CN110157827A - 一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定临床常见真菌的试剂盒及其应用 - Google Patents
一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定临床常见真菌的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于快速检测多种临床常见病原真菌的分子信标及试剂盒，属于微生物检测技术领域。本发明提供的分子信标序列如SEQ ID NO.1～3所示，通过在NCBI的基因序列库中比对多种临床常见真菌的18s核糖体RNA序列，在其V4和V9可变区的关键位点处设计特异性分子信标，能够对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌、皱落念珠菌、酿酒酵母、海洋酵母、粘红酵母、新型隐球菌、罗伦特隐球菌、土生隐球菌、阿萨西毛孢子菌、烟曲霉等17种临床常见真菌进行快速检测及鉴定。本发明还公开了包含上述分子信标的鉴定多种真菌的试剂盒，能快速、准确鉴定多种临床常见真菌。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种用于快速鉴定临床常见真菌的试剂盒；还涉及所述试剂盒中的特异性结合真菌18s核糖体RNA序列的分子信标。
背景技术
真菌感染根据病变部位不同可分成浅部真菌病和深部真菌病两大类。近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤药物及免疫抑制剂的开发和应用，介入治疗、器官移植、骨髓移植术及导管插管等技术的普遍开展，免疫障碍以及艾滋病的流行，医院深部真菌感染的发生率正在急剧升高，已成为引起血流感染的第四大致病菌。深部真菌感染有两大特点，一是病人临床症状和体征非特异性，早期诊断检出率低；二是一经感染后病情发展迅速，预后差，病死率高达40～90％，患者根本无法等待常规3-5天的报告周期。也许几天后检验科室给临床确实提供了一份准确、可靠的病原学检验报告，但此时病人的病情可能已发生变化。这份检验报告对于病人治疗而言已经过时，失去了其应有的价值，因此也大大降低了临床医师应用真菌鉴定技术的热情，他们往往选择根据本地流行病学情况采用经验性用药来治疗患者感染，这是造成抗生素滥用的最直接原因。因此及早将致病真菌鉴定到种对于指导临床应用合适的抗真菌药物进行治疗具有非常重要的意义。
以直接镜检及培养和形态学鉴定发现和确认病原菌的方法，仍是目前重要的检测方法，但其对人工的专业性要求高、操作繁琐费事。其培养时间长(至少3天)，时效性差，直接影响医生开单积极性，导致患者未经病原菌培养测试而直接被用以抗生素，造成因抗生素的不合理使用带来的并发症。
全自动微生物鉴定系统利用微生物体内物质对反应底物的利用，产生pH值变化、释放色源或荧光源复合物酶学反应的原理，能快速有效地实现上百种病原真菌的准确鉴定。目前已有多种微生物自动鉴定及药敏测试系统应用于临床微生物检测，如法国bioMérieux的Vitek-Auto Microbic System,Vitek 2compact,Vitek ATB；美国BD的PhoneixTM-100；德国西门子的MicroScan WalkAway System；英国的SensititreTMARIS；美国ABBott的MS-2System等。其操作方法简单，培养后的检测相对快速(6小时完成鉴定)、准确度高，近年来在大型医疗机构的接受度很高。但它同样存在一系列问题。首先，仪器设备，特别是耗材成本投入高，无法在中小型医院做到真正普及。其次，目前国内各大医院使用的全自动微生物鉴定系统几乎全依赖于国外进口，国产设备的性能差距非常大。
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种新型软电离生物质谱，其基本原理是根据样品与基质共结晶经过激光照射后形成的分子通过真空管所需的飞行时间来鉴别蛋白多肽等大分子，从而实现菌种鉴定。MALDI-TOF MS在微生物鉴定领域已成熟应用，其最大优势在于它非常庞大的数据库(FDA批准了IVD菌库的193种细菌和真菌以及RUO数据库的1250种)，可以直接鉴定培养的菌落，并且过程和结果解读都已实现高度自动化。但是该技术的设备费用投入高达200万以上，并非所有医疗机构都能承受。同时质谱检测的通量低，单次仅能检测1个样本，只能以连续进样的方式进行检测。当样本量大时，耗时显著。
分子诊断技术是微生物病原体鉴定领域的一项革命性技术，有时甚至可以同时检测数种病原菌。将真菌分离培养后与PCR、杂交探针法、基因芯片法、一代测序法、焦磷酸测序法等技术手段相结合，具有耗时短(3-5小时)、灵敏度高、重复性好的优点。但任何依赖PCR扩增的检测体系都无法回避因其高灵敏度而容易因轻微污染产生假阳性、扩增后产物易产生气溶胶污染等一系列难题。
综前所述，目前仍然没有一个理想的真菌快速鉴定产品，它既满足快速高效、操作简便、成本经济、灵敏度高、通量高的需求；同时具备结果稳定、重复性好、数据诠释方案简单、能实现自动化的特点。提供这样一种更具临床意义的快速、准确、高通量的病原学诊断方法，将传统的真菌病原菌的鉴定耗时从3-5天缩减至革命性的60分钟以内，将极大地推动临床医生的针对性用药，降低抗生素的滥用，在个性化用药领域具有划时代意义。此外，60分钟的检测时间大幅度缩短报告周期，使针对门诊病人的精确用药成为可能，同时亦可缩短病人住院周期，有助于医院医疗资源的周转利用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供用于17种临床常见真菌鉴定的分子信标。
本发明还要解决的技术问题是提供一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定真菌的试剂盒。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述试剂盒在临床常见真菌鉴定中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种用于鉴定临床常见病原真菌的分子信标，它包括如下序列：
(1)分子信标SMB1(SEQ ID NO.1)，其核苷酸序列为5’-HEX-CCGCGGCCTCTAAATGACCAAGTTTGACCAGCTTCTCGGCTCCAGAATCCGCGG-DAB-3’；
(2)分子信标SMB2(SEQ ID NO.2)，其核苷酸序列为5’-CY5-CGGCGCCTAAGCCAATCCGGAGGCCTCACTAAGCCATTCAATCGGTAGCGCCG-DAB-3’；
(3)分子信标SMB3(SEQ ID NO.3)，其核苷酸序列为5’-FAM-CCGCGGCATCAGAAAGATTGACCGGCCAACCAAGCCCAAAGTTCAACTACCCGCGG-DAB-3’；
上述三条分子信标在一次检测中共同使用，能够一次获得一组由三种不同的熔解温度值(Tm值)构成的数据，使得即便同源性较高的真菌菌种也能得以有效区分。
分子信标SMB1的5’端和3’端的各6个碱基是形成分子信标特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，中间42个碱基是分子信标SMB1与真菌18s核糖体RNA V9可变区互补结合的序列。
分子信标SMB2的5’端和3’端的各6个碱基是形成分子信标特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，中间41个碱基是分子信标SMB2与真菌18s核糖体RNA V9可变区互补结合的序列。
分子信标SMB3的5’端和3’端的各6个碱基是形成分子信标特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，中间44个碱基是分子信标SMB3与真菌18s核糖体RNA V4可变区互补结合的序列。
上述用于真菌鉴定的分子信标在制备鉴定临床常见真菌的试剂盒中的应用。
一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定真菌的试剂盒，该试剂盒包括上述三种分子信标混合液、HQ缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
其中，所述分子信标混合液中，分子信标SMB1的浓度为7.5μmol/L，分子信标SMB2的浓度为7.5μmol/L，分子信标SMB3的浓度为10μmol/L。
其中，所述HQ缓冲液中含有40mM Tris-Acetate pH7.8-8.0、100mM乙酸钾、30mM乙酸镁、0.5M甜菜碱、1.3mM DTT、11μg/mL BSA、1.3％(v/v)DMSO和DEPC水。
其中，所述阳性对照品为从白色念珠菌ATCC10231菌株中纯化得到的RNA、从光滑念珠菌ATCC2001菌株中纯化得到的RNA。每种真菌的RNA浓度为100ng/μL。
其中，所述阴性对照品为DEPC水。
上述鉴定临床常见真菌的试剂盒在真菌鉴定中的应用。
由于真菌的生长繁殖迅速，其基因组累积变异的速度也快；且多种真菌属于多倍体物种，其基因组内广泛存在等位基因异质性。因此即使是相同菌种的不同临床分离株之间核糖体RNA序列也会有所差异。本发明通过从NCBI的基因序列库中比对多种真菌及临床分离株的RNA序列，针对在相同菌种内相对保守、在不同菌种间差异性大的真菌18s核糖体RNA V4和V9可变区设计的特异性分子信标，能够快速可靠地实现临床常见病原真菌的准确鉴定。
有益效果：
(1)无需PCR扩增环节，能直接对提取的RNA产物进行熔解曲线检测与Tm值分析，大幅度缩减检测时间至30分钟以内，同时亦有效避免了PCR假阳性污染的风险；
(2)不含酶，提升了试剂盒的稳定性，并降低了检测成本；
(3)菌种鉴定覆盖范围广。本发明通过设计一组针对真菌18s核糖体RNA的特异性分子信标，可实现17种临床常见真菌的快速鉴定，鉴定范围涵盖了临床95％以上的侵袭性真菌感染的病原菌；
(4)实时检测，通过Tm值数据组合进行客观的结果判读，易建立标准化及自动化数据解析流程；
(5)本发明所述的真菌鉴定试剂盒具有操作简便、特异性强、成本低廉及高通量等优点，可用于指导临床快速诊断致病性真菌的感染情况，为临床用药治疗提供参考依据。
附图说明
图1为17种真菌在Hex荧光通道中的熔解曲线图。
图2为17种真菌在Cy5荧光通道中的熔解曲线图。
图3为17种真菌在Cy5荧光通道中的熔解曲线图。
图4为白色念珠菌阳性对照品在三个通道中的熔解曲线图组合。
图5为光滑念珠菌阳性对照品在三个通道中的熔解曲线图组合。
图6为一例浙江邵逸夫医院收集的热带念珠菌临床样本在三个通道中的熔解曲线图组合。
图7为一例济南军区总医院收集的乳酒念珠菌临床样本在三个通道中的熔解曲线图组合。
图8为阴性对照品在三个通道中的检测结果组合。三个信号通道均无熔解峰。
图中英文字母对应的中文名称为：
Fluorescence荧光值；Temperature温度；Melting Peaks熔解峰。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：用于鉴定临床常见真菌的分子信标寡核苷酸序列，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：
真菌核糖体RNA V9区分子信标SMB1(SEQ ID NO.1)：5’-HEX-CCGCGGCCTCTAAATGACCAAGTTTGACCAGCTTCTCGGCTCCAGAATCCGCGG-DAB-3’；
真菌核糖体RNA V9区分子信标SMB2(SEQ ID NO.2)：5’-CY5-CGGCGCCTAAGCCAATCCGGAGGCCTCACTAAGCCATTCAATCGGTAGCGCCG-DAB-3’；
真菌核糖体RNA V4区分子信标SMB3(SEQ ID NO.3)：5’-FAM-CCGCGGCATCAGAAAGATTGACCGGCCAACCAAGCCCAAAGTTCAACTACCCGCGG-DAB-3’。
实施例2：试剂盒的制备方法。
(1)HQ缓冲液：该缓冲液中含有40mM Tris-Acetate pH7.8-8.0、100mM乙酸钾、30mM乙酸镁、0.5M甜菜碱、1.3mM二硫苏糖醇(DTT)、11μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、1.3％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)和DEPC水(除DEPC水购自上海生工生物股份有限公司外，其余均购自美国Sigma-Aldrich公司)，-20℃保存；
(2)分子信标混合液：将SEQ ID NO.1～3所示的核苷酸序列交由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。用双蒸水溶解粉末后混合于一管中。分子信标SMB1的稀释浓度为7.5μmol/L，分子信标SMB2的稀释浓度为7.5μmol/L，分子信标SMB3的稀释浓度为10μmol/L，-20℃保存；
(3)阳性对照品：将白色念珠菌ATCC10231和光滑念珠菌ATCC2001菌株接种在念珠菌显色平板上，于37℃、70％相对湿度的条件下培养24-48小时后，取适量菌落进行核酸提取。对提取后的核酸进行浓度与纯度测试，确保A280/A260值不低于1.80；随即用DEPC水调整核酸浓度至100ng/μL。分装后置于-20℃保存。
(4)阴性对照品：DEPC水，-20℃保存。
实施例3：检测方法。
仪器：Roche480荧光定量PCR检测仪，BECKMAN22R台式微量冷冻离心机，Eppendorf 5810R台式冷冻离心机，太仓华利达实验室设备公司WH-866型涡旋振荡器。
(1)真菌RNA模板的制备(样本制备区)：本发明试剂盒未提供核酸提取试剂，用户可选取真菌RNA提取试剂盒或真菌总核酸提取试剂盒，提取含有18s核糖体RNA的真菌核酸；
(2)反应试剂的配制(试剂准备区)：从-20℃取出HQ缓冲液、分子信标混合液，在室温下融化后，根据样本数量配制反应液XμL：
X＝(8μL HQ缓冲液+4.5μL分子信标混合液)×(待检样本N个+阴性对照品1个+阳性对照品2个)。
振荡混匀后，2000rpm离心5s，按每孔12.5μL分装到96孔荧光定量检测板中，转至样本制备区备用。
(3)96孔板或PCR八连孔加样(样本制备区)：从-20℃取出阳性对照品和阴性对照品。将(1)中制备的真菌RNA模板、白色念珠菌阳性对照品、光滑念珠菌阳性对照品、阴性对照品分别取27.5μL加入到96孔板或PCR八连孔相应的反应孔中。贴好封口膜，3000rpm离心30s，然后放入荧光定量PCR仪中。
(4)荧光定量PCR检测(产物分析区)：将96孔板或PCR八连孔放入荧光PCR检测仪中，检测参数设置如下：
表1.真菌鉴定试剂盒荧光定量PCR检测参数
荧光通道选择FAM(465-510)、HEX(533-580)和CY5(618-660)，熔解因子设置为1.2，定量因子设置为10，最大整合时间设置为3；反应体系设置为40μL。保存文件，运行程序。
(5)检测结果解读：本试剂盒采用定量PCR仪中的Tm读取程序(Tm Calling)读取各孔各通道Tm峰值，检测结果应满足以下条件：
(5a)阴性对照孔中，各通道检测均无Tm峰值；
(5b)白色念珠菌阳性质控品、光滑念珠菌阳性质控品反应孔中，各通道检测呈现的Tm值要落在白色念珠菌、光滑念珠菌相应的Tm参考范围内。
上述条件应同时满足，否则系统检测无效。当系统检测是有效时，根据所读取的各通道Tm值与下表所列真菌Tm值参考范围的对应关系进行结果判定。如Tm值组合无法在下表中查得，则该菌为不属于本发明所覆盖的17种真菌的其他临床少见真菌。
表2.17种常见真菌Tm值参考范围
注：本发明只对检测对象进行定性分析，以相应荧光通道出现特异性Tm峰信号与否及其与各真菌种类的对应关系来进行判断，峰值的高低不能作为定量的依据。
实施例4：临床采集真菌样本的鉴定。
(1)样本：随机收集临床标本中分纯得到的真菌样本140例，挑取独立菌落接种于念珠菌显色平板(梅里埃)上，置于37℃、70％RH的恒温培养箱中培养24-48小时。
(2)比对方法：同时使用本发明所述的分子信标-熔解曲线法真菌鉴定试剂盒和梅里埃Vitek2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统对140例真菌进行种属鉴定，对比两者结果的符合率。
(3)检测方法：
(3a)真菌核酸提取：使用RNeasy Plant Mini Kit(德国Qiagen)提取真菌RNA；
(3b)熔解曲线检测：按照实施例3的方法进行操作；
(3c)比对方法：采用梅里埃Vitek2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统的真菌鉴定结果作为比对。
(4)检测及比对结果：利用本发明提供的分子信标-熔解曲线法真菌鉴定试剂盒与梅里埃Vitek2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统对140例真菌的种属鉴定结果进行比对，检测结果如表3所示。
表3.140例未知临床真菌分离株的鉴定与比对结果
利用本发明提供的分子信标-熔解曲线法真菌鉴定试剂盒与梅里埃Vitek2Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统对140例真菌的种属鉴定结果的符合率为100％。
图4为白色念珠菌阳性对照品在三个通道中的熔解曲线图组合。A为Hex通道检测熔解曲线图，分子信标SMB1的Tm值为73.61；B为Cy5通道检测熔解曲线图，分子信标SMB2的Tm值为75.83；C为Fam通道检测熔解曲线图，分子信标SMB3的Tm值为69.21。图5为光滑念珠菌阳性对照品在三个通道中的检测结果组合。A为Hex通道检测熔解曲线图，分子信标SMB1的Tm值为66.30；B为Cy5通道检测熔解曲线图，分子信标SMB2的Tm值为71.05；C为Fam通道检测熔解曲线图，分子信标SMB3的Tm值为60.19。图8为阴性对照品在三个通道中的信号图组合。阳性对照均在控，阴性对照无信号，系统检测有效。
图6为一例邵逸夫医院收集的热带念珠菌临床样本在三个通道中的熔解曲线图组合。A为Hex通道检测熔解曲线图，分子信标SMB1的Tm值为69.45；B为Cy5通道检测熔解曲线图，分子信标SMB2的Tm值为73.71；C为Fam通道检测熔解曲线图，分子信标SMB3的Tm值为63.62，判定为热带念珠菌，结果正确。
图7为一例济南军区总医院收集的乳酒念珠菌临床样本在三个通道中的熔解曲线图组合。A为Hex通道检测熔解曲线图，分子信标SMB1的Tm值为63.70；B为Cy5通道检测熔解曲线图，分子信标SMB2的Tm值为70.50；C为Fam通道检测熔解曲线图，分子信标SMB3的Tm值为60.27，判定为乳酒念珠菌，结果正确。
当待测菌种为非本试剂盒覆盖的17种菌时，或无熔解峰测得，或有熔解峰测得但Tm值组合结果不在试剂盒提供的Tm值参考范围内，因而不会被误判为本试剂盒覆盖范围内的菌种。
本发明能对包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌、皱落念珠菌、酿酒酵母、海洋酵母、粘红酵母、新型隐球菌、罗伦特隐球菌、土生隐球菌、阿萨西毛孢子菌、烟曲霉在内的17种临床常见真菌进行快速检测及鉴定。检测准确率为100％。本试剂盒具有操作简单、成本低廉、特异性高、通量高的优点；检测体系为封闭系统且无PCR扩增过程，能有效避免假阳性污染；检测流程从核酸提取(15min)到熔解曲线分析(35min)到出具报告单结果，总耗时在1小时以内，大大缩短了临床病原真菌检测的报告周期，用于临床能有助于医师进行真菌病原菌的快速诊断，改善治疗方案，减少抗生素滥用。该技术方案技术门槛低、设备投入简单、自动化程度高，易于推广，具有良好的临床应用前景。
序列表
<110> 杭州迪安医学检验中心有限公司
<120> 一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定临床常见病原真菌的试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgcggcctc taaatgacca agtttgacca gcttctcggc tccagaatcc gcgg 54
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcgcctaa gccaatccgg aggcctcact aagccattca atcggtagcg ccg 53
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgcggcatc agaaagattg accggccaac caagcccaaa gttcaactac ccgcgg 56
Claims (11)
1.一种用于真菌鉴定的分子信标，其特征在于，包括如下引序列：
(1)真菌核糖体RNA V9区分子信标SMB1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)真菌核糖体RNA V9区分子信标SMB2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)真菌核糖体RNA V4区分子信标SMB3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
上述三条分子信标在一次检测中共同使用。
2.权利要求1所述的用于真菌鉴定的分子信标，其特征在于，分子信标SMB1寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团HEX，3’端标记荧光猝灭基团DABCYL。
3.权利要求1所述的用于真菌鉴定的分子信标，其特征在于，分子信标SMB2寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团CY5，3’端标记荧光猝灭基团DABCYL。
4.权利要求1所述的用于真菌鉴定的分子信标，其特征在于，分子信标SMB3寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光猝灭基团DABCYL。
5.权利要求1所述的用于真菌鉴定的分子信标在制备真菌鉴定的试剂盒中的应用。
6.一种运用分子信标-熔解曲线技术鉴定真菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的三种分子信标混合液、HQ缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
7.根据权利要求6所述的运用分子信标-熔解曲线技术鉴定真菌的试剂盒，其特征在于，三种分子信标混合液中，分子信标SMB1的浓度为7.5μmol/L，分子信标SMB2的浓度为7.5μmol/L，分子信标SMB3的浓度为10μmol/L。
8.根据权利要求6所述的运用分子信标-熔解曲线技术鉴定真菌的试剂盒，其特征在于，所述HQ缓冲液中含有40mM Tris-Acetate pH7.8-8.0、100mM乙酸钾、30mM乙酸镁、0.5M甜菜碱、1.3mM DTT、11μg/mL BSA、1.3％(v/v)DMSO和DEPC水。
9.根据权利要求6所述的运用分子信标-熔解曲线技术鉴定真菌的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为从白色念珠菌ATCC10231菌株中纯化得到的RNA、从光滑念珠菌ATCC2001菌株中纯化得到的RNA，每种真菌的RNA浓度为100ng/μL。
10.根据权利要求6所述的运用分子信标-熔解曲线技术鉴定真菌的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为DEPC水。
11.权利要求6～10任一所述的用于鉴定临床常见真菌的试剂盒在真菌检测与鉴定中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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