CN107058559A - 一种植物病原真菌的分子检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物病原真菌的检测引物组以及植物病原真菌的分子检测方法及试剂盒。所述植物病原真菌的检测引物组包括可用于检测真菌DNA存在的引物对D652f/D1568r和/或特异扩增真菌ITS区段的引物对A1956f/A2685r；所述引物的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。引物组D652f/D1568r可用于检测真菌和植物的DNA的存在，真菌ITS区段扩增引物组可用于植物病原真菌等的扩增，两者结合使用，检测结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，尤其是对于提取含真菌或植物组织存在的材料总DNA，具有重要的实际应用意义，同时其可用于土壤等物质的总DNA存在性检测。
Description
技术领域
本发明属于病原分子检测技术领域。更具体地，涉及一种植物病原真菌的分子检测方法及试剂盒。
背景技术
在使用CTAB试剂法提取部分真菌DNA或者使用真菌试剂盒提取含大量植物组织的真菌DNA时，经常会出现将DNA溶解液进行PCR扩增并将产物电泳时，无条带的情况，此时需要辨别是DNA未提取成功，还是DNA存在却未进行反应。另外在病原菌的诊断中，最后PCR产物电泳无条带，不能证明提取液中是不含有DNA，还是不含有目的DNA(方明，2006)。这两种情况下，都需要证明总DNA的存在。
另外，土壤中存在大量的微生物，桑园土壤中更含有细碎植物组织等植物成分存在，故土壤提取DNA，理论上应可提取到DNA(袁小凤等，2013)。分光光度计检测DNA浓度与纯度机理为依靠DNA溶液的吸光度即OD值进行换算，理想条件为只存在DNA以及溶解液，但是若杂质等存在，同样会造成OD值的变化，所以以OD值作为DNA浓度的检测指标不是完全精准的。
ITS序列为目前用于真核生物快速鉴定使用最多的序列，也是用于真菌物种鉴定的主要条形码(Conrad et al.,2012)。因为ITS区上下游保守、中间变异略多、区段大小适中，易于扩增与测序，可用于分析物种的进化关系，可精确到属，部分确定到种(White etal.,1990；张宇等，2012；周均亮等，2013)。而在扩增真菌ITS区段，进行真菌的鉴定时，通用的ITS引物组可扩增部分植物的DNA，包括桑树，在植物病原真菌的DNA扩增上造成一定的干扰，在后续的DNA条带纯化等方面。
现有技术中已有多组真菌通用检测引物，如引物组ITS1/ITS4，引物组ITS4/ITS5等。但是均存在特异性不好活灵敏度不高的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有植物病原真菌检测技术的缺陷和不足，以真菌rDNA上18S rRNA和28S rRNA区段为靶基因设计真菌DNA存在与否的检测引物；该检测引物可以以病叶、菌丝体、病斑叶片、土壤、枝条等任何包含真菌和植物的材料提取的总DNA为模板，检测结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，扩增条带大小单一。尤其是对于含真菌或植物组织存在的材料总DNA，具有重要的实际应用意义，同时其可用于土壤等物质的总DNA存在性检测。
本发明的目的是提供一种植物病原真菌的检测引物组。
本发明另一目的是提供一种植物病原真菌的分子检测方法。
本发明再一目的是提供一种植物病原真菌的分子检测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
基于本发明人对多种真菌rDNA的研究实验和分析总结，选择18S rRNA和28S rRNA区段序列作为检测的靶基因。
设计了一种植物病原真菌的检测引物组，包括引物对D652f/D1568r和/或引物对A1956f/A2685r；所述引物对D652f/D1568r的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述引物对A1956f/A2685r的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
具体地，上述引物对D652f/D1568r是快速检测真菌DNA存在的PCR引物组，检测结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高。
引物对A1956f/A2685r是快速扩增真菌ITS区段的引物组，检测结果可靠、易于操作、扩增条带大小单一。
因此两组引物对分别在真菌检测中的应用或在制备真菌检测产品中的应用，以及引物对D652f/D1568r在真菌检测或制备真菌检测试剂盒中的应用，以及引物对A1956f/A2685r在真菌ITS区段扩增(鉴定)或制备真菌ITS区段扩增(鉴定)试剂盒中的应用，都应在本发明的保护范围之内。
两组引物的配合使用对于植物病原菌的检测，尤其是对侵染早期的植物检测和对泥土中病原菌的快速检测，具有重要的意义。而且克服解决了现有技术中存在的PCR结果无条带，以及扩增植物病原真菌时多条带的问题。
一种植物病原真菌的分子检测方法，以待测样本总DNA为模板，利用引物对D652f/D1568r进行PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物是否为900-1000bp大小的片段来判定待测样本中是否提取到了植物病原真菌或植物的DNA。
进一步优选地，在上述引物对D652f/D1568r扩增检测的基础上，进一步以待测样本总DNA为模板，利用引物对A1956f/A2685r进行PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物是否为700bp-800bp大小的片段来判定待测样本中是否含有植物病原真菌。
具体地，所述待测样本可以为叶片、枝条、菌丝体或土壤等多种样本。
优选地，所述PCR反应的反应体系为：
其中，2×反应缓冲液的组分为Taq DNA聚合酶，160mM Tris-HCl，40mM(NH4)2SO4，3.0mM MgCl2，400μM dNTP。
优选地，引物对D652f/D1568r扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min。
优选地，引物对A1956f/A2685r扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min。
一种包含所述引物对D652f/D1568r和/或引物对A1956f/A2685r的植物病原真菌的分子检测试剂盒，也在本发明的保护范围之内。
一种包含有引物对A1956f/A2685r的快速扩增真菌ITS区段的试剂盒，也在本发明的保护范围之内。
试剂盒的使用方法如上分子检测方法。
本发明以18S rRNA和和28S rRNA基因为靶基因，设计了上述真菌的通用检测引物，其具有很好的检测灵敏性，在真菌的实际检测应用中具有广泛的应用价值和意义。引物组D652f/D1568r可用于检测真菌和植物的DNA的存在，检测结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，扩增条带大小单一；尤其是对于提取含真菌或植物组织存在的材料总DNA，具有重要的实际应用意义。同时其可用于土壤等物质的总DNA存在性检测。真菌ITS区段扩增引物组可用于植物病原真菌等的扩增，因其不会扩增植物基因组DNA，其特异性与便捷性要好于真菌通用引物ITS1/ITS4和ITS4/ITS5。
本发明具有以下有益效果：
本发明设计获得了一组特异性、灵敏性较好的快速检测真菌的引物组，可用于真菌DNA的存在性检测，能够准确地判断样品是否含有真菌或植物DNA，可为相关的后续实验提供保障。还可轻松用于判定DNA是否提取成功，以及分析部分PCR实验无条带(失败)的原因。
另外，本发明引物及相关试剂可组装成试剂盒，使用方便。而且适用的PCR扩增模板非常多样，适用范围广，可以是多种样品的DNA，病叶、菌丝体、病斑叶片、土壤、枝条等提取的总DNA为模板，大大增加了检测对象的范围。
重要的是，本发明的特异检测引物和试剂盒均能够在病原菌侵染早期就能够特异性的检测出来，为桑污叶病的早期检测提供了一种简单快速的方法。
附图说明
图1为引物对D652f/D1568r进行真菌DNA存在性检测的结果。注：M：TaKaRaDL2000Marker；1至8号反应体系引物为真菌检测性引物组D652f/D1568r，1为枝孢霉属真菌(Cladosporium)；2为青霉属真菌(Pencillum)；3为曲霉属真菌(Aspergillus)；4为桑里白粉病病原菌(Phyllactinia moricola)；5为桑葚小粒性菌核病病原菌(Ciboriacarunculoides)；6为桑污叶病病原菌Pseudocercospora mori(阳性对照)；7为铜绿假单胞菌(阴性对照)；8为水(空白对照)。
图2为引物对A1956f/A2685r对不同材料提取的桑污叶病病原菌DNA验证。注：MTaKaRa DL5000Marker；各泳道的DNA模板提取材料分别为不同地区的桑污叶病病叶样品。
图3为不同真菌引物组灵敏度测试结果。注：M：TaKaRa DL2000Marker；1至7为ITS1/ITS4引物组；2至14为ITS4/ITS5引物组；15至21为A1956f/A2685r引物组；22至28为D652/D568r引物组；1、8、15、22为枝孢霉属真菌(Cladosporium)；2、9、16、23为龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodia pseudotheobromae)；3、10、17、24为为曲霉属真菌(Aspergillus)；4、11、18、25为青霉属真菌(Pencillum)；5、12、19、26为桑污叶病病叶(Pseudocercospora和mulberry)；6、13、20、27为桑树DNA；7、14、21、28为细菌铜绿假单胞菌(阴性对照)。
图4为不同ITS引物组用于扩增桑污叶病病原菌DNA的结果。注：M TakaraDL1000Marker；1、2ITS1/ITS4引物组；3、4ITS4/ITS5引物组；5、6A1956f/A2685r引物组；1、3、5为桑叶病斑提取DNA；2、4、6为洗脱子实体提取DNA；7空白对照(水)。
图5为多种土壤提取DNA中真菌DNA检测结果。注：M：TaKaRa DL1000Marker；1.实验室桑树种植区泥土；2.本实验回感实验区泥土；3.英德市英德蚕种场桑园泥土；4.英德市英德蚕种场泥土；5-8.华南农业大学蚕桑教学实验园泥土，取自桑园的4个桑树种植区域；9.桑污叶病子实体(阳性对照)；10.铜绿假单胞菌(阴性对照)；11.无菌水(空白对照)。
图6为非病原菌真菌DNA存在性检测结果。注：M：TaKaRa DL2000Marker；泳道1至8号引物为真菌检测性引物组D652f/D1568r，9至16引物为为病原菌检测性引物W1724f/W2196r；各泳道模版DNA分别为：1、9为枝孢霉属真菌(Cladosporium)；2、10为青霉属真菌(Pencillum)；3、11为曲霉属真菌(Aspergillus)；4、12为桑里白粉病病原菌(Phyllactiniamoricola)；5、13为桑葚小粒性菌核病病原菌(Ciboria carunculoides)；6、14为桑污叶病病原菌(阳性对照)；7为铜绿假单胞菌(阴性对照)；15为桑树DNA(阴性对照)；8、16为水(空白对照)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1检测引物设计及PCR扩增方法的建立
1、在NCBI核苷酸数据库中下载多种属真菌的rDNA全长，并确定rDNA各基因区段与转录间隔区(ITS)的核苷酸序列及其在rDNA上的位置。
2、经过对上述多种菌rDNA全长分析的基础上，设计了多对引物，通过大量的特异性和灵敏性检测，最终选取了2对有代表性的引物组，引物序列如下：
D652f/D1568r引物组
上游引物D652f(SEQ ID NO.1)：5’CTGAGAAACGGCTACCACATCC 3’
下游引物D1568r(SEQ ID NO.2)：5’GCAGACAAATCACTCCACCAACTA3’
A1956f/A2685r引物组
上游引物A1956f(SEQ ID NO.3)：5’-TCGGCAACGACCACCCA-3’
下游引物A2685r(SEQ ID NO.4)：5’-CTACCCAGAAGCATCCTCTACAAA-3’
3、PCR扩增方法的建立
以病叶、枝条、土壤的总DNA为模板，用上述的引物进行PCR扩增。
所述PCR反应的反应体系为：
其中，2×反应缓冲液的组分为Taq DNA聚合酶，160mM Tris-HCl，40mM(NH4)2SO4，3.0mM MgCl2，400μM dNTP。
引物对D652f/D1568r扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min。
引物对A1956f/A2685r扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min。
反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物片段的大小来判定待测样本中是否含有植物病原真菌。结果判断标准如下：
第一对引物D652f/D1568r：PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到900-1000bp左右的DNA片段判定真菌DNA是否提取成功。当能扩增出900-1000bp的DNA片段产物，即可判断总DNA提取成功。
第二对引物A1956f/A2685r：PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到700bp-800bp左右的DNA片段判定实验是否成功。当能扩增出700bp-800bp的DNA片段产物，即可判断真菌DNA存在。
4、结果的判定。
琼脂糖凝胶电泳检测结果分别如附图1～2所示，引物D652f/D1568r能扩增植物与真菌的DNA，得到结果为出现略小于1000bp的条带，而引物A1956f/A2685r扩增条带为单一的条带，不受植物DNA的影响。
实施例2引物D652f/D1568r的灵敏性
1、分别以多种真菌的DNA为模版，以真菌通用检测引物ITS1/ITS4，ITS4/ITS5，以及引物组D652f/D1568r和A1956f/A2685r为引物进行同样PCR程序的反应，查看琼脂糖凝胶电泳结果。
真菌通用引物ITS1/ITS4引物组
ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’
ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’
真菌通用引物ITS4/ITS5引物组
ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’
ITS5：5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’
2、引物的扩增结果分别如附图3所示。结果显示，引物对D652f/D1568r的灵敏性要强于真菌通用引物组ITS1/ITS4，ITS4/ITS5。
实施例3引物A1956f/A2685r特异性检测
1、以桑污叶病的病斑部分(植物桑树+真菌)提取的总DNA作为模版，以引物ITS1/ITS4，ITS4/ITS5，A1956f/A2685r作为引物进行同样PCR程序的反应，查看琼脂糖凝胶电泳结果。
2、引物的扩增结果分别如附图4所示。结果显示，引物组A1956f/A2685r条带为单一条带，条带清晰，特异性强于真菌通用引物组ITS1/ITS4和ITS4/ITS5。
实施例4患病桑园泥土中的总DNA提取检测
1、土壤总DNA的提取
土壤中真菌DNA的提取理念参考林福呈等(2010)的方法，并做修改。步骤如下：
采集自不同桑区的每份的泥土采集量超过10克，对采集的泥土样品进行充分研磨，去除不能研磨的石籽与沙砾，称取研磨后的泥土0.5克，采用试剂盒Genview进行DNA的提取，提取方法略作改动。
所用于提取DNA的泥土样品呈粉末状，不适合使用液氮研磨；且为保证提取DNA的含量，使用的样品量远多于试剂盒要求的100mg或30mg，为避免浪费试剂盒材料，将对实验步骤略作改动。
称取研磨后的泥土0.5克，加入试剂Buffer P1体积为1mL，且加入蛋白酶K与RNaseA，进行水浴消化处理，时间为65℃3小时左右，期间不断震荡混匀，后加入500μL氯仿，振荡混匀5分钟，后12000r/min离心10分钟，取上清；加入700μL的Buffer GF2(盐溶液使DNA析出)，混匀；吸取混合液于离心柱中，静置2分钟，12000r/min离心1分钟，弃滤液；加入700μL的Buffer WF1(高浓度乙醇洗去盐分)，静置2分钟，12000r/min离心1分钟，弃滤液；加入700μL的Buffer WF2(75％乙醇)，12000r/min离心1分钟，弃滤液；加入500μL的Buffer WF2，12000r/min，离心1分钟，弃滤液；再次12000r/min离心2分钟，弃滤液弃收集管；将离心柱装入1.5mL离心管中，加入50μL洗脱液Elution(溶解DNA)，室温放置5分钟，12000r/min离心2分钟；重复上一步骤，即获得纯度较高的总DNA。
2、PCR检测
以步骤1得到的各材料提取DNA为模板，用DNA检测引物D652f/D1568r进行PCR反应。
反应结果如附图5所示，证明多种土壤中均可检测到真菌的DNA。
实施例5其他真菌的DNA存在性检测
1、以实验室分离到的几种主要真菌作为对照组，提取DNA，并以桑污叶病病原菌特异检测引物作为对照实验组，用于确定部分实验中PCR无条带却存在DNA的情况。
2、PCR检测
以步骤1得到的各材料提取DNA为模板，用DNA检测引物D652f/D1568r与桑污叶病病原菌特异检测引物W1726f/W2196r进行PCR反应。
桑污叶病病原菌特异检测引物组W1726f/W2196r(扩增产物473bp)：
W1724f：5’GCTACACTGACAGAGCCAACG 3’
W2196r：5’GCTACACTGACAGAGCCAACG 3’。
3、反应结果如附图6所示，本发明的真菌检测引物D652f/D1568r有目的条带，而桑污叶病病原真菌检测引物W1726f/W2196r无条带。证明实验总DNA提取成功，且总DNA中无目的真菌(桑污叶病病原真菌)DNA存在。
因为实际情况下，部分PCR实验扩增产物电泳无条带的情况需区分看待，即可能有如下2种情况：
(1)总DNA提取成功，体系中有DNA存在，无目的真菌DNA存在；
(2)总DNA未提取成功，无总DNA存在(DNA提取环节失败)。
因此，上述结果证明了本发明的真菌检测引物组D652f/D1568r可克服如上情况，具有较高的灵敏性，只要DNA提取成功，即有扩增条带。可轻松用于判定DNA是否提取成功，以及分析部分PCR实验无条带(失败)的原因。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种植物病原真菌的分子检测方法及试剂盒
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 上游引物D652f
<400> 1
ctgagaaacg gctaccacat cc 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 下游引物D1568r
<400> 2
gcagacaaat cactccacca acta 24
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 上游引物A1956f
<400> 3
tcggcaacga ccaccca 17
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 下游引物A2685r
<400> 4
ctacccagaa gcatcctcta caaa 24
Claims (10)
1.一种植物病原真菌的检测引物组，其特征在于，包括引物对D652f/D1568r和/或引物对A1956f/A2685r；所述引物对D652f/D1568r的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，所述引物对A1956f/A2685r的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
2.权利要求1所述植物病原真菌的检测引物组在真菌检测中的应用或在制备真菌检测产品中的应用。
3.一种植物病原真菌的分子检测方法，其特征在于，以待测样本总DNA为模板，利用引物对D652f/D1568r进行PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物是否为900-1000bp大小的片段来判定待测样本中是否提取到了植物病原真菌或植物的DNA。
4.根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于，进一步以待测样本总DNA为模板，利用引物对A1956f/A2685r进行PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物是否为700bp-800bp大小的片段来判定待测样本中是否含有植物病原真菌。
5.根据权利要求3或4所述的分子检测方法，其特征在于，所述待测样本为叶片、枝条、菌丝体或土壤。
6. 根据权利要求3或4所述的分子检测方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系为：
2×反应缓冲液 10μL
10μM上游引物 0.5 μL
10μM下游引物 0.5 μL
模板 DNA 1 μL
ddH2O 补至20 μL；
其中，2×反应缓冲液的组分为Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl，40 mM(NH4)2SO4，3.0mM MgCl2，400 μM dNTP。
7. 根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于，所述PCR反应的程序为：94℃ 5min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1min，32个循环；72℃ 10 min。
8. 根据权利要求4所述的分子检测方法，其特征在于，所述PCR反应的程序为：94℃ 5min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1min，32个循环；72℃ 10 min。
9.一种植物病原真菌的分子检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对D652f/D1568r和/或引物对A1956f/A2685r。
10.一种快速扩增真菌ITS区段的试剂盒，其特征在于，包含有引物对A1956f/A2685r。
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| CN201710340557.3A Active CN107058559B (zh) | 2017-05-15 | 2017-05-15 | 一种植物病原真菌的分子检测方法及试剂盒 |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107796681A (zh) * | 2017-09-28 | 2018-03-13 | 安徽信灵检验医学科技有限公司 | 一种真菌荧光染色液及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101492743A (zh) * | 2009-01-19 | 2009-07-29 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种病原性真菌检测基因芯片 |
| CN101974640A (zh) * | 2010-11-16 | 2011-02-16 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | 真菌快速检测试剂盒及其检测方法 |
| CN104988144A (zh) * | 2015-06-26 | 2015-10-21 | 南开大学 | 检测土壤中10种常见病原微生物的基因液相芯片及其检测方法 |
-
2017
- 2017-05-15 CN CN201710340557.3A patent/CN107058559B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101492743A (zh) * | 2009-01-19 | 2009-07-29 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种病原性真菌检测基因芯片 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 金敏 等: "常见致病真菌通用引物PCR检测技术研究", 《环境与健康杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107796681A (zh) * | 2017-09-28 | 2018-03-13 | 安徽信灵检验医学科技有限公司 | 一种真菌荧光染色液及其制备方法 |
Also Published As
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|---|---|
| CN107058559B (zh) | 2020-10-23 |
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