CN111757945A

CN111757945A - 鉴定皮肤癣菌的方法

Info

Publication number: CN111757945A
Application number: CN201980014061.4A
Authority: CN
Inventors: C·库普施; Y·格雷泽
Original assignee: Dehrm Testing Co
Current assignee: Dehrm Testing Co
Priority date: 2018-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2020-10-09
Also published as: WO2019158767A1; US20210087641A1; EP3755817A1

Abstract

本发明涉及评估编码皮肤癣菌胞外富含丝氨酸/苏氨酸蛋白(ESTRP基因)的核酸在识别和优选区分不同皮肤癣菌中的方法。本发明涉及分离探针和寡核苷酸，还涉及相应的检测试剂盒。

Description

鉴定皮肤癣菌的方法

技术领域

本发明涉及评估编码皮肤癣菌胞外富含丝氨酸/苏氨酸蛋白(ESTRP基因)的核酸在鉴定皮肤癣菌(优选区分不同皮肤癣菌)中的应用的方法。本发明涉及分离的探针和寡核苷酸，还涉及相应的检测试剂盒。

背景技术

皮肤癣菌病是皮肤真菌病的一个特例，并且代表一组由皮肤癣菌引起的皮肤及其附属物(指甲和头发)的感染。皮肤癣菌引起的医学症状通常被称为癣，更详细地通过指示被感染的身体部位来描述，例如手癣(Tinea unguium)(也称甲真菌病或指甲真菌病)、足癣、体癣或头癣。

近年来，皮肤癣菌病，特别是甲真菌病的患病率一直在稳步上升，例如在美国，从1979年的2.18％上升到2000年的13.8％(1,2)。所谓的“阿喀琉斯计划”是一项涉及16个欧洲国家的研究计划，它在普通人群中进行了一项访问全科医生的研究，结果表明，差不多26％的普通人群患有该病(3)。

有许多诱发因素会增加癣的风险。除了遗传倾向和相关疾病，如糖尿病和免疫缺陷，其他因素，如体育运动，环境因素和人口的发展也可能起作用(4)。在工业化国家，60岁以上的人口中大约20％，70岁以上的人口中甚至有50％的比例患有脚癣(5,6)。大约20年内，60岁以上的人口将占总人口的15-35％(7)。在一年内(1989-90)，仅美国甲真菌病的治疗就花费了4300万美元(8)。1999年，仅治疗霉菌性指甲就花费了2.5亿美元(9)。鉴于癣感染的流行，特别是在日益增长的老年人口中，迫切需要在这类感染的诊断和治疗方面取得进展。

皮肤癣菌是嗜角蛋白丝状真菌，感染哺乳动物的皮肤及其附属物(毛发、指甲)，对人类不可避免地具有致病性。基本上，这种病原体的每一次发病都需要医疗治疗。

近40种皮肤癣菌可分为7个属，其中仅有来自于表皮癣菌属(Epidermophyton)、小孢子菌属(Microsporum)、毛癣菌属(Trichophyton)和南尼兹菌属(Nannizzia)4个属的约20种病原菌具有临床相关性。皮肤癣菌可分为3类：嗜人、嗜动物和嗜地。

嗜人病原体，如红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、指(趾)间毛癣菌(T.interdigitale)或絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)，只在人与人之间传播。虽然它们可以通过厚垣孢子的形成在环境中存活较长时间(长达数年)，但它们不能繁殖。在动物身上，嗜人物种只有在特殊的例子中存在，在这种情况下通常不具有传染性。因此，人类是这个物种唯一已知的生态位。这些病原体已经适应了人类，这就是为什么它们通常只引起轻微但慢性感染的主要原因(约占皮肤癣菌病总数的70％)(10)。

嗜动物性皮肤癣菌适应于特定的哺乳动物物种，并且通常是限于特定哺乳动物。这种情况对于寻找感染源很重要，因为嗜动物物种有可能传染给人类并引起皮肤感染(约30％)。最常见的传染源是宠物，如猫(犬小孢子菌(Microsporum canis))、豚鼠(本汉姆毛癣菌(T.benhamiae))和牛(疣状毛癣菌(T.verrucosum))，它们与人类有密切接触。

嗜地物种是生活在非生物、含有角蛋白的基质上的土壤居民。兼性嗜地性物种，如石膏样奈尼兹皮真菌(Nannizzia gypsea)或黄褐奈尼兹皮真菌(N.fulva)，感染动物或人类的可能性很小(约3％)，其余的嗜地物种则更为罕见。

最后提到的两个生态群在免疫系统完整的人类中引起急性炎症性皮肤癣菌病，因为它们不适应人类，因此人类是一个偶然宿主。

对于皮肤癣菌病的成功治疗来说，正确和快速的诊断是必不可少的。可以假设，仅根据临床症状作出的诊断会导致所有病例中约50％的误诊(11)。目前，基于实验室的诊断是基于真菌的直接显微镜检测和/或从临床材料中培养病原体。培养生长的真菌菌落从宏观上评估其形状和颜色，然后通过显微镜评估，根据大小和形状区分物种。一个主要的缺点是分生孢子(其对种属鉴定很重要)很少表达，尤其是在嗜人皮肤物种中。此外，通常生长缓慢的皮肤癣菌的培养是耗时的，需要两到六周才能完成。虽然直接显微镜检查可以在取样后立即进行，但它是非特异性的；它只是总体上显示真菌的存在。

在甲真菌病中，30-50％的镜检阳性结果是不可培养的(例如，患者在就诊前自行用药)，因此在物种水平上无法识别病原体。这表明结果是假阴性的。结果是停止或中断治疗10天，现有的真菌细胞恢复，只有在感染有进展后才能进行病原体鉴定。传统诊断的不确定性意味着德国40％的皮肤科医生在没有真正确定病因的情况下就开始了口服治疗(12)。从医学、经济和法律的角度来看，由于系统性抗真菌药物的潜在副作用和与环境的相互作用，应避免使用这些药物(13-15)。

由于其他原因，还需要对物种进行特定的诊断，例如小孢子菌属(Microsporum)和毛癣菌属(Trichophyton)对常见的抗真菌类药的反应不同。这同样适用于治疗时间。根据是嗜人还是嗜动物病原体导致感染，必须对它们进行不同时间的治疗。此外，一个正确的物种诊断可以用来得出关于动物的结论：从该动物身上感染发生了转移(通常是家畜)，必须进行治疗，以中断感染链。最好采用直接从临床材料中识别病原体的方法(无需任何形式的预培养，如基于质谱的方法，如MALDI-TOF-MS所需要的)，并且优选适合于治疗选择、分层和控制。

随着PCR作为一种微生物检测方法的引入，一种结合了所有这些优点的工具已经存在，使用这种工具通常可以在24-48小时内将皮肤癣菌在一个物种水平上将彼此区分开来。

对于大多数真菌的区分，核糖体DNA的ITS(内部转录间隔区)区域(ITS1和ITS2)原则上是足够可变的(16)。对于高度保守的侧翼rDNA基因(18S，5,8S和28S)可以设计通用引物，而干预变量ITS区域则用于下至物种水平的探针鉴定(17)。然而，对于系统发育密切相关的皮肤癣菌类群，由于亲缘关系密切的物种之间只有很少的多态性，所以该目标DNA区域适用性有限。虽然皮肤癣菌物种可以通过对整个ITS区域进行测序来区分，但由于许多皮肤癣菌ITS1和ITS 2区的序列相似性，使用更适合常规诊断的基于探针的技术仍然受到限制。

在此基础上，最近有人开发并发表了PCR方法(18-21)。WO 2006/133701 A2(Statens Serum Institut)教导了一种基于PCR引物检测样本中皮肤癣菌的方法，该PCR引物扩增了所有皮肤癣菌共有的几丁质合成酶基因片段。类似的方法是通过从内部转录间隔区ITS1和ITS2扩增一段来描述的(18)。关于红色毛癣菌和叉指毛癣菌检测的不同分子试验和培养的皮肤癣菌诊断性能的综述见(25)。此外，许多商业测试系统也是可以获得的。然而，这些方法都不能涵盖足够数量的临床相关物种。

发明内容

根据现有技术，本发明的技术问题是提供用于识别样本中的一种或多种皮肤癣菌的替代和/或改进方法。

本发明的另一个问题是提供区分皮肤癣菌的方法(means)。本发明的方法寻求提供样本中一种或多种皮肤癣菌的种属特异性测定，从而能够改进关于选择适当治疗方案的治疗分层和患者管理。

这一问题通过独立权利要求的特点得以解决。本发明的优选实施例由从属权利要求提供。

本发明涉及编码皮肤癣菌胞外富含丝氨酸/苏氨酸蛋白(ESTRP基因)的核酸在识别和优选区分皮肤癣菌中的用途。

因此，本发明涉及一种用于识别一种或多种皮肤癣菌或其核酸的方法，包括对怀疑含有一种或多种皮肤癣菌和/或其核酸的样品进行核酸扩增反应，其中所述反应包括与核酸分子杂交的引物，该核酸分子编码一种皮肤癣菌胞外富含丝氨酸/苏氨酸蛋白(ESTRP基因)，并评估扩增反应产物。

就发明人所知，如本文所述，先前没有公开新的标记基因ESTRP。尽管有各种基于PCR的皮肤癣菌诊断的现有技术披露，但这些披露并不涉及致病性皮肤癣菌的全面检测或使用ESTRP，而是通常仅依赖于ITS区域内的特定于属的证据(例如，US 15222652 A1，在此通过引用并入)，或者能够检测单个物种或复合物，但没有对多种潜在病原体的广泛覆盖。

目前市面上所有的商业测试系统都不符合皮肤癣菌综合诊断的要求。

(i)第二常见的皮肤癣菌指(趾)间毛癣菌(T.interdigitale)和须癣毛癣菌(T.mentagrophytes)之间的区别以及嗜动物物种中嗜人物种断发毛癣菌(T.tonsurans)与马毛癣菌(T.equinum)之间的区别，这在ITS中仅存在一个多态性不同，因此对其进行区分是不可能的。为了在嗜动物性病原体的案例中找到感染源，并能够对其进行治疗和预防，必须对其进行鉴别，以便治疗感染的动物和消除感染源。在嗜人物种中，准确的诊断可以中断感染链并防止流行病的发生(23)。

(ii)德国最流行的嗜动物性皮肤癣菌本汉姆毛癣菌(T.benhamiae)，可引起高度炎症性感染，尤其是在与豚鼠接触的儿童中(24)，且它无法通过任何可用的测试系统进行识别。只有一种试剂盒能够在复杂的环境中检测到它，但是和另外两个物种一起。目前，据本发明人所知，还没有试剂盒能够特别检测本汉姆毛癣菌。

因此，本发明代表了在皮肤癣菌检测和诊断方面的令人惊讶的和有益的进展。ESTRP基因在皮肤癣菌检测中的应用既没有被公开也没有被建议。在优选实施例中，本发明能够区分指(趾)间毛癣菌和须癣毛癣菌，和/或区分本汉姆毛癣菌,疣状毛癣菌和意瑞奈斯发癣菌(T.erinacei)。优选将ESTRP基因与翻译延伸因子1-α基因(EF-1-α基因)结合使用，用于进行断发毛癣菌和马毛癣菌之间的区分。

现有技术的可用测试系统的另一个缺点是缺乏对稀有皮肤癣菌的区分，例如，铁锈色小孢子菌(M.ferrugineum),猴类毛癣菌(T.simii)或同心圆毛癣菌(T.concentricum)。这些病原体是非洲、亚洲或南美洲的地方性疾病，但由于移民增加，在欧洲的流行率可能越来越高。也可以想象，更高温度和湿度的气候变化将导致这些病原体的传播增加。为了确保有效治疗这种感染并采取有针对性的预防措施，必须及时注意到这种流行病的变化。因此，准确和快速的诊断应该能够在物种水平上检测出所有人类致病性皮肤癣菌。

本发明基于在皮肤癣菌检测中使用ESTRP基因(任选与EF-1-α基因结合)，能够检测和区分猴类毛癣菌和铁锈色小孢子菌或同心圆毛癣菌，这是以前使用现有的分子技术不可能想到的。

在全基因组范围内寻找新的诊断标记物的过程中，发明人鉴定出了ESTRP(胞外富含丝氨酸/苏氨酸蛋白)基因，该基因可以区分许多相关的皮肤癣菌物种。这个基因包含许多序列差异，特别是物种之间的差异，这些物种之间的差异将以前的分子诊断推向了极限。这一点在看待指(趾)间毛癣菌种(全球第二大甲真菌病和足癣的第二大常见病因)和同样广泛分布的嗜动物性皮肤癣菌属须癣毛癣菌(T.mentagrophytes)时尤为明显。ESTRP基因编码一种富含丝氨酸/苏氨酸的胞外蛋白，以前没有作为诊断标志物被披露。

在本发明的优选实施例中，使用本文所述方法对皮肤癣菌ESTRP基因的评估能够区分物种指(趾)间毛癣菌和芒根癣菌。

在其他实施例中，本发明旨在(i)扩大要检测的病原体谱以覆盖所有致病性皮肤癣菌物种，(ii)包括通用的皮肤癣菌检测，将假阴性结果的风险降至最低，以及(iii)包括用于可靠物种区分的新ESTRP基因在内的多个目标，即使是在以前不可区分的物种之间，如指(趾)间毛癣菌和芒根癣菌进行区分。

在本发明的一个实施方案中，评估核酸扩增反应产物包括熔融曲线分析。通过熔融曲线分析，核酸扩增反应扩增出的ESTRP基因序列可以以种属特异的方式进行鉴定。在优选实施例中，对核酸扩增反应产物的评估包括将识别出的皮肤癣菌与其他皮癣菌种区分开来，其中为多个皮癣菌种中的一种或多种的核酸扩增反应产物指定唯一的熔化温度。

采用熔融曲线分析的本发明实施方案能够在任何给定样本中准确且利用先前不可能利用的分子测定和/或区分致病性皮肤癣菌物种，从而潜在地实现相应的诊断和治疗。熔融曲线分析与直接执行的附加优势相关，并且通常与成本降低相关，因为与其他基于探针的分析相比，不使用荧光标记探针或其数量显著减少，与熔融曲线分析中的其他基于探针的技术相比，一个单一探针足以检测和/或区分多个物种。

在本发明的一个实施方案中，核酸扩增反应是定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)。

定量RT-PCR能快速、准确、可靠地进行分析，污染风险低。原则上，两种PCR方法可用于常规微生物诊断。这包括经典的终点PCR，其需要通过探针杂交(例如以PCR-ELISA、印迹法或微阵列的形式)进行物种区分的后处理程序。经典的终点PCR是不定量的，由于有后处理，因此需要8-10小时。作为物种区分的一部分，打开带有先前扩增DNA的试管会导致潜在的污染。另一方面，第二种方法，实时PCR，在本发明中是优选的，并且污染低，因为DNA复制和通过探针杂交进行的物种区分都发生在同一管中。这使得该方法更快(1-2小时)，而且它还能够量化感染负荷。

在一个实施方案中，该方法包括使用序列非特异性双链DNA结合染料和/或一个或多个与ESTRP基因杂交的标记序列特异性探针进行熔融曲线分析。在一些实施方案中，本发明包括使用序列非特异性双链DNA结合染料的熔融曲线分析和一个或多个与ESTRP基因杂交的标记序列特异性探针。

在一个实施方案中，所述方法包括确定是否存在毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子菌属和/或南尼兹菌属的一个或多个种和/或区分。

在优选实施方案中，本发明包括识别和/或区分指(趾)间毛癣菌、指(趾)间毛癣菌、断发毛癣菌、马毛癣菌、苏丹毛癣菌(T.soudanense)、紫色毛癣菌(T.violaceum)、红色毛癣菌(T.rubrum)、本汉姆毛癣菌(T.benhamiae)和疣状毛癣菌(T.verrucosum)中的一种或多种。

在优选实施方案中，本发明包括指(趾)间毛癣菌与须癣毛癣菌之间的区分。

在优选的实施方案中，本发明包括对断发毛癣菌和马毛癣菌的区分。

在优选实施方案中，本发明包括意瑞奈斯发癣菌、同心发癣菌、疣状毛癣菌和意瑞奈斯发癣菌之间的区分。

上述实施方案代表可使用本发明的方法评估的皮肤癣菌的非限制性列表。本领域技术人员能够确定所述物种之间的序列差异以及使用诸如本文所公开的那些已建立的分子生物学技术来评估这些差异的手段。

在本发明的优选实施方案中，与ESTRP基因杂交的引物的特征在于：

a、所述与引物结合的ESTRP基因序列显示三种或更少、或者两种或更少，在毛癣菌属、表皮毛癣菌属和小孢子虫属的皮肤癣菌种和/或南尼兹菌属在内的皮肤癣菌种属内的核苷酸差异(能够扩增所述物种中任何一种或多种的ESTRP基因序列)。

b、所述引物结合并经核酸扩增反应序列之间的ESTRP基因序列，在一种或多种皮肤癣菌种类之间表现出足够的序列转移，在毛癣菌属、小孢子虫(优选确定一种小孢子虫属、铁锈色小孢子菌)和/或南尼兹菌属(优选确定一个种类：石膏样奈尼兹皮真菌、黄褐奈尼兹皮真菌、弯曲奈尼兹皮真菌(N.incurvata)和桃色小孢子菌(N.persicolor)中，以在一个或多个所述皮肤癣菌种和/或属的熔融曲线分析中实现独特的熔化温度。

通过上述特征a.和b.的结合，从毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子菌属和/或南尼兹菌属的皮肤癣菌种中扩增出皮肤癣菌ESTRP基因是可能的，由于(a.)这些引物与相应的靶序列具有足够的序列一致性，以便扩增出ESTRP基因的一个区域。随后，熔融曲线分析能够确定毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子虫属中的皮肤癣菌种(优选确定一个种：犬小孢子菌(microstorum canis)，铁锈色小孢子菌)和/或南尼兹菌属(优选确定种：石膏样奈尼兹皮真菌,黄褐奈尼兹皮真菌,弯曲奈尼兹皮真菌和桃色小孢子菌)，由于(b.)扩增的区域显示出足够的序列差异以提供不同的熔融温度。

根据上述a.和b.对待扩增的ESTRP基因区域的定义可以从结构和功能方面考虑，这对于本领域技术人员来说，足以识别能够实现本发明的方法的ESTRP基因的区域。用于确定ESTRP编码区域的可变区域之间的序列同一性的方法，用于计算估计的熔化温度的方法和用于通过实验方法来确定熔化温度的方法，这些方法对于本领域技术人员是已知的，以下将对这些方法详细描述。与另一个序列表现出足够的序列差异的扩增区域的功能定义，该足够的序列差异用于提供一个明显的熔化温度，这种功能定义与基于待比较序列的清晰结构特征直接相关。本领域技术人员能够确定所述物种之间的序列差异，以及使用诸如本文所公开的那些已建立的分子生物学技术通过熔化温度评估这些差异的方法。

作为实例，本文公开了编码疣状毛癣菌、断发毛癣菌、毛癣菌、马毛癣菌(Trichophyton interdigale)、叉指毛癣菌、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、苏丹毛癣菌和紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)(SEQ ID NO 19-26)的核酸的ESTRP序列。通过对这些序列(如图8所示)和编码其他皮肤癣菌种的核酸的ESTRP的比对，本领域技术人员能够确定这些核酸的区域，可以根据这些区域设计引物，并且可以获得不同的(distinct)熔化温度。

可以对其他皮肤癣菌种进行额外的测序，并对ESTRP基因和/或其他基因组区域的适当区域进行测序，以确定适合引物或探针结合的区域，以及确定足以进行差异熔化温度分析的区域。

如下图4-7所述，断发毛癣菌,马毛癣菌,指(趾)间毛癣菌,须癣毛癣菌,昆克努发癣菌(T.quinckeanum),舍恩莱发癣菌(T.schoenleinii),猴类毛癣菌,意瑞奈斯发癣菌,同心圆毛癣菌,本汉姆毛癣菌,疣状毛癣菌,红色毛癣菌,苏丹毛癣菌,紫色毛癣菌,絮状表皮癣菌,桃色小孢子菌,石膏样奈尼兹皮真菌,黄褐奈尼兹皮真菌,弯曲奈尼兹皮真菌,犬小孢子菌,和铁锈色小孢子菌的ESTRP基因序列已被测定并比较了序列同源性。在对这些皮肤癣菌种和其他皮肤癣菌种测序的基础上，可以确定合适的基因区域，以设计用于本发明方法的引物和/或探针靶序列。

图2提供了多种皮肤癣菌种的ESTRP基因中引物和探针的靶区示例，图2中显示了ESTRP基因的特别但非限制性区域(ESTRP-I和ESTRP-II区域；SEQ ID NO 29-49)的靶序列(用于探针和引物)的比对。举例来说，基于这些目标序列，设计了显示多个物种间保守性的引物，并且结合显示跨物种变异的针对探针的目标区域，确定和/或区分上述物种中的一个或多个是可能的。

在本发明的优选实施方案中，所述方法包括：

a、第一qRT-PCR反应，其中所述第一反应包括与皮肤癣菌ESTRP基因杂交的多个引物，其中第一反应(产物)使用序列非特异性双链DNA结合染料的熔融曲线分析进行评估，以及

b、第二qRT-PCR反应，其中所述第二反应包括与皮肤癣菌ESTRP基因杂交的多个引物，并且其中第二反应(产物)使用与该ESTRP基因杂交的一个或多个标记序列特异性探针的熔融曲线分析来评估。

将第一个PCR产物的熔融曲线分析与序列非特异性双链DNA结合染料，与第二个PCR结合使用熔融曲线分析，与一个或多个与ESTRP基因杂交的标记序列特异性探针以及选择性地在多位点反应中与其他DNA标记物杂交进行评估，提供覆盖范围广泛的皮肤癣菌，从而基本上能够检测任何给定的致病菌株。

在该方法的优选实施方案中，所述第二反应包括与所述ESTRP基因杂交的第一和第二标记序列特异性探针，其中

a、第一探针(锚定探针)的长度为15到40个核苷酸，并与皮肤癣菌属、表皮藻属和小孢子虫属和/或属种内的皮肤癣菌种的ESTRP基因序列保守区域的核苷酸差异为3个或更少，优选为2个或更少，ESTRP基因的核苷酸的差异在南尼兹菌属(优选为石膏样奈尼兹皮真菌、黄褐奈尼兹皮真菌、弯曲奈尼兹皮真菌和桃色小孢子菌)，以及

b、第二个探针(物种特异性探针)长度为15到40个核苷酸，并在毛癣菌属的一个或多个物种之间具有足够的序列转移，与皮肤癣菌ESTRP基因序列杂交，表皮癣菌和小孢子虫(优选犬小孢子菌和铁锈色小孢子菌)和/或南尼兹菌属的物种(优选石膏样奈尼兹皮真菌,黄褐奈尼兹皮真菌,弯曲奈尼兹皮真菌和桃色小孢子菌)，以便在对一个或多个所述皮肤癣菌物种和/或属的所述第二个探针的熔融曲线分析中实现独特的熔化温度，第二个探针在ESTRP基因上彼此杂交，并且在物理上接近时包含使荧光共振能量转移(FRET)的标签。

根据本发明，“序列特异性探针”或“物种探针”优选地(但不一定是)仅对待识别的一种物种唯一。在某些情况下，“物种探针”可能与两个或两个以上物种的目标序列潜在的结合，并在相似的温度下显示与所述目标序列的分离。

由上述a、b和c的探针结合的ESTRP基因区域的定义可以从结构和功能方面考虑，对于技术人员来说，足以识别能够实现本方法的ESTRP基因区域。技术人员已知用于确定ESTRP编码区域的不同区域之间的序列一致性、用于计算熔化温度以及确定锚与用于功能相互作用的物种特定探针之间的距离的方法，下文将更详细地描述这些方法。

在优选实施方案中，与ESTRP基因杂交的引物结合并扩增位于核苷酸1和250之间和/或核苷酸250和470之间和/或核苷酸470和768之间的ESTRP基因的区域，参考疣状毛癣菌株HKI 0517(序列号19)。这些区域使引物结合的序列保守性成为一种有益的组合，使来自多个皮肤癣菌的ESTRP基因序列能够扩增，并与不同熔化温度的可变内部区域相结合。

在优选实施方案中，用于第一反应的引物包括或由一个或多个序列组成，SEQ IDNO 1和/或2作为正向引物，SEQ ID NO 3和/或4作为反向引物。在其它实施方案中，功能相似的寡核苷酸可使用具有可变充分序列特性的寡核苷酸。

在优选实施方案中，用于第二反应的引物包括或包含一个或多个序列，所述序列为SEQ ID NO 5和/或6作为正向引物，SEQ ID NO 7和/或8作为反向引物。

在优选实施方案中，第二反应的一个或多个序列特异性探针结合到核苷酸70和110之间和/或核苷酸360和410之间的ESTRP基因的区域，该区域来自疣状毛癣菌HKI 0517(SEQ ID NO 19)。这些区域使引物结合的序列保守性成为一种有益的组合，使来自多个皮肤癣菌的ESTRP基因序列能够扩增，并与不同熔化温度的可变内部区域相结合。

在优选实施方案中，所述探针包括或包含根据作为锚定探针的SEQ ID NO 13和/或14以及作为物种特定探针的SEQ ID NO 15和/或16中的一个或多个序列。

在本发明的一个实施方案中，所述方法的特征在于，所述第一反应额外包含与皮肤癣菌内部转录间隔区1和/或2(ITS1和/或ITS2区域)杂交的引物。

在优选实施方案中，与ITS1和/或ITS2区域杂交的引物结合并放大核苷酸150和350之间的ITS1和/或ITS2的来自红色毛癣菌的区域(SEQ ID NO 27)。

在优选实施方案中，所述引物包括或包含根据作为前引物的SEQ ID NO 9和SEQID NO 10作为反向引物的序列。

在本发明的一个实施方案中，所述方法的特征在于，所述第二反应额外包含与皮肤癣菌翻译延伸因子1-a基因(EF-1-α基因)杂交的引物。

在本发明的一个实施方案中，与EF-1-α基因杂交的引物结合并放大核苷酸1和230之间的EF-1-α基因区域，参考红色毛癣菌的EF-1-α基因(SEQ ID NO 28)。

在本发明的一个实施方案中，所述引物包括或包含一个序列，所述序列根据作为前向引物的SEQ ID NO 11和作为反向引物的SEQ ID NO 12。

在本发明的一个实施方案中，所述一个或多个序列特异性探针用于第二反应并且结合到EF-1-alpha基因的区域，优选地，其中所述探针包含或包含根据作为锚定探针的SEQID NO 17和作为物种特异性探针的SEQ ID NO 18中的一个或多个序列。

本发明的这种多位点方法，询问ESTRP、其区域ITS和/或EF-1-α具有一个优点，即一个物种不是通过单个熔化温度来识别的，而是通过基于基因组中不同区域的多个熔化峰来识别的。因此，基本上排除了突变(种内变异性)引起的误认，因为在三个探针的结合位点，同一菌株中，这种突变极不可能同时发生。

关于本发明相对于现有技术的改进，除了现有技术测试系统中使用的靶基因的特异性有限之外，基于探针的系统的一个共同弱点是，当所选目标序列中发生突变或存在异常病原体时，它们容易产生假阴性，即无法通过使用的特定探头检测到。如本发明所提供的，可通过多轨迹分析将该问题最小化。

本发明的优选技术是有益的，因为它快速并且与低污染风险相关联。对结果的解释很简单，软件支持的熔融温度评估是可能的。对于物种识别，只需读取温度值。因此，在一些实施例中，本发明基于具有随后熔融曲线分析的qRT-PCR，通过选择足够可变以用于分化但在侧翼区域具有保守片段以用于引物设计和锚定探针定位的基因组片段而变得有益。

异质区是被需要的，是物种特异探针的结合位点，而保守区则是被称作锚定探针的结合位点。

在优选实施方案中，两个探针以这样的方式被荧光标记，使得如果它们彼此非常接近，则可以在它们之间发生荧光能量转移(FRET)。如果两个探针(锚定探针和物种特异性探针)都绑定在它们的目标序列上，那么就可以测量其波长取决于所选探针的荧光信号。如果温度逐渐升高，探针与DNA链之间的氢键被破坏，探针与靶DNA分离。因此，两个探针的近距离不再存在，也没有FRET信号。荧光信号的强度在温度升高过程中连续测量，信号强度记录为温度的函数。50％的探针分子从靶DNA中分离出来的温度通常被指定为熔化温度(Tm)。这个温度取决于探针的核苷酸序列，特别是探针是否与DNA上相应的结合位点100％互补。

例如，特定探针优选地与第一物种的目标序列具有100％的序列一致性，但是对于第二物种的目标序列存在多态性，即不匹配，并且对于潜在的第三物种，可能存在两个不匹配。因此，当第一种物质存在时，检测到的熔化温度最高，在每种情况下，当样品中存在第二种或第三种物质时，检测到的熔化温度较低，因为在后一种情况下，必须通过温度升高破坏较少的氢键。

病原体检测不仅可以通过荧光标记的探针进行，还可以通过插入双链DNA的染料，如SybrGreen或EvaGreen。这种分析不依赖于短探针和靶序列之间的分离，而是将较长的双链DNA片段(即SybrGreen与DNA结合，导致荧光信号可测量)分离成单链(即SybrGreen不再与DNA结合，无法测量信号)。这种变体具有成本效益，因为不需要荧光标记探针，而荧光标记探针通常需要很高的生产成本。

在优选实施方案中，本发明将一个或多个PCR反应与一个或多个荧光标记探针和一个或多个序列非特异性双链DNA结合染料结合。

在优选实施方案中，第一反应是确定临床样本中是否存在皮肤癣菌。优选地，该第一反应包含与皮肤癣菌ESTRP基因杂交的引物，其中第一反应(产物)使用序列非特异性双链DNA结合染料的熔融曲线分析进行评估。

同时，这种反应能够确定样品中的病原体是否为红色毛癣菌。这适用于大约90％的疑似皮肤癣菌病患者的临床样本(18-20，26)。

该第一反应优选仅基于EvaGreen染料或等效dsDNA结合染料。在第二个反应中，通常只需要对存在另一种皮肤癣菌的样品(通常约占所有可能样品的10％)进行进一步分析。

然后用荧光标记的探针进行第二个反应。

在优选实施方案中，使用三种不同的探针(优选选自SEQ ID NO 13-18)，20种致病性皮肤癣菌中的18种被区分。两个物种被检测为一个复合体。

在优选实施方案中，这三个探针中的两个位于新标记基因ESTRP中。第三探针优选靶向翻译延伸因子-1-α基因，该基因已被认为是区分皮肤癣菌和其他致病真菌的合适标记物(27)，但尚未用于商业皮肤癣菌诊断。

这两种技术(序列非特异性dsDNA结合染料和标记杂交探针)的结合，可以节省成本，进行物种特异性的皮肤癣菌检测或感染诊断，这在以前是不可能的。

本发明的另一方面涉及一种用于在怀疑含有一种或多种皮肤癣菌和/或其核酸的样品上进行核酸扩增反应的试剂盒，其中所述试剂包括(i)引物与ESTRP基因杂交，ESTRP基因和优选(ii)鉴定皮肤癣菌与其他区分的皮肤癣菌种，来自其他区分的皮肤癣菌种在特定熔化温度时，被指定一个或多个皮肤癣菌种给核酸扩增产物的反应的软件。

因此，本发明为可被诊断实验室和皮肤科诊所用于包括高质量皮肤癣菌诊断的测试系统或试剂盒。测试系统或试剂盒最好包含进行qRT-PCR和熔融曲线分析所需的所有PCR试剂，其设计应尽可能减少准备反应和评估的步骤。在优选实施方案中，存在只需将临床样本的DNA移到其中的现成PCR混合物，并且包含用于评估的软件，该软件自动提供发现或在进入所获得的熔化温度之后提供发现。

在优选实施方案中，本发明的工具箱另外包括：

a、一种或多种序列非特异性双链DNA结合染料

b、一种或多种与皮肤癣菌杂交的序列特异性探针ESTRP基因，优选根据序列号13-16的探针。

本发明的另一方面涉及长度为15至40个核苷酸的分离寡核苷酸，其包含或包含根据以下任一项的序列：

a、序号1-8，最好采用引物形式；或

b、序号13-16，最好是探针形式。

因此，本发明涵盖本文所述的特定引物和探针序列，其与上文关于本发明的方法详细描述的益处相关联。本发明的引物和探针也可以制备为一组寡核苷酸，包括本文所述的一个或多个寡核苷酸，尤其是上述关于本发明方法的功能组合中的寡核苷酸组。

本发明还涉及一种用于诊断皮肤癣菌感染的方法

(皮肤癣菌病)受试者，包括：

a、获取、提供和/或制备从怀疑患有上述感染的受试者身上获得的样本，

b、实施如本文所述的本发明的方法，和/或

c、确定导致上述感染的病原体。

在本发明的优选实施方案中，可通过本方法识别特定的皮肤癣菌病原体，并将其与其他潜在病原体区分开来。因此，对皮肤癣菌感染的诊断使我们能够就适当的治疗方案作出明智的决定，从而减少使用抗生素或抗真菌剂不足的不适当治疗，并加快受试者从所述感染中恢复。

在一些实施方案中，该方法包括将诊断传输到从其获得样本的对象。诊断可由负责的临床医生或进行分析的临床实验室传达给所述受试者。

本发明还涉及一种治疗皮肤癣菌感染的方法

(皮肤癣菌病)受试者，包括：

b、实施如本文所述的本发明的方法，

c、确定导致上述感染的病原体，以及

d、施用一种或多种适合于治疗所识别病原体的抗真菌剂。

具体实施方式

本发明涉及评估编码皮肤癣菌胞外富含丝氨酸/苏氨酸蛋白(ESTRP基因)的核酸在鉴定皮肤癣菌(优选区分不同的皮肤癣菌)中的应用的方法。本发明涉及分离的探针和寡核苷酸，还涉及相应的检测试剂盒。

根据本发明所述，术语“鉴定”涉及样品中存在的一个或多个特定皮肤癣菌属或种的存在测定。术语将一种已识别的皮肤癣菌与其他皮肤癣菌种进行“区分”，涉及提供关于在样品中是否存在一个或多个特定属或种，以及在样本中不存在一个或多个特定属或种的信息，或涉及确定存在一个或多个已鉴定的皮肤癣菌属或种，而其他属或种不存在的可能性较高的情况。

编码皮肤癣菌胞外富含丝氨酸/苏氨酸蛋白(ESTRP基因)的核酸可由本领域技术人员使用在分子微生物学领域建立起的方法进行测定，例如，通过对真菌物种中编码核酸与SEQ ID NO 19-26的核酸序列的序列同源性和/或功能相似性的分析与鉴定，以及相应编码的蛋白质的功能的序列分析和鉴定。

术语“评估”扩增反应产物的产物，包括获取(interrogating)核酸扩增产物以确定其结构或功能，包括在优选实施例中通过核酸测序进行序列分析、熔融曲线分析，例如为了确定获得的核酸产物的Tm，通过凝胶电泳或其他本领域技术人员已知的方法进行分析。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”可以互换使用，并且还可以根据使用这些术语的上下文分别包括每个术语的复数形式。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可执行任何功能，以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段的编码区或非编码区、连锁分析确定的位点(多个位点)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA、核酶、小干扰RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸，质粒、载体、任何序列的分离DNA(A、B和Z结构)、PNA、锁定核酸(LNA)、TNA(苏阿糖核酸)、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。

“核酸扩增反应”一词是指任何包含酶反应的方法，它允许核酸扩增。本发明的一个优选实施例涉及聚合酶链反应(PCR)。另一优选实施例涉及实时PCR(RT-PCR)或定量RT-PCR(qRT-PCR)，因为它允许实时量化扩增的目标。术语“实时PCR”意指任何能够在发生时(即实时)监测正在进行的扩增反应的进展的扩增技术。因此，数据是在PCR反应的指数阶段收集的，而不是像传统PCR那样在终点收集。测量该反应的反应动力学，PCR的早期阶段比传统的PCR检测具有明显的优势。在实时PCR中，反应的特征是循环过程中及时地首先检测到目标扩增的时间点，而不是在一个固定的循环次数后目标的累积量。核酸目标的起始拷贝数越高，观察到的荧光的显著增加越快。也可以采用传统的PCR方法，并使用分离方法，如琼脂糖凝胶，在PCR反应的最后阶段或终点检测PCR扩增。对于qRT-PCR，由于定量是在反应过程中实时进行的，因此不需要对未知DNA样品进行PCR后处理。而之后的处理，例如通过熔化曲线分析也是可能的。此外，报告子荧光信号的增加与产生的放大器数量直接成正比。

虽然核酸扩增通常通过PCR或RT-PCR进行，但也存在其他方法。这种方法的非限制性实例包括定量聚合酶链反应(Q-PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、自持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)，环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、解旋酶依赖性等温DNA扩增(tHDA)、支链DNA(bDNA)、循环探针技术(CPT)、固相扩增(SPA)、滚圈扩增技术(RCA)、实时RCA、固相RCA、与分子锁式(padlock)探针耦合的RCA(MPP/RCA)、基于适配子的RCA(适配子RCA)、锚定的SDA、引物延伸预放大(PEP)、简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、序列非依赖单引物扩增(SISPA)，连接子接头PCR、核酸酶依赖性信号扩增(NDSA)、分枝扩增(RAM)、多重置换扩增(MDA)、实时RAM和全基因组扩增(WGA)。

当样品含有具有可检测量的目标核苷酸序列的核酸时，PCR循环参数可以是用于扩增引物靶向的核苷酸序列的任何合适的循环参数集。在一些实施例中，循环参数包括90至100℃范围内的变性温度、5至45秒范围内的变性时间、可随反应中使用的引物而变化的退火温度、可在45至75℃范围内的退火温度以及5至45秒的退火时间；以及延伸温度在60至75℃范围内，延伸时间在20至120秒范围内。PCR循环可包括通过例如在循环结束时检测反应混合物中的荧光水平来检测反应混合物中的扩增产物。循环次数可在18至45个循环之间，例如20至40个循环。在某些实施例中，循环数是从30个循环到45个循环，例如，从33个循环到38个循环，包括从35个循环到37个循环。为了获得扩增产物的熔融温度，PCR实施方案可包括PCR循环完成后的熔融曲线分析步骤。

“熔融曲线分析”是本领域技术人员已知的方法，是表征扩增子(核酸扩增反应产物)的既定方法。熔融曲线分析也可用作荧光技术的替代方案。熔融曲线分析是对双链DNA在加热过程中的解离特性的评估。随着温度的升高，双链开始解离，导致吸光度强度和增色性的增加。收集到的信息可用于推断序列的存在和一致性，例如单核苷酸多态性(SNP)。这是由于G-C碱基对之间有3个氢键，而A-T碱基对只有2个氢键。与A-T含量较高的DNA相比，具有较高G-C含量的DNA，无论是由于其来源还是如前所述，由于SNPs，其熔化温度将更高。熔融曲线分析，例如通过SYBR Green、其他双链特异性染料，的PCR产物的熔融曲线分析，或基于探针的熔融曲线分析已成为普遍现象。基于探针的技术对检测单核苷酸多态性(SNP)具有足够的敏感性，并能根据产生的解离模式区分纯合野生型、杂合子和纯合突变等位基因。有了更高分辨率的仪器和先进的染料，单碱基变体的扩增子熔融分析现在可以用几种商用仪器进行。例如：Applied Biosystems 7500Fast系统和7900HT快速实时PCR系统、爱达荷科技公司的LightScanner(一种基于板(plate)的高分辨率熔融设备)、Qiagen’s Rotor-Gene仪器和Roche’LightCycler 480仪器。

通常，在DNA或cDNA扩增过程中加入一种非特异性的染料。在两条DNA链的温度依赖性解离过程中，该非特异性染料被释放出来，可以在检测通道中被检测到。非特定染料的释放与DNA的稳定性和组成直接相关，并允许扫描未知样本中的序列变异。靶扩增体的单碱基变化通过它们改变的熔融特性来检测，该改变的熔融特性通过释放荧光双链DNA结合染料来监测。与已知样品相比，这些改变的熔融特性导致熔融曲线形状发生变化，并允许对未知样品进行表征。本发明的优选方法允许通过分析熔融曲线分析期间非特异性染料的释放来表征目标。由于非特异性染料发出的光与序列特异探针发出的光不同，因此荧光团的释放可用于分析目标的组成和识别引物二聚体。

本文描述了采用熔化曲线分析的附加方法，例如使用序列特定探针的实施方案。例如，本发明包含基于FRET的方法，其中一个或多个探针用多个荧光标签标记，例如两个探针(优选锚定探针和序列特定探针)每个具有不同的标签，在物理接近时(即与目标核酸序列结合时)相互作用，以提供FRET信号。在熔融曲线分析中，当温度升高时，探针将与其目标位置分离，从而破坏标签的FRET交互作用，从而导致信号降低。

在本发明的一些实施方案中，扩增产物的评估可包括熔融曲线分析，因此优选地包括获得使用本文所述方法执行的实时PCR反应产物的一个或多个熔化温度(Tm)值，或用于确定特定的Tm及FRET探针组合体。50％的探针分子从靶DNA中分离出来的温度通常被指定为熔化温度(Tm)。因此，所述方法可包括将所获得的Tm值与特定皮肤癣菌物种的一个或多个参考Tm范围进行比较，其中，当多个Tm值中的一个在针对皮肤癣菌物种的一个或多个参考Tm范围内时，确定所述皮肤癣菌物种存在于样本中。

在本发明的一些实施方案中，皮肤癣菌特异性引物配置为扩增编码皮肤癣菌ESTRP的核酸。在某些情况下，皮肤癣菌特异性核酸产物可通过具有不同的预期Tm范围来区分。因此，在某些情况下，皮肤癣菌特异性引物可配置为扩增具有不同预期Tm范围的皮肤癣菌特异性ESTRP核酸，这取决于产生ESTRP基因的物种。不同物种特定Tm范围的预期Tm范围可不同于0.1℃或更高、0.5℃或更高，例如，1℃或更高、2℃或更高、3℃或更高、4℃或更高、5℃或更高、6℃或更高、8℃或更高，包括10℃或更高，例如，在各个范围的中间值之间测量。

本文所使用的术语“引物”是指寡核苷酸，无论是在纯化的限制性消化物中自然产生还是人工合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时，即在核苷酸和诱导剂(例如DNA聚合酶)的存在下以及在适当的温度和PH下，其能够充当合成起始点。为了最大限度地提高放大效率，引物最好是单股的，但也可以是双股的。如果是双股，则在用于制备延伸产品之前，应首先对引物进行处理，使其分开。优选地，引物是寡核苷酸。引物必须足够长，以便在诱导剂存在下为延伸产物的合成提供引物。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含8到50个、优选12-30个、或15-40个或更多个核苷酸，尽管它可能包含较少的核苷酸。

术语“探针”涉及一种核酸寡核苷酸探针，其靶向(或结合或杂交)使用本文所述的扩增引物组合产生的PCR扩增产物(产物)的内部区域，包括在本发明中。一组PCR生成的核酸模板由上述一种或多种目标微生物制备而成。这些探针可用于实时PCR检测(如TaqMan探针、分子信标)。如本文所用，术语“探针”是指可与互补单链靶序列杂交以形成双链分子(杂交)的单链核酸序列。探针用一个或多个荧光标签或荧光团标记。所述探针寡核苷酸序列包括、包含或基本上由5-100个碱基组成，优选5-50、10-40、15-40、12-38、13-35、14至33或15至30碱基，更优选25-35碱基。探针的长度优选在15到40个核苷酸之间。

“荧光标签”或“荧光团”是一种荧光化合物，在光激发下能重新发光。在构建本发明的标记探针中用作标签的荧光团包括(但不声称是详尽的)罗丹明和衍生物，例如德克萨斯红、荧光素和衍生物，例如5-溴甲基荧光素、荧光素黄、IAEDANS、7-Me2N-香豆素-4-乙酸、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸，7-NH2-4CH3-香豆素-3-乙酸(AMCA)、单溴双马烯、芘三磺酸盐，如级联蓝，以及

单溴三甲基氨苯二甲酸，FAM，TET，CAL Fluor Gold 540，HEX，JOE，VIC，CAL FluorOrange 560，Cy3，NED，Quasar 570，Oyster 556，TMR，加州荧光红590，ROX，LC红610，CALFluor Red 610，德州红，LC红610，加州荧光红610，LC红640，加州荧光红635，Cy5，LC红670，类星体670，牡蛎645，LC红705，Cy5.5，BODIPY FL，俄勒冈绿488、罗丹明绿、俄勒冈绿514、加州金、BODIPY R6Gj、Yakima黄色、JOE、HEX、Cal橙色、BODIPY TMR-X、Quasar-570/Cy3、TAMRA、罗丹明红-X、Redmond红、BODIPY 581/591、Cy3.5、Cal红/德州红、BODIPY TR-X、BODIPY 630/665-X、Pulsar-650、Quasar-670/Cy5。

用于RT-PCR的FRET探针可以是但不限于：供体探针1(3&apos；荧光素)LC610、LC640、LC670、LC705、LC Fluro、

5和

5.5 3&apos；FAM；受体探针2(5&apos；end)：

青色500、

Fluo、德州红、

Red 610、

Red 640、

Red 670和ROX。

如本文所用，术语“杂交”是指两条互补的核酸链结合以形成双链分子(杂交)。在本发明中，术语结合可代替杂交。杂交不需要两条互补的核酸链之间完全的序列一致性，有些不匹配是可以接受的。核酸链仍然会杂交。然而，杂交强度取决于两条互补核酸链之间的序列一致性水平。

本发明还提供了一种用于筛选样品的实时PCR引物的方法。该方法可包括i)识别皮肤癣菌ESTRP基因的目标核苷酸序列，ii)生成设计用于扩增包含目标核苷酸序列的核酸产物的引物对，以及iii)使用所生成的引物对执行一个或多个实时PCR，以及任选地评估(a)包括目标核苷酸序列的阳性对照样品以获得一个或多个Tm值的一个或多个范围，从而产生一个或多个参考Tm范围，并且任选地评估(b)不包括目标核苷酸序列的阴性对照样品以获得Ct值范围，由此产生截止Ct值，其中所述一个或多个参考Tm范围和/或截止Ct值用于确定皮肤癣菌物种的样本中是否存在。

如本文所使用的，两个核酸序列上下文中的“序列标识”或“标识”指的是当在指定的比较窗口上进行最大对应时，两个序列中相同的特定残基百分比，如通过序列比较算法或目测来测量的。

如本文所用，“序列标识百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳对齐序列而确定的值，其中与参考序列(不包括添加或删除)相比，比较窗口中的多核苷酸序列可包括添加或删除(即间隙)，以优化两个序列的对齐。通过确定两个序列中相同核酸碱基或氨基酸残基出现的位置数来计算百分比，从而得出匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100得到序列一致性的百分比。

可采用任何合适的序列比对方法进行比较。因此，可以使用数学算法来确定任意两个序列之间的百分比一致性。这些数学算法的计算机实现可用于序列比较，以确定序列标识。此类实现包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从加利福尼亚州山景城Intelligenetics获得)；ALIGN程序(2.0版)以及威斯康星州遗传学软件包版本8中的GAP、BESTFIT、

FASTA和TFASTA(可从麦迪逊市科学大道575号Genetics ComputerGroup(GCG))获得，美国威斯康星州)。使用这些程序的路线可以使用默认参数执行。执行

分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获取。

如本文所用，“主体”是指任何动物，例如诸如狗、猫、鸟、牲畜等哺乳动物，并且包括人。

“在”或“之间”指的是在一个数字范围内的数字，意味着包括定义范围的上限和下限的值。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。任何与本文描述的方法和材料类似或等效的方法和材料也可用于本发明实施方案的实践或测试中。本文提及的所有出版物均以引用方式并入本文中，以披露和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。

应当理解，为了清楚起见，在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与本发明相关的实施方案的所有组合被本发明具体包含，并且在本文中公开，就像每个和每个组合是单独和明确地公开的一样。

本发明还涉及一种试剂盒，其包括适合实施本发明方法的一个或多个组件。例如，该试剂盒可包括用于存储、运输和/或使用本文所述的引物和/或探针进行PCR反应的任何其他合适的组件。试剂盒可含有合适的介质，例如水介质。合适的水介质包括但不限于水、缓冲溶液等。该缓冲液可以是用于储存引物和/或进行PCR反应的任何合适的缓冲液。缓冲液可具有任何合适的pH值，可由熟练人员进行评估和测定。适当的培养基可基本上不含降解核酸的酶和化合物，例如核酸酶。在一些实施方案中，该组合物基本上是无菌的。

在一些实施方案中，试剂盒包括但不限于核酸模板、引物、一个或多个聚合酶、核苷酸等，其适于执行PCR反应以扩增本文所述引物靶向的核苷酸序列。所述聚合酶可以是任何合适的聚合酶，包括但不限于耐热DNA聚合酶，例如Taq聚合酶及其变体(例如，商业上可买到的耐热DNA聚合酶变体)。在一些实施方案中，试剂盒包括核酸插层染料，例如荧光插层染料。荧光插层染料可以是用于实时PCR的任何合适的DNA插层染料，包括但不限于

Green、

9、

Chromofy^TM和

在一些实施方案中，试剂盒里特异性地包含核酸杂交试剂盒中的由引物扩增的核酸扩增序列。该探针可以是荧光杂交探针，其根据探针是否与具有潜在相互作用的FRET标记的另一个探针物理上接近的目标核酸杂交而改变其荧光特性。因此，在一些实施方案中，探针包括共价连接到探针核酸的荧光官能团(例如，荧光染料)。附着的荧光染料的激发和发射波长可以被适当地配置以促进两个探针的附着染料之间的可测量的、依赖于距离的相互作用。

在一些实施方案中，执行对照以确认来自经受细胞裂解和核酸提取过程的样本的适当PCR扩增。在某些实施方案中，所述对照包括将一定量的已知核酸添加到所述样品中，所述样品在处理以裂解细胞并从所述细胞中提取核酸之前，将所述已知核酸添加到所述样品中以确定是否存在皮肤癣菌，所述样品用于裂解细胞并释放细胞核酸，以及使用扩增已知核酸中包含的核苷酸序列的引物对样本进行实时PCR。

在一些实施方案中，本方法还包括生成报告，指示在受本文方法步骤影响的样本中存在或不存在一种或多种皮肤癣菌。报告可以任何适当的形式提供，包括但不限于：一张物理纸上的报告、计算机系统上用户界面可访问的数字形式的报告(例如，网页或电子邮件)、患者病历数据库中的条目，和/或非瞬态计算机可读数据存储介质(例如，闪存驱动器、硬盘驱动器、光盘(CD)等)上的数据文件。

本发明中使用的样品可以是任何合适的组织或气体/液体样品，优选地包括组织，或者含有组织的气体/液体，例如组织提取物或任何要检测皮肤癣菌存在的环境样品。组织可以从人或动物身上获得。在某些实施方案中，样品包括角质组织，例如指甲、皮肤、头发等。指甲样品可包括脚趾甲或指甲的部分。来自环境的样品可包括或从地面上的碎屑或收集物中获得，例如从室内或室外地板表面获得，样品可包括纺织品，例如衣服、地毯、窗帘、椅子或其他物品。

在一些实施方案中，样品包括0.01mg或更多、0.1mg或更多，包括0.5mg或更多、1mg或更多、2mg或更多、5mg或更多、10mg或更多、20mg或更多、50mg或更多，并且包括200mg或更多的相关样品，例如从一个或多个指甲和/或脚趾甲上剪下的指甲、身体任何部位的皮肤刮片，包括来自身体任何部位的头皮或头发。

在一些实施方案中，样品包括浓度为0.0001ng/pL或更高、0.001ng/pL或更高、0.01ng/pL或更高浓度的核酸(例如，0.05ng/pL或更高浓度、0.1ng/pL或更高浓度、1.0ng/pL或更高浓度、5.0ng/pL或更高浓度、10ng/pL或更高浓度的核酸，包括浓度为1000ng/pL的核酸，例如DNAng/pL或更高。

如下文所述，可制备样品用如下文所示的任何适合的方法以裂解细胞并将细胞内的核酸释放到溶液中。在一些实施方案中，样品包含用于溶解细胞、稳定样品中的核酸和/或进行PCR的合适缓冲液。

在某些实施方案中，本方法包括制备样本(例如指甲样本)，以通过本文所述的方法进行筛选。制备样品可包括用机械、热、化学和/或酶法处理样品，以溶解样品中的细胞和细胞室(例如，质膜、细胞壁、细胞核、线粒体等)，以将核酸(例如，DNA和/或RNA)释放到样品中。可使用任何适当的机械溶解细胞的方法。在一些实施方案中，机械溶解细胞包括(例如)均匀化、研磨、超声或冷冻样品。在某些方面实施方案，样品中的细胞可通过将样品置于搅拌器、珠子或超声波均质、用研钵和杵研磨、法式压力机等进行物理裂解。

可使用任何适当的化学溶解细胞的方法。在一些实施方案中，化学溶解方法包括碱解、洗涤剂溶解(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))、溶剂溶解(例如氯仿)等。在一个实施方案中，化学溶解细胞涉及使用离液剂，例如，离液盐。离液剂的非限制性实例包括异硫氰酸胍、氯化胍、尿素、硫脲、高氯酸锂、醋酸锂、碘化钠、苯酚和其他。

可以使用任何合适的酶解细胞的方法。在一些实施方案中，酶解方法包括用蛋白酶、脂肪酶、糖苷水解酶等对样品进行处理。在一些实施方案中，可通过将样品置于蛋白酶K、角蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌素、裂解酶、溶菌酶、胶原酶、纤维素酶、葡聚糖酶、几丁质酶、果胶酶，或淀粉酶等。

可使用任何适当的热裂解电池的方法。在一些实施方案中，将样品置于50℃或更高温度下，例如60℃或更高温度、70℃或更高温度、80℃或更高温度、90℃或更高温度、或95℃或更高温度，并经受100℃或更低温度，例如98℃或更低温度，包括95℃或更低温度，以溶解样品中的细胞。

本发明的方法可以部分地或在整个计算机中实现，使得方法步骤(例如，筛选、确定、分析、计算和/或类似的)全部或部分自动化。因此，本发明提供了与计算机实现的检测样品中的皮肤癣菌的方法相关的方法、计算机系统、设备、软件等。

例如，方法步骤，包括获得用于实时PCR的Ct值和/或Tm值、分析Ct值和/或Tm值、将Ct值和/或Tm值与截止值和/或参考值和/或范围进行比较、生成报告等，可以完全或部分地由计算机程序产品(软件可能包含在本发明的工具箱中)。获得的值可以电子方式存储在数据库中，并且可以通过编程计算机执行算法。数据库可以存储特定于皮肤癣菌的截止值和/或参考值和/或范围，并且数据库结构允许基于皮肤癣菌的识别标签检索截止值和/或参考值和/或范围。

本公开提供用于执行上述程序的系统，该系统通常包括：a)中央计算环境；b)操作地连接到计算环境以接收数据的输入设备，其中数据可以包括，例如，如上所述，从使用受试者样本的分析中获得的Ct和/或Tm值或其他信息；c)连接到计算环境的输出设备，用于向用户(例如医务人员)提供信息；以及d)由中央计算环境(例如，处理器)执行的算法，其中，算法基于输入设备接收到的数据执行，并且其中该算法分析输入数据以确定样本中是否存在皮肤癣菌感染。

因此，本方法可用于发现诊断患有感染的患者(例如，人类患者，受感染的折磨)的感染。因此，本发明的方法可以包括获取样本，例如指甲或其他皮肤样本，使用本文所述的分析方法确定样本中是否存在皮肤癣菌，以及(如果存在)皮肤癣菌的类型，优选地生成一份报告，该报告指示患者样本中是否存在一种或多种皮肤癣菌，并且可选地(如果存在的话)确定感染中存在的可能类型的皮肤癣菌，并且，任选地，基于分析结果指示用于治疗感染的建议疗法。

治疗方法：

皮肤癣菌是毛癣菌属、小孢子菌属、表皮癣菌属和南尼兹菌属的丝状真菌。皮肤癣菌以皮肤、头发和指甲中的角蛋白代谢和生存。皮肤癣菌感染在全世界都很常见，皮肤癣菌是皮肤、头发和指甲真菌感染的主要原因。这些感染导致多种临床表现，如足癣、体癣、股癣、马约基肉芽肿、头癣和手癣(皮肤癣甲真菌病)。头皮毛(头癣)、胡须毛(巴巴多斯癣)和指甲(甲癣)的皮肤癣菌感染是常见的，可以通过本发明进行诊断和/或治疗。

皮肤癣菌感染的主要临床亚型有：体癣-除脚、腹股沟、面部、头皮毛或胡须毛以外的体表感染，足癣-足部感染，股癣-腹股沟感染，头癣-头皮毛感染，手癣(皮肤癣甲真菌病)-指甲感染。

体癣、足癣、股癣、面部癣和手癣感染通常是浅表性的，只累及表皮。偶尔，皮肤癣菌感染会穿透毛囊和真皮，导致一种叫做马约基肉芽肿的疾病。头癣和巴巴多斯癣的特点是终端毛感染。

如果皮肤的皮肤癣菌感染被误诊，最初用抗生素和/或局部皮质类固醇治疗，感染的外观可能会改变，使诊断更加困难(例如，无名癣)。患者可出现红斑和鳞屑减少、边界不清、病情恶化或深层毛囊炎(马约基肉芽肿)。基于这些原因，本发明通过确定要治疗的病原体和适当的治疗方案，使得在随后的治疗方案中能够显著改进。

本发明的方法可以包括基于分析结果选择治疗，例如抗真菌药物。在一些实施方案中，本发明的方法可包括基于分析结果实施治疗，例如抗真菌药物。如果方法包括抗真菌治疗的选择和/或给药，则根据检测到的皮肤癣菌选择治疗。

局部或全身抗真菌药物具有抗真菌活性是有效的治疗方法。大多数浅表性皮肤的皮肤癣菌感染可以通过局部治疗来治疗，如唑类、烯丙胺类、环吡咯和甲苯磺酸。口服药物如特比萘芬、伊曲康唑、氟康唑和灰黄霉素可用于广泛或难治性疾病

皮肤感染和蔓延到毛囊或真皮的感染(如马约基肉芽肿)或涉及指甲。

在一些实施方案中，治疗包括施用药物化合物或组合物。可使用任何合适的方法施用适合于治疗这种感染的药物化合物或药物。该药物化合物可局部或全身(口服)施用。在一些实施方案中，药物化合物是口服和/或局部给药。一种用于治疗甲真菌病的口服药物组合物可包括但不限于伊曲康唑、氟康唑和/或特比萘芬。一种用于治疗甲真菌病的局部施用的药物化合物可包括但不限于咪康唑、他伐泊罗、埃夫那康唑或环吡咯。该医药化合物可以任何适当剂型施用，例如，作为片剂、液体、乳膏、乳状液等，并且可与任何适当的医药上可接受的载体一起施用。

抗真菌治疗还可包括但不限于局部用药，如咪康唑、特比萘芬、克霉唑、酮康唑或甲苯磺酸酯，最好每天两次，直到症状消失，通常在两到六周内。

本发明的优选序列：

根据本发明，另一方面系关于包含或包含SEQ ID NO 1-8(优选为引物形式)或SEQID NO 13-16(优选为探针形式)或包含SEQ ID NO 1-18的寡核苷酸。

因此，本发明涉及

a)寡核苷酸，由序列号1-18所述的序列组成，

b)a)的寡核苷酸，根据序列号1-18，在序列的5’和/或3’端包含0到5个核苷酸的添加或删除，

c)与a)或b)序列同源性大于70％、75％、80％、85％、90％或优选大于95％的寡核苷酸和/或

d)a)到c)互补序列的寡核苷酸。

引物或探针的寡核苷酸序列可能来自双链靶DNA的任一链。引物或探针可以由碱基A、G、C或T或其类似物组成，并且可以在一个或多个选择的核苷酸位置退化，以确保目标真菌物种的潜在所有菌株的DNA扩增。简并引物是指在序列中的错配位置上有多种可能性的引物，以允许对互补序列进行退火和对各种相关序列进行扩增。简并降低了引物的特异性，意味着错配机会更大，背景噪声增加。引物的特异性增加，意味着降低背景噪声的机会也越大。应仔细设计退化引物，以避免影响分析的灵敏度和/或特异性。肌苷是一种被修饰的碱基，可以与任何常规碱基(A，T，C或G)结合。肌苷是为了使寡核苷酸中的简并酶的数量最小化而使用的。

如本文所用术语“在序列的5’和/或’端添加或删除0到5个核苷酸意味着寡核苷酸或核酸可具有a)在其5’端的0、1、2、3、4或5个附加核苷酸和在其3’端删除的0、1、2、3、4或5个核苷酸或b)0、1、2、3、4或5个附加核苷酸，2，3，4或5个核苷酸在其5’端被删除，c)0，1，

5’端有2、3、4或5个附加核苷酸，3’端有0、1、2、3、4或5个附加核苷酸，或d)5’端删除0、1、2、3、4或5个核苷酸，3’端删除0、1、2、3、4或5个核苷酸。本文所述的引物和探针长度的微小变化可由熟练人员进行，无需过度努力。

在一个实施例中，本发明的方法的特征在于，所述一个或多个引物或探针包含与本文提供的序列(例如，70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96)具有70％、75％、80％、85％、82％、83％、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96，97，98，99％序列一致性。序列同源性在70％和99％之间的序列变体优选功能上类似，即尽管显示出DNA序列的差异，因此例如相同的序列，在引物/探针和靶之间可能发生较少或更多的不匹配，对能。根据本待检测的各种病原体表现出类似的Tm和/或结合特异性，因此在本发明的背景下保持引物/探针的功申请中提供的信息，本领域技术人员可以在无需创造性努力的情况下测试功能类似序列，例如在所述PCR或其它扩增方法的背景下测试Tm或杂交特性。

附图说明

下面的附图更详尽地描述了本发明。这些并不旨在限制本发明的范围，而是表示本发明的各个方面的优选实施例，以提供更详细的说明。

图1：通过扩增ESTRP基因评估致病性皮肤癣菌基因组DNA的工作流程和评估。Tm＝熔化温度。Tm1是由于ESTRP基因中的PCR产物熔化引起的，Tm2是由PCR产物在ITS区熔化所引起的。

图2：皮肤癣菌属的引物和探针结合位点的序列比对，它们在PCR2中的ESTRP基因内被识别，针对ESTRP基因的两个不同靶区(分别是A和B)，使用寡核苷酸序列SQD NO 5-8作为引物，SEQ ID NO 13-16作为探针。所有序列均按5'-3'方向给出。所示靶区序列的变化用星点表示。

图3：多重PCR 1中的熔化温度(Tm)。显示ESTRP(上)及ITS(下)结果。在79.9℃和80.4℃之间的Tm1和在87.0℃和87.5之间的Tm2获得了一个独特的Tm组合。1＝断发毛癣菌，2＝马毛癣菌，3＝指(趾)间毛癣菌，4＝须癣毛癣菌，5＝昆克努发癣菌，6＝意瑞奈斯发癣菌，8＝疣状毛癣菌，9＝红色毛癣菌，10＝紫色毛癣菌，11＝絮状表皮癣菌，12＝南尼兹菌种(nannizzia spp.)，13＝犬小孢子菌，14＝奥杜盎小孢子菌(M.audouinii)，15＝寄生植物种(Paraphyton spp.)，16＝鸟洛夫顿(lophonton gallinae)，17＝节皮菌种(Arthrodermaspp.)。

图4：各种生物体中ESTRP编码区域的DNA序列标识的矩阵示例(ESTRP基因序列先前可从NCBI数据库获得)。

图5：各种生物体中ESTRP编码区DNA序列特征的矩阵表示(对所述皮肤癣菌的每个ESTRP基因进行ESTRP基因测序，分别为断发毛癣菌1,马毛癣菌2,指(趾)间毛癣菌3,须癣毛癣菌4,昆克努发癣菌5,舍恩莱发癣菌6,猴类毛癣菌7,意瑞奈斯发癣菌8,同心圆毛癣菌9,本汉姆毛癣菌10,疣状毛癣菌11,红色毛癣菌12,苏丹毛癣菌13,紫色毛癣菌14,絮状表皮癣菌15,桃色小孢子菌16,石膏样奈尼兹皮真菌17,黄褐奈尼兹皮真菌18,弯曲奈尼兹皮真菌19,犬小孢子菌20,铁锈色小孢子菌21)。

图6：ESTRP基因编码区DNA序列的不同区域的矩阵表示。

图7：不同生物中ESTRP编码区DNA序列差异数的矩阵表示(对所述皮肤癣菌的每个ESTRP基因进行ESTRP基因测序，分别为断发毛癣菌1，马毛癣菌2，T.指(趾)间毛癣菌3，须癣毛癣菌4，昆克努发癣菌5，舍恩莱发癣菌6，猴类毛癣菌7，意瑞奈斯发癣菌8,同心圆毛癣菌9，本汉姆毛癣菌10，疣状毛癣菌11，红色毛癣菌12，苏丹毛癣菌13(苏丹毛癣菌13),紫色毛癣菌14，絮状表皮癣菌15，桃色小孢子菌16,石膏样奈尼兹皮真菌17，黄褐奈尼兹皮真菌18，弯曲奈尼兹皮真菌19，犬小孢子菌20，铁锈色小孢子菌21。

图8：指(趾)间毛癣菌、断发毛癣菌、马毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、红色毛癣菌、意瑞奈斯发癣菌和疣状毛癣菌的ESTRP基因序列比对(序列号19-26)。

实施例：

通过以下实施例进一步描述本发明。这些并不旨在限制本发明的范围，而是表示本发明的各个方面的优选实施例，以提供更详细的说明。

本发明采用了Broad Institute(Cambridge，USA)公布的一个断发毛癣菌株和一个马毛癣菌的基因组序列，以便筛选出适合作为诊断标记的替代目标基因，以区分系统发育上密切相关的皮肤癣菌物种。标记搜索的重点是采用定量实时PCR(qRT PCR)，最好结合熔融曲线分析。

在原型实验中，发明人能够证明皮肤癣菌特异性检测与EvaGreen能同时运行。可以检测到不同的皮肤癣菌物种，而选定的非皮肤癣菌物种(亮白曲霉(Aspergilluscandidus)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、杜氏假丝酵母(Candidadubliniensis)、金孢子霉(Chrysosporium articulatum)、尖孢镰刀菌(Fusariumorxysporum)、茄类镰刀菌(Fusarium solani)、短帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)在77^℃C Id没有产生信号或仅产生非特异性信号，发明者显示在第一反应中可以将常见种红色毛癣菌与其他种区分开来是可能的(PCR1；图3)。

ESTRP基因包括至少两个可变区域，负责开发第一个PCR(PCR 1；EvaGreen(或其他dsDNA结合染料)支持的红色毛癣菌、紫色毛癣菌树的鉴定以及叉指红豆杉和薄荷树之间的区分的物种群特异性引物的开发(图1和图3)。在第二次PCR(PCR 2)中，物种特异性FRET探针可用于探针辅助区分剩余的皮肤癣菌。

为了普遍检测皮肤癣菌，以及区分红色毛癣菌和紫色毛癣菌，在一些实施例中，在PCR1中另外使用ITS区域的一部分。在PCR 2中，在优选实施例中，使用翻译延伸因子1-α的基因区域进行物种区分。

在优选实施例中，通过将该方法构建为多重PCR(优选PCR 1中ITS区域和ESTRP的扩增，以及PCR 2中EF-1-α和ESTRP的扩增)，同时使用三种不同荧光染料(例如LC610、LC640和LC670)结合的三种探针，所有相关物种只能用两个PCR反应进行分析(图1)。

因此，第一反应的通用皮肤癣菌检测最好基于已知的ITS区域进行，因为该区域已经可以获得广泛的序列数据，即使是非常稀有的物种。这可以可靠地确保检测到所有致病性皮肤癣菌，而非非皮肤癣菌被检测。

红色毛癣菌的鉴定是通过红色毛癣菌和紫色毛癣菌的ESTRP基因的特异性扩增以及与紫色毛癣菌的明确区分间接进行的，该引物位于ITS区域，放大了所有皮肤癣菌的遗传物质(图1和图3)。

指(趾)间毛癣菌的区分是通过ESTRP基因中的一组特异性引物对来实现的，该基因扩增指(趾)间毛癣菌及其近缘物种。熔融曲线分析提供了叉指锥虫的特定峰值(图1和图3)。

实验步骤：

根据制造商的说明，使用QiaAmp DNA微型试剂盒(QIAGEN)提取基因组DNA，并进行以下修改：蛋白酶K消化过夜，加入缓冲液ATL后，将混合物在95℃下培养5分钟。DNA在45πAE缓冲液中洗脱。

以2π的DNA作为PCR1反应的模板，其中包含10个pi 2x HRM PCR主混合物(类型itHRM试剂盒(QIAGEN))，每个引物0.7pm(PCR1_for 1和PCR1_rev1，PCR1_for 2和PCR1_rev2，PCR1_for 3和PCR1_rev3)，每个PCR反应的总体积为20pi。

引物PCR1_for 3和PCR1_rev3可扩增任何皮肤癣菌种核糖体DNA的一部分ITS(内部转录间隔区)区域。另外两对引物扩增了ESTRP基因的两个不同区域，扩增出两种复合物。PCR1_for1和PCR1_rev1特异性结合断发毛癣菌，马毛癣菌，指(趾)间毛癣菌和须癣毛癣菌。PCR1′for 2和PCR1′rev2特异性扩增红色毛癣菌、T.Soudanese和紫色毛癣菌树。

使用

480(ROCHE)进行高分辨率熔融分析，参数如下。在95℃下·初始变性5分钟，然后进行40个放大循环，95℃持续15秒，60℃持续40秒。熔点检测的温度曲线为95℃，持续1分钟，40℃持续1分钟，然后以0.02℃/s(每秒25次采集)的速度连续采集荧光数据。对于熔点检测，软件LightCycler R 480软件(版本1.50SP4)(罗氏)。用同一软件通过“Cp拟合点法”评估初始PCR扩增的成功率。

表A用于PCR1的引物序列。

name	Sequence 5′-3’	SEQ ID NO	target
				PCR1_for1	ACTCCTCCAAACTACACCCAgCAA	1	ESTRP
PCR1_rev1	TgCCCTCAgCAAgAgTTgCAAT	3	ESTRP
				PCR1_for2	AgCTCTgATCTCACCggTgACgATAg	2	ESTRP
PCR1_rev2	gCTTggAgggCTggggAgT	4	ESTRP
				PCR1_for3	gCgCYCgCCRgAggA	9	ITS
PCR1_rev3	CCggAACCAAgAgATCCgTTg	10	ITS

对于红色毛癣菌，将检测到两个熔化峰：80℃-80.3℃和Tm2在87.0℃-87.5℃。对紫色毛癣菌来说，Tm1＝80.8℃-81.3℃和Tm2＝86.9℃-87.4℃的组合。在这些情况下，完成分析。如果在79℃或更高温度下没有检测到熔化峰，则样品为阴性，分析完成。如果检测到79℃和81℃、5℃之间的熔化峰和/或低于88.8℃的第二个峰值，则样品为皮肤癣菌阳性，而不是红色毛癣菌或紫色毛癣菌。

在这些情况下，在以下条件下，使用物种特异性荧光共振能量转移(FRET)探针进行第二次PCR反应和HRM分析。用2π模板DNA和0.5U

DNA在20π反应体积内进行PCR聚合酶(Thermo Scientific^TM)，1x缓冲器I(Thermo Scientific^TM)0.2mM dNTP混合物(BIOZYM)，0.12pg BSA(NEB)，每个0.4μm的引物PCR2_for1，PCR2_for2，PCR2_for3，每个探针各0.2pm的引物PCR2_rev1、PCR2_rev2、PCR2_rev3和0.13pm(表B)。循环条件为95℃持续4分钟，然后在95℃下进行45次循环，持续10秒，56℃20秒和72℃持续20秒。

熔点检测在95℃下持续1分钟，40℃持续1分钟，然后以0.02℃/s的速度进行连续荧光数据采集。对于熔点检测，使用软件LightCycler R 480软件(版本1)选择“Tm调用”和“HybProbe格式”功能。1.5.0SP4)(罗氏)。

三种标记探针中的至少一种可获得独特的熔化峰，分别为断发毛癣菌、马毛癣菌、指(趾)间毛癣菌、须癣毛癣菌、猴类毛癣菌、意瑞奈斯发癣菌、本汉姆毛癣菌、同心圆毛癣菌、疣状毛癣菌、红色毛癣菌、紫色毛癣菌、状表皮癣菌、犬小孢子菌、奥杜盎小孢子菌、铁锈色小孢子菌、石膏样奈尼兹皮真菌、黄褐奈尼兹皮真菌、弯曲奈尼兹皮真菌、桃色小孢子菌、昆克努发癣菌、含恩莱发癣菌将被检测为物种复合体。

表B用于PCR2的引物和探针序列

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序列表

<110> 柏林夏里特医学院(CHARITé - UNIVERSITAETSMEDIZIN BERLIN)

<120> 鉴定皮肤癣菌的方法

<130> 20I0548PCN

<150> EP18157464.1

<151> 2018-02-19

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

actcctccaa actacaccca gcaa 24

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)

<400> 2

agctctgatc tcaccggtga cgatag 26

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

tgccctcagc aagagttgca at 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

gcttggaggg ctggggagt 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

tcactctcgt cgttgctgcc 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

cctayggcct cctgatcgt 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

ggcagccgtg gaggagca 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

tggtggactt tggtggct 18

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

gcgcycgccr gagga 15

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

ccggaaccaa gagatccgtt g 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

cacattaact tggtcgtyat cggc 24

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

gaacttctca atggtacg 18

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

gccrccgtct ctgccgtcac tcctccaaac ta 32

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

gagggcaccg gcgagtacca gtacagca 28

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 15

tccctgcctc cctctggcaa cccaa 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 16

caaattcggc gtcaagaacg agggcc 26

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 17

cgataccacc gcacttgtag atcaagtgac c 31

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 18

gtaatgttat agtcagtttc tgtgtaattc ggt 33

<210> 19

<211> 768

<212> DNA

<213> 疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)

<400> 19

atgaaggtca ctctcgtcgt tgctgccctc gcggccgccg tctctgccgt cactcctcca 60

aactactccc tgcctccctc tggcaacccc atcggcaccc caggcctcca cgagaaggtc 120

cctgtcgaca agccctacgc catcacctgg caggcaacca ccgagagcca tgtctccatc 180

atgctcctcc acggctgccc caagaactgc aacccagttc aaactcttgc tgagaacatc 240

ccgaacaccg gcagcctctc ttggactcct agttctgacc tcaccggtga cgactcctac 300

ggcctcgtga tcgtcgtcga gggcaccggc cagtaccagt acagcaccaa cttcggcatc 360

gagaaccaca gccccaagcc acagccacca aagtccacca cgccagccga gaagcctacc 420

tggactcccc agccctccaa gccagtcacc cacatcgtcg aggcttcctc cagcactccc 480

gtcccctccg gcggcgtcat cactctcacc acctccatct gcccgccatc tgctaccact 540

tccactgtcc ccggcgtgcc ccagccaact ggcagcgcgc cagtccccgg cactcctcac 600

ccaaccggcg gcaaccctgg cccagctcca gctccatctg gctccggtgc tcccgtgcca 660

ccaccagcct cgaccaacac ccctccacca ttcaacaacg gtgccggccg cgtcggcgct 720

ggcttcggtg ccgctctcct cgttgtcgcc gctgcttttg ccatgtaa 768

<210> 20

<211> 762

<212> DNA

<213> 断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)

<400> 20

atgaagttca ctctcgtcgt tgctgccttc gcggccaccg tctctgccgt cactcctcca 60

aactacaccc agcaaccctc cggcaacccc atcactactc cgggcctcgg cgagcgcgtc 120

ccagtcggcc aggtcttcac catctcctgg aagccaacca cccagaagcc cgtctccatc 180

atgctcctcc acggctgccc ccagaactgc aacccaattg caactcttgc tgagggcatc 240

cccaactccg gctctctccc ttggactcct gaagctgatc tcgtcgatga taacgcctac 300

ggcctcctga tcgttgtcga gggcaccggc gagtaccagt acagcaccca attcggcgtc 360

aagaacgacg gccccaagcc acagccacca aagtccacca agccagccga gaagcctacc 420

tgggttcccc agccctccaa gccagtcacc cacatcatcg acaccgcctc cagcactccc 480

gtcccctcca gcggcgtcgt caccctcacc acctctgtct gcccaccatc tgccaccacc 540

gtccccggtg tgccccagcc aaccggcagc atgcccatcc ccggtactcc tcagccaact 600

ggcggcaacc cgggcccagc tccagctccg tctggcacca gtgctcccat gccaccacca 660

ggctcgacca acacccctcc accattcaac aacggtgccg gccgcgtcgg cgctggtctc 720

ggtgccgctt tcctcgttct cgccgctgct tttgccatgt aa 762

<210> 21

<211> 795

<212> DNA

<213> 马毛癣菌(Trichophyton equinum)

<400> 21

atgaagttca ctctcgtcgt tgctgccttc gcggccaccg tctctgccgt cactcctcca 60

aactacaccc agcaaccctc cggcaacccc atcactactc cgggcctcgg cgagcgcgtc 120

acagtcggcc aggtcttcac catctcctgg aagccaacca cccagaagcc cgtctccatc 180

atgctcctcc acggctgccc ccagaactgc aacccaattg caactcttgc tgagggcatc 240

cccaactccg gctctctccc ttggactcct gaagctgatc tcgtcgatga taacgcctac 300

ggcctcctga tcgttgtcga gggcaccggc gagtaccagt acagcaccca attcggcgtc 360

aagaacgacg gccccaagcc acagccacca aagtccacca agccagccga gaagcctacc 420

tgggttcccc agccctccaa gccagtcacc cacatcatcg acaccgcctc cagcactccc 480

gtcccctcca gcggcgtcgt caccctcacc acctccgtct gcccaccatc tgccaccacc 540

gtccccggtg tgccccagcc aaccggcagc atgcccatcc ccggtactcc tcagccaacc 600

ggcagcgtgc ccatccctgg cactcagcca actggcggca acccgggccc agctccagct 660

ccgtctggca ccagtgctcc catgccacca ccaggctcga ccaacacccc tccaccattc 720

aacaacggtg ccggccgcgt cggcgctggt ctcggtgccg ctttcctcgc tctcgccgct 780

gcttttgcca tgtaa 795

<210> 22

<211> 798

<212> DNA

<213> 指趾间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)

<400> 22

atgaagttca ctctcgtcgt tgctgccttc gcggccaccg tctctgccgt cactcctcca 60

aactacaccc agcaaccctc cggcaacccc atcactgctc cgggcctcgg cgagcgcgtc 120

ccagtcggcc aggtcttcac catctcctgg cagccaacca cccagaagcc cgtctccctc 180

atgctcctcc acggctgccc cctgaactgc aacccaattg caactcttgc tgagggcatc 240

ccaaactccg gctctctccc ttggactcct gaagctggtc tcgtcgatga tgacgcctac 300

ggcctcctga tcgttgtcga gggcaccggc gagtaccagt acagcaccaa attcggcgtc 360

aagaacgagg gccccaagcc acagccacca aagtccacca agccagccga gaagcctacc 420

tgggttcccc agccctccaa gccagtcacc cacatcatcg acaccgcctc cagcactccc 480

gtcccctcca gcggcgtcgt caccctcacc acctccgtct gcccaccatc tgccaccaca 540

gtccccggtg tgccccagcc aaccggcagc atgcccatcc ccggtactcc tcagccaacc 600

ggcagcgtgc ccatccctgg cactcctcag ccaactggcg gcaacccggg cccagctcca 660

gctccatctg gcaccactgc tcccatgcca ccaccaggct cgaccaacac ccctccacca 720

ttcaacaacg gtgccggccg cgtcggcgct ggtctcggtg ccgctttcct cgttctcgcc 780

gctgcttttg ccatgtaa 798

<210> 23

<211> 768

<212> DNA

<213> 本汉姆毛癣菌(Trichophyton benhamiae)

<400> 23

atgaaggtca ctctcgtcgt tgctgccctc gcggccgccg tctctgccgt cactcctcca 60

aactactccc agcctccctc cggcaacccc atcggcaccc caggcctcca cgagaaggtc 120

cctgtcggcc agccctacac catcacctgg caggcaacca ccgagagcca tgtctccatc 180

atgctcctcc acggctgccc caagaactgc aacccagttc aaactcttgc tgagaacatc 240

ccgaactccg gcagcctctc ttggactccc aagtccgacc tcaccggtga cgactcctac 300

ggcctcatga tcgtcgtcga gggcaccggc cagtaccagt acagcaccaa cttcggcatc 360

gagaaccaca gccccaagcc acagccacca aagtccacca cgccagtcga gaagcctacc 420

tggactcccc agccctccaa gccagtcacc cacatcgtcg agacttcctc cagcactccc 480

gtcccctccg gcggcgtcat cactctcacc acctccatct gcccgccatc tgctaccact 540

tccactgtcc ccggcgtgcc ccagccaact ggcagcgcgc cagtacccgg cactcctcac 600

ccaaccggcg gcaaccctgg accagctcca gctccatctg gctccggtgc tcccgtgcca 660

ccaccagcct cgaccaacac ccctccacca ttcaacaacg gtgccggccg cgttggcgct 720

ggtttcggtg ccgctctcct cgttgtcgcc gctgcttttg ccatgtaa 768

<210> 24

<211> 759

<212> DNA

<213> 红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)

<400> 24

atgaagctca ctctcgtcgt tgctgccctc gcggccgccg tctctgccgt cactcctcca 60

aactacagcc agtctccctc cggcaacccc atcgcttccc cgggcctcca cgagcgcgtc 120

cctgtcagca agccctacac catcacctgg caggcaacca cctcgagcca cgtctccatc 180

atgctcctcc acggctgccc caagaactgc gaaccagttg caacgcttgc ggagaacatc 240

cccaactccg gccaccactc ctggactcct agctctgatc tcaccggtga cgatagctac 300

ggcctcatga ttgtcgtcga gggcaccggc cagtaccagt acagcaccaa cttcggcatc 360

gagaaccaca gccccaagcc acagccacca aagtccacca cgccagccga gaagcctacc 420

tggactcccc agccctccaa gccagtcacc catatcatcg agacctccag cactcccgtc 480

ccctccggcg gcgtcatcac tctcaccacc tccatctgcc ctccatccgg caccgccgtc 540

cccggtgtgc cccatccaac cggcagcgtg cctgtccccg gcactcctca cccaaccggc 600

ggcaacccag gcccagctcc agctccatct ggctctggtg ctcccatgcc accaccagcc 660

tcgaccaaca cccctccacc attcaacaac ggtgccggcc gcgtcggcgc tggtctcggt 720

gccgctctcc tcgttgtcgc cgctgctttt gccatgtaa 759

<210> 25

<211> 759

<212> DNA

<213> 苏丹毛癣菌(Trichophyton soudanense)

<400> 25

atgaagctca ctctcgtcgt tgctgccctc gcggccgccg tctctgccgt cactcctcca 60

aactacagcc agtctccctc cggcaacccc atcgcttccc cgggcctcca cgagcgcgtc 120

cctgtcagca agccctacac catcacctgg caggcaacca cctcgagcca cgtctccatc 180

atgctcctcc acggctgccc caagaactgc gaaccagttg caacgcttgc ggagaacatc 240

cccaactccg gccaccactc ctggactcct agctctgatc tcaccggtga cgatagctac 300

ggcctcatga ttgtcgtcga gggcaccggc cagtaccagt acagcaccaa cttcggcatc 360

gagaaccaca gcccccagcc acagccacca aagtccacca cgccagccga gaagcctacc 420

tggactcccc agccctccaa gccagtcacc catatcatcg agacctccag cactcccgtc 480

ccctccggcg gcgtcatcac tctcaccacc tccatctgcc ctccatccgg caccgccgtc 540

cccggtgtgc cccatccaac cggcagcgtg cctgtccccg gcactcctca cccaaccggc 600

ggcaacccag gcccagctcc agctccatct ggctctggtg ctcccatgcc accaccagcc 660

tcgaccaaca cccctccacc attcaacaac ggtgccggcc gcgtcggcgc tggtctcggt 720

gccgctctcc tcgttgtcgc cgctgctttt gccatgtaa 759

<210> 26

<211> 759

<212> DNA

<213> 紫色毛癣菌( Trichophyton violaceum)

<400> 26

atgaagctca ctctcgtcgt tgctgccctc gcggccgccg tctctgccgt cactcctcca 60

aactacagcc agtctccctc cggcaacccc atcgcttccc cgggcctcca cgagcgcgtc 120

cctgtcagca agccctacac catcacctgg caggcaacca cctcgagcca cgtctccatc 180

atgctcctcc acggctgccc caagaactgc gaaccagttg caacgcttgc ggagaacatc 240

cccaactccg gccaccactc ctggactcct agctctgatc tcaccggtga cgatagctac 300

ggcctcatga ttgtcgtcga gggcaccggc cagtaccagt acagcaccaa tttcggcatc 360

gagaaccaca gccccaagcc acagccacca aagtccacca cgccagccga gaagcctacc 420

tggactcccc agccctccaa gccagtcacc catatcatcg agacctccag cactcccgtc 480

ccctccggcg gcgtcatcac tctcaccacc tccatctgcc ctccatccgg caccgccgtc 540

cccggtgtgc cccatccaac cggcagcgtg cctgtccccg gcactcctca cccaaccggc 600

ggcaacccag gcccagctcc agctccatct ggctctggtg ctcccatgcc accaccagcc 660

tcgaccaaca cccctccacc attcaacaac ggtgccggcc gcgtcggcgc tggtctcggt 720

gccgctctcc tcgttgtcgc cgctgctttt gccatgtaa 759

<210> 27

<211> 617

<212> DNA

<213> 红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)

<400> 27

atcattaacg cgcaggccgg aggctggccc cccacgatag ggaccgacgt tccatcaggg 60

gtgagcagac gtgcgccggc cgtacgcccc cattcttgtc tacctcaccc ggttgcctcg 120

gcgggccgcg ctccccctgc cagggagagc cgtccggcgg gccccttctg ggagcctcga 180

gccggaccgc gcccgccgga ggacagacac caagaaaaaa ttctctgaag agctgtcagt 240

ctgagcgttt agcaagcaca atcagttaaa actttcaaca acggatctct tggttccggc 300

atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt ccgtgaatca 360

tcgaatcttt gaacgcacat tgcgccctct ggcattccgg ggggcatgcc tgttcgagcg 420

tcatttcaac ccctcaagcc cggcttgtgt gatggacgac cgtccggccc ctcccttcgg 480

gggcgggacg cgcccgaaaa gcagtggcca ggccgcgatt ccggcttcct aggcgaatgg 540

gcagccaatt cagcgccctc aggaccggcc gccctggccc caatctttat atatatatat 600

atcttttcag gttgacc 617

<210> 28

<211> 737

<212> DNA

<213> 红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)

<400> 28

cacattaact tggtcgttat cggccacgtc gattccggca aatccaccac tactggtaag 60

ccagccacca gatacctcta gccaggcacc gaattacaca gaaactgact ataacattac 120

aggtcacttg atctacaagt gcggtggtat cgaccagcgt accattgaga agttcgagaa 180

ggtaaataac cccccttttt tgaccctgct gtctccgttc tgttgcacaa ttttccccct 240

tcatcccact acaggtgaaa ttttggtgct gctggtggga tgtggcttgg cactcgcttg 300

ggcagcaaaa tccacacccc accaacatca aacatgcagc catcgctcca ggcaacgatc 360

gagcctcatg tcatgtttgg gatttgcttt tttctaagga tcgatgctaa caaggtacct 420

gtaggaagcc gaagagttgg gcaagaagtc cttcaagtac gcttgggttc ttgacaagct 480

caaggccgag cgtgagcgtg gtatcaccat cgatatcgcc ctctggaagt tcgagacccc 540

caagtacaat gtcaccgtca ttggtatgtt tctttgcctt gttccctcat gtggttgtac 600

catatctaac gagagtagac gcccccggtc accgtgactt catcaagaac atgatcactg 660

gtacctccca ggctgactgc gctattctca tcattgctgc cggtactggt gagttcgagg 720

ctggtatctc caaggat 737

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 29

tcactctcgt cgctgctgcc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 30

tcactctcgt cgtcgctgcc 20

<210> 31

<211> 32

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 31

gccgtcgcct ctgccgtcac tcctccaaac ta 32

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 32

acccagcaac cctccggcaa cccca 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 33

tcccagcaac cctccggcaa cccca 25

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 34

gcccagcaac cctccggcaa cccca 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 35

agccaggatc cctccggcaa cccct 25

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 36

tcccagcctc cctccggcaa cccca 25

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 37

tccctgcctc cctctggcaa cccca 25

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 38

agccagtctc cctccggcaa cccca 25

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 39

tcccagtcgc catccggcaa cccca 25

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 40

tccaactctc catccggcaa cccca 25

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 41

tccaactcgc cctccggcaa cccca 25

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 42

cctacggcct cgtgatcgt 19

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 43

cctacggcct catgatcgt 19

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 44

gctacggcct catgattgt 19

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 45

gagggcaccg gccagtacca gtacagca 28

<210> 46

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 46

ccaattcggc gtcaagaacg agggcc 26

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 47

caacttcggc atcgagaaca acagcc 26

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 48

caacttcggc gtcgagaacc acagcc 26

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 49

caatttcggc atcgagaacc acagcc 26

Claims

1.一种用于识别一种或多种皮肤癣菌或其核酸的方法，包括对疑似含有一种或多种皮肤癣菌和/或其核酸的样品进行核酸扩增反应，其中所述反应包括与编码皮肤癣菌胞外富含丝氨酸/苏氨酸蛋白(ESTRP基因)的核酸分子杂交的多个引物，并评估所述扩增反应的产物。

2.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，对核酸扩增反应的产物的评估包括熔融曲线分析。

3.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，包括将识别的皮肤癣菌与其他皮肤癣菌种进行区分的步骤，其中独特的熔化温度分配给用于多重皮肤癣菌种中的一种或多种的核算扩增反应的产物。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增反应是一种定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，包括使用序列非特异性双链DNA结合染料，和/或一个或多个与ESTRP基因杂交的标记序列特异性探针进行的熔融曲线分析。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括确定毛癣菌属、表皮毛癣菌属、小孢子虫属和/或南尼兹亚属中的一个或多个种的存在和/或对所述一个或多个种进行区别。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述与ESTRP基因杂交的多个引物的特征在于：

a、所述多个引物结合的ESTRP基因序列在毛癣菌属,表皮癣菌属和小孢子菌属的属中的皮肤癣菌种，和/或南尼兹菌属属的种中显示出两个或更少的核苷酸差异(能够扩增所述种的任何一种或多种的ESTRP基因序列)，以及

b、由多个引物结合并经核酸扩增反应扩增的序列之间的ESTRP基因序列在毛癣菌属,

表皮癣菌属和小孢子菌属的属中的皮肤癣菌种中的一种或多种(优选为犬小孢子菌和铁锈色小孢子菌种)，和/或南尼兹菌属的属的种(优选石膏样奈尼兹皮真菌,黄褐奈尼兹皮真菌,弯曲奈尼兹皮真菌和桃色小孢子菌种)中的皮肤癣菌种中的一种或多种之间具有足够的序列转移，以使得能够对所述皮肤癣菌种和/或属中的一种或多种在熔融曲线分析中具有独特的熔化温度。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，包括：

a、第一qRT-PCR反应，其中所述第一反应包括与皮肤癣菌ESTRP基因杂交的多个引物，并且其中所述第一反应使用序列非特异性双链DNA结合染料的熔融曲线分析来评估，和

b、第二qRT-PCR反应，其中所述第二反应包含与皮肤癣菌ESTRP基因杂交的多个引物，并且其中所述第二反应使用熔融曲线分析来评估，所述熔融曲线分析使用与所述ESTRP基因杂交的一个或多个标记序列特异性探针。

9.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述第二反应包括与所述ESTRP基因杂交的第一和第二标记序列特异性探针，其中

a、所述第一探针(锚定探针)长度为15到40个核苷酸，并且与皮肤癣菌ESTRP基因的保守序列杂交并且与毛癣菌属,表皮癣菌属和小孢子菌属的属中的皮肤癣菌种，和/或南尼兹菌属属的种(优选石膏样奈尼兹皮真菌,黄褐奈尼兹皮真菌,弯曲奈尼兹皮真菌和桃色小孢子菌种)中的皮肤癣菌种中的ESTRP基因序列有两个或更少的核苷酸差异，和/或南尼兹菌属属(优选是石膏样奈尼兹皮真菌,黄褐奈尼兹皮真菌和弯曲奈尼兹皮真菌)，以及

b、所述第二探针(物种特异性探针)长度为15到40个核苷酸,并且与皮肤癣菌ESTRP基因的序列杂交，且在毛癣菌属,表皮癣菌属和小孢子菌属(优选为犬小孢子菌和铁锈色小孢子菌种)，和/或南尼兹菌属属的种(优选石膏样奈尼兹皮真菌,黄褐奈尼兹皮真菌,弯曲奈尼兹皮真菌和桃色小孢子菌种)中的种的一种或多种之间具有足够序列转移，以使得能够对所述皮肤癣菌种和/或属中的一种或多种的所述第二探针的熔融曲线分析中实现独特的熔化温度，以及

c、所述第一和第二探针在ESTRP基因上彼此邻近杂交，并且包含在物理接近时能够进行荧光共振能量转移(FRET)的标签。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，与所述ESTRP基因杂交的多个引物结合并扩增位于核苷酸1和250之间和/或核苷酸250和470之间和/或位于核苷酸470和768之间的ESTRP基因的区域，参考来自疣状毛癣菌株HKI 0517(SEQ ID NO 19)的ESTRP基因，

优选地，其中用于第一反应的多个引物包括以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO 1和/或2作为正向引物，SEQ ID NO 3和/或4作为反向引物中的一个或多个序列，

并且优选地，其中用于第二反应的多个引物包括以下序列或由以下序列组成：SEQ IDNO 5和/或6作为正向引物，以及SEQ ID NO 7和/或8作为反向引物中的一个或多个序列。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二反应的一个或多个序列特异性探针结合至核苷酸70和110之间和/或核苷酸360和410之间的ESTRP基因的区域，参考疣状毛癣菌株HKI 0517(SEQ ID NO 19)，

优选地，其中所述多个探针包含或由以下序列组成：SEQ ID 13和/或14作为锚定探针，以及SEQ ID NO 15和/或16作为物种特异性探针。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于：

a、第一反应包含额外的多个引物，所述额外的多个引物与皮肤癣菌内部转录间隔区1和/或2(ITS1和/或ITS2区域)杂交，

其中优选地，与ITS1和/或ITS2区域杂交的多个引物结合并扩增核苷酸150和350之间的ITS1和/或ITS2区域的区域，参考来自红色毛癣菌的ITS1和/或ITS2区域(SEQ ID NO27)，

优选地，其中所述多个引物包含或由以下序列组成：SEQ ID NO 9作为正向引物，和SEQID 10作为反向引物的序列，和/或

b、第二反应包含额外的多个引物，所述额外的多个引物与皮肤癣菌翻译延伸因子1-α基因(EF-1-α基因)杂交，

其中优选地，与EF-1-α基因杂交的多个引物结合并扩增核苷酸1和230之间的EF-1-α基因区域，参考来自红色毛癣菌的EF-1-α基因(SEQ ID NO 28)，

优选地，其中所述多个引物包含或由以下序列组成：SEQ ID NO 11作为正向引物，SEQID NO 12作为反向引物的序列，

其中，优选地一个或多个序列特异性探针优选地在第二反应中使用，并结合到EF-1-α基因的区域，其中优选地，所述探针包含或包由以下序列组成：SEQ ID NO 17作为锚定探针，和的SEQ ID NO 18作为物种特异性探针的序列。

13.用于识别一种或多种皮肤癣菌或其核酸的试剂盒，包含一种或多种用于对疑似含有一种或多种皮肤癣菌和/或其核酸的样品进行核酸扩增反应的一种或多种试剂，其中，所述试剂包括(i)与ESTRP基因杂交的多个引物和优选地(ii)用于根据分配给用于一种或多种皮肤癣菌种的核算扩增反应的产物的独特熔化温度来识别皮肤癣菌和/或将皮肤癣菌与其他皮肤癣菌种区分的软件。

14.如前述权利要求所述的试剂盒，还包括：

a、一种或多种序列非特异性双链DNA结合染料，和

b、一个或多个与皮肤癣菌ESTRP基因杂交的标记序列特异性探针，优选根据权利要求11所述的探针。

15.长度为15至40个核苷酸的分离寡核苷酸，包含或由以下任一项所述的序列组成：

a、SEQ ID NO 1-8，优选为引物形式；或

b、SEQ ID NO 13-16，优选为探针形式。