CN102747157A - 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents
用于检测人类egfr基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于检测EGFR基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法。本发明的方法包括：（1）提供引物和探针；（2）检测样本的处理和DNA提取；（3）荧光定量PCR反应体系的成分；（4）待检测的EGFR突变基因的靶序列；（5）利用ARMS引物区分野生型和突变型基因，反应结果通过FAM和JOE的荧光强度来判断。本发明所提供的引物、探针及检测方法可同时检测EGFR基因上的29种突变，灵敏度高，特异性强，检测速度快，整个检测过程只需要60分钟。
Description
技术领域
本发明属于基因突变检测技术老年领域，特别涉及检测人类EGFR基因29种突变的引物、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
人类表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，具有酪氨酸激酶活性。它是HER/ErbB家族成员之一，因此又名HER1或ErbB1。EGFR与其配体结合后在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，在细胞内发出信号，经过细胞质中衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。当EGFR发生突变时，EGFR自身或其配体过表达，从而通过自分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增殖。此外，EGFR过度活化还可以启动多种蛋白水解酶和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，EGFR过表达者通常预后较差。
美国食品药品监督管理局于2003年5月批准了美国阿斯利康（Aotrazeneca）公司生产的小分子基因靶点药物吉非替尼（Gefitinib，也称为易瑞沙/Iressa）用于治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC），我国也与2005年2月批准了吉非替尼进入临床。吉非替尼是一种口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），它可以特异性地竞争结合癌细胞EGFR激酶功能区的ATP结合位点，通过抑制该酶的活性来抑制肿瘤的增长、增殖，却无明显的化疗副作用。美国哈佛医学院的研究人员Lynch等率先报道，肺癌细胞中有EGFR酪氨酸激酶基因编码区18~21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达80％以上。这种现象可能是由于EGFR突变使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些基团发生重构，增强了与ATP或其竞争性抑制剂吉非替尼的相互作用。因此，有EGFR基因突变的患者表现出对吉非替尼更好的治疗反应。研究表明，美国非小细胞肺癌患者中只有约10%有EGFR基因突变，然而在亚洲人中，约30%的非小细胞肺癌患者有EGFR基因突变。临床运用的结果表明，EGFR基因外显子18~21的突变（体细胞突变）是患者对此类靶向药物有效的必要前提，如果病人不携带有EGFR基因突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。
目前，针对EGFR基因突变的检测方法主要有直接测序法、传统的荧光定量PCR法和高分辨率熔解曲线法。直接测序法耗时长且灵敏度低，通常只用于科研，难以用于临床的检测。传统的荧光定量PCR法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易产生假阳性的检测结果。高分辨率熔解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院进行普及，而且此方法在检测缺失突变时，效果较差。因此，如何快速准确的检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变，就成为人们亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术检测能力的不足，本发明提供一种检测人类EGFR基因29种突变的引物、探针、试剂盒及检测方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种用于检测人类EGFR基因突变的引物及探针，包括下列5组引物和探针中的至少一组：
(1) 5’- ggtgacccttgtctctgtgttcttgtcc-3’ SEQ ID NO: 1
5’- gtgccgaacgcaccggatg -3’ SEQ ID NO: 2
5’- gtgccgaacgcaccggagtt -3’ SEQ ID NO: 3
5’- gccgaacgcaccggagga -3’ SEQ ID NO: 4
5’- FAM/ccttcaagatcctcaagagagcttggttggg/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 5
(2) 5’- gggcagcatgtggcaccatct-3’ SEQ ID NO: 6
5’- ccttgttggctttcggagatgtcttg -3’ SEQ ID NO: 7
5’- tccttgttggctttcggttccttg -3’ SEQ ID NO: 8
5’- tccttgttggctttcggagatattttg -3’ SEQ ID NO: 9
5’- ccttgttggctttcggagccttg -3’ SEQ ID NO: 10
5’- ccttgttggctttcggagattgct -3’ SEQ ID NO: 11
5’- tggctttcggagatgttggttcct -3’ SEQ ID NO: 12
5’- ccttgttggctttcggagattcctt -3’ SEQ ID NO: 13
5’- gttggctttcggagatggttccttg -3’ SEQ ID NO: 14
5’- FAM/tctcaccttctgggatccagagtccctatga/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 15
(3) 5’- cccgtatctcccttccctgattacctt -3’ SEQ ID NO: 16
5’- gcacacaccagttgagcaggtact -3’ SEQ ID NO: 17
5’- cctccaccgtgcagctcatcct -3’ SEQ ID NO: 18
5’- caggaagcctacgtgatggccct -3’ SEQ ID NO: 19
5’- cagcgtggccagcgtggac -3’ SEQ ID NO: 20
5’- tgatggccagcgtggacggt -3’ SEQ ID NO: 21
5’- agcgtggacaacccccaccac -3’ SEQ ID NO: 22
5’- FAM/cccttcggctgcctcctggactatgt/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 23
(4) 5’- cacagcagggtcttctctgtttca -3’ SEQ ID NO: 24
5’- gcacccagcagtttggcac -3’ SEQ ID NO: 25
5’- tggtattctttctcttccgcacccaggt -3’ SEQ ID NO: 26
5’- FAM/ tcttgacatgctgcggtgttttcaccagtac/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 27
(5) 5’- cttccagtttgccaaggcacgag -3’ SEQ ID NO: 28
5’- cctctgcacataggtaatttccaaattcc -3’ SEQ ID NO: 29
5’- JOE/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 30
5’- FAM/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 31。
一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
（1）提供上述5组引物和探针的至少一组；
（2）待测样品的处理和模板的提取；
（3）配制荧光定量PCR反应体系；
（4）用步骤（1）的引物和探针扩增待测的突变基因靶序列；
（5）利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果；JOE是内标信号，用于检测上样的DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值（CT值大于18）；FAM是检测信号，用于检测是否存在突变位点；在内标信号达到要求后，以FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值作为判断标准，CT值小于32为阳性，CT值大于35为阴性，CT值在32和35之间为弱阳性。
所述的一种检测人类EGFR基因突变的方法，其中步骤（2）所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。
优选地，所述的一种检测人类EGFR基因突变的方法，其中荧光定量PCR反应体系为：
1×PCR缓冲液：
MgCl2：2.0~5.0mmol
dNTP：0.2~0.8mmol
各条引物：0.1~1.0μmol
各条探针：0.1~1.0μmol
Taq酶：1~2Units
模板：4~6μl
总体积：20~30μl。
优选PCR反应条件为：
第一阶段：94℃ 5min；
第二阶段：94℃ 10s，60℃ 30s，40个循环；
第二阶段40个循环时，收集FAM和JOE信号。
另外，本发明还提供了一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，包括PCR反应缓冲液和上述的至少一组引物和探针。
本发明经过大量试验、研究和分析成功地筛选出能够用于快速、灵敏、有效的检测EGFR基因基因突变的引物组合和探针组合，并利用这些引物和探针开发出具有这样的优点的用于检测EGFR基因基因突变的引物组合物、探针组合、试剂盒和方法。利用这些引物和探针可以检测出人7号染色体外显子18~21上常见的29种突变，包括点突变和缺失突变。这29种基因突变见下表。
表1：EGFR基因常见基因突变
| 突变名称 | 基因突变 | 外显子 | 碱基变化 |
| Ex18-m1 | G719A | 18 | 2156G>C |
| Ex18-m2 | G719S | 18 | 2155G>A |
| Ex18-m3 | G719C | 18 | 2155G>T |
| Ex19-m1 | E746_A750del(1) | 19 | 2135_2249del15 |
| Ex19-m2 | E746_A750del(2) | 19 | 2236_2250del15 |
| Ex19-m3 | L747_P753>S | 19 | 2240_2257del18 |
| Ex19-m4 | E746_T751>I | 19 | 2235_2252>AAT(complex) |
| Ex19-m5 | E746_T751del | 19 | 2236_2253del18 |
| Ex19-m6 | E746_T751>A | 19 | 2237_2251del15 |
| Ex19-m7 | E746_S752>A | 19 | 2237_2254del18 |
| Ex19-m8 | E746_S752>V | 19 | 2237_2255>T(complex) |
| Ex19-m9 | E746_S752>D | 19 | 2238_2255del18 |
| Ex19-m10 | L747_A750>P(1) | 19 | 2238_2248>GC(complex) |
| Ex19-m11 | L747_T750>Q | 19 | 2238_2252>GCA(complex) |
| Ex19-m12 | L747_E749del | 19 | 2239_2247del19 |
| Ex19-m13 | L747_T751del | 19 | 2239_2253del15 |
| Ex19-m14 | L747_S752del | 19 | 2239_2256del18 |
| Ex19-m15 | L747_A750>P(2) | 19 | 2239_2248>C (complex) |
| Ex19-m16 | L747_P753>Q | 19 | 2239_2258>CA(complex) |
| Ex19-m17 | L747_ T751>S | 19 | 2240_2251del12 |
| Ex19-m18 | L747_ T751del | 19 | 2240_2254del15 |
| Ex19-m19 | L747_T751>P | 19 | 2239_2251>C(complex) |
| Ex20-m1 | T790M | 20 | 2369C>T |
| Ex20-m2 | S768I | 20 | 2303G>T |
| Ex20-m3 | H773_V774insH | 20 | 2319_2320insCAC |
| Ex20-m4 | D770_N771insG | 20 | 2310_2311insGGT |
| Ex20-m5 | V769_D770insASV | 20 | 2307_2308insGCCAGCGTG |
| Ex21-m1 | L858R | 21 | 2573T>G |
| Ex21-m2 | L861Q | 21 | 2582T>A |
29种突变分8个PCR反应体系检测，各管检测的突变见表2。
表2：EGFR检测体系
| 管号 | 突变 |
| 1 | L858R |
| 2 | L861Q |
| 3 | T790M |
| 4 | S768I |
| 5 | 20外显子插入 |
| 6 | 19外显子缺失 |
| 7 | 18m1~3 |
| 8 | 外标 |
所述特异性ARMS引物和特异性探针见表3。
表3：特异性ARMS引物和特异性探针
| 引物名称 | 序列（方向从5’到3’ ） | 序列号 |
| 18F | GGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCC | SEQ ID NO: 1 |
| 18R1 | GTGCCGAACGCACCGGATG | SEQ ID NO: 2 |
| 18R2 | GTGCCGAACGCACCGGAGTT | SEQ ID NO: 3 |
| 18R3 | GCCGAACGCACCGGAGGA | SEQ ID NO: 4 |
| 18P | FAM/ccttcaagatcctcaagagagcttggttggg/BHQ1 | SEQ ID NO: 5 |
| 19F | GGGCAGCATGTGGCACCATCT | SEQ ID NO: 6 |
| 19R1 | CCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTCTTG | SEQ ID NO: 7 |
| 19R2 | TCCTTGTTGGCTTTCGGTTCCTTG | SEQ ID NO: 8 |
| 19R3 | TCCTTGTTGGCTTTCGGAGATATTTTG | SEQ ID NO: 9 |
| 19R4 | CCTTGTTGGCTTTCGGAGCCTTG | SEQ ID NO: 10 |
| 19R5 | CCTTGTTGGCTTTCGGAGATTGCT | SEQ ID NO: 11 |
| 19R6 | TGGCTTTCGGAGATGTTGGTTCCT | SEQ ID NO: 12 |
| 19R7 | CCTTGTTGGCTTTCGGAGATTCCTT | SEQ ID NO: 13 |
| 19R8 | GTTGGCTTTCGGAGATGGTTCCTTG | SEQ ID NO: 14 |
| 19P | FAM/tctcaccttctgggatccagagtccctatga/BHQ1 | SEQ ID NO: 15 |
| 20R1 | CCCGTATCTCCCTTCCCTGATTACCTT | SEQ ID NO: 16 |
| 20R2 | GCACACACCAGTTGAGCAGGTACT | SEQ ID NO: 17 |
| 20F1 | CCTCCACCGTGCAGCTCATCCT | SEQ ID NO: 18 |
| 20F2 | CAGGAAGCCTACGTGATGGCCCT | SEQ ID NO: 19 |
| 20F3 | CAGCGTGGCCAGCGTGGAC | SEQ ID NO: 20 |
| 20F4 | TGATGGCCAGCGTGGACGGT | SEQ ID NO: 21 |
| 20F5 | AGCGTGGACAACCCCCACCAC | SEQ ID NO: 22 |
| 20P | FAM/cccttcggctgcctcctggactatgt/BHQ1 | SEQ ID NO: 23 |
| 21F | CACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCA | SEQ ID NO: 24 |
| 21R1 | GCACCCAGCAGTTTGGCAC | SEQ ID NO: 25 |
| 21R2 | TGGTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGGT | SEQ ID NO: 26 |
| 21P | FAM/ tcttgacatgctgcggtgttttcaccagtac/BHQ1 | SEQ ID NO: 27 |
| LF | CTTCCAGTTTGCCAAGGCACGAG | SEQ ID NO: 28 |
| LR | CCTCTGCACATAGGTAATTTCCAAATTCC | SEQ ID NO: 29 |
| LP | JOE/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQ1 | SEQ ID NO: 30 |
| OP | FAM/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQ1 | SEQ ID NO: 31 |
本发明涉及的检测人类EGFR基因29种突变的荧光定量PCR方法不包括对待测样品处理和模板提取的步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的段片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
与现有技术相比，本发明在ARMS引物区分野生型和突变型基因的基础上，建立了多重实时PCR同时检测29种人类EGFR基因突变，此方法具有如下有益效果和显著进步：（1）可在7个PCR管中同时检测29种突变；（2）灵敏度高，单拷贝即可检出；（3）特异性强，50ng野生型基因组DNA不会有非特异性信号；（4）选择性能力强，可以在50ng野生型基因组DNA背景下，检出0.1%的突变型DNA；（5）检测速度快，整个检测过程只需要60分钟。
附图说明
图1 为本发明单管检测不含EGFR基因突变的阴性样品检测曲线图；
图2 为本发明单管检测含29种EGFR基因突变的其中一种或多种的样品检测曲线图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1：临床样本DNA的提取
本实施例是从非小细胞肺癌患者肺部石蜡包埋组织切片中提取DNA,并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用Qiagen公司的QIAamp 石蜡包埋组织提取试剂盒，具体详述如下。
1、实验前的准备
(1) 将水浴锅调到56℃。
(2) 将QIAamp试剂盒中的Buffer ATL和Buffer AL于56℃放置，直到沉淀溶解。
2、样本的处理
(1) 将石蜡切片上多余的石蜡切去, 将切片切成合适的尺寸，装在石蜡切片机上。
(2) 将卡尺调到10μm，然后切蜡块，直到切下的切片上明显的看到均匀的组织。
(3) 去掉最初的5片，从第6片开始，装入1.5ml的EP管中，每管4片，然后编号。
3、DNA提取
(1) 在样本中加入1ml二甲苯，盖上盖子，轻柔的旋转颠倒混匀，室温下14000rpm离心3min。
(2) 用移液器吸去上清，加入1ml无水乙醇，盖上盖子，轻柔的旋转颠倒混匀，室温下14000rpm离心3min。
(3) 用移液器吸尽上清，将盖子打开，在56℃放置10min。
(4) 加入180μl Buffer ATL和20μl蛋白酶K，盖上盖子，旋涡混匀，于56℃水浴1h。
(5) 从水浴锅中拿出样本，轻柔的旋转颠倒混匀，在干式恒温仪上90℃放置1h。
(6) 用迷你离心机离心1min，使管盖上的液滴落下。
(7) 加入100mg/ml的RNase A 2μl，旋涡混匀后室温放置2min。
(8) 加入200μl Buffer AL和200μl无水乙醇，立即旋涡混匀。
(9) 用迷你离心机离心1min，使管盖上的液滴落下。
(10) 将离心管中的液体加入到吸附柱中，注意不要吸到沉淀。盖上盖子，12000rpm离心2min。弃去流出物，将吸附柱置于新的干净的2ml的收集管上。
(11) 加入500μl Buffer AW 1，盖上盖子，12000rpm离心2min。弃去流出物，将吸附柱置于新的干净的2ml的收集管上。
(12) 加入500μl Buffer AW 2，盖上盖子12000rpm离心2min。弃去流出物，将吸附柱置于新的干净的2ml的收集管上。
(13) 再12000rpm离心2min，彻底去除乙醇。
(14) 将吸附柱套入一个干净的1.5ml的EP管中，打开盖子，在膜中央加入50μl Buffer ATE。
(15) 盖上盖子，在56℃水浴10min。然后12000rpm离心2min。流出物即为提取的DNA。
4、定量
将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量，调整DNA浓度到10ng/μl。
实施例2：实时荧光PCR法扩增临床样本DNA
本实施例为采用本发明所提供的引物、探针扩增实施例1所提取的DNA样品。检测方法如下：
(1) 向45μl待测样本中加入5μl Taq酶，混匀后快速离心。
（2）在PCR管冰架上轻轻揭开8联管的管盖。8联管中所包含的组分和各组分含量为：
MgCl2：3mmol
dNTP：0.3mmol
各条引物：0.5μmol
各条探针：0.5μmol
Taq酶：1.5Units
模板：5μl
总体积：25μl。
其中每个检测体系中加入不同的检测引物和探针，其引物探针组合见表4。
表4 8联PCR管各反应体系中的引物和探针
| 8联管编号 | 检测试剂 | 引物 | 探针 |
| 1 | L858R | 21F1/21R1/LF/LR | 21P/LP |
| 2 | L861Q | 21F1/21R2/LF/LR | 21P/LP |
| 3 | T790M | 20F1/20R1/LF/LR | 20P/LP |
| 4 | S768I | 20F2/20R2/LF/LR | 20P/LP |
| 5 | 20外显子插入 | 20F3/20F4/20F5/20R2/LF/LR | 20P/LP |
| 6 | 19外显子缺失 | 19F1/19R1/19R2/19R3/19R4/19R5/19R6/19R7/19R8/LF/LR | 19P/LP |
| 7 | 18m1~3 | 18F1/18R1/18R2/18R3/LF/LR | 18P/LP |
| 8 | 外标 | LF/LR | 0P |
(2) 将混合好的DNA样本依次取5μl加入8联管的每个管中，然后小心盖上8联管的管盖，离心。
(3) 将8联管放入实时定量PCR仪中。
(4) 设置PCR程序：
第一阶段：94℃ 5min；
第二阶段：94℃ 10s，60℃ 30s，40个循环；
信号收集：第二阶段60℃时收集FAM和JOE信号。
本发明利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果，本实验在ABI StepOne plusTM上设置的阈值为3000。
JOE是内标信号，用于检测是否漏加模板，如果FAM信号的CT值在阈值线以下，则JOE信号的CT值必须小于30，否则视为漏加模板。若FAM信号的CT值小于30，JOE信号的CT值在阈值线以下，结果仍然可信，因为双重反应之间可能会有竞争，JOE荧光强度低于FAM，所以有可能被抑制。
外标体系用于检测模板的质量，外控体系是单独的，所以不受双重反应的影响，外标体系信号的CT值应小于30，否则视为模板浓度太低，达不到检测要求。
检测体系用于检测是否存在突变位点；在内标和外标信号达到要求后，以检测体系FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值作为判断标准，CT值小于32为阳性，CT值大于35为阴性，CT值在32和35之间为弱阳性（见图1、图2）。
Claims (5)
1.用于检测人类EGFR基因突变的引物及探针，包括下列5组引物和探针中的至少一组：
（1）5’- ggtgacccttgtctctgtgttcttgtcc-3’ SEQ ID NO: 1
5’- gtgccgaacgcaccggatg -3’ SEQ ID NO: 2
5’- gtgccgaacgcaccggagtt -3’ SEQ ID NO: 3
5’- gccgaacgcaccggagga -3’ SEQ ID NO: 4
5’- FAM/ccttcaagatcctcaagagagcttggttggg/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 5
（2）5’- gggcagcatgtggcaccatct-3’ SEQ ID NO: 6
5’- ccttgttggctttcggagatgtcttg -3’ SEQ ID NO: 7
5’- tccttgttggctttcggttccttg -3’ SEQ ID NO: 8
5’- tccttgttggctttcggagatattttg -3’ SEQ ID NO: 9
5’- ccttgttggctttcggagccttg -3’ SEQ ID NO: 10
5’- ccttgttggctttcggagattgct -3’ SEQ ID NO: 11
5’- tggctttcggagatgttggttcct -3’ SEQ ID NO: 12
5’- ccttgttggctttcggagattcctt -3’ SEQ ID NO: 13
5’- gttggctttcggagatggttccttg -3’ SEQ ID NO: 14
5’- FAM/tctcaccttctgggatccagagtccctatga/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 15
（3）5’- cccgtatctcccttccctgattacctt -3’ SEQ ID NO: 16
5’- gcacacaccagttgagcaggtact -3’ SEQ ID NO: 17
5’- cctccaccgtgcagctcatcct -3’ SEQ ID NO: 18
5’- caggaagcctacgtgatggccct -3’ SEQ ID NO: 19
5’- cagcgtggccagcgtggac -3’ SEQ ID NO: 20
5’- tgatggccagcgtggacggt -3’ SEQ ID NO: 21
5’- agcgtggacaacccccaccac -3’ SEQ ID NO: 22
5’- FAM/cccttcggctgcctcctggactatgt/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 23
（4）5’- cacagcagggtcttctctgtttca -3’ SEQ ID NO: 24
5’- gcacccagcagtttggcac -3’ SEQ ID NO: 25
5’- tggtattctttctcttccgcacccaggt -3’ SEQ ID NO: 26
5’- FAM/ tcttgacatgctgcggtgttttcaccagtac/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 27
（5）5’- cttccagtttgccaaggcacgag -3’ SEQ ID NO: 28
5’- cctctgcacataggtaatttccaaattcc -3’ SEQ ID NO: 29
5’- JOE/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 30
5’- FAM/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQ1-3’ SEQ ID NO: 31。
2.一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
（1）提供权利要求1所述的5组引物和探针的至少一组；
（2）待测样品的处理和模板的提取；
（3）配制荧光定量PCR反应体系；
（4）用步骤（1）的引物和探针扩增待测的突变基因靶序列；
（5）利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的FAM和JOE的荧光强度来判断检测结果；JOE是内控信号，用于检测上样的DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值（CT值大于18）；FAM是检测信号，用于检测是否存在突变位点；在内控信号达到要求后，以FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值作为判断标准，CT值小于32为阳性，CT值大于35为阴性，CT值在32和35之间为弱阳性。
3.根据权利要求2所述的一种检测人类EGFR基因突变的方法，其特征在于：步骤（2）所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。
4.根据权利要求2所述的一种检测人类EGFR基因突变的方法，其特征在于：荧光定量PCR反应体系为：
1×PCR缓冲液：
MgCl2：2.0~5.0mmol
dNTP：0.2~0.8mmol
各条引物：0.1~1.0μmol
各条探针：0.1~1.0μmol
Taq酶：1~2Units
模板：4~6μl
总体积：20~30μl。
5.一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：包括PCR反应缓冲液和权利要求1所述的至少一组引物和探针。
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