CN104513864A - 用于检测人类egfr基因突变的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及试剂盒。本发明的探针和引物共有7组，其可以准确检测人类EGFR基因上的29种常见突变。采用本发明引物和探针的试剂盒，其灵敏度高，在20ng野生型人类基因组的背景下可以检出1％的微量突变模板，减少了假阴性结果的出现。另外，所述试剂盒操作简便，可控性强，可进行大批量样品的检测，有利于临床操作。

Description

用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针及试剂盒。
背景技术
人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因位于人类7号染色体短臂7p12～14区，由28个外显子组成，该蛋白属于受体酪氨酸激酶(TKI)家族，存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞。EGFR可以激活酪氨酸激酶，从而打开下游信号通路最终介导细胞分化、生存、迁移、侵袭、黏附和细胞损伤修复等一系列过程,在肿瘤恶性生长中发挥重要作用。因此，EGFR成为肿瘤靶向治疗研究的一个重要靶点。
目前，临床上EGFR的靶向治疗主要基于小分子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)和单克隆抗体两种机制。其中，基于EGFR-TKI机制的吉非替尼(Gefitinib，商品名易瑞沙)和厄洛替尼(Erlotinib，商品名特罗凯)，是目前肿瘤患者最有效的靶向药物。但这些靶向药物并非对所有患者有效，EGFR敏感突变是药物有效的前提。临床研究结果表明，吉非替尼对EGFR外显子18、19或21发生突变的患者，有效率可达80％，而对野生型患者基本无效。此外，研究表明部分EGFR-TKI类药物初始治疗有效的患者在后期会发生耐药反应，这与EGFR20号外显子的突变密切相关，其中50％的EGFR-TKI耐药由外显子20的T790M点突变所致。
文献报道(Chan SK，et al，Eur J Cancer，2006，42(1)：17-23)，EGFR基因的酪氨酸激酶区存在多种突变，其中29种为常见突变(见表1)，主要集中在外显子18-21上，其中约90％存在于外显子19和21上，包括外显子19上747-750位氨基酸之间的19种常见缺失突变约占突变的45％；外显子21上的L858点突变约占突变的40-45％，这些位点也是中国人EGFR基因的热点突变(韩宇等，中华肿瘤学杂志，2007，29(4)：278-282；郭健等，中国肺癌杂志，2007，10(6)：504-507)。
由于EGFR-TKI类的靶向药物的价格昂贵，如果病人不携带EGFR突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查肿瘤患者是否携带EGFR突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。
目前，检测肿瘤组织中的EGFR突变的方法很多，其中，国内外主要采用的是基因测序技术。该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点：一是灵敏度低，一般需要突变基因丰度达到10％以上才能准确检测，对于低于10％的样品出现假阴性的结果。二是由于后续需要对PCR产物进行处理，容易出现污染，导致假阳性结果的出现。
因此，临床迫切需要开发一种快速准确、操作简便、灵敏度高和避免交叉污染的检测EGFR基因突变的试剂盒，满足临床用药和检测诊断的时效性要求。
突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system，ARMS)也叫等位基因特异性PCR，该法是在PCR基础上发展而成的，是一种直接用于点突变分析的PCR技术。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说处于至关重要的位置。根据这个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3’最末端，当反应进行时，如果引物3’末端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3’,5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的目的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测人类EGFR基因突变的引物及探针，其包含下列7组引物和探针中的任意一组或多组，具体为：
(1)正向引物：5’—CAAAAAGATCAAAGTGCTGAC—3’
正向引物：5’—CAAAAAGATCAAAGTGCTGA—3’
正向引物：5’—CAAAAAGATCAAAGTGCCGT—3’
反向引物：5’—ACAGCTTGCAAGGACTCTGG—3’
探针：5’—FAM/CCGGTGCGTTCGGCACGGTGTAT/BHQ1—3’；
(2)正向引物：5’—CACTGGGCAGCATGTGGC—3’
反向引物：5’—CAGCTGCCAGACATGAGAAA—3’
探针：5’—FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/BHQ1—3’
阻断核酸序列：
5’—CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-PO4—3’；
(3)正向引物：5’—CAGCGTGGCCAGCGTG—3’
正向引物：5’—TGATGGCCAGCGTGGACG—3’
正向引物：5’—TGATGGCCAGCGTGGACG—3’
反向引物：5’—AGGATCCTGGCTCCTTATCTC—3’
探针：5’—FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1—3’；
(4)正向引物：5’—GGAAGCCTACGTGATGGCCAT—3’
反向引物：5’—AGGATCCTGGCTCCTTATCTC—3’
探针：5’—FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1—3’；
(5)正向引物：5’—CTCCACCGTGCAGCTCATCAT—3’
反向引物：5’—AGGATCCTGGCTCCTTATCTC—3’
探针：5’—FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1—3’；
(6)正向引物：5’—GTCAAGATCACAGATTTTGGGCG—3’
反向引物：5’—AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG—3’
探针：5’—FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/BHQ1—3’；
(7)正向引物：5’—GATTTTGGGCTGGCCAAACA—3’
反向引物：5’—AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG—3’
探针：5’—FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/BHQ1—3’。
本发明的另一个目的是提供一种EGFR基因突变检测试剂盒，其由上述引物和探针、PCR混合反应液、1对质控引物、探针和内控系统组成。
在本发明进一步地实施方案中，所述PCR混合反应液包括：双组分热启动DNA聚合酶(化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶)、PCR Buffer、dNTPs、PCR增强剂、稳定剂、UNG酶等。
本发明的另一个目的是一种用于检测EGFR基因19号外显子的19种缺失突变的引物和探针，即Taqman探针结合阻断核酸序列的real-time PCR技术，所述引物和探针为：
正向引物：5’—CACTGGGCAGCATGTGGC—3’
反向引物：5’—CAGCTGCCAGACATGAGAAA—3’
探针：5’—FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/BHQ1—3’
阻断核酸序列：5’—CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-PO4—3’。
在本发明进一步地实施方案中，本发明还提供一种包含上述引物和探针的用于检测EGFR基因19号外显子的19种缺失突变的试剂盒，其由上述引物和探针、PCR混合反应液、1对质控引物、探针和内控系统组成。
本发明利用一对通用引物对EGFR基因19号外显子缺失突变区域序列进行特异性扩增，同时利用阻断核酸序列与待测样品中野生型DNA模板的特异结合，抑制该野生型DNA模板与引物探针的结合，仅实现缺失突变的特异性扩增，从而达到一次检测反应可检出19种缺失突变的一种或几种突变的效果。
上述发明均可使各位点的检测灵敏度达到1％。
本发明与现有的测序技术相比，具有下列优点：
(1)灵敏度更高，在20ng野生型人类基因组的背景下可以检出1％的微量突变模板，减少了假阴性结果的出现。
(2)全封闭反应，无需PCR产物后处理，避免了PCR产物的污染，减少了假阳性结果的出现，且避免了PCR反应液对操作员和环境的危害。
(3)检测速度快，从标本送检到出结果可在3个小时以内即可完成。
(4)结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析。
(5)操作简便，可控性强，可进行大批量样品的检测，有利于临床操作。
附图说明
图1本发明试剂盒对E746-A750del(2)突变型石蜡样本检测结果(突变检测管和质控管FAM信号)，突变检测管CT值23.27，质控管CT值16.78。
图2本发明试剂盒对E746-A750del(2)突变型石蜡样本检测结果(其余6管与质控管FAM信号)，其余6管CT值none，质控管CT值16.78。
图3本发明试剂盒对E746-A750del(2)突变型石蜡样本检测结果(突变检测管HEX信号(内控))，突变检测管HEX信号的CT值18.13，其余6管HEX信号与此结果几乎一致。
图4E746-A750del(2)突变型石蜡样本的测序验证结果。
具体实施方案
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明共包含8个PCR反应，将EGFR的4个外显子的29种突变分为7管进行检测，其中18号外显子的3种点突变在一管中检测，19号外显子的19种缺失突变在一管中检测，20号外显子的3种插入突变在一管中检测，20号外显子的S768I和T790M各自一管进行检测，21号外显子的L858R和L861Q各自一管进行检测。第8管为质控反应管。
本发明除19号外显子中含有一条阻滞核酸序列外，7个反应管中均包含PCR混合反应液SuperReal PreMix(Probe)，包括双组分热启动DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、PCR增强剂、稳定剂、UNG酶等，另外，特异性上下游引物、特异性TaqMan探针、内控上下游引物，内控TaqMan探针等组分。
实施例1本发明检测试剂盒的临床应用
1、质粒标准品的构建：本发明构建了EGFR基因29种突变型和野生型的质粒标准品，作为阳性质控，并用于前期PCR体系的构建。
2、配制PCR反应体系：
各反应管组分含量及终浓度如下：
7支突变检测管：
组分 体积(μL) 终浓度/L
ARMS上游引物 0.4 0.2μM
下游引物 0.4 0.2μM
TaqMan探针 0.25 0.125μM
内控引物F 0.4 0.2μM
内控引物R 0.4 0.2μM
内控TaqMan探针 0.25 0.125μM
2*SuperReal PreMix(Probe) 10 1*
H2O 5.9
1支质控管：
组分 体积(μL) 终浓度/L
质控引物F 0.4 0.2μM
质控引物R 0.4 0.2μM
质控TaqMan探针 0.25 0.125μM
2*SuperReal PreMix(Probe) 10 1*
H2O 6.95
3、临床样本基因组提取：本实施例是从非小细胞肺癌患者肺部及结直肠癌患者肠道石蜡包埋组织切片中提取DNA,并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用Qiagen公司的QIAamp石蜡包埋组织提取试剂盒(Cat No.56404)。
1)室温下平衡所有buffers。
2)水浴锅预热到70℃，buffer ATL、buffer AL 70℃溶解沉淀。
3)用手术刀整齐地切除组织样品周边的多余石蜡。
4)切下3～8片5-10μm厚的组织切片，放入1.5ml的离心管中，加入1ml二甲苯(xylene)，剧烈震荡10s。
5)室温下，20,000xg离心2min。
6)用移液枪移除上清液(舍弃)，注意不要移除任何沉淀。
7)添加1ml无水乙醇(95-100％)至沉淀中，震荡仪震荡混匀。
8)室温下，20,000xg离心2min。
9)用移液枪移除上清液(舍弃)，注意不要移除任何沉淀，用细小枪头尽量移除所有的无水乙醇。
10)打开管盖，37℃孵育10min，直到残余的无水乙醇全部蒸发掉。
11)将沉淀重新悬浮在180ul的buffer ATL中。添加20ul的蛋白酶K，震荡仪震荡混匀。12)56℃孵育1h，直到样品被buffer ATL完全溶解。
13)90℃孵育1h。
14)瞬时离心，将盖子上的液滴离心下来；离心管中添加2ul RNase A(100mg/ml)，室温孵育2min。
15)添加200ul的buffer AL，震荡仪立即充分震荡混匀。
16)添加200ul的无水乙醇，震荡仪立即充分震荡混匀。
17)瞬时离心，将盖子上的液滴离心下来。
18)将所有的溶解液转移到吸附柱中，6000xg离心1min，将吸附柱重新放置到新的收集管中。
19)向吸附柱中添加500ul的buffer AW1，6000xg离心1min；将吸附柱重新放置到新的收集管中。
20)向吸附柱中添加500ul的buffer AW2，6000xg离心1min将吸附柱重新放置到新的收集管中；20,000xg离心3min。
21)将吸附柱移至新的1.5ml离心管中，添加50μL的buffer ATE到吸附柱膜的中央。
22)室温孵育1min，20,000xg离心1min。
4、紫外分光光度计测定样本提取质量及浓度，并用H2O稀释至10ng/μL。
5、每孔各取2μL(20ng)提取基因组于试剂盒的8个反应管中进行qPCR反应。
6、优选的反应条件：50℃2min，95℃预变性15min；95℃变性5s，64℃退火15s(每循环一次温度下降1℃)，72℃延伸15s，10个循环；95℃变性5s，58℃退火15s(采集FAM、HEX通道的荧光信号)，72℃延伸15s，40个循环。
适用仪器为Bio-Rad CFX connect、Bio-Rad CFX 96。
7、结果判定：
1)突变检测管的内控HEX信号应升起，若内控系统HEX信号为阴性或部分管分析为阴性，说明加入样本含有PCR抑制剂或样本加入量不够，需要重新提取DNA后再做或增加样本加入量后再实验；但是如果管内FAM有信号，可能是由于突变的扩增抑制了内控序列的扩增，结果仍然可信。
2)质控管FAM信号CT＜16，提示样品加入量过高，需减少样本加入量再实验；质控管FAM信号CT＞21或阴性，提示该样本加入量过低或提取失败，需要增加样本量再实验或重新提取。
3)质控管FAM信号16≤CT≤21，
①相应ARMS引物管CT值＜25，该样本结果判读为阳性；
②相应ARMS引物管CT值＞阴性临界值(如下表)或者均无扩增曲线，该样本结果判读为阴性；
③相应ARMS引物管25≤CT值＜阴性临界值(如下表)，且其与质控管FAM信号的ΔCT≤△CT Cut-off值，该样本结果判读为阳性；反之则判读为阴性。
8、结果分析
41例石蜡样本中，共检测出22例突变型，其中L858R突变阳性13例，19-Del突变阳性7例，20-Ins突变阳性1例，T790M突变阳性1例；其余19例检测结果为阴性。在进行Taqman-ARMS检测的同时，本发明对上述样本同时进行了测序验证，结果表明，两种方法的检测一致率为100％。
实施例2
分别从实施例1中的41例病人的外周血、冰冻切片、新鲜组织中提取DNA，用于检测模板DNA，其他检测条件选择实施例1的实验条件，检测结果表明，外周血、冰冻切片、新鲜组织、石蜡切片中提取的模板DNA均可检测，结果与实施例1相同，并且差异性不大。
实施例3
采用实施例1制备的EGFR基因外显子19中的19种缺失突变型和野生型的质粒标准品，按照拷贝数百分比1％和10％的突变型质粒分别与野生型质粒混合(总质粒量为2.4*10-5ng)制备样本，采用实施例1的检测方法进行检测，具体结果如下：
表1
表2

Claims (5)

1.一种用于检测人类EGFR基因突变的引物及探针，其包含下列7组引物和探针中的任意一组或多组，具体为：
(1)正向引物：5’—CAAAAAGATCAAAGTGCTGAC—3’
正向引物：5’—CAAAAAGATCAAAGTGCTGA—3’
正向引物：5’—CAAAAAGATCAAAGTGCCGT—3’
反向引物：5’—ACAGCTTGCAAGGACTCTGG—3’
探针：5’—FAM/CCGGTGCGTTCGGCACGGTGTAT/BHQ1—3’；
(2)正向引物：5’—CACTGGGCAGCATGTGGC—3’
反向引物：5’—CAGCTGCCAGACATGAGAAA—3’
探针：5’—FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/BHQ1—3’
阻断核酸序列：
5’—CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-PO4—3’；
(3)正向引物：5’—CAGCGTGGCCAGCGTG—3’
正向引物：5’—TGATGGCCAGCGTGGACG—3’
正向引物：5’—TGATGGCCAGCGTGGACG—3’
反向引物：5’—AGGATCCTGGCTCCTTATCTC—3’
探针：5’—FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1—3’；
(4)正向引物：5’—GGAAGCCTACGTGATGGCCAT—3’
反向引物：5’—AGGATCCTGGCTCCTTATCTC—3’
探针：5’—FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1—3’；
(5)正向引物：5’—CTCCACCGTGCAGCTCATCAT—3’
反向引物：5’—AGGATCCTGGCTCCTTATCTC—3’
探针：5’—FAM/GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCT/BHQ1—3’；
(6)正向引物：5’—GTCAAGATCACAGATTTTGGGCG—3’
反向引物：5’—AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG—3’
探针：5’—FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/BHQ1—3’；
(7)正向引物：5’—GATTTTGGGCTGGCCAAACA—3’
反向引物：5’—AGCCTGGTCCCTGGTGTCAG—3’
探针：5’—FAM/CTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC/BHQ1—3’。
2.一种EGFR基因突变检测试剂盒，其由权利要求1所述的引物和探针、PCR混合反应液、1对质控引物、探针和内控系统组成。
3.根据权利要求2所述的EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述PCR混合反应液包括：双组分热启动DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、PCR增强剂、稳定剂、UNG酶。
4.一种用于检测EGFR基因19号外显子的19种缺失突变的引物和探针，所述引物和探针为：
正向引物：5’—CACTGGGCAGCATGTGGC—3’
反向引物：5’—CAGCTGCCAGACATGAGAAA—3’
探针：5’—FAM/GCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAG/BHQ1—3’
阻断核酸序列：5’—CGACAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAG-PO4—3’。
5.一种用于检测EGFR基因19号外显子的19种缺失突变的试剂盒，其由权利要求4所述的引物和探针、PCR混合反应液、1对质控引物、探针和内控系统组成。
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