTTGTGTTTGCATCCACTGGGAGAACTCCCCCCCGAAAGAGAGCGTTCCCCCAACGAACAAAAGAATAGTAGTAAAGTAAACTCCACTGTGTGTAGTAATTAGAAAGTGTCGAGTCGTGTGATAAAACACCTCCTTTGGAATAGAGAGATCCACGCACACTCCCAGGTCTTTGTCGGCTCCCTCCCCCCACTGCAGAACACCCACCAACCGCGCACTTAAGCGCAGGCAGGAGAAATAGCATTCACAGCAGAGAAAATATTTTAGGAGCCTCCTGAGTGTCTACACTGGTCCTCCCCAGAGATGTCTCTCTCCGAGCTCAGACAAATCAATTAAATTTCTTTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTAGTTCCTCTAAATGACCAAGTTTGACCAGATTCTCCGCTCTGAAGTGGAGTCGCCCCCTCTTCTAAGCAGATCCTGAGGCCTCACTAAGCCATTCAATCGGTACTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTACAATGCTCTATCCCCAGCACGACGGAGTTTCACAAGATTACCAAGACCTCTCGGCCAAGGTTAGACTCGCTGGCTCCG。

在本发明中，所述PCR扩增近平滑念珠菌DNA序列的引物优选为：近平滑念珠菌上游引物和近平滑念珠菌下游引物，所述近平滑念珠菌上游引物的序列如SEQ ID No.21所示，具体序列为：

5'-TCATCGCACGGGATTCTCAC-3'；

所述近平滑念珠菌下游引物的序列如SEQ ID No.22所示，具体序列为：

5'-TGTGAAACTCCGTCGTGCTG-3'。

在本发明中，所述近平滑念珠菌DNA序列如SEQ ID No.7所示，具体为：

TCATCGCACGGGATTCTCACCCTCTGTGACGTTCTGTTCCAAGAAACATAGACAAGAGCCAGACCCAAAGATACCTTCTTCAAATTACAACTCGGACACTGAAAGTGCCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGCTACTAAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTTGAGGTCGAATTTGGAAGAAGTTTTGGAGTTTGTACCAATGAGTGGAAAAAACCTATCCATTAGTTTATACTCCGCCTTTCTTTCAAGCAAACCCAGCGTATCGCTCAACACCAAACCCGAGGGTTTGAGGGAGAAATGACGCTCAAACAGGCATGCCCTTTGGAATACCAAAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGAATATCTGCAATTCATATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTATTAAATAATCGGTTGACATTAAATAAAATTTGGTTGAGTTTAATCTCTGGCAGGCCCCATATAGAAGGCCTACCAAAGCAAAGTTTTCAAAAAAAGAAAAACACATGTGTAAGAAAAAATGCAGTTAAGCACTTTTCATTCTGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCAAGTTTGACTAGCTTCTCGGTTCCAAGATGGAGTTGCCCCCTTCTCTAAACCAATCCGGAAGCCTCACTAAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTACAATGCTCTATCCCCAGCACGACGGAGTTTCACA。

在本发明中，所述PCR反应液包括400～500μM的dNTP、0.1～0.2U/μL的Taq酶、0.1～0.2U/μL的UNG酶、0.1～0.25μM的参比荧光ROX、3～6mM的MgCl₂和缓冲液，所述缓冲液包括10～20mM的Tris-HCl、100～200mM的KCl，所述Tris-HCl的pH值为8。

在本发明中，所述试剂盒在使用时，PCR反应体系每20μL包括：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，PCR反应液10μL，ddH₂O 4.5μL，样品、阳性对照品或阴性对照品4μL。

在本发明中，所述试剂盒在使用时，PCR反应条件包括：

第一阶段：50℃，2min；1个循环；

第二阶段：95℃，10min；1个循环；

第三阶段：95℃，15s；56℃，30s；40个循环。

在本发明中，所述同时检测四种念珠菌的结果分析条件优选设定为：

(1)分析扩增曲线图(Amplification Plot)结果时，设定成图类型(Plot type)为：ΔRn vs Cycle；

(2)基线(Baseline)设定：以循环数2至最先扩增曲线之前3个循环数为基线；

(3)阈值(Threshold)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置阈值线，也可手动设置，通常阈值线设在基线以上扩增曲线的指数增长期内呈线性的部位，扩增曲线与阈值线相交的点即为Ct值，代表了标准化后报告基团荧光强度(Rn，The Normalized Intensityof the Reporter)扩增前后的变量值ΔRn[ΔRn＝Rn(PCR扩增后读数)-Rn(PCR扩增前读数)]，Ct值与反应初始目的DNA片段的量对数值呈线性负相关。

在本发明中，所述阳性对照和阴性对照优选同时满足以下条件，否则视为无效：

(1)阴性质控：阴性对照Ct值＞34，或“Undetermined”；

(2)阳性质控：阳性对照Ct值≤34。

在本发明中，当检测结果的Ct值≤34时，为阳性结果，当检测结果的样本Ct值＞34或者“Undetermined”时，为阴性结果。

下面结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

试剂盒的组成：

1、引物设计

根据白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌的核糖体RNA的基因组DNA的序列，筛选能够通用检测这四种念珠菌且与其他物种不同源的靶序列，靶序列的核苷酸序列与具体实施方式中靶序列的核苷酸序列相同，在此不再赘述。

针对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌的靶序列，设计用于荧光PCR检测这四种念珠菌的特异性引物，引物的序列与具体实施方式中的引物序列相同，在此不再赘述。

2、荧光探针设计

针对上述荧光PCR的特异性引物序列及靶序列，设计与四种念珠菌序列特异性结合的荧光探针，探针的序列与具体实施方式中的探针的序列相同，在此不再赘述。

探针5'端标记的报告荧光基团，比如FAM或VIC等等。探针3'末端标记淬灭荧光基团，比如BHQ或TAMRA等。探针由上海捷瑞生物技术有限公司合成。

3、试剂盒的组成

引物由上述的上游引物和下游引物组成，浓度分别为10μM。

探针为上述的荧光探针，探针浓度为10μM。

阴性对照为含无关基因的质粒，该无关基因为植物拟南芥的DNA片段，阴性对照浓度为1000ng/mL。

阴性对照质粒的构建过程与具体实施方式中的构建过程相同，在此不再赘述。得到的拟南芥的DNA片段的序列与具体实施方式中的序列相同，在此不再赘述。

阳性对照，为了使念珠菌检测试剂盒有阳性对照，特意设计了引物用于扩增阳性对照序列，阳性对照序列针对本试剂盒的荧光PCR扩增的靶序列(包括四种上述念珠菌的靶序列)，且此阳性对照的DNA序列的长度比靶序列的要长，这样就能完全覆盖整个荧光PCR扩增的靶序列。

阳性对照为分别含白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌及光滑念珠菌阳性对照DNA序列的4种克隆质粒，1000ng/mL等比例混合后，稀释到20ng/mL。

阳性对照的制备过程与具体实施方式中的制备过程相同，在此不再赘述。

含白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌及光滑念珠菌阳性对照DNA序列的4种克隆质粒混合，调节浓度。

PCR反应液包括dNTP(含脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP，dCTP，dGTP和dUTP)、耐热的Taq DNA聚合酶(Taq酶)、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、参比荧光(用来校正孔与孔之间的荧光信号ROX)，可购自美国ABI公司，货号为4440038。

表1试剂盒的组成

实施例2

试剂盒的检测方法

在使用本试剂盒进行检测前，需提取待检测样本的DNA，待检测样本可以是痰液、分泌物、尿液、胸水、腹水、脑脊液等可能含念珠菌的样本，样本DNA的提取和纯化需要有特殊的方法，其中与常规DNA提取方法不同的是真菌有比较厚的细胞壁，与其他普通细菌、病毒等微生物不同，需要增加破壁这个环节，否则DNA很难释放出来，造成后续荧光PCR反应的失败。对于真菌DNA提取和纯化，可以使用杭州缔蓝生物技术有限公司生产的专门针对真菌的提取试剂盒。

1、PCR反应管的准备(试剂准备区)

(1)确定需要进行的反应管数n(样本数+阴性对照+阳性对照)；取出灭菌纯化水(用户自备)和PCR反应液；取出试剂盒中的其他组分，放冰上或室温融化，所有试剂盒组分使用前均需要瞬时离心，每份反应体系如表2所示：

表2 PCR反应体系

PCR反应液

上游引物

下游引物

探针

灭菌纯化水

样本/对照品

总体积

10μL

0.5μL

4.5μL

4μL

20μL

按反应管数n计算上述各试剂(除了样本/对照品)的用量，并加入至离心管中，充分混匀(建议用移液器缓慢反复吹打混匀，同时避免液体飞溅或产生大量气泡)，瞬时离心后，向每个PCR反应管分装16μL。

(2)将上述准备好的PCR反应管及阴性对照、阳性对照转移到样本处理区或者加样区。

2、加样(样本处理区或者加样区)

向准备好的PCR反应管中分别加入4μL待测样本的DNA或阴性对照或阳性对照样本，盖紧管盖(或贴上封板膜)后瞬时离心，转移到样本检测区。

3、PCR扩增及荧光检测(样本检测区)

将准备好的反应管放置在荧光PCR仪中，依照已编辑的样本信息按下列条件进行扩增反应及检测，见表3：

表3 PCR扩增条件

4、结果分析条件设定

(1)分析扩增曲线图(Amplification Plot)结果时，一般可设定成图类型(Plottype)为：ΔRn vs Cycle。

(2)基线(Baseline)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置基线，通常是循环数2至最先扩增曲线之前3个循环数为基线。

(3)阈值(Threshold)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置阈值线，也可手动设置，通常阈值线设在基线以上扩增曲线的指数增长期内呈线性的部位，扩增曲线与阈值线相交的点即为Ct值，代表了标准化后报告集团荧光强度(Rn，The Normalized Intensityof the Reporter)扩增前后的变量值ΔRn[ΔRn＝Rn(PCR扩增后读数)-Rn(PCR扩增前读数)]，Ct值与反应初始目的DNA片段的量对数值呈线性负相关。

5、质控标准

本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效，需要重做：

(1)阴性质控：阴性对照Ct值＞34，或“Undetermined”。

(2)阳性质控：阳性对照Ct值≤34。

6、实验结果的读取

以ABI7500为例，其它机型以该机型所配套的软件说明书为准。根据ABI7500仪器配套的分析软件说明书，首先将基线和阈值设定好(建议基线设定选自动，阈值设定选手动，可设在ΔRn＝0.3附近)，然后在软件内点击分析(Analyse)，系统将自动生成结果，观察每个样本扩增曲线的Ct值，并下载到Excel文件中。

利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样本念珠菌(FAM或VIC等)Ct值，根据表4进行判定。

表4阳性判断值

1	样本Ct值≤34	阳性结果
			2	样本Ct值＞34或者“Undetermined”	阴性结果

实施例3

试剂盒的性能评价

1、检测限

1)本试剂盒与白色念珠菌阳性参考品的剂量效应曲线

白色念珠菌阳性参考品：即不同浓度的白色念珠菌克隆质粒ABc-T。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对白色念珠菌阳性参考品进行检测，结果见表5。

表5白色念珠菌的检测限

根据表5可以得出，本申请提供的试剂盒在1ng/μl～0.00001ng/μl范围内可检出白色念珠菌。

2)本试剂盒与热带念珠菌阳性参考品的剂量效应曲线

热带念珠菌阳性参考品：即不同浓度的热带念珠菌克隆质粒ARc-T。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对热带念珠菌阳性参考品进行检测，结果见表6。

表6热带念珠菌的检测限

根据表6可以得出，本发明提供的试剂盒在1ng/μl-0.000001ng/μl范围内可检出热带念珠菌。

3)本试剂盒与光滑念珠菌阳性参考品的剂量效应曲线

光滑念珠菌阳性参考品：即不同浓度的光滑念珠菌克隆质粒AGc-T。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对光滑念珠菌阳性参考品进行检测，结果见表7。

表7光滑念珠菌的检测限

根据表7可以得出，本发明提供的试剂盒在1ng/μl～0.000001ng/μl范围可检出光滑念珠菌。

4)本试剂盒与近平滑念珠菌阳性参考品的剂量效应曲线

近平滑念珠菌阳性参考品：即不同浓度的近平滑念珠菌克隆质粒AJc-T。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对近平滑念珠菌阳性参考品进行检测，结果见表8。

表8近平滑念珠菌的检测限

根据表8可以得出，本发明提供的试剂盒在1ng/μl～0.000001ng/μl范围可检出近平滑念珠菌。

5)本试剂盒与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌四种阳性参考品混合在一起的剂量效应曲线

白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌四种阳性参考品质粒按1ng/μl等比混合(混合阳性参考品)，然后按表9浓度进行稀释。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对混合阳性参考品进行检测。

表9白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌四种混合的的检测限

根据表9可以得出，本发明提供的试剂盒在1ng/μl～0.000001ng/μl范围可检出白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌。

2、特异性

1)阳性反应

分别提取白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌的DNA(模板浓度为1ng/μl)，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测。

表10特异性结果

样本类型	CT值	结果
			白色念珠菌	15.585±0.400	阳性
热带念珠菌	13.417±0.250	阳性
			光滑念珠菌	13.428±0.260	阳性
近平滑念珠菌	13.729±0.008	阳性

根据表10可以得出，本发明提供的试剂盒中的组分可以与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌产生阳性反应。

2)交叉反应

方法：分别提取新生隐球菌、格特隐球菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、金黄色葡萄球菌(黄金亚种)和肺炎链球菌的DNA，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测，结果见表11。

表11交叉反应结果

样本类型	CT值	结果
			新生隐球菌	Undetermined	阴性
格特隐球菌	Undetermined	阴性
			黄曲霉	Undetermined	阴性
烟曲霉	Undetermined	阴性
			黑曲霉	Undetermined	阴性
杂色曲霉	Undetermined	阴性
			大肠杆菌	Undetermined	阴性
肺炎链球菌	Undetermined	阴性
			阴性对照	Undetermined	阴性
阳性对照	18.94683838	阳性

根据表11的结果可以得出，本发明提供的试剂盒与临床常见其他各类真菌病原体(新生隐球菌、格特隐球菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、杂色曲霉)不产生交叉反应。另外，与大肠杆菌和肺炎链球菌不存在交叉反应。

3、精密度

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，用高浓度(样本浓度为20ng/mL)、低浓度(样本浓度为0.4ng/mL)的混合阳性参考品连续重复10次检测，高浓度样本的检测结果参见表12，低浓度样本的检测结果参见表13。

表12高浓度样本的检测结果

表13低浓度样本的检测结果

样本编号	CT值	结果
			J1-1	24.36381149	阳性
J1-2	24.32072258	阳性
			J1-3	24.59988403	阳性
J1-4	24.95740891	阳性
			J1-5	24.99547768	阳性
J1-6	25.12367058	阳性
			J1-7	24.68927574	阳性
J1-8	24.54802132	阳性
			J1-9	24.65227699	阳性
J1-10	24.37594986	阳性

根据表12和13可以得出，计算得到高浓度样本的批内CV值为1.3％，低浓度样本的批内CV值为1.1％。

4、稳定性

对试剂盒进行热稳定试验，将试剂盒置于37℃温箱中放置，每天取出可进行试剂盒性能指标全检量的试剂盒进行性能检测，连续检测六天。性能指标包括最低检测限、阳性参考品符合率、特异性和精密度。

(1)最低检测限

设定试剂盒的最低检测限为0.01ng/mL，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对浓度为0.01ng/mL的混合阳性参考品进行检测，重复20次，计算阳性检出比(阳性检出样本数/20)。

(2)阳性参考品符合率

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对10份阳性参考品进行检测，计算阳性参考品符合率(阳性样本数/10)。

阳性参考品包括：100ng/mL白色念珠菌阳性参考品、20ng/mL白色念珠菌阳性参考品、10ng/mL白色念珠菌阳性参考品、100ng/mL热带念珠菌阳性参考品、20ng/mL热带念珠菌阳性参考品、10ng/mL热带念珠菌阳性参考品、100ng/mL光滑念珠菌阳性参考品、20ng/mL光滑念珠菌阳性参考品、100ng/mL近平滑念珠菌阳性参考品、20ng/mL近平滑念珠菌阳性参考品。

(3)特异性

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对样本进行检测。样本包括：不含被测物的特异性样本、与被测物种属相近的特异性样本。

不含被测物的特异性样本包括：含人类DSCR3基因片段1的质粒、含人类ITM2B基因片段的质粒、含人类KLHDC8A基因片段的质粒、含人类LINC00441基因片段的质粒、含人类LPAR6基因片段的质粒、含人类RB1基因片段1的质粒、含人类RB1基因片段2的质粒、含人类RCBTB2基因片段的质粒、含人类TTC3基因片段1的质粒、拟南芥ARID基因片段质粒。

与被测物种属相近、感染部位相同或感染症状相似的特异性样本包括：含黑曲霉基因片段质粒、含黄曲霉基因片段质粒、含烟曲霉基因片段质粒、含杂色曲霉基因片段质粒、含格特隐球菌基因片段质粒、含新生隐球菌基因片段质粒、大肠杆菌DNA、肺炎链球菌DNA、含拟南芥ARID基因片段质粒。

(4)精密度

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，用高浓度(样本浓度为20ng/mL)、低浓度(样本浓度为0.4ng/mL)的混合阳性参考品连续重复10次检测。

以上4种性能指标的检测结果汇总参见表14。

表14 4种性能指标的检测结果

根据表14可以得出本试剂盒在温度在37℃的温箱中放置6天后，各项性能指标包括最低检测限、阳性参考品符合率、特异性和精密度均达到设计要求。

实施例4

试剂盒在临床样本中的应用

临床试验选取念珠菌传统临床实验室“金标准”培养检定法作为“对照方法”。采用“双盲表”进行“培养检定”和“荧光PCR试验”。对于进行荧光PCR试验检测的样本，按照产品说明书相关要求进行处理，将处理后的样本用念珠菌通用核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(以下简称“考核试剂”)进行检测，检测结果采用2×2列联表对计数资料进行假设检验，计算Kappa值，评价“考核试剂”与“对照方法”的一致性。对于不一致的检测结果，则采用再次培养或送至第三方专业测序公司作DNA测序的方法，结果进一步比对，综合判断“考核试剂”的临床有效性和一致性。

本次试验共检测了痰液、尿液、分泌物共计1583份有效样本。检测时，本试剂的质控品和培养检定法质控品均正常在控，符合实验要求，具体样本检测结果见表15：

表15全部样本检测结果表

Kappa＝0.949；

阳性符合率＝97.64％，95％置信区间96.41％～98.53％；

阴性符合率＝97.27％，95％置信区间95.76％～98.35％；

总符合率＝97.47％。

根据以上检测数据可以得出，本发明提供的试剂盒检测的结果与培养检定法检测的结果具有较高的符合性(Kappa＝0.949)，阳性符合率为97.64％，阴性符合率为97.27％，总符合率为97.47％。

由以上实施例可知，本发明提供的一对引物一条探针特异性地同时检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌四种念珠菌；在检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌的同时，与临床其他常见真菌、细菌无交叉反应，即特异性强；可以检测到DNA含量低至0.00001ng/μl-0.000001ng/μl的样本中的白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌，即灵敏度高，总符合率为97.47％。

实施例5

试剂盒可以定量检测四种念珠菌

用已知浓度的标准品(将本试剂盒可检测的四种念珠菌每种浓度为1ng/μl等量均匀混合)，进行10倍连续梯度稀释制备成5至7个浓度点的标准曲线，每个浓度3个复管，以建立Ct值与浓度之间的线性关系。外加一个用阳性标准品制成的阳性对照(也可以不加，因为标准曲线所用的就是阳性标准品)，另外加一个阴性对照，用无关基因拟南芥的基因片段做为阴性对照。另外，可以加一个内参，此处用人的beta-actin管家基因，以监控样本核酸提取过程以及荧光PCR反应体系的状态。另外反应体系中加入ROX荧光素，以校准基础荧光值，消除孔与孔之间的差异。标准曲线在PCR反应的线性扩增区域形成线性方程，其R²:0.997,本试剂盒扩增效率是95.57％(见图1和图2)，其线性范围是：1ng/μl～0.000001ng/μl，平均Ct值见表9。在测量样本时，上述标准曲线、阴、阳性对照、内参以及一定浓度的样本DNA同时进行荧光PCR反应，使用ABI7500、7300、StepOne Plus等荧光PCR仪，其内置分析软件将会根据标准曲线和样本的Ct值，计算出样本中的靶基因的核酸浓度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州缔蓝生物技术有限公司

<120> 一种同时检测四种念珠菌的引物探针组合和试剂盒

<141> 2017-12-13

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaaaacttt caacaacgga tctc 24

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcatttcgc tgcgttct 18

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggttctcgc atcgat 16

<210> 4

<211> 826

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatcgccaag ccaaattcac acttcagtat gacttgtgtc tttccaggaa ggaatttctc 60

aacctcactt ttttccttct cagtagaaac ggccttatga cctgaaagtg acattaacat 120

caagtatcat gcataacgca ttttctataa aagaaaaagg gtctaaacca aaaaaaggtg 180

cataataaac ccacatgatg cagacggtta ataatcaaca gctcctcttc atctgtaaga 240

ctggcactac cacattctgc gaatggagta ttaaaccatt cttcgaaatt atgaattgag 300

ttaaagatgt gaggaagaag aaaattaagc agcgaccata gttcttgcag actgttctgt 360

atgggagttc cagttaatag aagtctgcgc ttaatccggt agctgcatcc aggacaaatt 420

agtgtaagca aaatgtcttt aaatttcctt tgtgacagta tctttaagag ataaatcaga 480

gtaacaacta attaacacca ttcacttcag acttcatcaa gctaatgcgt aaaaaggcat 540

gtctaaacat ctttaagaaa ctagatacag tctactcaaa gaccagagta acatacagaa 600

acatacccag ttcctagagt ctttgcgaga gcacattcat ggttcttcag acgatgtcct 660

tcatcaacaa tcatgtagtt ccagtcaatt ttcttcaaaa atgctttatc tctcatgata 720

agatcgtagt gggttatcaa cacattaaat tttcctcctg ctattcttgc tcttatttca 780

gttcttttct cctttgatcc atcgtaaaga aaatcgctga atcatg 826

<210> 5

<211> 1013

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagcttgctg tgattacgtc cctgcccttt gtgcacaccg cccgtcgcta ctaccgattg 60

aatggcttag tgaggcctcc ggattggttt aggaaagggg gcaacctcat tctggaaccg 120

agaagctggt caaactttgt catttagagg aagtaaaagt cgtaacaagg tttccgtagg 180

tgaacctgcg gaaggatcat tactgatttg cttaattgca ccacatgtgt ttttctttga 240

aacaaacttg ctttggcggt gggcccagcc tgccgccaga ggtctaaact tacaaccaat 300

tttttatcaa cttgtcacac cagattatta cttaatagtc aaaactttca acaacggatc 360

tcttggttct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga tacgtaatat gaattgcaga 420

tattcgtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc tctggtattc cggagggcat 480

gcctgtttga gcgtcgtttc tccctcaaac cgctgggttt ggtgttgagc aatacgactt 540

gggtttgctt gaaagacggt agtggtaagg cgggatcgct ttgacaatgg cttaggtcta 600

accaaaaaca ttgcttgcgg cggtaacgtc caccacgtat atcttcaaac tttgacctca 660

aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag catatcaata agcggaggaa aagaaaccaa 720

cagggattgc ctcagtagcg gcgagtgaag cggcaaaagc tcaaatttga aatctggcgt 780

ctttggcgtc cgagttgtaa tttgaagaag gtatctttgg gcccggctct tgtctatgtt 840

ccttggaaca ggacgtcaca gagggtgaga atcccgtgcg atgagatgac ccgggtctgt 900

gtaaagttcc ttcgacgagt cgagttgttt gggaatgcag ctctaagtgg gtggtaaatt 960

ccatctaaaa ctaaatattg gcgagagacc gatagcgaac aagtacagtg atg 1013

<210> 6

<211> 964

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgggaaatct tgtgaaactc cgtcgtgctg gggatagagc attgtaattg ttgctcttca 60

acgaggaatt cctagtaagc gcaagtcatc agcttgcgtt gattacgtcc ctgccctttg 120

tacacaccgc ccgtcgctac taccgattga atggcttagt gaggcttccg gattggttta 180

ggaaaggggg caactccatt ctggaaccga gaagctagtc aaacttggtc atttagagga 240

agtaaaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt actgatttgc 300

ttaattgcac cacatgtgtt ttttattgaa caaatttctt tggtggcggg agcaatccta 360

ccgccagagg ttataactaa accaaacttt ttatttacag tcaaacttga tttattatta 420

caatagtcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctcg catcgatgaa gaacgcagcg 480

aaatgcgata cgtaatatga attgcagata ttcgtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca 540

ttgcgccctt tggtattcca aagggcatgc ctgtttgagc gtcatttctc cctcaaaccc 600

ccgggtttgg tgttgagcaa tacgctaggt ttgtttgaaa gaatttaacg tggaaactta 660

ttttaagcga cttaggttta tccaaaaacg cttattttgc tagtggccac cacaatttat 720

ttcataactt tgacctcaaa tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca tatcaataag 780

cggaggaaaa gaaaccaaca gggattgcct tagtagcggc gagtgaagcg gcaaaagctc 840

aaatttgaaa tctggctctt tcagagtccg agttgtaatt tgaagaaggt atctttgggt 900

ctggctcttg tctatgtttc ttggaacaga acgtcacaga gggtgagaat cccgtgcgat 960

gaga 964

<210> 7

<211> 946

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcatcgcacg ggattctcac cctctgtgac gttctgttcc aagaaacata gacaagagcc 60

agacccaaag ataccttctt caaattacaa ctcggacact gaaagtgcca gatttcaaat 120

ttgagctttt gccgcttcac tcgccgctac taaggcaatc cctgttggtt tcttttcctc 180

cgcttattga tatgcttaag ttcagcgggt agtcctacct gatttgaggt cgaatttgga 240

agaagttttg gagtttgtac caatgagtgg aaaaaaccta tccattagtt tatactccgc 300

ctttctttca agcaaaccca gcgtatcgct caacaccaaa cccgagggtt tgagggagaa 360

atgacgctca aacaggcatg ccctttggaa taccaaaggg cgcaatgtgc gttcaaagat 420

tcgatgattc acgaatatct gcaattcata ttacttatcg catttcgctg cgttcttcat 480

cgatgcgaga accaagagat ccgttgttga aagttttgac tattaaataa tcggttgaca 540

ttaaataaaa tttggttgag tttaatctct ggcaggcccc atatagaagg cctaccaaag 600

caaagttttc aaaaaaagaa aaacacatgt gtaagaaaaa atgcagttaa gcacttttca 660

ttctgtaatg atccttccgc aggttcacct acggaaacct tgttacgact tttacttcct 720

ctaaatgacc aagtttgact agcttctcgg ttccaagatg gagttgcccc cttctctaaa 780

ccaatccgga agcctcacta agccattcaa tcggtagtag cgacgggcgg tgtgtacaaa 840

gggcagggac gtaatcaacg caagctgatg acttgcgctt actaggaatt cctcgttgaa 900

gagcaataat tacaatgctc tatccccagc acgacggagt ttcaca 946

<210> 8

<211> 977

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgctcgtgtc ccacatactg atatggccta caatttcaag ttaactcaaa aacgagtatc 60

actcactacc aaacacaatg tgtttgagaa ggaaatgacg ctcaaacagg catgcccccc 120

ggaataccag agggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg attcacggaa ttctgcaatt 180

cacattacgt atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc gagaaccaag agatccattg 240

ttgaaagttt tgaagttgtt ttctactaaa agaaatcttg tgttgactga attagtttaa 300

aaaaatattt gtttgtgttt gcatccactg ggagaactcc cccccgaaag agagcgttcc 360

cccaacgaac aaaagaatag tagtaaagta aactccactg tgtgtagtaa ttagaaagtg 420

tcgagtcgtg tgataaaaca cctcctttgg aatagagaga tccacgcaca ctcccaggtc 480

tttgtcggct ccctcccccc actgcagaac acccaccaac cgcgcactta agcgcaggca 540

ggagaaatag cattcacagc agagaaaata ttttaggagc ctcctgagtg tctacactgg 600

tcctccccag agatgtctct ctccgagctc agacaaatca attaaatttc tttaatgatc 660

cttccgcagg ttcacctacg gaaaccttgt tacgactttt agttcctcta aatgaccaag 720

tttgaccaga ttctccgctc tgaagtggag tcgccccctc ttctaagcag atcctgaggc 780

ctcactaagc cattcaatcg gtactagcga cgggcggtgt gtacaaaggg cagggacgta 840

atcaacgcaa gctgatgact tgcgcttact aggaattcct cgttgaagag caataattac 900

aatgctctat ccccagcacg acggagtttc acaagattac caagacctct cggccaaggt 960

tagactcgct ggctccg 977

<210> 9

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 60

g 61

<210> 10

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 60

g 61

<210> 11

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcaaaacttt caacaatgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 60

g 61

<210> 12

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 60

g 61

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aatcgccaag ccaaattcac ac 22

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catgattcag cgattttctt tacg 24

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagcttgctg tgattacgtc cctgcccttt g 31

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

catcactgta cttgttcgct atcggtct 28

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgggaaatct tgtgaaactc cgtcgtg 27

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tctcatcgca cgggattctc ac 22

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgctcgtgtc ccacatactg a 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cggagccagc gagtctaacc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcatcgcacg ggattctcac 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgtgaaactc cgtcgtgctg 20

Claims

1.一种同时检测四种念珠菌的引物探针组合，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；

2.一种试剂盒，包括权利要求1所述的引物探针组合、阴性对照品、阳性对照品和PCR反应液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：浓度为8～12μM的上游引物15～25μL，浓度为8～12μM的下游引物15～25μL，浓度为8～12μM的探针8～15μL，浓度为800～1200ng/mL的阴性对照品10～20μL，质粒总浓度为15～25ng/mL的阳性对照品10～20μL，PCR反应液的量为200～250μL。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括含有白色念珠菌DNA序列的质粒、含有热带念珠菌DNA序列的质粒、含有近平滑念珠菌DNA序列的质粒和含有光滑念珠菌DNA序列的质粒，所述含有白色念珠菌DNA序列的质粒与含有热带念珠菌DNA序列的质粒、含有近平滑念珠菌DNA序列的质粒和含有光滑念珠菌DNA序列的质粒的质量比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)；

所述白色念珠菌DNA序列如SEQ ID No.5所示；

所述热带念珠菌DNA序列如SEQ ID No.6所示；

所述近平滑念珠菌DNA序列如SEQ ID No.7所示；

所述光滑念珠菌DNA序列如SEQ ID No.8所示。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括400～500μM的dNTP、0.1～0.2U/μL的Taq酶、0.1～0.2U/μL的UNG酶、0.1～0.25μM的参比荧光ROX、3～6mM的MgCl₂和缓冲液，所述缓冲液包括10～20mM的Tris-HCl、100～200mM的KCl，所述Tris-HCl的pH值为8。

7.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在使用时，PCR反应体系每20μL包括：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，PCR反应液10μL，ddH₂O 4.5μL，样品、阳性对照品或阴性对照品4μL。

8.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在使用时，PCR反应条件包括：

第一阶段：50℃，2min；1个循环；

第二阶段：95℃，10min；1个循环；

第三阶段：95℃，15s；56℃，30s；40个循环。