CN108611412A - 一种egfr基因突变检测的引物探针组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种EGFR基因突变检测的引物探针组合及其应用，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括EGFR基因突变检测特异性引物对、EGFR基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；其中，所述EGFR基因的突变检测的位点为18‑21外显子突变位点。本发明对EGFR基因突变具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，可以对肿瘤组织样本进行检测，能够辅助临床治疗，具有重要价值。

Description

一种EGFR基因突变检测的引物探针组合及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种EGFR基因突变检测的引物探针组合及其应用。
背景技术
肺癌和结直肠癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，并已成为绝大多数国家癌症死亡的主要原因。其中以非小细胞肺癌(NSCLC)最常见。目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌(NSCLC)和结直肠癌临床治疗的重要手段。大量研究资料表明EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区(tyrosine kinase coding domain，TKI)的18-2l外显子上，而这些突变与吉非替尼药物反应性有关，原因可能是这些突变改变了EGFR胞内ATP结合区的结构，提高了EGFR对吉非替尼的结合能力。虽然已报道不下30种突变与药物反应有关，但是主要是19外显子的框内缺失(746-753)性突变，约占所有突变的45％；21外显子的替代突变(主要是L858R和L861Q)，约占所有突变的40-45％，目前普遍认为，这两个热点突变可以增强肿瘤细胞对TKI的敏感性，并且可作为TKI治疗的有效预测指标。18外显子G719X约占突变5％，20外显子插入突变占1％。2005年发现了能够从50％耐药病人身上检测到外显子20上的T790M突变。2013年证实了EGFR胞外区域的S492R突变可诱导结直肠癌患者使用西妥昔单抗无效，而该突变则对帕尼单抗的效用无影响。因此，检测EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值。
目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌(NSCLC)临床治疗的重要手段，而靶向药物的施用与EGFR基因突变有关。对非小细胞肺癌和结直肠癌患者细胞的19外显子缺失突变、20外显子的T790M和21外显子的L858R和L861Q点突变进行定性检测，检测结果用于辅助临床医生对非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤患者制定最为适合病人的个体化肿瘤治疗方案。
对EGFR突变的检测方法有直接测序法、突变体富集PCR、ARMS-PCR、高分辨率熔解曲线(HRM)以及TaqMan-MGB法等，直接测序敏感性低，费用高；突变富集体PCR容易造成PCR的污染而导致假阳性；HRM对模板的要求高，敏感度不高；TaqMan-PCR在敏感度和准确性上均有所提高，但是ARMS-MGB法要比TaqMan-PCR敏感度、准确性还高，且特异性很高。因此，利用与ARMS-MGB法荧光定量PCR技术检测EGFR突变能够可以筛选出抗EGFR(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。
ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System，突变扩增阻滞系统)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。ARMS技术利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因(即利用特异引物对突变靶序列进行高精准的PCR扩增放大)；同时利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测。
市场上已有采用ARMS-PCR的检测试剂，CN 105567854A公开了一种检测人EGFR、EGFR、BRAF基因突变的ARMS引物，其在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，使其成为双内参系统和双重判读规则的试剂盒。CN106755297A公开了一组基于ARMS荧光定量PCR检测EGFR基因T790M突变的引物组及其制备方法。该引物组包括T790M引物对、TaqMan-MGB探针、野生型下游引物，其中在T790M上游引物额外引入错配碱基，使其对野生型扩增效率下降。但现有的方法ARMS-PCR的检测试剂检测精准度和特异性不够高。
近年非常令人兴奋的是预测性基因检测的开展，利用基因检测技术在疾病发生前发现疾病发生的风险，提早预防，由于大部分肿瘤突变是体细胞突变，突变细胞常常与野生型细胞混合在一起，因此所获得的的DNA往往含大量的野生型背景，对体细胞突变的检测就需要一种高特异性和高灵敏度的检测方法。
因此，利用与ARMS-MGB法荧光定量PCR技术检测EGFR突变能够筛选出抗EGFR(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种EGFR基因突变检测的引物探针组合及其应用，所述试剂盒能够检测速度快，具有很高的特异性和灵敏度。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种EGFR基因突变检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括对EGFR基因突变检测特异性引物对、EGFR基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；
其中，所述EGFR基因突变检测特异性引物对的错配率为15-30％。
本发明中，发明人发现通过调节EGFR基因突变检测特异性引物的错配率，使得绝大部分野生型背景与突变型检测无法结合，且通过增加G-C碱基的错配，使得20bp左右的引物就能达到与Taqman MGB探针5-10℃的Tm差值，使得引物和探针的Tm差异符合MGB探针的设计原则，从而实现对样本中非特异性序列进行阻断扩增的目的，进一步提高检测的准确度和特异性，且仅仅只需要10ng的DNA样品就能够完成检测，检测灵敏度达到0.5％。
根据本发明，所述EGFR基因突变检测特异性引物对的错配率为15-30％，例如可以是15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％，优选为20-25％。
根据本发明，所述扩增阻断探针与EGFR基因突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为3-10bp，例如可以是3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或10bp，优选为6-9bp。
本发明中，阻碍探针与突变型的引物碱基长度基本一致，且序列3’端最后一个碱基与野生型序列一致，且3’端用磷酸基团封闭，从而抑制EGFR基因突变区野生型模板的非特异性扩增，大大增加EGFR突变检测的灵敏度和特异性。
根据本发明，所述EGFR基因的突变检测的位点为19号外显子的19种缺失突变、20号外显子的T790M、20号外显子3种插入突变、18号外显子的G719S、G719C、G719A、20号外显子的S768I、21号外显子的L858R和L861Q、胞外区域的S492R；具体的突变位点如下：2239_2247del9、2239_2248>C、2238_2248>GC、2235_2249del15、2236_2250del15、2237_2255>T、2239_2256del18、2240_2257del18、2239_2258>CA、2239_2251>C、2240_2251del12、2237_2251del15、2235_2252>AAT、2238_2252>GCA、2239_2253del15、2236_2253del18、2237_2254del18、2240_2254del15、2238_2255del18、L858R、T790M、2307_2308ins9、2310_2311insGGT、2319_2320insCAC、G719S、G719C、G719A、S768I、L858R、L861Q和S492R。
优选地，所述扩增阻断探针的5’端和3’端进行修饰。
优选地，所述扩增阻断探针的5’端修饰有荧光基团或硫代修饰。
本发明中，所述硫代修饰与3’端的磷酸化修饰或C3Spacer修饰对应，用于提高阻断探针的Tm值，有效的抑制了野生型基因的扩增，沉默了样本中非特异的连接，进一步提高检测的准确率。
优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为NED。
优选地，所述扩增阻断探针的3’端修饰有淬灭基团、磷酸化修饰或spacer修饰。
优选地，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate(PS)中的任意一种或至少两种的组合，优选为MGB。
本发明中，发明人发现采用MGB作淬灭基团可以将探针的Tm值提高6-10℃左右，提高配对与非配对模板间的Tm值差异，用这种探针可以降低本底，因此检测的重复性和准确度得以大大提高，但由于MGB对碱基数量有要求，碱基过长，MGB会发生淬灭，所以有些探针采用硫代和磷酸化、C3 Spacer修饰来提高Tm值。
优选地，所述EGFR基因特异性探针的5’端和3’端进行修饰。
优选地，所述EGFR基因特异性探针的5’端修饰有荧光基团，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM。
优选地，所述EGFR基因特异性探针的3’端修饰淬灭集团，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate(PS)中的任意一种或至少两种的组合，优选为MGB。
根据本发明，所述EGFR基因突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-36所示，具体序列如下表1所示：
表1
本发明中，所述SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35中的I指的是脱氧次黄嘌呤，与其它碱基结合时会比其它碱基错配相对更稳定；脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC>dI:dA>dI:dG>dI:dT，在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dC结合。
根据本发明，所述EGFR基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.37-42所示，具体序列如下：
EGFR基因19外显子的19个位点(具体包括：2239_2247del9、2239_2248>C、2238_2248>GC、2235_2249del15、2236_2250del15、2237_2255>T、2239_2256del18、2240_2257del18、2239_2258>CA、2239_2251>C、2240_2251del12、2237_2251del15、2235_2252>AAT、2238_2252>GCA、2239_2253del15、2236_2253del18、2237_2254del18、2240_2254del15和2238_2255del18)的特异性探针(SEQ ID NO.37)为：CAGAGCCATGGACC；
EGFR基因21外显子的L858R和L861Q位点特异性探针(SEQ ID NO.38)为：CCTTCTGCATGGTATTC；
EGFR基因20外显子的T790M、2307_2308ins9、2310_2311insGGT和2319_2320insCAC位点的特异性探针(SEQ ID NO.39)为：AGGAGGCAGCCGAA；
EGFR基因18外显子的G719S、G719C和G719A位点的特异性探针(SEQ ID NO.40)为：CCCAGCTTGTGGAGCC；
EGFR基因20外显子的S768I位点的特异性探针(SEQ ID NO.41)为：TCTGGCCACCATGC；
EGFR基因胞外区域的S492R位点的特异性探针(SEQ ID NO.42)为：CTGTTTGGGACCTCCG。
优选地，所述扩增阻断探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.43-51所示，具体序列如下：
EGFR基因外显子19的2239_2247del9、2239_2248>C、2238_2248>GC、2235_2249del15、2236_2250del15、2237_2255>T、2239_2256del18、2240_2257del18和2239_2258>CA位点扩增阻断探针(SEQ ID NO.43)为：GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA(5’前三碱基硫代，3’端磷酸化)；
本发明中，5’前三碱基硫代是防止核酸外切酶进行酶切，采用3个硫代才能保证不被核酸外切酶进行酶切。EGFR基因外显子19的2239_2251>C、2240_2251del12、2237_2251del15、2235_2252>AAT、2238_2252>GCA、2239_2253del15、2236_2253del18、2237_2254del18、2240_2254del15和2238_2255del18位点的扩增阻断探针(SEQ ID NO.44)为：GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAA(5’前三碱基硫代，3’端C3Spacer修饰)；
EGFR基因外显子21的L858R位点的扩增阻断探针(SEQ ID NO.45)为：TTGGGCTGGCCAA；
EGFR基因外显子20的T790M位点的扩增阻断探针(SEQ ID NO.46)为：CTCATCACGCAGCTC；
EGFR基因外显子20的2307_2308ins9、2310_2311insGGT和2319_2320insCAC位点的扩增阻断探针(SEQ ID NO.47)为：ACAACCCCCACGTGTGCC(5’前三碱基硫代，3’端C3Spacer修饰)；
本发明中，5’前三碱基硫代是防止核酸外切酶进行酶切，3’端C3Spacer修饰是留下空间，阻止产物继续延伸扩增；采用3个硫代才能保证不被核酸外切酶进行酶切。
EGFR基因外显子18的G719S、G719C和G719A位点的扩增阻断探针(SEQ ID NO.48)为：CGGAGCCCAGCAC；
EGFR基因外显子20的S768I位点的扩增阻断探针(SEQ ID NO.49)为：CACGCTGGCCAT；
EGFR基因外显子21的L861Q位点的扩增阻断探针(SEQ ID NO.50)为：CCAAACTGCTGGGT；
EGFR基因胞外区域的S492R位点扩增阻断探针(SEQ ID NO.51)为：TGTTGCTTATAATTT。
优选地，所述内参系统包括内参引物对和内参探针。
优选地，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.52-53所示，具体序列如下：
正向引物(SEQ ID NO.52)：GCGGGTTGTCCTTGAGAAAC；
反向引物(SEQ ID NO.53)：AATGGTCCACCCGGTACATC.
优选地，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示，具体序列如下：CACAGAACTCGGGACC.
第二方面，本发明提供一种检测EGFR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合物。
根据本发明，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂。
优选地，所述阴性质控为TE缓冲液。
优选地，所述阳性质控为EGFR基因19外显子2240-2257del18突变质粒，所述突变质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示，具体序列如下：
ACTTTATAACAGGCTTTACAAGCTTGAGATTCTTTTATCTAAATAATCAGTGTGATTCGTGGAGCCCAACAGCTGCAGGGCTGCGGGGGCGTCACAGCCCCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTTTCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTATAACTCCCTCCCCTTAGAGACAGCACTGGCCTCTCCCATGCTGGTATCCACCCCAAAAGGCTGGAAACAGGCAATTACTGGCATCTACCCAGCACTAGTTTCTTGACACGCATGACGAGTGA.
优选地，所述辅助试剂为Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液。
第三方面，本发明提供一种利用如第二方面所述的试剂盒用于检测EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、EGFR基因突变检测特异性引物对、EGFR基因特异性探针、扩增阻断探针、内参引物对、内参探针、阳性质控和阴性质控；
(3)PCR扩增。
根据本发明，所述MgCl2的浓度为1-5mM，例如可以是1mM、2mM、3mM、4mM或5mM，优选为2-4mM。
优选地，所述dNTPs的浓度为0.1-1mM，例如可以是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1mM，优选为0.1-0.8mM。
优选地，所述Taq酶的浓度为0.5-2U/μl，例如可以是0.5U/μl、0.6U/μl、0.7U/μl、0.8U/μl、0.9U/μl、1U/μl、1.2U/μl、1.3U/μl、1.4U/μl、1.5U/μl、1.6U/μl、1.7U/μl、1.8U/μl、1.9U/μl或2U/μl。
优选地，所述EGFR基因突变检测特异性引物对的浓度为50-900nM，例如可以是50nM、80nM、100nM、150nM、180nM、200nM、250nM、280nM、300nM、320nM、350nM、380nM、400nM、420nM、450nM、480nM、500nM、550nM、580nM、600nM、650nM、680nM、700nM、750nM、800nM、850nM、880nM或900nM，优选为200-600nM。
优选地，所述EGFR基因特异性探针的浓度为100-400nM，例如可以是100nM、150nM、180nM、200nM、250nM、280nM、300nM、320nM、350nM、380nM或400nM，优选为100-200nM。
优选地，所述扩增阻断探针的浓度为100-2000nM，例如可以是100nM、150nM、180nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM、1100nM、1200nM、1300nM、1400nM、1500nM、1600nM、1700nM、1800nM、1900nM、1950nM或2000nM，优选为300-2000nM。
优选地，所述内参引物对的浓度为300-900nM，例如可以是300nM、320nM、350nM、380nM、400nM、420nM、450nM、480nM、500nM、550nM、580nM、600nM、650nM、680nM、700nM、750nM、800nM、850nM、880nM或900nM，优选为400-600nM。
优选地，所述内参探针的浓度为100-400nM，例如可以是100nM、150nM、180nM、200nM、250nM、280nM、300nM、320nM、350nM、380nM或400nM，优选为100-200nM。
优选地，所述阳性质控的浓度为200-1000copies/μl，例如可以是200copies/μl、230copies/μl、250copies/μl、280copies/μl、300copies/μl、320copies/μl、350copies/μl、380copies/μl、400copies/μl、420copies/μl、450copies/μl、480copies/μl、500copies/μl、520copies/μl、550copies/μl、580copies/μl、600copies/μl、620copies/μl、650copies/μl、680copies/μl、700copies/μl、720copies/μl、750copies/μl、780copies/μl、800copies/μl、820copies/μl、850copies/μl、880copies/μl、900copies/μl、920copies/μl、950copies/μl、980copies/μl或1000copies/μl，优选为300-600copies/μl。
根据本发明，步骤(3)所述的PCR扩增的条件为：
a)95℃预变性2min；
b)95℃变性15s，58℃延伸1min，5个循环；
c)95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环。
1)试剂盒有效性的判定：
阳性对照组有效：阳性对照组在ABI7500的FAM通道下均有典型的扩增曲线，确认无误后通过调节阈值将PC的Ct值均调至24±0.2，并将此阈值作为待检样本的阈值；
阴性对照组有效：阴性对照组在ABI7500的FAM通道下均无典型的扩增曲线或无Ct值，否则可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测。
2)检测样本有效性的判定：
若Ct值在18-25之间，表明加入的DNA量正常；
若Ct≤18，表明所加样本DNA过量，需稀释后在检测；
若Ct＞25，说明加入的样本DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量不够，需重新提取DNA后再检测。
3)根据本发明，所述PCR结果突变的判定如下：
对于2307_2308ins9、2310_2311insGGT和2319_2320insCAC突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于30，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于30，则为阴性结果；
对于2239_2247del9、2239_2248>C、2238_2248>GC、2235_2249del15、2236_2250del15、2237_2255>T、2239_2256del18、2240_2257del18和2239_2258>CA突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于31，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于31，则为阴性结果；
对于2239_2251>C、2240_2251del12、2237_2251del15、2235_2252>AAT、2238_2252>GCA、2239_2253del15、2236_2253del18、2237_2254del18、2240_2254del15、2238_2255del18和S768I突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于32，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于32，则为阴性结果；
对于G719S、G719C和G719A突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于33，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于33，则为阴性结果；
对于T790M突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于34，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于34，则为阴性结果；
对于S492R、L858R和L861Q突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于35，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于35，则为阴性结果。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合和/或如第二方面所述的试剂盒用于制备辅助临床诊断、肿瘤相关靶向药物或非小细胞肺癌和/或结直肠癌癌分子诊断试剂和/或药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明通过特异选择了EGFR基因的30个突变位点，增加了扩增阻碍探针，有效的抑制了野生型基因的扩增，可从野生型背景中检测到1％突变等位基因，增加了一根3‘端进行磷酸化修饰的阻断探针，沉默了样本中非特异的连接，实现了高度的反应特异性和灵敏度沉默了样本中的野生型背景，很大程度提高了检测的灵敏度和特异性；
(2)本发明调节EGFR基因突变检测特异性引物的错配率，使得引物和探针的Tm有差异，实现对样本中非特异性序列进行阻断扩增的目的，进一步提高检测的准确度和特异性，且仅仅只需要10ng的DNA样品就能够完成检测，检测灵敏度达到0.5％；
(3)本发明试剂盒包含内参系统，更具有科学性和可靠性，更高的特异性和灵敏度，且本发明试剂盒检测速度快，全部检测过程只需要两个小时即可完成，检测通量大，一台仪器一次可完成48人份的检测；
(4)本发明对仪器设备的要求低，两通道的荧光定量PCR仪即可胜任检测工作，利于大规模的市场推广应用。
附图说明
图1为本发明肺癌样本19外显子2239_2247del9、2239_2248>C、2238_2248>GC、2235_2249del15、2236_2250del15、2237_2255>T、2239_2256del18、2240_2257del18、2239_2258>CA突变检测结果；
图2为本发明肺癌样本19外显子2239_2251>C、2240_2251del12、2237_2251del15、2235_2252>AAT、2238_2252>GCA、2239_2253del15、2236_2253del18、2237_2254del18、2240_2254del15、2238_2255del18突变检测结果；
图3为本发明肺癌样本21外显子L858R突变检测结果；
图4为本发明肺癌样本20外显子L858R突变检测结果；
图5为本发明肺癌样本18外显子G719X突变检测结果；
图6为本发明2239_2247del9突变位点检测灵敏度结果图；
图7为本发明2239_2248>C突变位点检测灵敏度结果图；
图8为本发明2238_2248>GC突变位点检测灵敏度结果图；
图9为本发明2235_2249del15突变位点检测灵敏度结果图；
图10为本发明2236_2250del15突变位点检测灵敏度结果图；
图11为本发明2237_2255>T突变位点检测灵敏度结果图；
图12为本发明2239_2256del18突变位点检测灵敏度结果图；
图13为本发明2240_2257del18突变位点检测灵敏度结果图；
图14为本发明2239_2258>CA突变位点检测灵敏度结果图；
图15为本发明2239_2251>C突变位点检测灵敏度结果图；
图16为本发明2240_2251del12突变位点检测灵敏度结果图；
图17为本发明2237_2251del15>C突变位点检测灵敏度结果图；
图18为本发明2235_2252>AAT突变位点检测灵敏度结果图；
图19为本发明2238_2252>GCA突变位点检测灵敏度结果图；
图20为本发明2239_2253del15/2240_2254del15突变位点检测灵敏度结果图；
图21为本发明2236_2253del18突变位点检测灵敏度结果图；
图22为本发明2240_2254del15突变位点检测灵敏度结果图；
图23为本发明2238_2255del18突变位点检测灵敏度结果图；
图24为本发明L858R突变位点检测灵敏度结果图；
图25为本发明T790M突变位点检测灵敏度结果图；
图26为本发明2307_2308ins9突变位点检测灵敏度结果图；
图27为本发明2310_2311insGGT突变位点检测灵敏度结果图；
图28为本发明2319_2320insCAC突变位点检测灵敏度结果图；
图29为本发明G719S突变位点检测灵敏度结果图；
图30为本发明G719C突变位点检测灵敏度结果图；
图31为本发明G719A突变位点检测灵敏度结果图；
图32为本发明S768I突变位点检测灵敏度结果图；
图33为本发明L861Q突变位点检测灵敏度结果图；
图34为本发明S492R突变位点检测灵敏度结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1试剂盒的组装
引物探针组合的设计，具体序列如下表2所示：
表2
其中，所述EGFR基因突变检测特异性引物对的错配率为24％，所述扩增阻断探针与EGFR基因突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为8bp；
阴性质控品：所述阴性质控为TE缓冲液；
阳性质控品：EGFR基因突变质粒，所述突变质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示，具体序列如下：
ACTTTATAACAGGCTTTACAAGCTTGAGATTCTTTTATCTAAATAATCAGTGTGATTCGTGGAGCCCAACAGCTGCAGGGCTGCGGGGGCGTCACAGCCCCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTTTCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTATAACTCCCTCCCCTTAGAGACAGCACTGGCCTCTCCCATGCTGGTATCCACCCCAAAAGGCTGGAAACAGGCAATTACTGGCATCTACCCAGCACTAGTTTCTTGACACGCATGACGAGTGA；
辅助试剂：Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液；
将上述组分、说明书及离心管组装后装入试剂盒中。
实施例2EGFR基因突变检测
采用实施例1中的试剂盒进行EGFR基因突变检测，包括如下步骤：
(1)样本DNA提取：
取非小细胞肺癌肿瘤(样本1)和结直肠癌(样本2)的石蜡包埋病理组织切片，使用QIAGEN的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat.no.56404)提取石蜡包埋组织切片样本，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度应在3.3～13.2ng/ul之间；
(2)配制体系，具体的体系组成如下表3所示：
表3
向上述反应体系中加入步骤(1)提取的DNA样本，DNA样本量小于15ng，加入至对应的PCR反应孔中，封上荧光定量PCR级别的封闭膜或盖上管盖，以2000rpm/min，离心30s，以确保反应混合液全部离入管底；
(3)将步骤(2)体系放入PCR仪，进行PCR扩增，具体的扩增条件如表4所示：
表4
阶段2的检测荧光通道为FAM，运行PCR反应程序，保存文件；
(4)结果判定：
1)试剂盒有效性的判定：
阳性对照组有效：阳性对照组在ABI7500的FAM通道下应均有典型的扩增曲线，确认无误后通过调节阈值将PC的Ct值均调至24±0.2，并将此阈值作为待检样本的阈值；
阴性对照组有效：阴性对照组在ABI7500的FAM通道下应均无典型的扩增曲线或无Ct值，否则可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测；
2)检测样本有效性的判定：
若Ct值在18-25之间，表明加入的DNA量正常；
3)根据本发明，所述PCR结果突变的结果如图1-图34所示；
从图1-图5可以看出，EGFR基因突变检测试剂盒检测非小细胞肺癌肿瘤(样本1)和结直肠癌(样本2)的阳性样本时，有典型的扩增曲线，其中针对各位点具体如下：
2307_2308ins9、2310_2311insGGT和2319_2320insCAC突变位点，Ct值＜30；
2239_2247del9、2239_2248>C、2238_2248>GC、2235_2249del15、2236_2250del15、2237_2255>T、2239_2256del18、2240_2257del18和2239_2258>CA突变位点，Ct值＜31；
2239_2251>C、2240_2251del12、2237_2251del15、2235_2252>AAT、2238_2252>GCA、2239_2253del15、2236_2253del18、2237_2254del18、2240_2254del15、2238_2255del18和S768I，Ct值＜32；
G719S、G719C和G719A突变位点，Ct值＜33；
T790M突变位点，Ct值＜34；
L858R、L861Q和S492R突变位点，Ct值＜35；
无非特异性扩增，且准确度达到0.5％；
从图6-图34可以看出，在293细胞基因组DNA中加入1％、2％、10％、50％的EGFR基因对应检测位点的突变质粒时，有典型的扩增曲线，其中针对各位点具体如下：
2307_2308ins9、2310_2311insGGT和2319_2320insCAC突变位点，Ct值＜30；
2239_2247del9、2239_2248>C、2238_2248>GC、2235_2249del15、2236_2250del15、2237_2255>T、2239_2256del18、2240_2257del18和2239_2258>CA突变位点，Ct值＜31；
2239_2251>C、2240_2251del12、2237_2251del15、2235_2252>AAT、2238_2252>GCA、2239_2253del15、2236_2253del18、2237_2254del18、2240_2254del15、2238_2255del18和S768I，Ct值＜32；
G719S、G719C和G719A突变位点，Ct值＜33；
T790M突变位点，Ct值＜34；
L858R、L861Q和S492R突变位点，Ct值＜35；
无非特异性扩增，且准确度达到0.5％。
实施例3
与实施例1-2相比，仅仅所述扩增阻断探针与EGFR基因突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为2bp，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，则检测样本出现非特异性扩增。
实施例4
与实施例1-2相比，仅仅所述扩增阻断探针与EGFR基因突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为12bp，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，则阻断探针与下游引物结合性增强，导致下游引物与上游引物结合率降低，扩增曲线荧光高度下降。
实施例5
与实施例1-2相比，仅仅所述淬灭基团选自BHQ-1，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，猝灭基团BHQ-1的特异性没有MGB好，检测样本会出现轻微的非特异性。
对比例1
与实施例1-2相比，仅仅所述EGFR基因突变检测特异性引物对的错配率为10％，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，则检测样本检测限高，准确度降低，达到3％。
对比例2
与实施例1-2相比，仅仅所述EGFR基因突变检测特异性引物对的错配率为35％，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，发现该对比例PCR结果无荧光，无法完成PCR。
综上所述，本发明通过调节EGFR基因突变检测特异性引物的错配率，使得引物和探针的Tm有差异，实现对样本中非特异性序列进行阻断扩增的目的，进一步提高检测的准确度和特异性，且仅仅只需要10ng的DNA样品就能够完成检测，检测灵敏度达到0.5％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种EGFR基因突变检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括对EGFR基因突变检测特异性引物对、EGFR基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；
其中，所述EGFR基因突变检测特异性引物对的错配率为15-30％。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述EGFR基因突变检测特异性引物对的错配率为20-25％；
优选地，所述扩增阻断探针与EGFR基因突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为3-10bp，优选为6-9bp；
优选地，所述EGFR基因的突变检测的位点为2239_2247del9、2239_2248>C、2238_2248>GC、2235_2249del15、2236_2250del15、2237_2255>T、2239_2256del18、2240_2257del18、2239_2258>CA、2239_2251>C、2240_2251del12、2237_2251del15、2235_2252>AAT、2238_2252>GCA、2239_2253del15、2236_2253del18、2237_2254del18、2240_2254del15、2238_2255del18、L858R、T790M、2307_2308ins9、2310_2311insGGT、2319_2320insCAC、G719S、G719C、G719A、S768I、L861Q和S492R。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述扩增阻断探针的5’端和3’端进行修饰；
优选地，所述扩增阻断探针的5’端修饰有荧光基团或硫代修饰；
优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为NED；
优选地，所述扩增阻断探针的3’端修饰有淬灭基团、磷酸化修饰或C3Spacer修饰；
优选地，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合，优选为MGB；
优选地，所述EGFR基因特异性探针的5’端和3’端进行修饰；
优选地，所述EGFR基因特异性探针的5’端修饰有荧光基团；
优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM；
优选地，所述EGFR基因特异性探针的3’端修饰淬灭集团；
优选地，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合，优选为MGB。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合，其特征在于，所述EGFR基因突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-36所示；
优选地，所述EGFR基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.37-42所示；
优选地，所述扩增阻断探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.43-51所示；
优选地，所述内参系统包括内参引物对和内参探针；
优选地，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.52-53所示；
优选地，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示。
5.一种检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂；
优选地，所述阴性质控为TE缓冲液；
优选地，所述阳性质控为EGFR基因19外显子2240-2257del18突变质粒，所述突变质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示；
优选地，所述辅助试剂为Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液。
7.一种利用如权利要求5或6所述的试剂盒用于检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、EGFR基因突变检测特异性引物对、EGFR基因特异性探针、扩增阻断探针、内参引物对、内参探针、阳性质控和阴性质控；
(3)PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述MgCl2的浓度为1-5mM，优选为2-4mM；
优选地，所述dNTPs的浓度为0.1-1mM，优选为0.1-0.8mM；
优选地，所述Taq酶的浓度为0.5-2U/μl；
优选地，所述EGFR基因突变检测特异性引物对的浓度为50-900nM，优选为200-600nM；
优选地，所述EGFR基因特异性探针的浓度为100-400nM，优选为100-200nM；
优选地，所述扩增阻断探针的浓度为100-2000nM，优选为300-2000nM；
优选地，所述内参引物对的浓度为300-900nM，优选为400-600nM；
优选地，所述内参探针的浓度为100-400nM，优选为100-200nM；
优选地，所述阳性质控的浓度为200-1000copies/μl，优选为300-600copies/μl。
9.根据根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的PCR扩增的条件为：
a)95℃预变性2min；
b)95℃变性15s，58℃延伸1min，5个循环；
c)95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环；
优选地，所述PCR结果的判定如下：
对于2307_2308ins9、2310_2311insGGT和2319_2320insCAC突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于30，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于30，则为阴性结果；
对于2239_2247del9、2239_2248>C、2238_2248>GC、2235_2249del15、2236_2250del15、2237_2255>T、2239_2256del18、2240_2257del18和2239_2258>CA突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于31，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于31，则为阴性结果；
对于2239_2251>C、2240_2251del12、2237_2251del15、2235_2252>AAT、2238_2252>GCA、2239_2253del15、2236_2253del18、2237_2254del18、2240_2254del15、2238_2255del18和S768I突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于32，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于32，则为阴性结果；
对于G719S、G719C和G719A突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于33，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于33，则为阴性结果；
对于T790M突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于34，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于34，则为阴性结果；
对于L858R、L861Q和S492R突变位点，若结果检测通道的Ct值不大于35，则为阳性结果；若结果检测通道的Ct值大于35，则为阴性结果。
10.一种如权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合和/或如权利要求5或6所述的试剂盒用于制备辅助临床诊断、肿瘤相关靶向药物或非小细胞肺癌和/或结直肠癌癌分子诊断试剂和/或药物中的应用。
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Effective date of registration: 20230925

Granted publication date: 20211217

Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Wuxi Huishan branch

Pledgor: WUXI SHENRUI BIO-PHARMACEUTICALS Co.,Ltd.

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