CN103773837A - 一种pik3ca基因突变荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种pik3ca基因突变荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种采用荧光定量PCR检测基因突变的方法，特别涉及一种PIK3CA基因突变荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。本发明的方法包括：设计特异性引物和探针；配制荧光定量PCR反应体系和设计反应条件；利用特异性引物扩增样品中的突变基因靶序列；利用探针和扩增产物的杂交，检测反应体系中FAM、HEX、Cy5荧光信号强度作为结果的判断标准。使用本发明提供的试剂盒可同时检测PIK3CA基因的8种突变，特异性强，选择能力强，可在突变含量只有0.1％的临床样本中检测出低至5个拷贝的PIK3CA突变分子。检测速度快，只需90分钟即可完成检测。

Description

一种PIK3CA基因突变荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种采用荧光定量PCR检测基因突变的方法，特别涉及一种PIK3CA基因突变荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，可在突变含量只有0.1％的临床样本中检测出低至5个拷贝的PIK3CA突变分子。 
背景技术
磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)是一个重要的信号传导通路分子。其由一个催化亚基p110和一个调节亚基p85构成。根据PI3K的p110结构特点和底物分子不同可将其分为I型、II型和III型等3个亚型。PI3K介导的信号转导通路在细胞的增殖、转化、凋亡和肿瘤的发生中起重要作用，调节肿瘤细胞的增殖和存活。研究发现，PI3K-AKT信号通路失调可导致肺癌、卵巢癌、乳癌、恶性胶质瘤、子宫内膜癌和鼻咽癌等恶性肿瘤的发生。 
PI3K的催化亚基p110α由PIK3CA(phosphatidylinositol3-kinase catalytic alpha)基因编码。PIK3CA是一个长度为34kb的基因，定位于3号染色体3q26.32，含20个外显子，编码1068个氨基酸，生成124kDa蛋白质。其功能是催化4，5-PIP2成为3，4，5-PIP3，激活PI3K-AKT信号通路，参与信号通路的功能发挥。研究发现PIK3CA是PI3K信号通路中最常发生突变的基因，在人类癌症中呈现高频突变。例如，Samuels等人报道，PIK3CA在胶质母细胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌组织中突变率分别为27％、25％、8％和4％，而在结肠癌组织中突变率则高达32％[1]。Campbell等研究发现在卵巢癌中PIK3CA亦存在高频突变，突变率达到18.8％。这种非随机高频突变显示了其在肿瘤发生中的重要意义[2]。 
绝大部分(80％～90％)的PIK3CA基因突变聚集在该基因的第9号外显子和第20号外显子上，分别对应该酶的螺旋区(包括E542K、E545K和E545D等突变类型)和激酶区(包括H1047R和H1047L等突变类型)。 
近年来，数个特异性抑制PI3K/AKT/mTOR通路的靶向药物已进入后期临床研究(www.clinicaltrial.gov)。这些靶向药物主要针对PIK3CA基因突变阳性的患者。例如GDC-0941是Genentech公司推出的专门针对PIK3CA的靶向药物，其作用原理是通过与PIK3CA的催化亚基单位p110结合，非竞争性、不可逆地抑制PIK3CA激酶活性，阻断PIK3CA介导的信号通路，抑制癌细胞生长，导致癌细胞凋亡。该药物已在不同的肿瘤治疗实验中显示出了极好的疗效[3]。另一方面，PIK3CA基因突变可以预测癌症患者对某些靶向药物的反应性。例如，治疗结直肠癌的靶向药物爱必妥(Cetuximab)和帕尼单抗(Panitumumab)对于PIK3CA基因突变的结直肠癌患者无效。而用于治疗乳腺癌的分子靶向药物赫赛汀(Trastuzumab)对PIK3CA基因突变患者的疗效亦欠佳，其预后不及PIK3CA为野生型的患者。关于PIK3CA基因突变对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗非小细胞肺癌的预后及疗效预测价值的研究结果表明，PIK3CA基因突变与疾病进展时间(TTP)和总生存期(OS)相关，应当将其纳入EGFR-TKI治疗耐药及生存预测标志物中。 
上述及其他大量的研究表明，在制定临床治疗方案之前，应用分子诊断技术准确地检测病人肿瘤细胞中PIK3CA基因突变状态，从而选择合适的靶向治疗药物，是应用靶向药物对癌症实行个性化治疗的前提和基础；同时PIK3CA基因突变检测亦可为临床评判病人的预后提供帮助。 
目前在临床上检测PIK3CA基因突变的通用方法为传统的DNA直接测序法。DNA直接测序法检测灵敏度只有20～30％，亦即肿瘤样本中必须要含有20～30％的突变阳性细胞才能被检测出来；对于小样本病理组织的检测，直接测序法的检测精度有限，难以满足实际应用的需求。同时，该方法容易造成污染，出现假阳性；操作复杂，耗时长(通常需要2～3天才能出检测结果)。针对此类问题，本发明提供了一种快速、高效、高灵敏度、操作简便的PIK3CA基因突变检测方法和试剂盒，仅需90分钟即可完成PIK3CA基因8种突变的检测，为临床个体化用药提供准确实验依据。 
发明内容
为了提高临床检验能力，现提供一种快速有效检测PIK3CA基因突变的荧光定量PCR方法，该方法可 以在90分钟检测出PIK3CA基因的8种突变类型。 
本发明的技术方案包含以下步骤： 
1.根据人类PIK3CA基因9号、20号外显子的野生型基因序列和相对应的突变型基因序列，设计出多对特异性高效引物和探针，9号外显子探针以FAM信号进行荧光标记，20号外显子探针以Cy5信号进行荧光标记；以PIK3CA基因中的保守序列为内控，设计相应的引物和探针，探针以HEX信号进行荧光标记。 
2.建立荧光定量PCR扩增突变基因序列的反应体系，利用特异性引物通过PCR反应大量扩增目的基因序列。 
3.利用特异性探针和扩增产物进行杂交，检测反应体系中FAM和HEX荧光信号的强度，以HEX的信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明样品DNA中包含PIK3CA基因，且上样量在允许范围内，说明FAM的信号可信、有效；以FAM信号达到设定阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，当Ct值等于0或35时，检测结果判定为阴性，Ct值＜32时，检测结果为阳性。 
本发明提供一种用于检测PIK3CA基因突变的试剂盒，所建立的荧光定量PCR反应体系为： 
Figure BSA00000916991300021
反应体系总体积为25μL，用去离子水补足体积后，漩涡震荡、短暂离心混匀。 
本发明所述荧光定量PCR反应条件是95℃预变性5分钟后进入以下循环：72℃15秒，95℃15秒，64℃45秒，进行15个循环；72℃15秒，95℃15秒，60℃45秒，共45个循环，荧光信号收集温度设定在退火温度。 
本发明所提供的检测PIK3CA基因突变的试剂盒可同时检测PIK3CA基因8种突变点。本发明所述的PIK3CA基因的突变点位于第9外显子和/或第20外显子；位于PIK3CA基因第9外显子的突变位点为第542和/或545和/或546核苷酸，发生的碱基突变情况为G1624A(E542K)、G1633A(E545K)、A1634C(E545A)、G1635T(E545D)、C1636A(Q546K)、A1637G(Q546R)；位于PIK3CA基因第20外显子的突变位点为PIK3CA基因的第1047核苷酸，发生的碱基突变情况为A3140G(H1047R)、A3140T(H1047L)。 
8种突变同时在PCR八联管中检测，除7号管作为外控以外，1-6号管中均加入内控引物和探针，各管检测的突变见表1。 
表1：PCR八联管各管检测的突变 
Figure BSA00000916991300022
本发明提供了特异性引物和探针，引物的5’端有一段作为标签的序列，标签引物序列为：taactactgtcgacactgacag。P-SEQ-25～P-SEQ-27是外控引物和探针；P-SEQ-28～P-SEQ-30是内控引物和探针。本发明所述特异性引物和特异性探针见表2。 
表2：特异性引物和探针 
Figure BSA00000916991300031
所述的一种检测PIK3CA基因8种突变的荧光定量PCR方法不包括样品DNA提取步骤，但对于从甲醛固定石蜡包埋的样品获得的DNA片段依然具有与从新鲜组织样品中提取的DNA同样的扩增和检测能力。 
与现有的检测方法相比，本发明具有以下优势： 
(1)建立了荧光定量PCR的方法，可同时检测PIK3CA基因8种突变； 
(2)灵敏度高，能检出5～10拷贝的突变； 
(3)特异性强，10～100ng的野生型DNA不会产生非特异性干扰信号； 
(4)选择性强，可在99～99.9％的野生型DNA背景下检测出0.1％～1.0％的突变型。 
(5)检测操作简便，在封闭的体系中进行DNA扩增和实时荧光检测，检测速度快，仅需90分钟即可完成检测。 
附图说明
图1：本发明试剂盒检测PIK3CA基因野生型样本的扩增曲线图 
图2：本发明试剂盒检测PIK3CA基因A3140G(H1047R)突变型的扩增曲线图 
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。 
实施例1：PIK3CA基因A3140G(H1047R)、A3140T(H1047L)突变型的检测 
收集临床诊断为肠癌的68例患者的肿瘤组织(包括新鲜组织和石蜡切片)，提取出基因组DNA作为模板。其中新鲜病理组织取约1.0g，使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA；石蜡切片样品切成约10μm的切片，用二甲苯脱蜡后，使用使用Qiagen公司的石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA。提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲液中，即10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)，经紫外分光光度计测定浓度，配成50ng/μL的溶液，作为PCR扩增的模板。 
设计能特异性检测PIK3CA基因A3140G(H1047R)、A3140T(H1047L)突变的引物和荧光探针，序列为见表2。 
荧光PCR扩增反应体系总体积为25μL，各成分为： 
Figure BSA00000916991300041
上述荧光定量PCR反应条件是95℃预变性5分钟后进入以下循环：72℃15秒，95℃15秒，64℃45秒，进行15个循环；72℃15秒，95℃15秒，60℃45秒，共45个循环，荧光信号收集温度设定在退火温度。 
采用Roche480II实时PCR扩增仪进行检测，检测反应体系中FAM和HEX荧光信号的强度，以HEX的信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明样品DNA中包含PIK3CA基因，且上样量在允许范围内，说明FAM的信号可信、有效；以FAM信号达到设定阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，当Ct值等于0或≥35时，检测结果判定为阴性；Ct值＜32时，检测结果为阳性；Ct值介于32至35之间为临界值，需重新检测，亦可用直接测序法鉴定。 
如图2所示，68例样品中共检测出27例样本有A3140G(H1047R)突变、18例样本有A3140T(H1047L)突变。另外将实施例1中的样品进行测序验证，测序结果与采用本试剂盒进行荧光定量检测的实验结果完全一致，可确认本试剂盒可正确测定PIK3CA基因20号外显子1047位点的突变。 
实施例2：PIK3CA基因第9外显子G1633A(E545K)突变检测 
实验用含G1633A(E545K)突变质粒模板1株，细胞系2株，分别为H1650和H460(均为PIK3CA基因野生型。利用本发明提供的检测PIK3CA基因9号外显子G1633A(E545K)突变的方法如下： 
使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取质粒及细胞系的基因组DNA。提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲液中，即10mmol/LTris-HCl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)，经紫外分光光度计测定浓度，配成50ng/μL的溶液，作为PCR扩增的模板。 
设计能特异性检测PIK3CA基因G1633A(E545K)突变的引物和荧光探针，序列为见表2。 
荧光PCR扩增反应体系总体积为25μL，各成分为： 
Figure BSA00000916991300042
上述荧光定量PCR反应条件是95℃预变性5分钟后进入以下循环：72℃15秒，95℃15秒，64℃45秒，进行15个循环；72℃15秒，95℃15秒，60℃45秒，共45个循环，荧光信号收集温度设定在退火温度。 
采用Roche480II实时PCR扩增仪进行检测，检测反应体系中FAM和HEX荧光信号的强度，以HEX的信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明样品DNA中包含PIK3CA基因，且上样量在允许范围内，说明FAM的信号可信、有效；以FAM信号达到设定阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，当Ct值等于0或≥35时，检测结果判定为阴性；Ct值＜32时，检测结果为阳性；Ct值介于32至35之间为临界值，需重新检测，亦可用直接测序法鉴定。 
PIK3CA基因野生型样本的扩增曲线图如图1所示。 
灵敏度分析：将突变型模板从100ng/μL连续10倍梯度稀释，分别为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，每次检测加入5μL作为模板。检测结果表明本发明提供的荧光定量PCR灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。 
选择性能力分析：将突变型模板和野生型细胞系H1650的DNA浓度配制为20ng/μL，两者等体积混匀即为含50％突变型的DNA，用野生型DNA逐步稀释，配制成含20％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％突变型DNA的供试模板，取供试模板进行荧光定量PCR检测，结果表明，10ng样品DNA中含0.1％的突变DNA即可检出。 
重复性分析：每次反应加入突变型模板DNA10ng、1ng和100pg，重复10次荧光定量PCR检测，10次的Ct值相差不超过0.2个循环。 
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Figure ISA00000916991500011
Figure ISA00000916991500021
Figure ISA00000916991500051

Claims (7)

1.用于检测PIK3CA基因突变的特异性引物和探针，包括下列标签序列和10组30条引物和探针。 
(1)标签序列：taactactgtcgacactgacag 
(2)PIK3CA基因突变的特异性引物和探针核苷酸序列，见本发明说明书表2，P-SEQ-1～P-SEQ-30。 
2.一种检测PIK3CA基因突变的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的10组30条引物和探针。 
3.如权利要求2所述的检测PIK3CA基因突变的检测试剂盒，包括以下荧光定量PCR反应体系： 
Figure FSA00000916991200011
4.如权利要求2所述的检测PIK3CA基因突变的检测试剂盒，荧光定量PCR反应条件为： 
95℃预变性5分钟后进入以下循环：72℃15秒，95℃15秒，64℃45秒，进行15个循环；72℃15秒，95℃15秒，60℃45秒，共45个循环，荧光信号收集温度设定在退火温度。 
5.如权利要求2所述的检测PIK3CA基因突变的检测试剂盒，检测结果判定方法为：以HEX的信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明样品DNA中包含PIK3CA基因，且上样量在允许范围内，说明FAM的信号可信、有效；以FAM信号达到设定阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，当Ct值等于0或35时，检测结果判定为阴性，Ct值＜32时，检测结果为阳性。 
6.如权利要求2所述的检测PIK3CA基因突变的检测试剂盒，待检测样品包括新鲜病理组织、石蜡包埋病理组织、石蜡切片和血液。 
7.一种用于检测PIK3CA基因突变的引物和探针，其特征在于，由P-SEQ-1～P-SEQ-30的寡核苷酸引物和探针或序列与其有至少70％同一性的寡核苷酸组成。 
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