CN103382503A

CN103382503A - Egfr基因19号外显子19种缺失突变检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN103382503A
Application number: CN2013102871182A
Authority: CN
Inventors: 蔡从利; 张喆; 罗艳; 周鹏飞
Original assignee: WUHAN YZY BIOPHARMA CO Ltd
Current assignee: WUHAN YOUZHIYOU MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2013-07-08
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2033-07-08
Also published as: CN103382503B

Abstract

本发明适用于生物技术以及医学领域，涉及一种EGFR基因19号外显子19种缺失突变检测试剂盒及检测方法。本发明的检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，其中该第一试剂包含引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3，该第二试剂包含引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3和阻断核酸序列SEQ ID NO:4，其中该探针SEQ ID NO:3的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。本发明的检测方法利用上述检测试剂盒通过荧光定量PCR反应进行。

Description

EGFR基因19号外显子19种缺失突变检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术以及医学领域，尤其涉及一种人类EGFR基因19号外显子19种缺失突变的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生长因子受体）基因位于人类7号染色体短臂7p12～14区，由28个外显子组成，该蛋白属于受体酪氨酸激酶（TKI）家族。EGFR是一种跨膜蛋白，主要分布于细胞膜的表面，由细胞外配体结合域、跨膜区与细胞内酪氨酸激酶域三部分组成，其中18-24号外显子编码该基因的酪氨酸激酶结构域。EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR通过与配体结合来激活，EGFR配体包括EGF和TGFα。EGFR与配体结合后发生二聚作用，引发酪氨酸残基的自磷酸化，从而激活其下游的3条主要信号通路：（1）Ras/Raf/MAPK通路；（2）PI3K/AKT通路；（3）JAK和STAT通路，这三条信号通路最终介导细胞分化、生存、迁移、侵袭、黏附和细胞损伤修复等一系列过程,在肿瘤恶性生长中发挥重要作用。

EGFR信号通路重要靶标的检测及靶向治疗已是肿瘤个体化医疗领域关注的焦点，目前已开发出多种EGFR靶向药物。按照其作用机制，针对EGFR的靶向药物分为以下2种：1）作用于EGFR激酶区的小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）；2）作用于EGFR胞外域部分的单克隆抗体（mAb），如西妥昔单抗（Cetuximab）、帕尼单抗（Vectibix）。其中EGFR-TKI在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）临床疗效明显，已被推荐为晚期患者的一线药物。

常用的EGFR-TKI包括吉非替尼（Gefitinib，又叫易瑞沙）和厄洛替尼（Erlotinib，又叫特罗凯），是目前NSCLC患者最有效的靶向药物。但EGFR-TKI并非对所有患者有效，EGFR敏感突变是药物有效的前提。临床研究结果表明，EGFR外显子18、19或21发生突变的患者，吉非替尼有效率可达80%，而吉非替尼对于野生型患者基本无效；在对吉非替尼和厄洛替尼有反应的患者中EGFR突变率为77%，而对吉非替尼和厄洛替尼耐药的患者中突变率为7%。此外，研究表明部分EGFR-TKI初始治疗有效的患者在后期会发生耐药反应，这与EGFR20号外显子的突变密切相关，其中50%的EGFR-TKI耐药由外显子20的T790M点突变所致。

研究发现，EGFR基因酪氨酸激酶区存在多种突变，主要集中在外显子18-21上，其中以19号外显子的缺失突变以及21号外显子L858R突变最为常见。EGFR基因19号外显子有19种常见缺失突变，这些突变发生在基因序列2235-2240bp处，分别缺失9～18bp序列，占该基因所有突变比率的45%（见表1）。

表1：EGFR基因19种缺失突变

研究发现，EGFR基因序列的这些突变与靶向药物吉非替尼和厄洛替尼的疗效显著相关，对于NSCLC患者选择用药的疗效预测有重要作用。美国FDA要求对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的患者进行EGFR基因突变检测。我国《非小细胞肺癌临床实践指南》中明确指出EGFR突变，尤其是19号外显子缺失突变与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的敏感度有重要关系。由此可见，对于EGFR基因19号外显子缺失突变的检测对于肿瘤个体化治疗显得十分重要。

目前针对基因突变的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法（High Resolution Melting Analysis，HRM），荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测缺失突变效果较差，准确度不高。因此，需要建立一种快速有效的检测EGFR基因19号外显子缺失突变的方法。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种EGFR基因19号外显子19种缺失突变的检测试剂盒及其检测方法，旨在解决现有技术中针对此种缺失突变检测效果不理想的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种EGFR基因19号外显子19种缺失突变检测试剂盒，包括分开设置的第一试剂和第二试剂，其中该第一试剂包含引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3，该第二试剂包含引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3和阻断核酸序列SEQ IDNO:4，其中该探针SEQ ID NO:3的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。

本发明实施例的另一目的在于提供一种EGFR基因19号外显子19种缺失突变的检测方法，该检测方法利用本发明的检测试剂盒进行，该检测方法包括以下步骤：

（1）获得待测样品基因组DNA；

（2）取本发明的检测试剂盒，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述第一试剂和所述第二试剂中并同时进行PCR反应，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

本发明实施例采用荧光定量PCR方法，对EGFR基因19号外显子缺失突变区域序列进行特异性扩增检测，同时利用阻断核酸序列与待测样品中野生型DNA模板的特异结合，抑制该野生型DNA模板与引物探针的结合，实现缺失突变的特异性扩增，达到一次检测反应可检出19种缺失突变的一种或几种突变的效果。本发明实施例提供的检测方法简单有效，检测灵敏度高，操作简单快速，结果判读简单客观，是一种有效检测人类EGFR基因19号外显子缺失突变的方法。

附图说明

图1是本发明实施例提供的检测试剂盒的一个阴性检测结果图；

图2是本发明实施例提供的检测试剂盒的一个阳性检测结果图；

图3是本发明实施例提供的检测试剂盒的另一个阴性检测结果图；

图4是本发明实施例提供的检测试剂盒的另一个阳性检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种针对EGFR基因19号外显子19种缺失突变的检测试剂盒，包括分开设置的第一试剂和第二试剂，其中该第一试剂包含引物对SEQID NO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3，该第二试剂包含引物对SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3和阻断核酸序列SEQ ID NO:4，其中该探针SEQ ID NO:3为MGB探针序列，其5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团NFQ。

具体地，上述第一试剂和第二试剂可与其他组分构成PCR反应体系，或者自身包含有PCR反应所必需的组分以进行荧光定量PCR检测。在第一试剂和第二试剂单独作为PCR反应体系时，该第一试剂除了包含引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3之外，还包含PCR缓冲液，Taq酶，并可通过加水补充体积，其中该PCR缓冲液中含有镁离子及dNTP。该第二试剂含有引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针SEQ ID NO:3以及阻断核酸序列SEQ ID NO:4，还包含PCR缓冲液，Taq酶，并可通过水补充体积，其中该PCR缓冲液中含有镁离子及dNTP。即阻断核酸序列SEQ ID NO:4存在于该第二试剂中，而不存在于第一试剂中。在进行检测时可分别将待测样品DNA加入至上述第一试剂和第二试剂中进行PCR检测，根据分别含有上述第一试剂和第二试剂的PCR反应体系的检测结果的Ct值比较差值来确定检测结果是否为阳性。

具体地，上述引物、探针及阻断核酸序列分别为：

正向引物SEQ ID NO:1 5’-AGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAA-3’，

反向引物SEQ ID NO:2 5’-CACAGCAAAGCAGAAACTCACATC-3’，

探针SEQ ID NO:3 5’-AAAGCCAACAAGGAAAT-3’MGB，

阻断核酸序列SEQ ID NO:4 5’-CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAC-PO₄-3’

具体地，上述探针序列5’端连接的荧光基团可以为FAM或VIC荧光基团，此外还可选用其他合适的荧光基团，例如ROX，HEX。该探针序列3’端连接的淬灭基团NFQ可为本领域技术人员熟知的淬灭基团。探针5’端的荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近的时候，荧光报告基团不能发出荧光，但随着PCR扩增反应的进行，5’端的荧光基团随着探针的水解而脱落下来，从而能发出荧光，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。该探针的3’端连接有MGB(Minor Groove Binder)基团，MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验效果。该MGB基团可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此对于同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，特异性更强。

上述阻断核酸为3’端磷酸化序列，该序列与普通核酸序列的区别在于3’端最后一个碱基加入磷酸基团（PO₄），使得该序列在扩增时无法正常延伸，从而阻止了该阻断核酸序列所结合的DNA模板的扩增。在本发明实施例中，该阻断核酸序列与野生型（即未发生突变的）EGFR基因19号外显子序列结合，阻止正向引物序列SEQ ID NO:1与该DNA模板的结合扩增；另一方面，该阻断核酸序列不与发生缺失突变的EGFR基因19号外显子序列结合，而引物SEQ IDNO:1可与该发生缺失突变的模板结合，并在引物SEQ ID NO:2、探针SEQ IDNO:3的共同作用下完成突变DNA模板的特异性扩增，实现EGFR基因19号外显子缺失突变的特异性检测，通过将该检测结果与第一试剂的PCR反应体系检测结果进行比较以确定待检测样品中是否有突变发生。

具体地，本发明实施例提供的试剂盒中上述第一试剂和第二试剂中除水以及阻断核酸序列SEQ ID NO:4之外相应的组分组成及含量相同，即，在第一试剂和第二试剂中正向引物SEQ ID NO:1，反向引物SEQ ID NO:2，探针SEQ IDNO:3组成及含量均相同。

本发明实施例提供的检测试剂盒操作简便，检测周期短，实现了对于样品的快速检测。

本发明实施例还提供一种针对EGFR基因19号外显子突变的检测方法，该检测方法利用本发明实施例提供的检测试剂盒进行，该检测方法包括以下步骤：

（1）获得待测样品基因组DNA；

（2）将上述获得的基因组DNA先后取同样的量分别加入至含有本发明的检测试剂盒中第一试剂的PCR反应体系和含有本发明的检测试剂盒中第二试剂的PCR反应体系中，并使该两个反应体系同时进行PCR反应，两个PCR反应彼此独立进行，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

具体地，例如，含有第一试剂的PCR反应体系对应的Ct值为质控值Ct₀，而含有第二试剂的PCR反应体系对应的Ct值为Ct₁，△Ct=Ct₁-Ct₀。首先根据质控值Ct₀作为上样量是否适当的标准，Ct₀≤32则上样量合适，检测结果有效；Ct₀＞32则上样量偏低，需重新检测，重新检测时可适当提高上样量后再进行检测。在对上样量进行判定的同时可对EGFR基因19号外显子突变的结果进行判定：△Ct值≥6（包括含有第二试剂的PCR反应体系进行PCR反应后无Ct值的情况）则样品无19号外显子缺失突变或缺失突变丰度低于本试剂盒突变检测下限，如图1和3所示；△Ct＜6则样品存在19号外显子缺失突变，如图2和4所示。

具体地，本发明实施例提供的检测方法的检测下限为1%，即突变丰度高于1%的样品可以被检测到。

本发明实施例中，还可以通过上调△Ct值来检测突变丰度低于1%的样品。

具体地，上述含有第一试剂的PCR反应体系的反应体积可以为任何适用于荧光定量PCR反应的体积。本发明的优选实施例中上述含有第一试剂的PCR反应体系的反应体积为25μl，可按照如下比例配制：

上述PCR缓冲液中含有dNTP，镁离子等进行PCR反应所必需的组分。

具体地，上述含有第二试剂的PCR反应体系的反应体积可以为任何适用于荧光定量PCR反应的体积。优选地，上述含有第二试剂的PCR反应体系的反应体积为25μl，可按照如下比例配制：

优选地，同样的组分（除了水）在上述含有第一试剂的PCR反应体系和含有第二试剂的PCR反应体系中含量相同，即除了阻断核酸序列SEQ ID NO:4和水，含有第二试剂的PCR反应体系中各组分含量与含有第一试剂的PCR反应体系中各组分相同，即在上述两个PCR反应体系中引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、探针SEQ ID NO:3、PCR缓冲液、Taq酶组成及含量均相同。

具体地，在进行EGFR基因19号外显子突变检测时，上述两种PCR反应体系在相同反应条件下进行。优选地，上述两种反应体系的PCR反应条件为：

95℃ 5～10min；

95℃ 15～30s，60℃ 45～60s，40～45个循环；

在上述每个循环后收集荧光信号，该过程由反应仪器自动完成。

本发明实施例中采用了荧光定量PCR方法，对EGFR基因19号外显子缺失突变区域序列进行特异性扩增检测，同时利用阻断核酸序列与样品中野生型DNA模板的结合抑制后者与引物探针的结合，实现缺失突变的特异性扩增，利用该结果与未加入阻断核酸序列反应体系的检测结果的比较实现了在一次检测反应中可检出19种缺失突变的任一突变类型。本发明建立的检测方法简单有效，检测灵敏度高，操作简单快速，结果判读简单客观，是一种有效检测人类EGFR基因19号外显子19种缺失突变的方法。

以下通过具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1

制备EGFR基因19号外显子突变检测试剂盒，具体包括以下步骤：

1.合成引物及探针序列

合成引物序列SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2；合成特异性探针序列SEQ IDNO:3，并在5’端标记FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团NFQ和MGB修饰基团。

将上述引物序列分别配制成100μM的母液储存，将上述探针序列分别配制成100μM的母液储存。

2.合成阻断核酸序列

合成阻断核酸序列SEQ ID NO:4，并在3’端进行磷酸基团（PO₄）修饰。

将阻断核酸配制成100μM的母液储存。

3.荧光定量PCR反应体系的制备

分别制备含有第一试剂的质控检测反应体系和含有第二试剂的突变检测反

应体系，各组分如下表2所示：

表2质控检测反应体系和突变检测反应体系的组成

上述PCR缓冲液为从市场购得，其中含有dNTP、镁离子等PCR反应所必需的组分。

实施例2

用实施例1制备的EGFR基因19号外显子突变检测试剂盒对待测样品进行检测。

本实施例中收集41例临床病理诊断为非小细胞肺癌患者的石蜡包埋组织切片，并从中提取基因组DNA，用实施例1中得到的EGFR基因19号外显子突变检测试剂盒检测待测样品中是否存在EGFR基因19号外显子的缺失突变，同时采用传统测序的方法进行验证，具体操作步骤为：

1.样品基因组DNA的提取

使用DNA提取试剂盒（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit,Cat No.56404）提取上述肺癌患者的组织标本的基因组DNA。DNA提取方法参照说明书进行，操作步骤简述如下：将临床采集的石蜡包埋组织（≤25mg）放置在1.5ml的离心管中，加入1200μl的二甲苯，剧烈涡旋10s，12000rpm室温离心5min。弃上清，注意不要倒掉沉淀。加入1200μl无水乙醇，以除去残留的二甲苯，轻轻涡旋。12000rpm室温离心5min。弃上清，再次加入1200μl无水乙醇，轻轻涡旋。12000rpm室温离心5min。弃上清，打开离心管，在37℃孵育10-15min，直至乙醇完全蒸发。加入180μl buffer ATL。加入20μl蛋白酶K，彻底涡旋，56℃孵育2h左右，直到该组织完全溶解（在孵育过程中可以偶尔涡旋），之后涡旋15s，加入200μl buffer AL，涡旋后加入200μl无水乙醇，混合后再次彻底涡旋震荡。将最后的混合物加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃废液。加入500μl buffer AW1，8000rpm离心1min，弃废液。加入500μl bufferAW2，12000rpm离心3min，弃废液后12000rpm离心1min，将离心柱放置在新的1.5ml离心管中，加入50～200μl buffer AE，室温放置1min,12000rpm离心1min。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl，分别取5μl并加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的PCR反应。

2.样本的荧光定量PCR检测

将步骤1中稀释后的DNA样品依次取5μl分别加入实施例1的试剂盒的质控检测反应体系和突变检测反应体系中，使两种反应体系总体积均为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：

95℃ 5min；

95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环；每个循环后收集FAM荧光信号。

3.样本的检测结果分析

本发明利用阻断核酸序列抑制野生型DNA模板序列的扩增，并通过收集FAM荧光信号检测发生缺失突变DNA模板的扩增，通过质控检测反应体系的质控值Ct₀判断样本是否有效，通过突变检测反应体系突变检测值Ct₁与质控值Ct₀的差值△Ct判断是否发生EGFR基因19号外显子缺失突变。

具体的结果判读标准如下：

质控值Ct₀≤32则表明上样量合适，检测结果有效；质控值Ct₀＞32则表明上样量偏低，可适当提高上样量后重新检测；

以突变检测值Ct₁与质控值Ct₀的差值△Ct作为EGFR基因19号外显子是否发生缺失突变的判断标准，△Ct值≥6则检测结果为阴性，即样品无19号外显子缺失突变或突变丰度低于1%，如图1所示；△Ct值＜6则检测结果为阳性，即样品存在19号外显子缺失突变，如图2所示。

本实施例中41例临床标本的检测结果如下：

EGFR基因19号外显子野生型样本17例，其中13例样本突变检测无Ct值，如图1所示，4例样本突变检测值Ct₁与质控值Ct₀的差值△Ct≥6，其中一个检测结果如图3所示；

EGFR基因19号外显子缺失突变样本24例，突变检测值Ct₁与质控值Ct₀的差值△Ct＜6，其中一个检测结果如图4所示。

上述检测结果中有2例样本用本发明的检测方法检测为EGFR基因19号外显子缺失突变阳性，而测序结果为野生型，后再次重复测序结果表明为该样品发生EGFR基因19号外显子缺失突变，突变丰度较低。其余39例样本测序结果与荧光定量PCR检测结果一致。

以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类EGFR基因19号外显子19种缺失突变检测结果可靠，与直接测序的符合率≥95%，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种EGFR基因19号外显子19种缺失突变检测试剂盒，包括分开设置的第一试剂和第二试剂，其中所述第一试剂包含引物对SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2，探针SEQ ID NO:3，所述第二试剂包含引物对SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2，探针SEQ ID NO:3和阻断核酸序列SEQ ID NO:4，其中所述探针SEQ IDNO:3的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团可以为FAM、VIC、ROX或HEX。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂和第二试剂中所述引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述探针SEQ ID NO:3组成及含量均相同。

4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂和第二试剂分别包含PCR缓冲液以及Taq酶。

5.一种EGFR基因19号外显子突变检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

（1）获得待测样品基因组DNA；

（2）取权利要求1-4中任一项所述的检测试剂盒，将所述基因组DNA先后取相同的量加入所述第一试剂和所述第二试剂中并同时进行PCR反应，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，根据以下条件进行所述判断：

△Ct<6则待测样品存在19号外显子缺失突变；△Ct值≥6则待测样品无19号外显子缺失突变或缺失突变丰度低于本试剂盒突变检测下限。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，还包括对上样量是否合适进行判断的步骤，判断依据如下：

Ct₀≤32则上样量合适，检测结果有效；Ct₀>32则上样量偏低，需增加上样量后重新检测，

其中，所述Ct₀为所述第一试剂对应的Ct值。

8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述△Ct值≥6的情况包括所述第二试剂进行PCR反应后无Ct值的情况。

9.如权利要求5-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR反应条件为：

95℃ 5～10min；

95℃ 15～30s，60℃ 45～60s，40～45个循环。