CN102094082A - 家兔犬小孢子菌鉴定方法 - Google Patents

Abstract

犬小孢子菌是家兔、犬、猫之间相互传播的一种皮肤癣菌病致病菌，本发明公开了用于鉴定犬小孢子菌特异性引物序列，通过利用这对引物序列，通过PCR扩增，可特异性鉴定出犬小孢子菌，速度快，可靠性高，为家兔皮肤癣菌病诊断和兔场癣菌病净化奠定理论基础，并提供技术性指导。

Description

家兔犬小孢子菌鉴定方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，主要涉及聚合酶链反应试验中的引物在检测、鉴定犬小孢子菌中的用途。使用这些引物能够检测家兔皮肤犬小孢子菌病的动态变化，并为该病诊断、治疗和兔场癣菌病净化奠定理论基础，并提供技术性指导。 

背景技术

家兔的皮肤真菌病是一种发病率高、传染性强、难治愈的人畜共患传染病。在家畜中主要感染兔、犬、猫，家兔皮肤真菌病病原主要有须癣毛癣菌，絮状表皮癣菌，石膏样小孢子菌等，近年来，由家养犬、猫传播感染家兔犬小孢子菌病的报道也时有出现，成为一些兔场主要的致病真菌。由于皮肤癣菌感染家兔临床症状类似，在区别诊断上困难很大，从而导致药物治疗上的盲目性，因此，非常有必要建立一个快速、简便的鉴定方法，能够在家兔皮癣菌在兔场流行之前采取有效措施进行防控，在引进种兔时进行皮肤癣菌病的快速检验、检疫，在兔场皮癣菌净化提供有效监测手段。 

在疾病诊断方法，研究人员已经使用以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术，并成功检测了受感染动物病原体。在家兔皮肤癣菌病诊断方面，有基于病原菌核糖体RNA基因区的ITS，设计引物，使用PCR技术和测序分析技术加以鉴别、诊断，有利用随机引物进行皮肤真菌基因组DNA扩增，进行多态性分析，达到鉴别诊断的目的，但是这些方法在临床实践中，成本高，实际操作和分析手段对操作人员要求较高，在临床上难以推广应用。 

本发明的DNA序列来自病原菌的基因组未知功能序列，在GenBank序列比对中未发现与之同源性高的序列，设计的特异性引物，通过PCR可有效区别于其它病原菌，从而达到鉴别、鉴定的目的，本发明鉴定、检测方法操作简单，快速，特异性强。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组检验家兔犬小孢子菌的核苷酸序列。 

本发明要解决的另一个技术问题是提供家兔犬小孢子菌鉴定方法。 

为实现以上目的，本发明采用了以下技术方案： 

本发明提供了鉴定犬小孢子菌的特异性引物序列和扩增产物的序列。特异性引物对包括正向引物序列SEQ ID NO：1所述的碱基序列，反向引物序列SEQ ID NO：2，以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的互补序列，扩增产物序列的互补序列。 

本发明还提供了一种用于鉴定家兔犬小孢子菌的方法，该方法包括以下步骤： 

(1)提取待测癣菌DNA，或者提取待检测家兔皮肤毛样DNA； 

(2)特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。 

(3)以(1)的DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增； 

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10mmol/L引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。 

反应条件：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃60s，35个循环；72℃延伸8～10min。 

(4)PCR产物扩增的产物经0.8-1％琼脂糖凝胶电泳、荧光显色后，通过目测或与标准样品比较扩增片段大小达到鉴定犬小孢子菌的目的。 

当扩增产物为单一DNA片段，大小为1738bp，判定为犬小孢子菌； 

当DNA条带数为0，判定为无犬小孢子菌感染。 

下列实施例和附图对本发明作进一步说明，可以用于以下典型实验方案达到发明内容的目的，本发明的实施例并不限于此，凡依照本发明公开序列和引物进行的PCR所做的修改、优化的实施内容，均属于本发明的保护范围。 

附图说明：

图1以须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌标准株基因组DNA为样本，鉴定犬小孢子菌。泳道样品：1：DNAMarker：4500，3000，1200，800，500，200bp；2：须癣毛癣菌标准菌株；3：犬小孢子菌标准菌株；4：絮状表皮癣菌标准菌株；5：石膏小孢子菌标准菌株；6：空白对照；7：兔基因组DNA。 

图2以须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌标准株和临床株基因组DNA为样本，鉴定犬小孢子菌。泳道样品：1：DNAMarker：4500，3000，1200，800，500，200bp；2：须毛癣菌标准菌株；3-8：须毛癣菌临床菌株；9：犬小孢子菌标准菌株；10-11：犬小孢子菌临床菌株；12：絮状表皮癣菌标准菌株；13-15：絮状表皮癣菌临床菌株；16：石膏小孢子菌标准菌株；17-18：石膏小孢子菌临床菌株；19：兔基因组DNA；20：空白对照。 

具体实施方式：

实施例1： 

所选菌株：须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌标准株各一株。将上述菌株接种于真菌选择性琼脂培养基(大豆胨1％，葡萄糖4％，琼脂1.8％，氯霉素0.005％，放线菌酮0.05％)的菌丝体接种于150ml真菌选择性液体培养基，28℃培养10-15天，挑取菌丝体于研钵中，液氮研磨，将磨碎的菌丝体0.05-0.1g于1.5ml Eppendorf管中，采用尿素法提取基因组DNA，具体操作如下： 

尿素提取法。0.05-0.1g研磨好的菌丝样品加入1mL尿素提取液(7mol/L Urea、50mmol/LTris-HCl pH 8.0，62.5mmol/LNaCl、1％SDS)，摇匀，12000r/min离心5min，吸取上清液，上清液12000r/min再次离心5min；将上清液移入另一新管中，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液，用力振荡数次混匀，12000r/min离心5min；取上清到一新管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/LNaAc(pH 5.2)，-20℃放置30min，12000r/min离心15min；弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70％无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥30min，溶于50ul双蒸水中，-20℃保存备用。 

特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。 

采集健康家兔血1ml，用全血基因组DNA提取试剂盒提取家兔基因组DNA，作为PCR反应阴性对照样本，具体操作可参考所购相关试剂盒说明书。 

以上述DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增： 

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10mmol/l引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。 

反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃60-100s，35个循环，72℃延伸10min。 

取PCR产物各5ul，0.8％琼脂糖电泳，荧光显色后，在凝胶成像分析仪上观察，图1结果表明该特异性引物能特异性扩增出犬小孢子菌，为大小约1738bp单一条带，絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、须癣毛癣菌和兔基因组DNA、空白对照无扩增片段。 

实施例2： 

所选菌株：须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌标准株各一株及部分临床株。上述菌株只是作为实验材料，也可选择其他分离株，对本发明实施没有影响。 

将上述菌株接种于真菌选择性琼脂培养基(大豆胨1％，葡萄糖4％，琼脂1.8％，氯霉素0.005％，放线菌酮0.05％)的菌丝体接种于150ml真菌选择性液体培养基，28℃培养10-15天，挑取菌丝体于研钵中，液氮研磨，将磨碎的菌丝体0.05-0.1g于1.5ml Eppendorf管中，提取基因组DNA，具体操作如下： 

0.05-0.1g研磨好的菌丝样品(100mmol/LTris-HCl pH9.0，40mmol/L EDTA pH8.0)，振荡混匀，加入100μL 10％SDS，300μL氯化苄，剧烈振荡，使管内混合物呈乳状，50℃保温1h，每隔几分钟振荡混匀1次，冷却至室温，加入300μL预冷的3mol/LNaAc(pH5.2)溶液，混匀，然后冰浴15min，11000r/min离心15min；取上清液，加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，12000r/min离心5min；取上清，取上清到一新管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)，-20℃放置20min，12000r/min离心15min；弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70％无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥30min，溶于50μL双蒸水中，-20℃保存备用。 

采集健康家兔血1ml，用全血基因组DNA提取试剂盒提取家兔基因组DNA，作为PCR反应阴性对照样本，具体操作可参考所购相关试剂盒说明书。 

特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。 

以上述DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增： 

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10mmol/l引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。 

反应条件：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃100s，30个循环；72℃延伸10min。 

取PCR产物各5ul，0.8％琼脂糖电泳，荧光显色后，在凝胶成像分析仪通过目测与标准样 品比较扩增片段大小达到鉴定须癣毛癣菌的目的。 

结果：从图2所示，该特异性引物能特异性扩增出犬小孢子菌标准菌株和临床菌株，为大小约1738bp单一条带，絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、须癣毛癣菌标准菌株及临床菌株和兔基因组DNA、空白对照无扩增片段。结果判定：当扩增产物为单一DNA片段，大小为1738bp，判定为犬小孢子菌；当DNA条带数为0，判定为无犬小孢子菌。 

实施例3： 

所选菌株：犬小孢子菌标准株一株，临床家兔皮肤毛样5个样本以及实验感染犬小孢子菌患兔皮毛样本2个。上述菌株只是作为实验材料，也可选择其他分离株，对本发明实施没有影响。 

将犬小孢子菌标准菌株接种于真菌选择性琼脂培养基(大豆胨1％，葡萄糖4％，琼脂1.8％，氯霉素0.005％，放线菌酮0.05％)的菌丝体接种于150ml真菌选择性液体培养基，28℃培养10-15天，挑取菌丝体于研钵中，液氮研磨，将磨碎的菌丝体0.05-0.1g于1.5ml Eppendorf管中，采用氯化苄法提取基因组DNA，临床毛样采用氯化苄法提取基因组DNA，具体操作如下： 

0.05-0.1g研磨好的菌丝样品、0.01-0.1g家兔皮肤毛样(100mmol/L Tris-HCl pH9.0，40mmol/L EDTA pH8.0)，振荡混匀，加入100μL 10％SDS，300μL氯化苄，剧烈振荡，使管内混合物呈乳状，50℃保温1h，每隔几分钟振荡混匀1次，冷却至室温，加入300μL预冷的3mol/LNaAc(pH5.2)溶液，混匀，然后冰浴15min，11000r/min离心15min；取上清液，加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，12000r/min离心5min；取上清，取上清到一新管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)，-20℃放置20-60min，12000r/min离心15-30min；弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70％无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥10-30min，溶于50μL双蒸水中，-20℃保存备用。 

特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。 

采集健康家兔血1ml，用全血基因组DNA提取试剂盒提取家兔基因组DNA，作为PCR反应阴性对照样本，具体操作可参考所购相关试剂盒说明书。 

以上述DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增： 

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶2U，10mmol/l引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。 

反应条件：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃60s，35个循环；72℃延伸10min。 

取PCR产物各5ul，1％琼脂糖电泳，在凝胶成像分析仪上观察，结果表明犬小孢子菌标准株和2个实验感染犬小孢子菌患兔皮毛样本扩增产物为单一DNA片段，大小为1738bp，判定为犬小孢子菌。临床家兔皮肤毛样5个样本(经形态学、生物学验证为须癣毛癣菌，)DNA条带数为0，判定为非犬小孢子菌。 

Claims (1)

1.本发明提供了一种快速鉴定家兔犬小孢子菌的分子生物学方法，其特征是：

A、用于鉴定犬小孢子菌的寡核苷酸引物对，即正向引物序列SEQ ID NO：1(5’-TCCCGTAGTCTCCCAACCCATTCTTACCC-3’)和反向引物序列SEQ ID NO：2(5’-TCTTCATGTCTCCACTGCGCTCCTTTATCC-3’)及其反向序列；

B、用于鉴定犬小孢子菌的长度为1738bp的核苷酸序列及其反向序列；

C、一种鉴定犬小孢子菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测菌或家兔皮肤毛样DNA；

(2)以(1)DNA为模板，使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2引物进行PCR扩增；

(3)通过目测PCR产物凝胶电泳后显色结果，来鉴定犬小孢子菌：

扩增条带为大小约1738bp单一条带，判定为犬小孢子菌，絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、须癣毛癣菌和兔基因组DNA、空白对照无扩增片段。 

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