CN105177156A - 人egfr基因突变检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人EGFR基因的多突变的检测方法，其包括在8个PCR反应管中分别混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、引物和探针；进行实时PCR，根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。另外，本发明还涉及可以用于该检测试剂盒的核酸组合等。

Description

人EGFR基因突变检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种人EGFR基因的多突变的检测试剂盒及检测方法。另外，本发明还涉及可以用于该检测试剂盒的核酸组合等。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)的突变与一些疾病(如，非小细胞肺癌)或其疗效存在弱关联，尽管无法用于直接判定相应疾病或其疗效，但是可以作为整个诊断的一小部分，将相应结果与其他检测结果综合判读，从而最终得出诊断结果。
EGFR的突变十分多，主要集中于其基因的第18、19、20和21号外显子，尤以19号外显子和21号外显子突变为主，新的突变也在不断被发现之中(如参见中国专利200680013839和201010100949等)，其中许多与疾病的关联性仍在研究之中。
尽管采用基因测序技术来检测这些突变是最直接的，但是出于成本考虑，目前也有一些基于PCR的检测技术来检测EGFR的突变，例如，中国专利200410103223号公开了检测表皮生长因子受体基因点突变方法，中国专利200610027918号公开了EGFR基因突变的快速检测，中国专利200610035604号公开了检测表皮生长因子受体基因位点突变的荧光定量PCR试剂盒，中国专利200810027672号公开了引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒，201010131040号公开了人表皮生长因子受体外显子19及21突变检测试剂盒，中国专利201010148299号公开了一种扩增人类EGFR基因的多重PCR引物及其设计方法，中国专利201010504423号公开了检测EGFR基因突变的试剂及其应用，中国专利201110020982号公开了表皮生长因子受体EGFR外显子突变定量检测试剂盒及方法，中国专利201110054629号公开了检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变和外显子21点突变的方法，中国专利2011100705149号公开了用于检测人类EGFR基因20号基因外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法，中国专利201210291816号公开了检测EGFR基因突变位点的试剂盒，中国专利201210334208号公开了检测EGFR基因突变的引物、探针及其试剂盒和使用方法，中国专利201310092075号公开了检测表皮生长因子受体19、21外显子突变的引物探针体系、方法及试剂盒。
然而，本发明人发现，上述基于PCR的检测技术要么检测的EGFR突变的种类不够多，要么检测的准确性不高，尤其是检测突变的引物也容易把野生型EGFR也扩增并检测出来，造成假阳性结果。由于在实际的检测工作中野生型EGFR的样品比例占绝大多数，如果无法避免假阳性结果出现，则该检测技术几乎无实际应用的前景。本发明人长期致力于单管多重PCR检测的研究工作，但是为了检测足够多的EGFR突变，最终跳出了单管多重PCR检测的框架(当然同一管中仍然有超过40个引物和探针)，采用不对称多重分组技术，在同一PCR轮次中判定大量EGFR突变的存在性，在灵敏检测的基础上保证了准确性(特异性)，尤其是避免了假阳性结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的人EGFR基因突变的检测方法，其能在尽量多重检测的基础上，特异性好，灵敏度高，结果判读方便。另外，本发明还提供可用于上述方法的检测试剂盒和核酸混合物等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了一种人EGFR基因突变的检测方法，其包括：
(1)在8个PCR反应管中分别混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、引物和探针，其中，每个反应管中包含的引物和探针的核苷酸序列分别如下表所示：
管编号 引物 探针
1 SEQ ID NOs:1-39 SEQ ID NO:70
2 SEQ ID NOs:40-42 SEQ ID NO:71
3 SEQ ID NOs:43-45 SEQ ID NO:72
4 SEQ ID NOs:46-52 SEQ ID NO:73
5 SEQ ID NOs:53-59 SEQ ID NO:74
6 SEQ ID NOs:60-62 SEQ ID NO:75
7 SEQ ID NOs:63-65 SEQ ID NO:76
8 SEQ ID NOs:66-67 SEQ ID NO:77
，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61和64所示的引物标记有淬灭基团；
(2)进行实时PCR，根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
在这8个PCR管之外，还可以包括其他PCR管，例如作为阴性对照管，其中用水取代核酸提取液；又如阳性对照管，其中用已知存在突变或野生型EGFR的样品取代核酸提取液。
在本文中，术语“编号”用以区分同类别的多个物体(即用以表示被赋予不同编号的物体之间是不相同的)并可用于指代和引用，而并非确定性的具体编号。具体编号可以以一一对应的方式用其他编号方式而被重新映射。
可以对核酸提取液进行直接检测，但是优选对样品进行处理后获得核酸提取液后再进行检测。所以，优选核酸提取液是提取样品中的核酸而获得的提取液，如是采用磁珠提取法提取的。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸吸附类物质的顺磁性颗粒，在低pH(如，pH值5～7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁性颗粒表面，在进行磁分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8～9)、低盐浓度的条件下可将核酸洗脱下来，由此富集了核酸(如靶核酸)的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异性吸附(如杂交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。这些处理过程对于本领域技术人员来说是熟知的，也可参见郑秀芬等，模板DNA磁珠提取法.中国法医学杂志，18(3)：107-108；中国专利200610030229.5、200710118802.2和201110105181.0等。
优选采用本发明人进一步优化的磁珠提取法，其对于提取人EGFR中的核酸，更为可靠，步骤也方便。优选的提取受试品中的核酸的过程是：向样品加入核酸萃取液(优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤(优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱(优选洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液(如，Tris-HCl))。
因此，优选在本发明的第一方面的方法中，核酸提取液是从样品中提取的，例如，其中提取是采用磁珠提取法提取的。即优选本发明的第一方面的方法包括提取样品中的核酸以获得核酸提取液的步骤。
在本文中，所检测的“样品”是潜在可能含有靶核酸的离体样品，如食品、血液、血液制品、尿液、唾液、医疗用品或药品等。本发明的方法优选不是诊断方法，如可用于公共卫生领域的血液样品检测(如，对群体血液样品检测，其群体百分比数据结果可供公共卫生机构人力和药物准备之用，也可供医疗保险机构预算之用，而非对患者进行诊断)。本发明的方法优选仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人的血液样品中的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中还是取样时不慎污染的，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况，尤其是许多EGFR基因的突变与疾病仅仅存在弱相关性，难以直接表征疾病。在本发明的具体实施方式中，样品是市售的标准品。
在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判读结果的优良指标。在本发明的第一方面的方法中，对于步骤(3)，其中一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值≤45，则这种靶核酸存在于样品中；一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值>45，则这种靶核酸不存在于样品中。这是我们经过长期大量试验摸索出来的经验，可靠性和重复性俱佳。因此在本发明的第一方面的方法中，也优选采用内对照。内对照包含内对照核酸、内对照引物和内对照探针。
优选在本发明的第一方面的方法中，内对照核酸、内对照引物和内对照探针的核苷酸序列如Genbank登录号NC_003287.2所示，内对照引物的核苷酸序列如SEQIDNOs:68-69所示，内对照探针的核苷酸序列如SEQIDNO:78所示，而且所述内对照探针标记有荧光基团和淬灭基团。
本发明人发现，如果提高探针的浓度，可以进一步提高本发明的第一方面的方法的检测灵敏度。所以，优选在本发明的第一方面的方法中，每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应管中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。另外，优选在本发明的第一方面的方法中，在步骤(1)中所述单个PCR反应管中还进一步混合有PCR反应所需的其他试剂，如盐。还优选了甘油浓度，用以延长PCR条件下酶活耐久力。在本发明的具体实施方式中，盐优选是Mg盐。本领域技术人员还可以容易地选择出其他pH缓冲剂(如磷酸缓冲液等)来调节到合适的pH，也可以容易地选择出其他可溶性盐(如KCl等)来调节离子强度。另外，还可以进一步混合有抗氧化剂(还原剂)、蛋白(酶)保护剂(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)。这些成分的选择对于本领域技术人员来说都是熟知的。
在本文中，核酸按照本领域所常用的表示方法表示，其序列如未特别指出，均为5’端到3’端方向。其中，探针上标记有荧光标记物。荧光标记物可以位于探针的5’端、内部和/或3’端，优选位于5’端和/或3’端。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其由为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链DNA。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。各种探针标记有相同或不同的荧光基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售的，如荧光基团可以采用FAMTM/GreenI、/JOE/HEX、NEDTM/TAMRATM/ROXTM/Texas和等产品，淬灭基团可以采用TAMRA、Eclipse和BHQ等产品。为了避免对野生型EGFR扩增的假阳性结果产生，本发明的核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61和64所示的引物(优选在3’端)标记有淬灭基团。
优选在本发明的第一方面的方法中，核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团是相同的，例如是FAM；也优选核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团与所述内对照探针的荧光基团(优选是VIC)是不同的。不同种探针(之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样能够同时或快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本发明的具体实施方式中，淬灭基团是相同的。
可以委托公司合成标记有荧光标记的探针。在本发明的具体实施方式中，其中采用的标记有不同检测波长的荧光标记的探针都是委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成的，纯度达到HPLC纯，不含杂带。优选在本发明的第一方面的方法中，各种探针标记有不同的荧光基团。在本发明的具体实施方式中，优选的荧光基团是FAM和VIC。
本领域技术人员能够根据引物及相应需要PCR扩增的核酸来设计PCR反应条件。对于本发明的检测中，为了平衡不同突变型的扩增条件，本发明人经过长期摸索，优化出的条件为：PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。在本发明的具体实施方式中，PCR反应优选先25℃保温5分钟并94℃变性2分钟，然后进行上述条件的45个循环。
优选在本发明的第一方面的方法中，当管编号为1、4或5的PCR反应管的检测结果为阳性时，包括进一步对核酸提取液检测的步骤。这样可以进一步确定多重检测中结果所指向的具体突变。对核酸提取液检测优选是进行实时PCR检测，例如，在如下表所示的条件发生时以如下表所示的引物和探针分别进行实时PCR检测：
在第二方面，本发明提供了用于检测人EGFR基因突变的试剂盒，其包括8个容器，其中，每个容器中包含的引物和探针的核苷酸序列分别如下表所示：
容器编号 引物 探针
1 SEQ ID NOs:1-39 SEQ ID NO:70
2 SEQ ID NOs:40-42 SEQ ID NO:71
3 SEQ ID NOs:43-45 SEQ ID NO:72
4 SEQ ID NOs:46-52 SEQ ID NO:73
5 SEQ ID NOs:53-59 SEQ ID NO:74
6 SEQ ID NOs:60-62 SEQ ID NO:75
7 SEQ ID NOs:63-65 SEQ ID NO:76
8 SEQ ID NOs:66-67 SEQ ID NO:77
，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61和64所示的引物标记有淬灭基团。
优选本发明第二方面的试剂盒还进一步包括DNA聚合酶和dNTP。
在试剂盒中，不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几种长期保存而不发生化学反应或者不干扰检测进行的试剂合并保存在相同的容器中(如上表同一容器编号的容器中的引物和探针)。容器可以是常规的用于装PCR、酶或核酸试剂的反应管。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第一方面所述方法进行操作。标签可以贴在上述反应管上，或者直接打印到上述反应管上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。
对于本发明第二方面的试剂盒，其中优选的各成分如本发明第一方面所述的那样优选。优选诸如，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应管中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。
也优选其中含有内对照核酸。优选在本发明第二方面的试剂盒中，每个容器还进一步包含内对照核酸、内对照引物和内对照探针。
进一步优选其中，内对照核酸、内对照引物和内对照探针的核苷酸序列如Genbank登录号NC_003287.2所示，内对照引物的核苷酸序列如SEQIDNOs:68-69所示，内对照探针的核苷酸序列如SEQIDNO:78所示，而且所述内对照探针标记有荧光基团和淬灭基团。
另外优选其中，核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团是相同的，优选是FAM；核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团与所述内对照探针的荧光基团(优选是VIC)是不同的。
另外，本发明第二方面的试剂盒还可以进一步包括磁珠提取法所需试剂，优选其中磁珠提取法所需试剂包括：
核酸萃取液，优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl)；
第一次洗涤所用的洗涤液，优选其包含高氯酸钠和乙醇；
第二次洗涤所用的洗涤液，优选其包含乙醇；和，
洗脱所用的洗脱液，优选其包含pH缓冲液(如，Tris-HCl)。
也优选本发明第二方面的试剂盒还包括进一步对核酸提取液检测的试剂容器，更加优选进行实时PCR检测的试剂容器，例如包括分别包含如下表所示的引物和探针的容器：
容器编号 引物 探针
A1 SEQ ID NOs:1和39 SEQ ID NO:70
A2 SEQ ID NOs:3和39 SEQ ID NO:70
A3 SEQ ID NOs:5和39 SEQ ID NO:70
A4 SEQ ID NOs:7和39 SEQ ID NO:70
A5 SEQ ID NOs:9和39 SEQ ID NO:70
A6 SEQ ID NOs:11和39 SEQ ID NO:70
A7 SEQ ID NOs:13和39 SEQ ID NO:70
A8 SEQ ID NOs:15和39 SEQ ID NO:70
A9 SEQ ID NOs:17和39 SEQ ID NO:70
A10 SEQ ID NOs:19和39 SEQ ID NO:70
A11 SEQ ID NOs:21和39 SEQ ID NO:70
A12 SEQ ID NOs:23和39 SEQ ID NO:70
A13 SEQ ID NOs:25和39 SEQ ID NO:70
A14 SEQ ID NOs:27和39 SEQ ID NO:70
A15 SEQ ID NOs:29和39 SEQ ID NO:70
A16 SEQ ID NOs:31和39 SEQ ID NO:70
A17 SEQ ID NOs:33和39 SEQ ID NO:70
A18 SEQ ID NOs:35和39 SEQ ID NO:70
A19 SEQ ID NOs:37和39 SEQ ID NO:70
A20 SEQ ID NOs:46和52 SEQ ID NO:73
A21 SEQ ID NOs:48和52 SEQ ID NO:73
A22 SEQ ID NOs:50和52 SEQ ID NO:73
A23 SEQ ID NOs:53和59 SEQ ID NO:74
A24 SEQ ID NOs:55和59 SEQ ID NO:74
A25 SEQ ID NOs:57和59 SEQ ID NO:74
。
在第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的试剂盒在制备用于人EGFR基因突变的检测方法的检测试剂产品中的应用。在本文中，检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很容易理解其中检测试剂盒的成分以及其中方法的流程。
优选地，本发明提供了本发明第二方面所述的试剂盒在制备用于本发明第一方面的方法的检测试剂产品中的应用。
在第四方面，本发明提供了互不干扰实时PCR的核酸混合物，其中核酸是如下组之任一：
组1：SEQIDNOs:1-39和70，任选进一步还有SEQIDNOs:68-69和78；
组2：SEQIDNOs:46-52和73，任选进一步还有SEQIDNOs:68-69和78；
组3：SEQIDNOs:53-59和74，任选进一步还有SEQIDNOs:68-69和78。
如无相反的指示，本发明第四方面的核酸混合物可以带有前述方面的特征或优选特征，例如，其中核苷酸序列如SEQIDNOs:70、73、74和78所示的探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、47、49、51、54、56和58所示的引物标记有淬灭基团。
又如，核苷酸序列如SEQIDNOs:70、73和74所示的探针标记有荧光基团是相同的，如FAM；核苷酸序列如SEQIDNOs:70、73和74所示的探针标记有荧光基团与核苷酸序列如SEQIDNO:78所示的探针标记有荧光基团是不同的。
该混合物可以用于本发明的第一方面的方法中，也可以用于制备本发明第二方面的试剂盒。例如，在第五方面，本发明提供了本发明第四方面的的核酸混合物在制备用于人EGFR基因突变的检测方法的检测试剂产品中的应用。
优选在本发明第五方面的应用中，所述用于人EGFR基因突变的检测方法的检测试剂产品是用于本发明第一方面的方法的检测试剂产品，例如本发明第二方面所述的试剂盒。
本发明的有益效果在于：能够在一轮PCR中仅用少量PCR管检测样品中是否存在多达数十种人EGFR突变基因，保证了的准确性、可靠性、特异性、灵敏度和重复性，尤其是能避免用突变引物误扩增野生型EGFR的加阳性结果的产生；而且使用目前常规的市售实时荧光PCR设备，无需改造，操作方便并节省成本，并且可以使用内对照监控，进一步控制假阴性。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1～3显示了检测包含2235-2249del15突变的样品(其中也含有野生型)的实时PCR的检测图谱，其中图1是1号管的图谱(扩增出突变和内对照两条曲线)，图2是5号管的图谱(仅有内对照一条扩增曲线)，图3是8号管的图谱(扩增出野生型和内对照两条曲线)，其他管的图谱类似于5号管(仅有内对照一条扩增曲线，未显示)。
图4～6显示了检测包含2156G>C突变的样品(其中也含有野生型)的实时PCR的检测图谱，其中图4是1号管的图谱(仅有内对照一条扩增曲线)，图5是5号管的图谱(扩增出突变和内对照两条曲线)，图6是8号管的图谱(扩增出野生型和内对照两条曲线)，其他管的图谱类似于1号管(仅有内对照一条扩增曲线，未显示)。
图7～9显示了检测不包含突变(仅含有野生型)的样品的实时PCR的检测图谱，其中图7是1号管的图谱(仅有内对照一条扩增曲线)，图8是5号管的图谱(仅有内对照一条扩增曲线)，图9是8号管的图谱(扩增出野生型和内对照两条曲线)，其他管的图谱类似于1和5号管(仅有内对照一条扩增曲线，未显示)，可见突变检测管的检测对野生型扩增取得了很好的控制。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社,北京,中国,2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1核酸的提取
含人EGFR野生型和突变基因的供试样品可购自国家卫生部临检中心，均为标准品，供核酸提取。
核酸的提取按照常规磁珠提取法进行提取，为了同时适应大量人EGFR基因突变型的核酸提取，改进如下：向1uL标准品加入90uL核酸萃取液(配方及终浓度为：异硫氰酸胍1.2M、乙二胺四乙酸钠(pH8.0)10mM、吐温-202％(W/W)、高氯酸钠1M、乙醇40％(V/V)、Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，然后加入10uLD-BeadsDNA磁珠悬浮液(50mg/mL，可购自北京艾比根生物技术有限公司)，振荡混合均匀后，套在磁架上施加磁场，弃去其中液体，然后加入200uL洗涤液A(配方及终浓度为：高氯酸钠1M、乙醇30％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液A，再加入200uL洗涤液B(配方及终浓度为：乙醇70％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液B，最后加入洗脱液(配方及终浓度为：Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，吸出并保留液体，即为核酸提取液。
实施例2人EGFR实时PCR测试
1，引物及探针序列和荧光标记
委托合成核苷酸序列如SEQIDNOs:1-69所示的引物和核苷酸序列如SEQIDNOs:70-78所示的探针。
在核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的5’端分别委托合成标记荧光标记FAM，并在3’端标记淬灭基团BHQ；在核苷酸序列如SEQIDNO:78所示的探针的5’端委托合成标记荧光标记VIC，并在3’端标记淬灭基团BHQ；在核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61、64所示的引物的3’端标记淬灭基团BHQ；其他核酸或部分并不进行标记。
2，PCR反应分组
共取8个PCR反应管，按下表分别包含相应的引物和探针：
3，PCR反应条件
PCR反应体系总体积为20μl，其中各组分的终浓度分别为：核酸提取液(100倍稀释)1uL，内对照核酸(其核苷酸序列如Genbank登录号NC_003287.2所示)含量为3.5×10-5ng/ml，每一种引物含量为15pmol/ml，每一种探针含量为8pmol/ml，Mg2+(MgCl2)浓度为3.75mmol/ml，dNTP浓度各为0.2mmol/ml，UNG酶含量为0.05U，2×PCRbuffer(可购自TaKaRa公司，pH8.3，无Mg2+)为10ul，TaqDNA聚合酶为2U，甘油15％(V/V)，余量为去离子水。
反应热循环条件如下：
25℃5分钟94℃2分钟
(94℃10秒55℃15秒65℃45秒)×45个循环
使用ABI7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM和VIC检测波长。
4，结果判断
基线和阈值设定为ABI7500荧光仪默认自动设定。如果各荧光FAM、VIC、NED、TexasRed或CY5)层Ct值大于45，则判定为相应的核酸(各种突变或野生型)检测阴性，如果小于等于45，则判定相应的核酸(各种突变或野生型)检测阳性。
示例性的检测结果如图1-9所示。以上测试用含不同突变和野生型EGFR的样品重复了2048次，结果均正确，表明本发明准确性和可靠性好。本发明的方法能够检测3.3×10-6ng/ml浓度的上述EGFR突变，而且在即使多达19重的同管检测中也没有发生互相干扰而出现假阴性的结果，尤其是突变检测中对野生型的控制良好，没有出现野生型EGFR假阳性的结果，达到了超敏的检测灵敏度。

Claims (17)

1.一种人EGFR基因突变的检测方法(优选是非诊断方法)，其包括：
(1)在8个PCR反应管中分别混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、引物和探针，其中，每个反应管中包含的引物和探针的核苷酸序列分别如下表所示：
管编号 引物 探针 1 SEQ ID NOs:1-39 SEQ ID NO:70 2 SEQ ID NOs:40-42 SEQ ID NO:71 3 SEQ ID NOs:43-45 SEQ ID NO:72 4 SEQ ID NOs:46-52 SEQ ID NO:73 5 SEQ ID NOs:53-59 SEQ ID NO:74 6 SEQ ID NOs:60-62 SEQ ID NO:75 7 SEQ ID NOs:63-65 SEQ ID NO:76 8 SEQ ID NOs:66-67 SEQ ID NO:77
，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61和64所示的引物标记有淬灭基团；
(2)进行实时PCR，根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。
2.权利要求1所述的方法，其中核酸提取液是从样品中提取的，优选其中提取是采用磁珠提取法提取的，更优选提取的过程是：向样品加入核酸萃取液(优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤(优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱(优选洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液(如，Tris-HCl))。
3.权利要求1所述的方法，其中每个反应管还进一步包含内对照核酸、内对照引物和内对照探针。
4.权利要求3所述的方法，其中内对照核酸、内对照引物和内对照探针的核苷酸序列如Genbank登录号NC_003287.2所示，内对照引物的核苷酸序列如SEQIDNOs:68-69所示，内对照探针的核苷酸序列如SEQIDNO:78所示，而且所述内对照探针标记有荧光基团和淬灭基团。
5.权利要求1或4所述的方法，其中核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团是相同的，优选是FAM；核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团与所述内对照探针的荧光基团(优选是VIC)是不同的。
6.权利要求1所述的方法，其中当管编号为1、4或5的PCR反应管的检测结果为阳性时，该方法包括进一步对核酸提取液检测的步骤，优选进行实时PCR检测，更优选在如下表所示的条件发生时以如下表所示的引物和探针分别进行实时PCR检测：
7.用于检测人EGFR基因突变的试剂盒，其包括8个容器，其中，每个容器中包含的引物和探针的核苷酸序列分别如下表所示：
容器编号 引物 探针 1 SEQ ID NOs:1-39 SEQ ID NO:70 2 SEQ ID NOs:40-42 SEQ ID NO:71 3 SEQ ID NOs:43-45 SEQ ID NO:72 4 SEQ ID NOs:46-52 SEQ ID NO:73 5 SEQ ID NOs:53-59 SEQ ID NO:74 6 SEQ ID NOs:60-62 SEQ ID NO:75 7 SEQ ID NOs:63-65 SEQ ID NO:76 8 SEQ ID NOs:66-67 SEQ ID NO:77
，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、41、44、47、49、51、54、56、58、61和64所示的引物标记有淬灭基团。
8.权利要求7所述的试剂盒，其中每个容器还进一步包含内对照核酸、内对照引物和内对照探针。
9.权利要求8所述的试剂盒，其中内对照核酸、内对照引物和内对照探针的核苷酸序列如Genbank登录号NC_003287.2所示，内对照引物的核苷酸序列如SEQIDNOs:68-69所示，内对照探针的核苷酸序列如SEQIDNO:78所示，而且所述内对照探针标记有荧光基团和淬灭基团。
10.权利要求7或9所述的试剂盒，其中核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团是相同的，优选是FAM；核苷酸序列如SEQIDNOs:70-77所示的探针的荧光基团与所述内对照探针的荧光基团(优选是VIC)是不同的。
11.权利要求7所述的试剂盒，其还进一步包括DNA聚合酶和dNTP。
12.权利要求7所述的试剂盒，其还进一步包括磁珠提取法所需试剂，优选其中磁珠提取法所需试剂包括：
核酸萃取液，优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl)；
第一次洗涤所用的洗涤液，优选其包含高氯酸钠和乙醇；
第二次洗涤所用的洗涤液，优选其包含乙醇；和，
洗脱所用的洗脱液，优选其包含pH缓冲液(如，Tris-HCl)。
13.权利要求7所述的试剂盒，其还包括进一步对核酸提取液检测的试剂容器，优选进行实时PCR检测的试剂容器，更优选包括分别包含如下表所示的引物和探针的容器：
容器编号 引物 探针 A1 SEQ ID NOs:1和39 SEQ ID NO:70
A2 SEQ ID NOs:3和39 SEQ ID NO:70 A3 SEQ ID NOs:5和39 SEQ ID NO:70 A4 SEQ ID NOs:7和39 SEQ ID NO:70 A5 SEQ ID NOs:9和39 SEQ ID NO:70 A6 SEQ ID NOs:11和39 SEQ ID NO:70 A7 SEQ ID NOs:13和39 SEQ ID NO:70 A8 SEQ ID NOs:15和39 SEQ ID NO:70 A9 SEQ ID NOs:17和39 SEQ ID NO:70 A10 SEQ ID NOs:19和39 SEQ ID NO:70 A11 SEQ ID NOs:21和39 SEQ ID NO:70 A12 SEQ ID NOs:23和39 SEQ ID NO:70 A13 SEQ ID NOs:25和39 SEQ ID NO:70 A14 SEQ ID NOs:27和39 SEQ ID NO:70 A15 SEQ ID NOs:29和39 SEQ ID NO:70 A16 SEQ ID NOs:31和39 SEQ ID NO:70 A17 SEQ ID NOs:33和39 SEQ ID NO:70 A18 SEQ ID NOs:35和39 SEQ ID NO:70 A19 SEQ ID NOs:37和39 SEQ ID NO:70 A20 SEQ ID NOs:46和52 SEQ ID NO:73 A21 SEQ ID NOs:48和52 SEQ ID NO:73 A22 SEQ ID NOs:50和52 SEQ ID NO:73 A23 SEQ ID NOs:53和59 SEQ ID NO:74
A24 SEQ ID NOs:55和59 SEQ ID NO:74 A25 SEQ ID NOs:57和59 SEQ ID NO:74
。
14.权利要求7～13之任一所述的试剂盒在制备用于人EGFR基因突变的检测方法的检测试剂产品(优选是用于权利要求1-6之任一所述的方法的检测试剂产品)中的应用。
15.互不干扰实时PCR的核酸混合物，其中核酸是如下组之任一：
组1：SEQIDNOs:1-39和70，任选进一步还有SEQIDNOs:68-69和78；
组2：SEQIDNOs:46-52和73，任选进一步还有SEQIDNOs:68-69和78；
组3：SEQIDNOs:53-59和74，任选进一步还有SEQIDNOs:68-69和78。
16.权利要求15所述的核酸混合物，其中核苷酸序列如SEQIDNOs:70、73、74和78所示的探针标记有荧光基团和淬灭基团，并且核苷酸序列如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、47、49、51、54、56和58所示的引物标记有淬灭基团。
17.权利要求15或16所述的核酸混合物在制备用于人EGFR基因突变的检测方法的检测试剂产品(优选是用于权利要求1-6之任一所述的方法的检测试剂产品，例如权利要求7～13之任一所述的试剂盒)中的应用。
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