CN111206114B - 九种皮肤癣菌的荧光pcr检测用引物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用引物及试剂盒，属于病原微生物体外分子检测技术领域。本发明所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述九种皮肤癣菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌。本发明所述引物检测快速、灵敏、特异、重复性好，可用于对临床患者进行早期、无创、准确的检测，辅助临床有效的抗真菌治疗。

Description

九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及病原微生物体外分子检测技术领域，具体涉及九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用引物及试剂盒。
背景技术
皮肤癣菌属于表浅真菌，皮肤癣菌病主要由红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、铁锈色小孢子菌等30多种皮肤癣菌引起，在临床上表现为头癣、甲癣、手足癣及体癣等，是人群中最常见的皮肤感染之一。皮肤癣菌感染一般是通过接触进行传播，可以发生自身传染和传染他人，真菌不仅侵犯表皮，而且会侵袭至真皮层，甚至皮下组织，由于真菌会隐藏在皮损深部，以致于患者误认为治愈了，造成治疗不彻底，致使感染反复发作，久治不愈。虽然皮肤癣菌病一般不会致命，但是皮损严重时，症状和体征均很顽固难忍，致使患者生活质量降低、加至外观难看，尤其是头面部，给患者造成极大身心困扰。皮肤癣菌的感染传播快、发病率高、皮损危害大，对于患者的生活造成极大的障碍，需要对皮肤癣菌病进行及时的诊断和积极的治疗。皮肤癣菌由毛癣菌属、表皮癣菌属和小孢子菌属组成，临床表现以及治疗效果也因不同致病属而有所不同。因此，在诊疗过程中，能够识别不同的皮肤癣菌属感染对于更有效地治疗相应的皮肤癣菌病具有非常重要的意义。
皮肤癣菌感染传统的检测方法是皮损部位皮屑的直接镜检方法和培养方法两种方法。其中直接镜检方法的敏感性低，特异性差，很难鉴别到种属水平；真菌培养方法的阳性率很低，一般不大于20％，培养周期长，一般是2～3周，对临床早期诊断意义不大；由于皮肤癣菌病仅为浅表感染，故免疫学检测方法很难建立。
发明内容
本发明的目的在于提供九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用引物及试剂盒。本发明所述引物检测快速、灵敏、特异、重复性好，可用于对临床患者进行早期、无创、准确的检测，辅助临床有效的抗真菌治疗。
本发明提供了九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用引物，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述九种皮肤癣菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌。
本发明还提供了九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物、阴性对照和阳性对照；所述九种皮肤癣菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌。
优选的是，所述阳性对照包括阳性对照1、阳性对照2和阳性对照3，所述阳性对照1含上述技术方案所述引物扩增的毛癣菌属任意一种菌的靶基因，所述阳性对照2含上述技术方案所述引物扩增的小孢子菌属的任意一种菌的靶基因，所述阳性对照3含上述技术方案所述引物扩增的表皮癣菌属菌或疣状毛癣菌的靶基因；
所述毛癣菌属任意一种菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌或许兰毛癣菌；
所述小孢子菌属的任意一种菌包括犬小孢子菌或石膏样小孢子菌；
所述表皮癣菌属菌包括絮状表皮癣菌。
优选的是，所述阴性对照包括TE溶液。
优选的是，所述试剂盒还包括PCR反应液。
本发明提供了九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用引物。本发明所述引物能够特异性地同时检测红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌9种皮肤癣菌；在检测红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌的同时，与临床其他常见真菌、细菌无交叉反应，即特异性强；可以检测到基因组DNA含量低至0.1ng/μL～0.001ng/μL的样本中的红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌，即灵敏度高；可以直接从样本中提取DNA进行检测，而且操作简单，耗时短(2～3h)。
附图说明
图1为本发明提供的许兰毛癣菌标准曲线图；
图2为本发明提供的九种皮肤癣菌扩增曲线图；
图3为本发明提供的九种皮肤癣菌融解曲线图。
具体实施方式
本发明提供了九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用引物，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物(5'-GTAGGTGAACCTGCGGAAG-3')和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物(5'-ACCGGGTAAGGTAGACAAG-3')；所述九种皮肤癣菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌。
本发明所述引物扩增的9种皮肤癣菌的靶序列具体如下：
1)红色毛癣菌靶基因序列如SEQ ID NO:3所示(133bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGACCGACGTTCCATCAGGGGTGAGCAGACGTGCGCCGGCCGTACGCCCCCATTCTTGTCTACCTCACCCGGT。
2)须癣毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:4所示(132bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGCCAAACGTCCGTCAGGGGTGAGCAGATGTGCGCCGGCCGTACCGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGT。
3)紫色毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:3所示(133bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGACCGACGTTCCATCAGGGGTGAGCAGACGTGCGCCGGCCGTACGCCCCCATTCTTGTCTACCTCACCCGGT。
4)断发毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:5所示(132bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCAGGATAGGGCCAAACGTCCGTCAGGGGTGAGCAGATGTGCGCCGGCCGTACCGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGT。
5)许兰毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:6所示(132bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGCCAAACGTCCATCAGGGGTGAGCAGATGTGCGCCGGCCGTACCGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGT。
6)絮状表皮癣菌靶序列如SEQ ID NO:7所示(118bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGCAGTCGGCCCGTCCCCCTTCTCTCTGAATGCTGGACGGTGTCGCCGGCCACACGCCCATTCTTGTCTACACTACCCGGT。
7)疣状毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:8所示(132bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGATCAGCGTTCCATCAGGGGTGTGCAGATGTGCGCCGGCCTTACGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGT。
8)犬小孢子菌靶序列如SEQ ID NO:9所示(149bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCCATTCTTGTCTACTGACCCGGT。
9)石膏样小孢子菌靶序列如SEQ ID NO:10所示(113bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGTAGACGGCCCGTCCCCGGATGCGTCCGGGGGCGGTGTCGCCGGCCACACGCCCATTCTTGTCTATTTACCCAGT。
本发明还提供了九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物、阴性对照和阳性对照；所述九种皮肤癣菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌。
本发明所述试剂盒是荧光PCR方法中的多重PCR结合融解曲线法的真菌分子检测试剂盒。根据红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌9种皮肤癣菌的同源保守基因组DNA片段设计特异性引物，通过检测荧光信号的强度和扩增曲线的形状来判定是否有特异性的PCR产物形成，根据不同序列融解温度的差别性分析，可以快速鉴别不同皮肤癣菌至属的水平，进而判断所测样本中是否含有目的DNA片段及属于何种皮肤癣菌属的目的DNA片段。
本发明所述引物或试剂盒优选用于定性检测最常见的3种皮肤癣菌属，即毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属的9种皮肤癣菌。本发明更优选用于红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌核酸分子快速检测。
在本发明中，所述阳性对照包括阳性对照1、阳性对照2和阳性对照3，所述阳性对照1含上述技术方案所述引物扩增的毛癣菌属任意一种菌的靶基因，所述阳性对照2含上述技术方案所述引物扩增的小孢子菌属的任意一种菌的靶基因，所述阳性对照3含上述技术方案所述引物扩增的表皮癣菌属菌或疣状毛癣菌的靶基因；
所述毛癣菌属任意一种菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌或许兰毛癣菌；
所述小孢子菌属的任意一种菌包括犬小孢子菌或石膏样小孢子菌；
所述表皮癣菌属菌包括絮状表皮癣菌。
在本发明具体实施例中，所述阳性对照1优选针对许兰毛癣菌靶基因进行制备，具体的，许兰毛癣菌(Sch)序列(645bp)优选如SEQ ID NO:11所示：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGCCAAACGTCCATCAGGGGTGAGCAGATGTGCGCCGGCCGTACCGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGTTGCCTCGGCGGGCCGCGCTCTCTCTCAGGAGAGCCGTTCGGCGAGCCTCTCTTTAGTGGCTCAACGCTGGACCGCGCCCGCCGGAGGACAGACGCAAAAAATTCTTTCAGAAGAGCTGTCAGTCTGAGCGTTAGCAAGCAAAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAGCCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGATGGACGACCGTCCGGCACCCCCTTTCTCGGGGGTGCGGGACGCGCCCGAAAAGCAGTGGCCAGGCCGCGATTCCGGCTTCCTAGGCGAATGGGCGCAACAAACCAGCGCCTCCAGGACCGGCCGCTCTGGCCTCAGAATCTGTTTCTATACTTATCAGGTTGACCTCGGATCAGG。
阳性对照2优选针对絮状表皮癣菌靶基因进行制备，具体的，絮状表皮癣菌(Flo)序列(738bp)优选如SEQ ID NO:12所示：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGCAGTCGGCCCGTCCCCCTTCTCTCTGAATGCTGGACGGTGTCGCCGGCCACACGCCCATTCTTGTCTACACTACCCGGTTGCCTCGGCGGGCCGCGCCCCCTAGGCTGCAGTGTCGCTGCAGCGTCTCGGGGGGGCCGTTCGGGGGATGGAGAAGGATGCCCCGGCGGGGTTGATCGCTCCCCCACCCCTGGACAGCGCTCGCCGAAGGAGTGATTCTCAGAAATTCTACGAAATCTCCATAGGTGGTTCAGTCTGAGCGTTGGCAAGCAAAAACCAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGATGGACGACCGTCCGACCGCCTTTGCATCCCCCGTTCCACCGGGAGAGGAGAAAGGTGGAGGGGACGCGCCCGAAAAGCAGTGGCCAGGCCGCGATTCCGGGCCCCTGGGCGAATGGGCAACAAAACCAGCGCCTTCAGGACCGGCCGGCTCTCTGGCCCTAGTTTCCGTCGGGAGGACGAAAGGGGGCGACCCCTCTCTCCCCTCCGCATTCAGGTTGACCTCGGATCAGG。
阳性对照3优选针对犬小孢子菌靶基因进行制备，具体的，犬小孢子菌(Can)序列(695bp)优选如SEQ ID NO:13所示：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCCATTCTTGTCTACTGACCCGGTTGCCTCGGCGGGCCGCGCCTGCTGTGCTACAGCGGCCGTTCGGGGGGGACGCCTGAGGGGGACTCTTGTTTCCTAGGCCACGCCCCGGGCAGCGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCGAGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGATGGACGACCGTCCCCCCTCCCCAGTAACCACCCACCGCTTAGGGGGGTGGGAGGGAGGGGGACGCGCCCGAAAAGCAGTGGTCAGGCCGCGATTCCGGCTCCTGGGCGAATGGGACATACCACCGCCTCCAGGACCGGCCGGCAGGCTGGCCTAACGCACCATGTATTATTCAGGTTGACCTCGGATCAGG。
在本发明中，针对许兰毛癣菌靶基因、絮状表皮癣菌靶基因和犬小孢子菌靶基因进行制备时，优选分别以许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌和犬小孢子菌的基因组DNA为模板，采用引物DL-F/DL-R进行PCR扩增。DL-F的核苷酸序列具体为：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(SEQ ID NO:14)，DL-R的核苷酸序列具体为5'-CCTGATCCGAGGTCAACCTG-3'(SEQ ID NO:15)。
在本发明中，所述阴性对照包括TE溶液，更优选为0.1×TE溶液。
在本发明中，所述试剂盒还包括PCR反应液。在本发明中，所述PCR反应液优选为2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix，包含dNTP，Mg2+，AceTaq DNA Polymerase，SYBRGreenΙ，Specific ROX Passive Reference Dye等，购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号Q511-02。
本发明所述试剂盒每20μL的反应体系中，优选包含PCR反应液10μL、引物0.8μL、灭菌纯化水7.2μL和样本/对照品2μL。反应条件优选95℃5min；95℃10sec，60℃30sec(采集信号)，40个循环；95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec(60℃到95℃升温过程采集信号)。
在本发明中中，所述试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效，需要重做：
(1)阴性质控：阴性对照Ct值＞36，或“Undetermined”。
(2)阳性质控：阳性对照Ct值≤36。
本发明优选结合各样本Ct值和Tm值对检测结果进行判定，当样本Ct值≤36，阳性结果；样本Ct值＞36或者“Undetermined”，阴性结果。
当样本的Tm值为86.26±0.11℃时，鉴定为絮状表皮癣菌或疣状毛癣菌。当样本的Tm值为87.39±0.27℃时，鉴定为毛癣菌属，包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、许兰毛癣菌、断发毛癣菌5种毛癣菌中的任意一种。当样本的Tm值为89.00±0.20℃时，鉴定为小孢子菌属，包括犬小孢子菌和石膏样小孢子菌2种小孢子菌中的任意一种。
下面结合具体实施例对本发明所述的九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用引物及试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
试剂盒的组成
1、引物设计
根据红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌的核糖体RNA的基因组DNA的序列，筛选能够通用检测这9种皮肤癣菌且与其他物种不同源的靶序列，设计用于荧光PCR检测的特异性引物，委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。
引物序列和靶序列的核苷酸序列如下：
特异性引物的碱基序列为：
上游引物：5'-GTAGGTGAACCTGCGGAAG-3'(SEQ ID NO:1)
下游引物：5'-ACCGGGTAAGGTAGACAAG-3'(SEQ ID NO:2)
应用上面引物对可以在同一管中同时多重扩增9种皮肤癣菌的靶基因片段，每种皮肤癣菌的靶基因扩增片段的核苷酸序列如下：
(1)红色毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:3所示(133bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGACCGACGTTCCATCAGGGGTGAGCAGACGTGCGCCGGCCGTACGCCCCCATTCTTGTCTACCTCACCCGGT
(2)须癣毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:4所示(132bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGCCAAACGTCCGTCAGGGGTGAGCAGATGTGCGCCGGCCGTACCGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGT
(3)紫色毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:3所示(133bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGACCGACGTTCCATCAGGGGTGAGCAGACGTGCGCCGGCCGTACGCCCCCATTCTTGTCTACCTCACCCGGT
(4)断发毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:5所示(132bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCAGGATAGGGCCAAACGTCCGTCAGGGGTGAGCAGATGTGCGCCGGCCGTACCGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGT
(5)许兰毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:6所示(132bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGCCAAACGTCCATCAGGGGTGAGCAGATGTGCGCCGGCCGTACCGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGT
(6)絮状表皮癣菌靶序列如SEQ ID NO:7所示(118bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGCAGTCGGCCCGTCCCCCTTCTCTCTGAATGCTGGACGGTGTCGCCGGCCACACGCCCATTCTTGTCTACACTACCCGGT
(7)疣状毛癣菌靶序列如SEQ ID NO:8所示(132bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGATCAGCGTTCCATCAGGGGTGTGCAGATGTGCGCCGGCCTTACGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGT
(8)犬小孢子菌靶序列如SEQ ID NO:9所示(149bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCCATTCTTGTCTACTGACCCGGT
(9)石膏样小孢子菌靶序列如SEQ ID NO:10所示(113bp)：
GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGTAGACGGCCCGTCCCCGGATGCGTCCGGGGGCGGTGTCGCCGGCCACACGCCCATTCTTGTCTATTTACCCAGT
2、试剂盒的组成(规格20人份/盒)
(1)引物
引物由上述的上游引物和下游引物组成，浓度分别为10μM。
(2)阴性对照
阴性对照为0.1×TE。
(3)阳性对照
本发明融解温度的不同将9种皮肤癣菌分为三组(除了疣状毛癣菌，大致是按3种菌属划分)，从三组中各选一种菌，作为该菌属的一个阳性对照，因此本试剂盒共有三个阳性对照。阳性对照序列是针对本试剂盒的荧光PCR扩增的靶序列，且此阳性对照的DNA序列的长度比靶序列的要长，这样就能完全覆盖整个荧光PCR扩增的靶序列。
具体的，阳性对照1为含许兰毛癣菌基因片段的质粒，阳性对照2为含絮状表皮癣菌基因片段的质粒，阳性对照3为含犬小孢子菌基因片段的质粒，浓度均为20ng/mL。
阳性对照的制备过程为：
克隆质粒的构建：
提取许兰毛癣菌的基因组DNA：以该基因组DNA为模板，采用引物DL-F/DL-R进行PCR扩增，扩增得到许兰毛癣菌阳性对照DNA片段；回收并纯化PCR产物，将其连入质粒载体(PUC-T)中，转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证，许兰毛癣菌阳性对照DNA片段(Sch)如下所示，重组转化子培养后提取质粒，得到许兰毛癣菌克隆质粒Sch-T。
絮状表皮癣菌和犬小孢子菌同样采用引物DL-F/DL-R得到絮状表皮癣菌阳性对照DNA片段(Flo)和犬小孢子菌阳性对照DNA片段(Can)，后续构建过程如上，得到絮状表皮癣菌克隆质粒Flo-T和犬小孢子菌克隆质粒Can-T。
DL-F：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(SEQ ID NO:14)
DL-R：5'-CCTGATCCGAGGTCAACCTG-3'(SEQ ID NO:15)
阳性对照1：许兰毛癣菌(Sch)序列如SEQ ID NO:11所示(645bp)：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGCCAAACGTCCATCAGGGGTGAGCAGATGTGCGCCGGCCGTACCGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGTTGCCTCGGCGGGCCGCGCTCTCTCTCAGGAGAGCCGTTCGGCGAGCCTCTCTTTAGTGGCTCAACGCTGGACCGCGCCCGCCGGAGGACAGACGCAAAAAATTCTTTCAGAAGAGCTGTCAGTCTGAGCGTTAGCAAGCAAAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAGCCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGATGGACGACCGTCCGGCACCCCCTTTCTCGGGGGTGCGGGACGCGCCCGAAAAGCAGTGGCCAGGCCGCGATTCCGGCTTCCTAGGCGAATGGGCGCAACAAACCAGCGCCTCCAGGACCGGCCGCTCTGGCCTCAGAATCTGTTTCTATACTTATCAGGTTGACCTCGGATCAGG
阳性对照2：絮状表皮癣菌(Flo)序列如SEQ ID NO:12所示(738bp)：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCCGCAGTCGGCCCGTCCCCCTTCTCTCTGAATGCTGGACGGTGTCGCCGGCCACACGCCCATTCTTGTCTACACTACCCGGTTGCCTCGGCGGGCCGCGCCCCCTAGGCTGCAGTGTCGCTGCAGCGTCTCGGGGGGGCCGTTCGGGGGATGGAGAAGGATGCCCCGGCGGGGTTGATCGCTCCCCCACCCCTGGACAGCGCTCGCCGAAGGAGTGATTCTCAGAAATTCTACGAAATCTCCATAGGTGGTTCAGTCTGAGCGTTGGCAAGCAAAAACCAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGATGGACGACCGTCCGACCGCCTTTGCATCCCCCGTTCCACCGGGAGAGGAGAAAGGTGGAGGGGACGCGCCCGAAAAGCAGTGGCCAGGCCGCGATTCCGGGCCCCTGGGCGAATGGGCAACAAAACCAGCGCCTTCAGGACCGGCCGGCTCTCTGGCCCTAGTTTCCGTCGGGAGGACGAAAGGGGGCGACCCCTCTCTCCCCTCCGCATTCAGGTTGACCTCGGATCAGG
阳性对照3：犬小孢子菌(Can)序列如SEQ ID NO:13所示(695bp)：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCAAGAGGTCGAAGTTGGCCCCCGAAGCTCTTCCGTCTCCCCCCCGGGCCTCCCGGGGAGGTTGCGGGCGGCGAGGGGTGCCTCCGGCCGCACGCCCATTCTTGTCTACTGACCCGGTTGCCTCGGCGGGCCGCGCCTGCTGTGCTACAGCGGCCGTTCGGGGGGGACGCCTGAGGGGGACTCTTGTTTCCTAGGCCACGCCCCGGGCAGCGCTCGCCGGAGGATTACTCTGGAAAACACACTCTTGAAAGAACATACCGTCTGAGCGAGCAACGCAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGATGGACGACCGTCCCCCCTCCCCAGTAACCACCCACCGCTTAGGGGGGTGGGAGGGAGGGGGACGCGCCCGAAAAGCAGTGGTCAGGCCGCGATTCCGGCTCCTGGGCGAATGGGACATACCACCGCCTCCAGGACCGGCCGGCAGGCTGGCCTAACGCACCATGTATTATTCAGGTTGACCTCGGATCAGG
(4)PCR反应液
PCR反应液，2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix，包含dNTP，Mg2+，AceTaqDNA Polymerase，SYBR GreenΙ，Specific ROX Passive Reference Dye等，购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号Q511-02。
表1、试剂盒的组成
实施例2
试剂盒的检测方法
在使用本试剂盒进行检测前，需提取待检测样本的DNA，可用杭州缔蓝生物技术有限公司生产的真菌核酸提取或纯化试剂盒进行DNA的提取。
1、PCR反应管的准备(试剂准备区)
(1)确定需要进行的反应管数n(样本数+阴性对照+阳性对照)；取出灭菌纯化水(用户自备)和PCR反应液；取出试剂盒中的其他组分，放冰上或室温融化。所有试剂盒组分使用前均需要瞬时离心。每份反应体系如表2：
表2、加样条件
PCR反应液 引物 灭菌纯化水 样本/对照品 总体积
10μL 0.8μL 7.2μL 2μL 20μL
按反应管数n计算上述各试剂(除了样本/对照品)的用量，并加入至离心管中，充分混匀(建议用移液器缓慢反复吹打混匀，同时避免液体飞溅或产生大量气泡)，瞬时离心后，向每个PCR反应管分装18μL。
2、加样(样本处理区或者加样区)
向准备好的PCR反应管中分别加入2μL待测样本的DNA或阴性对照或阳性对照样本，盖紧管盖(或贴上封板膜)后瞬时离心，转移到样本检测区。
3、PCR扩增及荧光检测(样本检测区)
将准备好的反应管放置在荧光PCR仪中，依照已编辑的样本信息按下列条件进行扩增反应及检测(表3)：
表3、扩增反应条件
a.如模板GC含量较高，可将预变性时间延长为10min；
b.使用ABI7300至少31sec；使用ABI7500至少34sec；
c.仪器类型不同，融解曲线程序不尽相同，使用仪器默认融解曲线采集程序即可。
4、结果分析条件设定
(1)分析扩增曲线图(Amplification Plot)结果时，一般可设定成图类型(Plottype)为：ΔRn vs Cycle。
(2)基线(Baseline)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置基线，通常是循环数2至最先扩增曲线之前3个循环数为基线。
(3)阈值(Threshold)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置阈值线，也可手动设置，通常阈值线设在基线以上扩增曲线的指数增长期内呈线性的部位，扩增曲线与阈值线相交的点即为Ct值，Ct值是扩增曲线达到阈值时的循环数，代表了标准化后报告集团荧光强度(Rn，The Normalized Intensity of the Reporter)扩增前后的变量值ΔRn[ΔRn＝Rn(PCR扩增后读数)-Rn(PCR扩增前读数)]，Ct值与反应初始目的DNA片段的量对数值呈线性负相关。
(4)分析融解曲线(Melt Curve)结果时，一般可设定成Plot(DerivativeReporter)模式。选中单个样本时，图中显示的温度即为该样本的融解温度，当该对引物扩增只有一种产物时，融解曲线为单峰，反之为多峰，即有多种扩增产物表明扩增是非特异的。
5、质控标准
本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效，需要重做：
(1)阴性质控：阴性对照Ct值＞36，或“Undetermined”。
(2)阳性质控：阳性对照Ct值≤36。
6、实验结果的读取
以ABI7500为例，其它机型以相应机型所配套的软件说明书为准。根据ABI7500仪器配套的分析软件说明书，首先将基线和阈值设定好(建议基线设定选自动，阈值设定选自动)，然后在软件内点击分析(Analyse)，系统将自动生成结果，观察每个样本扩增曲线的Ct值，并下载到Excel文件中。
利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样本Ct值和Tm值，根据表4和表5进行判定。
表4、Ct值判定标准
1 样本Ct值≤36 阳性结果
2 样本Ct值＞36或者“Undetermined” 阴性结果
表5、Tm值判定标准
*疣状毛癣菌应当属于毛癣菌属，但是其融解温度与絮状表皮癣菌在同一范围内，因此本试剂盒检测时将此菌归属于絮状表皮癣菌属内，特此说明。
实施例3
菌种鉴定
为保证试剂盒检测的准确性，对实验所用的须癣毛癣菌、红色毛癣菌、许兰毛癣菌、断发毛癣菌和紫色毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌DNA进行测序验证，测序针对ITS区和28S的D1/D2区进行测序，ITS区测序引物(ITS-1：
5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID NO:14)；ITS-4：
5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO:16))，28S的D1/D2区测序引物(NL-1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’(SEQ ID NO:17)；NL-4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’(SEQ ID NO:18))。
本试剂盒所检测的9种皮肤癣菌均经过上述方法测序确定各自的菌种无误后，用于本试剂盒的菌种验证实验。
实施例4
试剂盒的性能指标
1、检测限
本试剂盒结果分为三个菌属，因此选三种菌属中每种菌属的其中一种皮肤癣菌为代表进行检测限标准曲线，如表6。许兰毛癣菌(毛癣菌属)检测限可达到1×10-3ng/μL，絮状表皮癣菌(表皮癣菌属)检测限可达到1×10-2ng/μL，犬小孢子菌(小孢子菌属)检测限可达到1×10-1ng/μL。图1为许兰毛癣菌标准曲线图。通过对许兰毛癣菌的基因组DNA进行系列浓度稀释后用5种浓度分别进行PCR扩增，得出了本发明引物对靶基因的扩增浓度范围(1×10-3ng/μL～1×10ng/μL)和融解温度(Tm,87℃)，虽然扩增的Ct值不同，但都具有相同的Tm值，标准曲线呈直线。其中，A是扩增曲线图(AmplificationPlot)，以反应循环数(Cycle)与荧光的强度的变化值(△Rn)作图而形成。扩增曲线一般呈S形，图中曲线根据核酸浓度大小从左到右依次排列；B是融解曲线图(Melt Curve)是根据温度(Temperature℃)与扩增时产生的荧光信号[Derivative Reporter(-Rn)]变化作图而形成，融解温度与PCR扩增产物的序列有关，对于某一荧光定量PCR扩增产物，其融解温度固定；C是标准曲线(StandardCurve),是由靶基因的核酸浓度(Quantity)与所对应的达到阈值时的循环数(CT)作图而形成，图中5个点，由浓度小(左侧)向浓度大(右侧)呈直线分布，其直线相关系数R2为0.999。
表6检测限实验结果(图1中A、B、C所示许兰毛癣菌)
2、特异性
2.1阳性反应
分别取浓度为1ng/μL红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、许兰毛癣菌、断发毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌基因组DNA，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测，见图2和图3。其中，图2为九种皮肤癣菌扩增曲线图；断发毛癣菌和紫色毛癣菌扩增曲线(Amplification Plot)重合；当DNA中目标扩增片段拷贝数越多，扩增曲线的循环数(CT)越小。图3为九种皮肤癣菌融解曲线图；由于扩增序列差异导致融解温度不同，图3中融解曲线可将9种菌根据融解温度可分为三组，从左至右依次：絮状表皮癣菌属组(包括絮状表皮癣菌和疣状毛癣菌)，毛癣菌属组(包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌)，犬小孢子菌属组(包括犬小孢子菌和石膏样小孢子菌)。因此得出结论，图2说明9种皮肤癣菌基因组DNA进行PCR扩增，均有很好得S形扩增曲线，虽然所用的核酸浓度相同，但因各自的靶基因序列不同，其Ct值各不相同。图3显示9种皮肤癣菌表现出三组融解曲线，每组的融解温度Tm值各不相同，因此，根据其Tm值可以鉴定出三个菌属的皮肤癣菌。
表7是上述图2和图3所作实验的具体数据，显示所用相同浓度的核酸样本(1ng/μL)，所得出的Tm值可以归纳成三组，分别为86℃组(絮状表皮癣菌和疣状毛癣菌)、87℃组(红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、许兰毛癣菌和断发毛癣菌)和89℃组(犬小孢子菌和石膏样小孢子菌)。
表7、9种皮肤癣菌特异性验证结果
DNA样本名称 浓度 Tm Ct 结果
絮状表皮癣菌 1ng/μL 86.38 23.17 阳性
疣状毛癣菌 1ng/μL 86.20 17.91 阳性
红色毛癣菌 1ng/μL 87.31 19.74 阳性
须癣毛癣菌 1ng/μL 87.68 24.77 阳性
紫色毛癣菌 1ng/μL 87.50 18.59 阳性
许兰毛癣菌 1ng/μL 87.31 19.38 阳性
断发毛癣菌 1ng/μL 87.87 18.68 阳性
犬小孢子菌 1ng/μL 89.17 25.36 阳性
石膏样小孢子菌 1ng/μL 89.17 26.21 阳性
2.2交叉反应
分别取10ng/μL的人、白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌基因组DNA，在ABI7500上进行特异性检验。
由表8结果可知，设计的通用引物特异性良好，不与人及临床常见的细菌和真菌产生交叉反应。
表8、交叉反应实验验证结果
种类 浓度 Ct Tm1 Tm2 Tm3
人 10ng/μL Undetermined 61.93 79.06
白念珠菌 10ng/μL Undetermined 61.93 82.15 89.08
热带念珠菌 10ng/μL Undetermined 61.93
光滑念珠菌 10ng/μL Undetermined 61.73
近平滑念珠菌 10ng/μL Undetermined 61.73 80.80
黄曲霉 10ng/μL 38.85 82.53 61.93
土曲霉 10ng/μL Undetermined 61.73 85.80
黑曲霉 10ng/μL Undetermined 61.93
烟曲霉 10ng/μL Undetermined 61.73 83.11 78.29
杂色曲霉 10ng/μL Undetermined 61.93 82.72
大肠杆菌 10ng/μL Undetermined 62.12 79.64
金黄色葡萄球菌 10ng/μL Undetermined 61.93 83.69
肺炎克雷伯 10ng/μL Undetermined 61.73 84.84 75.60
肺炎链球菌 10ng/μL Undetermined 61.93 83.30 77.33
粪肠球菌 10ng/μL Undetermined 61.93
屎肠球菌 10ng/μL Undetermined 61.73
奇异变形杆菌 10ng/μL Undetermined 61.73
铜绿假单胞菌 10ng/μL Undetermined 61.93 88.50 82.15
表皮葡萄球菌 10ng/μL Undetermined 61.93 84.26
红色毛癣菌 1ng/μL 19.97 87.54
空白对照 / Undetermined 61.54
备注：当没有扩增或存在不止一个扩增产物时，融解曲线会产生多个峰，因此会产生不止一个融解温度(Tm值)，反之，只有单个峰和一个Tm值。
3、融解温度稳定性
采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，用浓度均为1ng/μL的8种皮肤癣菌进行融解温度稳定性检测，共检测5次，计算其CV值。
由表9结果可知，5次实验融解温度差异较小，CV值均小于0.5％，数据的离散程度均较小，说明融解温度稳定，不受实验次数影响。
表9、5次检测融解温度结果
4、机型等效性
采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，在公司现有的ABI7500荧光PCR仪和ABI7300 Plus荧光PCR仪上进行。实验中8种皮肤癣菌浓度均为1ng/μL，分别用同一批PCR反应液、引物、进行检测，分别检测1次。
由表10结果可知，ABI7500荧光PCR仪和ABI7300 Plus荧光PCR仪实验CV(Tm)值均小于0.5％，CV(Ct)值均小于5％，结果等效。
表10、机型等效实验结果
5、DNA纯度对实验的影响
本发明使用的样本是各种皮肤癣菌的基因组DNA，DNA的提取使用的是上海速创诊断产品有限公司的“核酸提取试剂(一步法)”，DNA没有经过纯化。为验证未经纯化的DNA是否会对实验结果产生影响，因此使用宁波市重鼎生物技术有限公司的“DNA溶液回收/浓缩试剂盒”对样本DNA进行纯化，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，将纯化和未纯化DNA同时进行检测，验证DNA未纯化对实验的影响。
由表11结果可知，与纯化的DNA相比，未纯化DNA基本对实验结果没有影响，纯化前后Ct值没有太大差异，不影响扩增，融解温度Tm值也差异较小，不影响结果判定。
表11、DNA纯化前后实验结果
实施例5
临床样本检测
采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，将由合作医院提供的临床皮肤癣菌样本，经杭州缔蓝生物技术有限公司的真菌核酸提取或纯化试剂盒提取，进行检测(见表12)。
由表12可知，镜检结果与PCR结果基本一致。
表12、临床样本检测结果
样本序号 镜检结果 Ct 检测结果 Tm 预判定
1 + 22.78 + 87.34 毛癣菌属
2 - Undetermined - 61.66 阴性
3 + 30.86 + 87.34 毛癣菌属
4 + 28.71 + 87.34 毛癣菌属
5 + 32.98 + 86.41 絮状表皮癣菌或疣状毛癣菌
6 - Undetermined - 61.85 阴性
7 + 34.55 + 86.97 毛癣菌属
8 - Undetermined - 79.08 阴性
9 + 31.48 + 87.05 毛癣菌属
10 + 32.80 + 87.05 毛癣菌属
11 - Undetermined - 61.85 阴性
12 + 26.41 + 87.42 毛癣菌属
13 + 29.71 + 87 毛癣菌属
14 + 29.07 + 87 毛癣菌属
15 + 22.29 + 87 毛癣菌属
16 + 30.48 + 86.85 毛癣菌属
17 - / - / 阴性
18 - / - / 阴性
19 + 31.06 + 87.04 毛癣菌属
20 - / - / 阴性
21 + 32.25 + 86.96 毛癣菌属
22 + 25.74 + 89.09 小孢子菌属
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州缔蓝生物技术有限公司
<120> 九种皮肤癣菌的荧光PCR检测用引物及试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaggtgaac ctgcggaag 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accgggtaag gtagacaag 19
<210> 3
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaggtgaac ctgcggaagg atcattaacg cgcaggccgg aggctggccc cccacgatag 60
ggaccgacgt tccatcaggg gtgagcagac gtgcgccggc cgtacgcccc cattcttgtc 120
tacctcaccc ggt 133
<210> 4
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtaggtgaac ctgcggaagg atcattaacg cgcaggccgg aggctggccc cccacgatag 60
ggccaaacgt ccgtcagggg tgagcagatg tgcgccggcc gtaccgcccc attcttgtct 120
accttactcg gt 132
<210> 5
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaggtgaac ctgcggaagg atcattaacg cgcaggccgg aggctggccc cccaggatag 60
ggccaaacgt ccgtcagggg tgagcagatg tgcgccggcc gtaccgcccc attcttgtct 120
accttactcg gt 132
<210> 6
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtaggtgaac ctgcggaagg atcattaacg cgcaggccgg aggctggccc cccacgatag 60
ggccaaacgt ccatcagggg tgagcagatg tgcgccggcc gtaccgcccc attcttgtct 120
accttactcg gt 132
<210> 7
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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ctctgaatgc tggacggtgt cgccggccac acgcccattc ttgtctacac tacccggt 118
<210> 8
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtaggtgaac ctgcggaagg atcattaacg cgcaggccgg aggctggccc cccacgatag 60
ggatcagcgt tccatcaggg gtgtgcagat gtgcgccggc cttacgcccc attcttgtct 120
accttactcg gt 132
<210> 9
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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cttccgtctc ccccccgggc ctcccgggga ggttgcgggc ggcgaggggt gcctccggcc 120
gcacgcccat tcttgtctac tgacccggt 149
<210> 10
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtaggtgaac ctgcggaagg atcattaacg cgcaggccgt agacggcccg tccccggatg 60
cgtccggggg cggtgtcgcc ggccacacgc ccattcttgt ctatttaccc agt 113
<210> 11
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta acgcgcaggc cggaggctgg ccccccacga 60
tagggccaaa cgtccatcag gggtgagcag atgtgcgccg gccgtaccgc cccattcttg 120
tctaccttac tcggttgcct cggcgggccg cgctctctct caggagagcc gttcggcgag 180
cctctcttta gtggctcaac gctggaccgc gcccgccgga ggacagacgc aaaaaattct 240
ttcagaagag ctgtcagtct gagcgttagc aagcaaaaat cagttaaaac tttcaacaac 300
ggatctcttg gttccggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt 360
gcagaattcc gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgccccctgg tattccgggg 420
ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcagccc ctcaagcccg gcttgtgtga tggacgaccg 480
tccggcaccc cctttctcgg gggtgcggga cgcgcccgaa aagcagtggc caggccgcga 540
ttccggcttc ctaggcgaat gggcgcaaca aaccagcgcc tccaggaccg gccgctctgg 600
cctcagaatc tgtttctata cttatcaggt tgacctcgga tcagg 645
<210> 12
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta acgcgcaggc cgcagtcggc ccgtccccct 60
tctctctgaa tgctggacgg tgtcgccggc cacacgccca ttcttgtcta cactacccgg 120
ttgcctcggc gggccgcgcc ccctaggctg cagtgtcgct gcagcgtctc gggggggccg 180
ttcgggggat ggagaaggat gccccggcgg ggttgatcgc tcccccaccc ctggacagcg 240
ctcgccgaag gagtgattct cagaaattct acgaaatctc cataggtggt tcagtctgag 300
cgttggcaag caaaaaccag tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ccggcatcga 360
tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattccgtg aatcatcgaa 420
tctttgaacg cacattgcgc cctctggtat tccggggggc atgcctgttc gagcgtcatt 480
tcaacccctc aagcccggct tgtgtgatgg acgaccgtcc gaccgccttt gcatcccccg 540
ttccaccggg agaggagaaa ggtggagggg acgcgcccga aaagcagtgg ccaggccgcg 600
attccgggcc cctgggcgaa tgggcaacaa aaccagcgcc ttcaggaccg gccggctctc 660
tggccctagt ttccgtcggg aggacgaaag ggggcgaccc ctctctcccc tccgcattca 720
ggttgacctc ggatcagg 738
<210> 13
<211> 695
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta acgcgcaaga ggtcgaagtt ggcccccgaa 60
gctcttccgt ctcccccccg ggcctcccgg ggaggttgcg ggcggcgagg ggtgcctccg 120
gccgcacgcc cattcttgtc tactgacccg gttgcctcgg cgggccgcgc ctgctgtgct 180
acagcggccg ttcggggggg acgcctgagg gggactcttg tttcctaggc cacgccccgg 240
gcagcgctcg ccggaggatt actctggaaa acacactctt gaaagaacat accgtctgag 300
cgagcaacgc aaatcagtta aaactttcaa caacggatct cttggttccg gcatcgatga 360
agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttccgtgaat catcgaatct 420
ttgaacgcac attgcgcccc ctggcattcc ggggggcatg cctgttcgag cgtcatttca 480
acccctcaag cccggcttgt gtgatggacg accgtccccc ctccccagta accacccacc 540
gcttaggggg gtgggaggga gggggacgcg cccgaaaagc agtggtcagg ccgcgattcc 600
ggctcctggg cgaatgggac ataccaccgc ctccaggacc ggccggcagg ctggcctaac 660
gcaccatgta ttattcaggt tgacctcgga tcagg 695
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tccgtaggtg aacctgcgg 19
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<212> DNA
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cctgatccga ggtcaacctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcctccgctt attgatatgc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcatatcaat aagcggagga aaag 24
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (5)

1.九种皮肤癣菌的荧光PCR鉴别用引物，其特征在于，所述引物包括核苷酸序列如SEQID NO:1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物；所述九种皮肤癣菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌。
2.九种皮肤癣菌的荧光PCR鉴别用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物、阴性对照和阳性对照；所述九种皮肤癣菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌、许兰毛癣菌、絮状表皮癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括阳性对照1、阳性对照2和阳性对照3，所述阳性对照1含权利要求1所述引物扩增的毛癣菌属任意一种菌的靶基因，所述阳性对照2含权利要求1所述引物扩增的小孢子菌属的任意一种菌的靶基因，所述阳性对照3含权利要求1所述引物扩增的表皮癣菌属菌或疣状毛癣菌的靶基因；
所述毛癣菌属任意一种菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌、断发毛癣菌或许兰毛癣菌；
所述小孢子菌属的任意一种菌包括犬小孢子菌或石膏样小孢子菌；
所述表皮癣菌属菌包括絮状表皮癣菌。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照包括TE溶液。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液。
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