CN117625835A - 快速检测红色毛癣菌的系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了快速检测红色毛癣菌的系统，包括ERA扩增和LFS侧流条检测两个步骤，ERA扩增过程中所用的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；探针序列如SEQ ID NO.3所示。本发明实现了门诊患者随来随做、立等可取，扩增结果可及时指导抗真菌药物处方开具，有助于指导临床及时采取适当治疗方案，缩减患者诊疗过程。
Description
技术领域
本发明属于医学生物检测技术领域，涉及红色毛癣菌的快速检测，具体涉及一种快速检测红色毛癣菌的系统。
背景技术
皮肤癣菌是临床上常见的浅部真菌，可引起皮肤及其皮下角蛋白组织的感染，累及皮肤、指（趾）甲、毛发等。红色毛癣菌的菌落形态呈羊毛、绒毛、粉末状等，培养耗时较长，敏感性差，直接镜检结果阳性率低，缺乏特异性，对检验人员技术要求较高，导致难以满足临床快速诊断和及时治疗的需求。随着分子生物学的发展，基于核酸检测的PCR、qPCR等分子诊断技术已在临床上得到广泛应用，此类方法能够克服传统诊断方法的缺陷，实现较好的特异性和敏感性，显著缩短诊断时间，但成本高且依赖昂贵的仪器，在临床上尤其是资源贫乏地区很难得到推广应用。以上问题综合导致红色毛癣菌漏诊误诊率居高不下，精准治疗难以实施。因此，亟需开发一种既能快速诊断、又兼顾成本效益的早期诊断方法。
等温扩增由于不受仪器和实验室场景限制，在快速诊断领域方兴未艾。酶促恒温扩增(Enzymatic Recombinase Amplification, ERA)技术是近年兴起的恒温扩增技术，与传统PCR相比，其反应不再需要热循环装置，在恒温条件下即可实现DNA的快速扩增；与其他技术相比，ERA具有更好的特异性、灵敏度和操作便携性。其利用改造的DNA工具酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列并启动DNA合成，对模板上的目标基因进行指数式扩增，在37-40℃反应20 min即可获得大量的扩增产物。
ERA的扩增产物可以用凝胶电泳、荧光检测器和侧流条(lateral flow strip,LFS)进行检测。然而，在实验室外，凝胶电泳和荧光检测的灵敏度和可操作性有限，相反，LFS适用于简单直观的检测，且结果判读不依赖复杂的设备和检测人员的技术。LFS可视化取决于探针的5 '的异硫氰酸荧光素(FITC)标签和3 '端的C3阻滞位点以及反向引物的亲和(如生物素)标记。在探针中间，一个碱基被四氢呋喃(THF)取代，探针与扩增链的结合从内切酶IV(Nfo)的裂解开始，它释放出探针的3 '端进行延伸，并与反向引物一起扩增带有双重标记的扩增产物。LFS共轭垫上的金纳米粒子标记(AuNP标记)的抗FITC抗体可以与扩增产物结合，随后被涂有链霉亲和素的检测线捕获并聚集，表现为红色阳性信号。迄今，LFS被广泛应用于病原微生物的医学检验中。
发明内容
本发明旨在利用ERA-LFS技术，建立一种针对红色毛癣菌的快速检测技术，实现门诊患者随来随做、立等可取，扩增结果可及时指导抗真菌药物处方开具，缩减患者诊疗过程。
为了实现上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：
本发明第一方面，提供了一种红色毛癣菌ERA检测用探针引物组合物，具有如下技术特征：其上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。探针序列如SEQ ID NO.3所示，其中插入有四氢呋喃，优选第30位和第31位碱基之间插入设置四氢呋喃；此外，探针的5 '端设置FITC标签，3 '端设置C3阻滞位点。
探针引物组合物的具体序列如下：
上游引物，5’-CTGGCCCCCCACGATAGGGACCGACGTTCCATC-3’（SEQ ID NO.1）；
下游引物，5’-biotin-TGCTTGCTAAACGCTCAGACTGACAGCTCTTC-3’（SEQ ID NO.2）；
探针，FITC-CTCGAGCCGGACCGCGCCCGCCGGAGGACA-THF-ACACCAAGAA
AAAAT//-C3-spacer（SEQ ID NO.3）。
本发明第二方面，提供了一种红色毛癣菌ERA检测试剂盒，包含上述所述的探针引物组合物、溶解剂、扩增试剂、激活剂以及双蒸水。
其中，上游引物、下游引物以及探针均为粉末形式，使用时采用双蒸水进行溶解，浓度均为10 μmol/L。溶解剂、扩增试剂、激活剂均选用现有ERA检测试剂盒内产品。
本发明第三方面，提供了一种红色毛癣菌ERA-LFS检测系统，包括红色毛癣菌ERA检测试剂盒以及LFS侧流条。其中，红色毛癣菌ERA检测试剂盒如上所述，LFS侧流条的共轭垫上设置金纳米粒子标记的抗FITC抗体，检测线上涂有链霉亲和素。
本发明第四方面，提供了采用上述红色毛癣菌ERA-LFS检测系统对红色毛癣菌进行快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）ERA扩增
将20 μL溶解剂、2.1 μL上游引物、2.1 μL下游引物、0.6 μL探针、2 μL待测组织
的提取DNA作为模板DNA以及23.2 μL双蒸水混合后作为预混液；将预混液转移至含扩增试剂的反应管内，在反应管盖上加2 μL激活剂，混匀离心后，37℃反应20 min。其中，上游引物、下游引物、探针的浓度均为10 μmol/L。
（2）LFS侧流条检测
计算样本拷贝数，当处于预定范围（102~109拷贝/μL）内时，进行试纸条检测。
本发明的有益效果如下：
检测效率方面，本发明先进行ERA扩增然后进行LFS侧流条检测，ERA扩增检测时间为20min，LFS侧流条检测时间为几分钟，外加前期的组织DNA提取以及操作准备时间几分钟，全程30分钟内可以完成检测。相较于目前临床使用的传统PCR检测方法需要2~3小时才能完成检测，本发明实现了门诊患者随来随做、立等可取，扩增结果可及时指导抗真菌药物处方开具，有助于指导临床及时采取适当治疗方案，缩减患者诊疗过程。
检测条件方面，ERA扩增不再需要热循环装置，在37-40℃恒温条件下反应20min即可获得大量的扩增产物，采用水浴锅或其他能提供该恒温条件的装置即可实现检测，既降低了检测成本，又避免依赖昂贵的仪器，有助于在临床上尤其是资源贫乏地区推广应用，降低红色毛癣菌误诊率。
特异性方面，本发明检测系统仅能够对红色毛癣菌进行检测，对于常见皮肤病原菌，如其他皮肤癣菌、念珠菌、曲霉、隐球菌等均不发生检测反应。
灵敏度方面，在102-109拷贝/μL范围内的样品均能被检出，灵敏度优异。
附图说明
图1为特异性引物筛选结果，其中，（a）为红色毛藓菌、须癣毛癣菌以及部分犬小孢子菌的不同引物检测结果，M：100 bp marker，P1:F1/R1，2: F1/R2， 3: F1/R3，4: F2/R1，5: F2/R2，6: F3/R1，7: F3/R2，8: F3/R3，红毛：红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）；须癣：须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes）；犬小：犬小孢子菌（Microsporum canis）；（b）为犬小孢子菌的引物检测结果，P7: F3/R2，M：100 bp marker。
图2为灵敏度测试结果；1-9号分别代表红色毛癣菌DNA浓度为109-101拷贝/μL的样本，10号代表无模板空白对照（NTC）；
图3为引物特异性测试结果，图中各数字对应的菌株如下：
1-红色毛癣菌（Trichophyton rubrum），2-须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes），3-断发毛癣菌（Trichophyton tonsurans），4-紫色毛癣菌（Trichophyton violaceum），5-许兰毛癣菌（Trichophyton schoenleinii），6-铁锈色小孢子菌（Microsporum ferrugineum），7-疣状毛癣菌（Trichophyton verrucosum），8-絮状表皮癣菌（Epidermophyton floccosum），9-犬小孢子菌（Microsporum canis），10-赤星病菌（Alternaria alternata），11-球孢枝孢菌（Cladosporium sphaerospermum），12-茄病镰刀菌（Fusarium solani），13-土曲霉（Aspergillus terreus），14-无模板空白对照（NTC），15-烟曲霉（Aspergillus fumigatus），16-黑曲霉（Aspergillus niger），17-黄曲霉（Aspergillus flavus），18-白念珠菌（Candida albicans），19-热带念珠菌（Candida tropicalis），20-光滑念珠菌（Candida glabrata），21-近平滑念珠菌（Candida parapsilosis），22-克柔念珠菌（Candida krusei），23-格特隐球菌（Cryptococcus gattii），24-新生隐球菌新型变种（Cryptococcus neoformansvar. grubii），25-海洋红酵母（Rhodotorula mucilaginosa），26-大肠杆菌（Escherichia coli），27-表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），28-金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、引物设计
基于红色毛癣菌ITS1区域进行引物设计，在NCBI基因数据库中检索，使用premier5.0软件结合ERA引物设计原则，共获得3对引物，具体参见表1：
2、基因组DNA提取
采用天根植物DNA提取试剂盒，参照说明书进行提取。
3、引物筛选
在NCBI基因数据库对已经设计的候选引物进行初步验证，采用25 μL反应体系进行：10 μmol/L的ITS1基因上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL、dd H2O 8.5 μL、2×Taq PCR预混液12.5 μL。对以上引物进行排列组合，PCR后通过琼脂糖凝胶电泳进行筛选，结果如图1所示，其中F3/R1（6号）特异性最好。
1、质粒标准品构建
使用筛选获得的引物F3/R1以及Taq酶进行PCR（50 μL体系），扩增红色毛癣菌目的基因，使产物3’带“A”碱基；随后进行琼脂糖凝胶电泳，按照DNA marker指示大小初步估计为目的条带；最后，切取胶条带按照说明进行胶回收，超微量紫外分光光度测定浓度与纯度，备用。扩增产物与pEASY-T1克隆载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，均匀涂布于含有100 mg/L卡那霉素的固体LB培养基，37℃培养16-18h。筛选出阳性单克隆加入含卡那霉素的5 mL液体培养基，37℃培养，取2 mL菌液提取质粒，测序确认阳性转化子，命名为T1-ITS1（4164 bp，核酸序列如SEQ ID NO.8所示）。剩余菌液甘油保种，于-80℃保存备用。
2、灵敏度检测
构建含有目的基因的标准质粒，计算拷贝数。对质粒标准品进行倍比稀释，设置109-101几个梯度，进行ERA试验，并用LFS进行检测，测试ERA检测的灵敏度，具体步骤如下：
质粒标准品用紫外分光光度计测量浓度为121.4 ng/μL，T1-ITS1的碱基数为4164bp，每个碱基平均相对分子质量为660道尔顿，每微升样品中的拷贝数按照计算公式：样品拷贝数(拷贝/μL)＝(6.02×1023)×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(660×碱基数)，最终计算出的拷贝数为2.66×1010 拷贝/μL。
以上的标准品按照10倍倍比稀释，取浓度在109-101拷贝/μL的红色毛癣菌标准质粒为模板，参照ERA试剂盒的方法进行实验，红色毛癣菌特异性引物及探针序列见下表2。实验体系如下：20 μL溶解剂、2.1 μL F3、2.1 μL R1、0.6 μL probe、2 μL模板DNA、23.2 μLdd H2O，共48 μL体系。将48 μL预混液转移至含扩增试剂的反应管，在反应管盖上加上2 μL激活剂，混匀离心后，在水浴锅中37℃反应20 min。扩增完成后进行LFS侧流条检测。
检测结果如图2所示：当拷贝数为109-102 拷贝/μL时，试纸条的检测线均有明显条带，当拷贝数为101 拷贝/μL仅试纸条的质控线显色，检测线未见明显条带。
针对常见皮肤癣菌、念珠菌、曲霉、隐球菌等实验室已有的菌种，使用以上引物及体系进行ERA试验，并用LFS进行检测，测试ERA对红色毛癣菌的特异性。实验菌种如下表3所示
结果如图3所示，所有试纸条中，只有红色毛癣菌测试试纸条的检测线出现明显条带，其余菌种的测试试纸条仅质控线显色，检测线未见明显条带。
综合上述实验结果可知，本发明ERA-LFS检测系统与PCR检测系统（如图1）均可采用同样的引物实现红色毛癣菌的特异性检测，但本发明检测系统特异性、灵敏度以及时效性明显更具优势。
以上已对本发明创造的实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (5)
1.一种快速检测红色毛癣菌的系统，其特征在于，包括红色毛癣菌ERA检测试剂盒以及LFS侧流条，检测步骤如下：
（1）ERA扩增
将20 μL溶解剂、2.1 μL上游引物、2.1 μL下游引物、0.6 μL探针、2 μL模板DNA以及23.2 μL双蒸水混合后作为预混液；将预混液转移至含扩增试剂的反应管内，在反应管盖上加2 μL激活剂，混匀离心后，37℃反应20 min，
其中，所述模板DNA为待测组织的提取DNA，上游引物和下游引物的序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；探针序列如SEQ ID NO.3所示，
（2）LFS侧流条检测
计算样本拷贝数，当处于预定范围内时，进行试纸条检测。
2.根据权利要求1所述的快速检测红色毛癣菌的系统，其特征在于，上游引物、下游引物、探针的浓度均为10 μmol/L。
3.根据权利要求1所述的快速检测红色毛癣菌的系统，其特征在于，所述样本拷贝数的预定范围为102 ~109 拷贝/μL。
4.根据权利要求1所述的快速检测红色毛癣菌的系统，其特征在于，所述红色毛癣菌ERA检测试剂盒含有所述上游引物、下游引物以及探针；所述LFS侧流条的共轭垫上设置金纳米粒子标记的抗FITC抗体，检测线上涂有链霉亲和素。
5.根据权利要求4所述的快速检测红色毛癣菌的系统，其特征在于， 所述红色毛癣菌ERA检测试剂盒还包括溶解剂、扩增试剂、激活剂以及双蒸水。
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