CN101492743A

CN101492743A - 一种病原性真菌检测基因芯片

Info

Publication number: CN101492743A
Application number: CNA2009101030889A
Authority: CN
Inventors: 鲁卫平; 周元国; 陈星云; 顾大勇; 熊仁平; 刘苹; 李平; 赵艳; 安琳; 杨楠
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2009-01-19
Publication date: 2009-07-29
Anticipated expiration: 2029-01-19
Also published as: CN101492743B

Abstract

本发明涉及一种病原性真菌检测基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的特异性寡核苷酸探针，其中固定在所述固相载体上的特异性寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：1－SEQ ID NO：20所示的寡核苷酸序列或者与SEQ ID NO：1－SEQ ID NO：20所示的寡核苷酸序列互补的DNA或RNA序列；本发明还涉及上述病原性真菌检测基因芯片的制备方法和使用方法，本发明所述的病原性真菌检测基因芯片可同时、快速地检测多种病原性真菌，具有灵敏度高、特异性好、操作简单，不需要特殊仪器设备等特点，适合临床实验室开展。

Description

一种病原性真菌检测基因芯片

技术领域

本发明涉及一种基因芯片，尤其涉及一种病原性真菌检测基因芯片。

背景技术

近年来，致病性真菌引起的院内感染呈逐年上升趋势，特别是大量使用免疫抑制剂的患者、肿瘤患者、烧伤患者以及AIDS患者极易感染，另外，大量使用广谱抗菌药物以及留置导管的使用也大大增加了感染的机会。目前，侵袭性真菌感染已经成为免疫受损宿主致病率和死亡率增高的主要原因。临床真菌病的诊断主要依靠常规直接镜检、培养和形态学、免疫学方法以及生化鉴定方法，但这些方法不同程度存在操作繁琐、费时费力、阳性率低、特异性差等缺点，致使许多患者的诊断和治疗延误。虽然利用形态学和生物化学等方法将致病性酵母菌鉴定到种的技术已非常成熟，但通常耗时3～5天，若在此期间患者不进行有效的抗真菌治疗，导致体内真菌大量繁殖，后果往往较为严重。因此，建立一种能快速、敏感、准确地检测与鉴定真菌，尽早确定是否真菌感染的方法显得十分重要。

随着分子生物学研究和生物技术的进展，通过核酸序列的分析即基因型的鉴定进行分类被认为是当前进行种系发生关系及种间、种内分类、分型最可靠的方法之一。rRNA基因序列由于其在进化过程中保守性强而且其序列中又不乏有可变区和高变区，因此一直是生物学家研究的热点。真菌的rRNA基因是一种串联重复基因，即：18SrRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28SrRNA转录单位，分隔18S，5.8S，28S rRNA基因亚单位的序列称为内转录间隔区(internal transcribed space，ITS)，为非编码区。由于ITS区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中，序列中有足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究。

目前，在真菌核酸分子水平上应用较多的技术是基于PCR的RFLP(restrictionfragment length polymrphism)、RAPD(random amplified polymorphism DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)以及测序等技术。但这些技术对于临床检验来说，不同程度存在程序复杂、技术和设备要求高等问题。基因芯片又称DNA芯片、DNA微探针阵列等等，它是将半导体工业的微型制造技术与分子生物学结合起来，在玻璃、陶瓷、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片物质表面上产生二维DNA探针阵列，然后将待测定未知目标DNA与芯片上已知DNA探针“杂交”，以确定未知DNA分子。基因芯片技术由于同时将大量不同的探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品中多种不同物质进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、检测目标序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值。因此该技术具有高速度、高通量、高效率、并行地监测与之杂交的生物样品的特点。将其与真菌核糖体分型技术相结合，非常适合用于病原性真菌的检测和鉴定。

目前，基因芯片技术通常采用荧光标记的方法，其荧光染料和检测设备非常昂贵，荧光信号易淬灭，且操作要求严格，限制了该技术的应用。作为荧光素的替代，纳米直径的金微粒标记具有低价、稳定和独特的理化性质，在生物传感上具有很好的应用前景。纳米金是指直径为纳米范围的金颗粒或含金的化合物，对其进行修饰使其带上可与核酸形成共价结合的特定的连接分子，就能将纳米金颗粒标记到特定的核酸上，作为信号报告分子使用，化学性质稳定，且与银反应后可形成比原来体积大10⁶倍的黑色颗粒，可以用肉眼观察或用普通装置记录如照相、扫描记录。

发明内容

本发明的目的在于提供一种病原性真菌检测基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的特异性寡核苷酸探针，其中固定在所述固相载体上的特异性寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列或者与SEQID NO：1-SEQ ID NO：20所示的寡核苷酸序列互补的DNA或RNA序列。

本发明所述的病原性真菌检测基因芯片，还包括真菌通用探针、阳性对照探针、阴性对照探针，其中所述真菌通用探针优选具有SEQ ID NO：21所示的寡核苷酸序列，阳性对照探针优选具有SEQ ID NO：22所示的寡核苷酸序列，所述阴性对照探针优选具有SEQ ID NO：23所示的寡核苷酸序列，空白对照为不含任何探针的空白点样液。

本发明还提供所述的病原性真菌检测基因芯片的制备方法，其主要包含步骤：

1)合成SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20所示的特异性寡核苷酸探针；

2)合成SEQ ID NO：21所示的真菌通用探针、SEQ ID NO：22阳性对照探针、SEQ ID NO：23所示的阴性对照探针；

3)将步骤1)中合成的特异性寡核苷酸探针和步骤2)中合成的真菌通用探针、阳性对照探针和阴性对照探针印于固相载体上的相应位置，空白对照点为点样液，然后进行固定、封闭、洗涤和干燥，制得所述的病原性真菌检测基因芯片。

上述的病原性真菌检测基因芯片的制备方法中，步骤1)优选包括SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：20所示的特异性寡核苷酸探针。步骤2)中所述的真菌通用探针优选具有SEQ ID NO：21所示的寡核苷酸序列，阳性对照探针优选具有SEQ IDNO：22所示的寡核苷酸序列，所述阴性对照探针优选具有SEQ ID NO：23所示的寡核苷酸序列。

上述的病原性真菌检测基因芯片的制备方法中，步骤1)和步骤2)中合成所有寡核苷酸探针时，在探针5’端连上长度为15的poly(dT)作为间隔臂，然后在5’端标记上氨基。

本发明还提供上述的病原性真菌检测基因芯片的使用方法，其主要包含步骤：

1)对待测样品进行PCR扩增并标记生物素，得标记物；

2)将步骤1)制得的标记物滴加到所述病原性真菌检测基因芯片上的探针区，进行反应，洗涤并室温干燥；

3)将链酶亲和素标记的纳米金滴加到所述病原性真菌检测基因芯片上的探针区上，进行反应，洗涤并室温干燥；

4)将银染试剂滴加到所述病原性真菌检测基因芯片上的探针区上，进行反应，洗涤并室温干燥，然后进行检测结果的信息判读。

上述的病原性真菌检测基因芯片的使用方法中，步骤1)中包括使用PCR引物，该PCR引物具有SEQ ID NO：24-SEQ ID NO：25所示的寡核苷酸序列。

其中步骤1)中PCR扩增的反应体系和反应条件优选如下：

(1)PCR反应体系含：

10×PCR缓冲液 5μl

2.5mmol/L dNTPs 4μl

25nmol/L MgCl₂ 4μl

25μmol/L上游引物 0.4μl

25μmol/L下游引物 0.4μl

5U/μl Taq DNA聚合酶 0.25μl

模板DNA 10μl

灭菌蒸馏水补足到50μl。

(2)PCR反应扩增条件：

94℃5分钟预变性；

94℃30秒变性，52℃30秒退火，72℃1分钟延伸，共35个循环；

72℃延伸10分钟，结束反应。

本发明所述的病原性真菌检测基因芯片可以用于下述病原性真菌：白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、总状毛霉、葡枝根霉、马尔尼菲青霉、裴氏着色真菌、疣状瓶霉、红色毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌中至少一种病原性真菌中的检测。

本发明所述的病原性真菌检测基因芯片可同时、快速地检测多种病原性真菌，具有灵敏度高、特异性好、操作简单，不需要特殊仪器设备等特点，适合临床实验室开展。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是本发明的病原性真菌检测基因芯片的示意图，其中：1：固相载体，2：阳性对照探针，3：阴性对照探针，4：真菌通用探针，5：病原性真菌特异性寡核苷酸探针，6：空白对照。

图2是本发明的病原性真菌检测基因芯片的探针位点示意图，其中：1：阳性对照，2，空白对照，3：阴性对照，4：真菌通用探针，5：白色念珠菌，6：热带念珠菌，7：光滑念珠菌，8：近平滑念珠菌，9：克柔念珠菌，10：季也蒙念珠菌，11：葡萄牙念珠菌，12：乳酒念珠菌，13：新型隐球菌14：烟曲霉，15：黄曲霉，16：黑曲霉，17：总状毛霉，18：葡枝根霉，19：马尔尼菲青霉，20：裴氏着色真菌，21：疣状瓶霉，22：红色毛癣菌，23：犬小孢子菌，24：絮状表皮癣菌。

图3-1～图3-20为应用本发明的基因芯片进行检测的检测结果，其中：图3-1：白色念珠菌，图3-2：热带念珠菌，图3-3：光滑念珠菌，图3-4：近平滑念珠菌，图3-5：克柔念珠菌，图3-6：季也蒙念珠菌，图3-7：葡萄牙念珠菌，图3-8：乳酒念珠菌，图3-9：新型隐球菌，图3-10：烟曲霉，图3-11：黄曲霉，图3-12：黑曲霉，图3-13：总状毛霉，图3-14：葡枝根霉，图3-15：马尔尼菲青霉，图3-16：裴氏着色真菌，图3-17：疣状瓶霉，图3-18：红色毛癣菌，图3-19：犬小孢子菌，图3-20：絮状表皮癣菌。

具体实施方式

实施例1病原性真菌核糖体基因通用PCR扩增方法

1.通用引物的设计：利用clonemanager 8.0软件，对待检真菌的rRNA基因的5.8s至28s的DNA序列进行比对，利用primer premier5.0软件在5.8S rDNA和28S rDNA的高保守序列区域设计通用扩增引物，可扩增真菌5.8S rDNA部分序列、ITS2全序列、28S rDNA的部分序列。引物序列如下：

寡聚核苷酸1：5′-CAACGGATCTCTTGGTTC-3′(SEQ ID NO：24)

寡聚核苷酸2：5′-ATGCTTAAGTTCAGCGGG-3′(SEQ ID NO：25)

寡聚核苷酸1的5′端修饰生物素。

2.通用PCR反应体系：包括

10×PCR缓冲液 5μl

2.5mmol/L dNTPs 4μl

25nmol/L MgCl₂ 4μl

25μmol/L上游引物 0.4μl

25μmol/L下游引物 0.4μl

5U/μl Taq DNA聚合酶 0.25μl

模板DNA 10μl

灭菌蒸馏水补足到50μl。

3.通用PCR反应条件：

94℃5分钟预变性；

94℃30秒变性，52℃30秒退火，72℃1分钟延伸，共35个循环；

72℃延伸10分钟，结束反应。

实施例2待测样品的制备

1.标本的处理

培养物：1)对于固体培养基，刮取培养基上适量的菌落或菌丝，置无菌的1.5ml EP管中；

2)对于液体培养基，取500μl含菌培养物置无菌的1.5ml EP管中，10000r/min离心15分钟，沉渣用PBS洗涤两次。

血液：取500μl含菌的血标本置无菌的1.5ml EP管中，加1ml红细胞裂解液(10mM Tris(pH7.6)，5mM MgCl₂，10mMNaCl)，37℃孵育10分钟后10000r/min离心15分钟。沉淀加500μl白细胞裂解液(10mM Tris(pH7.6)，10mM EDTA(pH8.0)，50mM NaCl，0.2％SDS，200μg蛋白酶K/ml)，65℃水浴2小时。10000r/min离心15分钟，沉渣用PBS洗涤两次。。

痰液：标本中加入等量的1M NaOH，室温下混合10分钟，10000r/min离心15分钟，沉渣用PBS洗涤两次。

胸水、腹水、脑脊液、尿液、肺泡灌洗液：10000r/min离心15分钟，沉渣用PBS洗涤两次。

2.PCR模板制备

在上述已处理好的样品中加入20μl基因释放剂(Genereleaser，Bio Ventures公司)漩涡混匀后，用小研棒研磨，然后转移到扩增管中，加石蜡油覆盖。将扩增管置于微波炉中，以最大火力加热10分钟。将扩增管放入80℃预热的扩增仪中，保温5分钟。

实施例3真菌特异性探针的设计

真菌的rRNA基因是一种串联重复基因，即：18S rRNA-ITS1-5.8SrRNA-ITS2-28SrRNA转录单位，分隔18S，5.8S，28S rRNA基因亚单位的序列称为内转录间隔区(internal transcribed space，ITS)，为非编码区。由于ITS区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中，序列中有足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究。

1.在Genbank的核酸序列数据库中查询所选目标菌的rRNA基因序列，并用clonemanager 8.0软件进行序列比对。

2.利用AlleleID 6.0软件针对靶细菌的内转录间隔区ITS2序列设计种特异性探针。遵循以下条件：(1)长度为25-35bp(2)Tm值63±1℃(3)G+C含量在40％-60％之间(4)避免发夹结构和自身二聚体的形成(5)避免单一碱基的重复出现(不能多于4个)。

3.用clonemanager 8.0进行探针间、探针与扩增片段间的互补性分析，并将备选探针提交Genbank，利用BLAST程序进行特异性分析。

4.将筛选出的探针进行合成，为减少空间位阻，使杂交更易进行，探针合成时5’端连上长度为15的poly(dT)作为间隔臂，并在5’末端修饰氨基。

实施例4检测监控系统的设计

为保证检测的可靠性，设置完善的检测监控系统，包括真菌通用检测探针、阳性对照、阴性对照和空白对照。真菌通用探针序列选自所有病原性真菌5.8SrDNA序列保守区，可与所有病原性真菌PCR扩增产物杂交结合。采用与人类和微生物无任何同源性的植物基因为阳性对照和阴性对照，阳性对照与样品并行处理，用于监测待检样品的制备、标记、杂交、显色等检测过程，阴性对照用于检测杂交信号是否正确，空白对照用于检测芯片制备是否正常。真菌通用探针、阳性对照探针和阴性对照探针的设计按实施例3中特异性探针的设计要求进行。

实施例5芯片的制备

1.点样：用无菌去离子水配置浓度为40μmol/L的探针溶液，取4.0μl探针溶液入微孔板中，每孔中加入4.0μl点样液(Micro Spotting Solution Plus，Telechem公司)，充分混匀。空白对照为1×的空白点样液。取醛基修饰玻片，用点样仪取探针溶液点于玻片相应位置(见图2)。

2.点好样的玻片移入湿盒中，室温孵育1～2小时。然后置20～30℃，湿度＜40％的环境中孵育过夜。

3.取出孵育后的玻片，重新放置于湿盒中，于60℃水浴箱中再水合1小时。

4.用0.2％SDS液室温清洗2次，每次2分钟，再用去离子水清洗2次，每次2分钟。清洗好的芯片放入硼酸盐溶液中(1.0g NaBH4→288ml PBS+96ml无水乙醇)室温孵育5分钟。取出芯片，用0.2％SDS液室温清洗3次，每次2分钟，再用去离子水清洗3次，每次2分钟，空气中干燥。

实施例6杂交试验

1.将10μl扩增产物和1μl阳性对照混匀，95变性10min，立即冰浴5分钟。加入20μl杂交液(0.45M NaCl，20mM Tris-HCl PH8.0，0.1％SDS)，混匀后立即滴加于芯片探针区，盖上盖玻片，置杂交盒中，55℃杂交2小时。

2.取出杂交好的芯片，用1×SSC+0.1％SDS的漂洗液，室温漂洗5分钟，再用0.1×SSC+0.1％SDS的漂洗液，室温漂洗5分钟，然后用0.1×SSC稍稍漂洗，去离子水漂洗，空气中干燥。

实施例7显色反应

1.将纳米金试剂(NANOGOLD-STREPTAVIDIN，Nanoprobes公司)用稀释液(PBS+1％BSA)按1∶200稀释后，滴加于芯片探针区，盖上盖玻片，置湿盒中，室温反应30分钟。

2.洗涤：用PBS缓冲液清洗2次，每次2分钟，双蒸水清洗后干燥。

3.滴加50μl银染试剂(LI SILVER ENHANCEMENT KIT，Nanoprobes司)于芯片上杂交反应区，室温反应15～25分钟后用去离子水冲洗玻片，空气晾干芯片后，直接裸眼判定检测结果。

实施例8基因芯片的检测

1.真菌菌株的培养

将真菌菌种接种于沙堡固体培养基，置30℃培养箱中培养，酵母菌(念珠菌和隐球菌)培养2天。深部丝状真菌和浅部皮肤真菌培养5-7天。

2.PCR扩增

1)挂取适量菌落或菌丝于无菌的1.5ml EP管中，加入20μl基因释放剂，漩涡混匀后，用小研棒研磨，然后转移到扩增管中，加石蜡油覆盖。将扩增管置于微波炉中，以最大火力加热10分钟。将扩增管放入80℃预热的扩增仪中，保温5分钟。

2)PCR反应体系：

10×PCR缓冲液 5μl

2.5mmol/L dNTPs 4μl

25nmol/L MgCl₂ 4μl

25μmol/L上游引物 0.4μl

25μmol/L 下游引物 0.4μl

5U/μl Taq DNA聚合酶 0.25μl

模板DNA 10μl

灭菌蒸馏水补足到50μl。

上游引物序列和下游引物序列分别为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25。

3)漩涡混匀反应液，将扩增管置PCR仪中，按下面程序扩增：

94℃5分钟预变性；

94℃30秒变性，52℃30秒退火，72℃1分钟延伸，共35个循环；

72℃延伸10分钟，结束反应。

3.杂交反应

1)将10μl扩增产物和1μl阳性对照混匀，95变性10分钟，立即冰浴5分钟。加入20μl杂交液(0.45M NaCl，20mM Tris-HCl pH8.0，0.1％SDS)，混匀后立即滴加于芯片探针区，盖上盖玻片，置杂交盒中，55℃杂交2小时。

2)取出杂交好的芯片，用1×SSC+0.1％SDS的漂洗液，室温漂洗5分钟，再用0.1×SSC+0.1％SDS的漂洗液，室温漂洗5分钟，然后用0.1×SSC稍稍漂洗，去离子水漂洗，空气中干燥。

3)将纳米金试剂(NANOGOLD-STREPTAVIDIN，Nanoprobes公司)用稀释液(PBS+1％BSA)按1∶200稀释后，滴加于芯片探针区，盖上盖玻片，置湿盒中，室温反应30分钟。用PBS缓冲液清洗2次，每次2分钟，双蒸水清洗后干燥。滴加50μl银染试剂(LI SILVER ENHANCEMENT KIT，Nanoprobes公司)于芯片上杂交反应区，室温反应25分钟后用去离子水冲洗玻片，空气晾干芯片后，直接裸眼判定检测结果，扫描仪记录结果。见图3-1～图3-20：图3-1：白色念珠菌，图3-2：热带念珠菌，图3-3：光滑念珠菌，图3-4：近平滑念珠菌，图3-5：克柔念珠菌，图3-6：季也蒙念珠菌，图3-7：葡萄牙念珠菌，图3-8：乳酒念珠菌，图3-9：新型隐球菌，图3-10：烟曲霉，图3-11：黄曲霉，图3-12：黑曲霉，图3-13：总状毛霉，图3-14：葡枝根霉，图3-15：马尔尼菲青霉，图3-16：裴氏着色真菌，图3-17：疣状瓶霉，图3-18：红色毛癣菌，图3-19：犬小孢子菌，图3-20：絮状表皮癣菌。

因此，本发明所述的病原性真菌检测基因芯片可同时、快速地检测多种病原性真菌，并且有灵敏度高、特异性好的优点，适用于临床实验室。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>一种病原性真菌检测基因芯片

<130>

<160>25

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>1

ttgaagatat acgtggtgga cgttaccgc 29

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>2

tggtggccac tagcaaaata agcgtttt 28

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>3

cctccctaga tcaacaccga gttggtaaa 29

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>4

tccattagtt tatactccgc ctttctttca agc 33

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>5

aaagtctagt tcgctcggcc agctt 25

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>6

ccaacaatac cagaaatatc ccgccacac 28

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>7 29

taaacgtgtt tgacagcgcg gttgatat

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>8

agagttttgg ttaaagccgt atgcctcaag 30

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>9

gagatggttg ttatcagcaa gccgaagac 29

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>10

aaaataaagt tgggtgtcgg ctggcg 26

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>11

cctggaaaag attgatttgc gttcggc 27

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>12

tggaaagaat ggttggaaaa cgtcggc 27

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>13

tcaagaggtt cgagatctga cgatcaagag 30

<210>14

<211>35

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>14

tctctttcat tattctttgt tctctccctt cttgc 35

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>15

ccgtggtaaa tatggtggtg accaacc 27

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>16

ggaaagtgtg aactcgctcc accaag 26

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>17

cgttgttaca cgaccaaaat ccgtcca 27

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>18

tatatataaa gattggggcc agggcggc 28

<210>19

<211>28

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>19

gaataataca tggtgcgtta ggccagcc 28

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>特异性寡核苷酸探针序列

<400>20

cccgacggaa attagggcca gagag 25

<210>21

<211>27

<212>DNA

<213>真菌通用探针

<400>21

gcaatg(gt)tgcg ttcaaagat(c)t cgatgattca c 31

<210>22

<211>27

<212>DNA

<213>阳性对照探针

<400>22

gaagagtgcg gaagatggtc cagtgta 27

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>阴性对照探针

<400>23

gctcagccaa taaccaccgt tcacaat 27

<210>24

<211>18

<212>DNA

<213>PCR引物序列

<400>24

caacggatct cttggttc 18

<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>PCR引物序列

<400>25

atgcttaagt tcagcggg 18

Claims

1.一种病原性真菌检测基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的特异性寡核苷酸探针，其特征在于固定在所述固相载体上的特异性寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20所示的寡核苷酸序列或者与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20所示的寡核苷酸序列互补的DNA或RNA序列。

2.根据权利要求1所述的病原性真菌检测基因芯片，其特征在于还包括真菌通用探针、阳性对照探针、阴性对照探针和空白对照。

3.根据权利要求2所述的病原性真菌检测基因芯片，其特征在于所述真菌通用探针具有SEQ ID NO：21所示的寡核苷酸序列，阳性对照探针具有SEQ IDNO：22所示的寡核苷酸序列，阴性探针具有SEQ ID NO：23所示的寡核苷酸序列，空白对照为不含任何探针的空白点样液。

4.权利要求1-3任一项所述的病原性真菌检测基因芯片的制备方法，其特征在于包含步骤：

1)合成SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20所示的特异性寡核苷酸探针；

2)合成SEQ ID NO：21所示的真菌通用探针、SEQ ID NO：22所示的阳性对照探针、SEQ ID NO：23所示的阴性对照探针；

3)将步骤1)中合成的特异性寡核苷酸探针和步骤2)中合成的真菌通用探针、阳性对照探针和阴性对照探针印于固相载体上的相应位置，空白对照点为不含任何探针的空白点样液，然后进行固定、封闭、洗涤和干燥，制得所述的病原性真菌检测基因芯片。

5.根据权利要求4所述的病原性真菌检测基因芯片的制备方法，其特征在于步骤1)中在合成SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：20所示的特异性寡核苷酸探针以及步骤2)中在合成SEQ ID NO：21所示的真菌通用探针、SEQ ID NO：22所示的阳性对照探针、SEQ ID NO：23所示的阴性对照探针时在其5’端连上长度为15的poly(dT)作为间隔臂，然后在5’端标记上氨基。

6.权利要求1-3任一项所述的病原性真菌检测基因芯片的使用方法，其特征在于包含步骤：

1)对待测样品进行PCR扩增并标记生物素，得标记物；

7.根据权利要求7所述的病原性真菌检测基因芯片的使用方法，其特征在于步骤1)中包括使用PCR引物，该PCR引物具有SEQ ID NO：24-SEQ ID NO：25所示的寡核苷酸序列。

8.权利要求1-3任一项所述的病原性真菌检测基因芯片在检测下述白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、总状毛霉、葡枝根霉、马尔尼菲青霉、裴氏着色真菌、疣状瓶霉、红色毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌中至少一种病原性真菌中的应用。