CN101506385A - 检测血液样品中egfr突变的方法 - Google Patents

检测血液样品中egfr突变的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101506385A
CN101506385A CNA2007800316040A CN200780031604A CN101506385A CN 101506385 A CN101506385 A CN 101506385A CN A2007800316040 A CNA2007800316040 A CN A2007800316040A CN 200780031604 A CN200780031604 A CN 200780031604A CN 101506385 A CN101506385 A CN 101506385A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
nucleic acid
sudden change
egfr
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007800316040A
Other languages
English (en)
Inventor
拉斐尔·罗赛尔克斯塔
米格尔·达荣洛卡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pangaea Biotech SL
Original Assignee
Pangaea Biotech SL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pangaea Biotech SL filed Critical Pangaea Biotech SL
Publication of CN101506385A publication Critical patent/CN101506385A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/173—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties staining/intercalating agent, e.g. ethidium bromide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及个体血液(血清/血浆)样品中EGFR突变的检测。所述方法包括：(i)从所述样品获得DNA；(ii)利用蛋白－核酸探针，通过PCR扩增对应于EGFR基因特异区域的核酸序列；和(iii)检测所述突变。

Description

检测血液样品中EGFR突变的方法
发明领域
本发明涉及个体血液(血清/血浆)样品中EGFR突变的检测。
背景技术
在男性和女性中，肺癌均是癌相关死亡的主要原因。肺癌的患病率仅次于男性的前列腺癌和女性的乳腺癌。最近肺癌超过心脏病成为吸烟相关死亡的主要原因。此外，患有肺癌的大部分患者吸烟，并且其心脏和肺受到吸烟相关的损害，使选择积极手术或者综合治疗不太可行。大部分肺癌是在晚期被诊断的，造成预后较差。
非小细胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的大约75％。NSCLC是组织的异质聚集。最常见的组织结构是表皮样癌或者鳞状癌、腺癌和大细胞癌。
已经进行了数项研究来鉴定临床、实验室和分子标志物，以帮助临床医生和研究人员区分NSCLC患者的亚组。按照这个线索，已经证明40-80％的非小细胞肺癌和许多其他上皮癌中表皮生长因子受体(EGFR)过表达。
异常的表皮生长因子受体(EGFR)信号转导对于限制针对抗癌剂的敏感性非常重要，而不依赖于配体的EGFR酪氨酸激酶激活常常是由胞外结构域的EGFR突变引起的，在各种肿瘤类型诸如多形性胶质母细胞瘤中已经观察到所述突变。EGFR信号转导是由生长因子诸如表皮生长因子(EGF)的结合引发的。受体通过其酪氨酸激酶结构域的自体磷酸化和转磷酸作用导致下游效应物的募集，以及增殖信号和细胞存活信号的激活。
两种突变占据了迄今为止报道的肺腺癌EGFR突变的约90％。在白种人中，最常见的突变类型是外显子19中9、12、15、18或者24个核苷酸的短的框内缺失，这在大约65％的EGFR突变病例中可以观察到。第二种最常见的突变(可以在大约35％的EGFR突变病例中观察到)是外显子21中核苷酸2573的点突变(CTG到CGG)，导致密码子858(L858R)的亮氨酸被精氨酸取代，所述密码子858接近于激酶活化环中羧基端小叶的DFG基序。
这些EGFR突变纯粹是NSCLC的体细胞突变，并没有在其他原发肿瘤类型中鉴定出。此外，EGFR突变是非小细胞肺癌(NSCLC)中对吉非替尼(gefitinib)的肿瘤反应的主要决定因素。关于外显子18、20和21中其他不太常见的突变也有描述。
到目前为止，对这些突变的筛选基于直接测序或者单链构象多态性分析。核酸扩增方法(例如，聚合酶链式反应)允许在正常分子的背景下检测少量突变分子。尽管检测少量肿瘤细胞的替代方法(诸如流式细胞术)通常限于血液恶性肿瘤，但在恶性细胞鉴定和化疗后的预后预测方面，核酸扩增分析法被证明具有灵敏性和特异性。
已经开发出各种检测实体瘤组织中少量突变分子的核酸扩增策略。例如，一种鉴定突变ras原癌基因DNA的灵敏和特异性方法基于无法切割关键的第12密码子的限制性位点(Kahn et al.Rapid and sensitivenonradioactive detection of mutant K-ras genes via′enriched′PCRamplification(通过“富集”PCR扩增对突变K-ras基因的快速和灵敏的非放射性检测).Oncogene.1991 Jun；6(6)：1079-83)。类似的实验步骤可被用于检测肿瘤中DNA的任意突变区，允许检测其他原癌基因DNA或者肿瘤相关的DNA。因为不仅可以在原发癌，而且可以在前体病灶和转移部位中检测到突变的DNA，所以核酸扩增分析法提供了在疾病早期及晚期检测和监测癌症的方法。
其他研究利用核酸扩增试验分析癌症患者的外周血，以检测从患者的循环癌细胞中提取的胞内DNA。但是，必须强调这些研究尝试用基于核酸的扩增试验来检测从循环癌细胞内提取的胞内DNA。所述分析利用全血内的细胞沉淀或者细胞对癌症患者血液的细胞部分进行，而血清或者血浆部分在分析前通常被忽视或者丢弃。因为这类方法需要转移性循环癌细胞的存在(对于非血液肿瘤来说)，所以它在癌症早期患者中的临床使用受到限制，而且它不能用于检测非血液、非侵袭性的肿瘤或者癌前状态。
在现有技术中已知小的但数量显著的正常DNA在健康人的血液中循环，但在癌症状态发现所述数量增加。现有技术公开了可以在癌症患者的外周血血浆或者血清中检测到突变的原癌基因DNA。但是，这些报道通常也只限于患有晚期癌症或者已知肿瘤性或者增殖性疾病的患者。一些作者(Kimura et al.，2006.EGFR Mutation of Tumor andSerum in Gefitinib-Treated Patients with Chemotherapy-Naive Non-smallCell Lung Cancer(用吉非替尼治疗的患有初次接受化疗的非小细胞肺癌的患者的肿瘤和血清中的EGFR突变))描述了在NSCLC患者的血清样品中能够检测到EGFR基因的突变。所述文献描述了利用位于所述突变侧翼的引物，通过PCR和测序检测这类突变。
发明概述
本发明涉及在个体血液样品中检测EGFR基因突变的方法，所述方法包括：
(i)从所述样品获得DNA；
(ii)利用蛋白-核酸探针，通过PCR扩增对应于EGFR基因特异区域的核酸序列；和
(iii)检测所述突变。
本文中，发明人开发和证实了用于检测血浆/血清样品中最常见EGFR突变的基于聚合酶链式反应(PCR)的分析法。利用蛋白-核酸(PNA)探针，通过增强待分析样品中突变等位基因的扩增，该分析法提供比标准方法更高的分析灵敏度，其中使用所述突变侧翼的引物进行PCR扩增以及进一步的测序分析。因此，本文提供有效和可获得的方法来快速鉴定大部分肺癌患者，所述患者有可能对特异性EGFR抑制剂产生应答。
此外，尽管肿瘤组织的直接分析常常是困难或者不可能的(诸如潜伏的、未被认定的疾病)，如上所述的方法在利用血液诸如外周血检测所述突变方面具有优势。外周血可以轻易获得，并适于基于核酸的分析。
发明详述
为了便于理解本说明书，将在下面解释本发明范围内一些术语和表达的含义：
术语“个体”表示任意年龄或者种族的男性或者女性人类。优选地，它包括患有或者被怀疑患有非小细胞肺癌(NSCLC)的人。对于医学领域的普通技术人员来说，NSCLC的诊断方法和NSCLC诊断的临床描述是公知的。例如，鉴定被怀疑患有NSCLC的个体的方法可以包括身体检查、个体的家族病史，个体的病史，肺活检，或者大量成像技术诸如超声检查。
术语“核酸”涉及包括核苷或者核苷类似物的多体化合物，所述核苷或者核苷类似物具有含氮杂环碱基或者碱基类似物，它们通过磷酸二酯键连接形成多核苷酸。
术语“DNA”是指脱氧核糖核酸。DNA序列是脱氧核糖核苷酸序列。DNA是核苷酸的长聚合物，利用遗传密码编码蛋白的氨基酸残基序列。
术语“蛋白-核酸探针”是指合成的DNA类似物，其中磷酸二酯骨架被N-(2-氨基乙基)甘氨酸的重复单元取代，嘌呤和嘧啶碱基通过甲基羰基连接子与其连接。
一方面，本发明涉及方法，在本文中被称为“本发明的方法”，用于在个体的血液样品中检测EGFR基因的突变，所述方法包括：
(i)从所述样品获得DNA；
(ii)利用蛋白-核酸探针，通过PCR扩增对应于EGFR基因特异区域的核酸序列；和
(iii)检测所述突变。
本发明的方法可用于检测EGFR基因的任意突变。在本发明的特定实施方式中，待检测的EGFR基因突变选自：外显子19的ELREA缺失，外显子21的L858R突变和外显子21的T790M突变。
样品
说明但非限制性的样品(从中可以提取核酸并利用本发明的方法进行分析)实例包括，但不限于，正常和癌性血液(血清或者血浆)以及其他包含可检测核酸的体液。
为了实施本发明的方法，从被研究的个体处获得样品。在特定实施例中，所述样品是血液样品。可以从先前诊断患有或者不患有NSCLC的个体，或者从正在接受或者先前已经接受抗NSCLC治疗的个体处获得样品。在一个实施方式中，所述样品是来自具有正常肺功能组织的个体的样品，即，没有NSCLC证据的个体。
在实施本发明时，通过标准方法将血液采集到收集管，其优选地包括硅化玻璃，不含用于血清制备的抗凝剂，或者包含用于血浆制备的EDTA、肝素或者类似的抗凝剂，最优选的是EDTA。任选地，随后可以让抗凝血浆与等体积的氯化钙在37℃孵育较短时间(最优选的1-3分钟)直到出现凝血，从而将血浆转化为血清。然后通过短暂离心沉淀凝块，将脱去蛋白质的血浆转移到另一个管。可选择地，离心可以被省略。还可以利用促凝剂管(clot activator tubes)获得血清。
DNA扩增
在本发明的特定实施方式中，血清或者血浆可以直接用于突变DNA的鉴定。在另一个特定实施方式中，从血浆或者血清提取核酸作为本发明的起始步骤。在这种情况下，从所述样品提取的总DNA将代表适于后续扩增的工作材料。
一旦获得样品后，就可以进行核酸的扩增。在特定实施方式中，通过PCR实现DNA的扩增。核酸扩增和检测(诸如利用PCR)的一般原理和条件是本领域技术人员公知的。特别地，通过本发明方法实施的聚合酶链式反应(PCR)使用合适并且特异性的寡核苷酸引物或者扩增寡核苷酸来特异性扩增EGFR靶序列。说明但非限制性的，这类扩增寡核苷酸的实例包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。术语“寡核苷酸引物”或者“扩增寡核苷酸”在本文中的使用没有差别，是指通常低于1,000个残基的聚合核酸，包括大小范围的下限为大约2到5个残基和上限为大约500到900个残基的聚合核酸。在优选的实施方式中，寡核苷酸引物大小范围的下限为大约5到大约15个残基，上限为大约100到200个残基。更优选的，本发明寡核苷酸引物大小范围的下限为大约10到大约15个残基，上限为大约17到100个残基。尽管可以从天然存在的核酸纯化寡核苷酸引物，但它们通常是利用各种公知的酶法或者化学法中的任意一种合成的。在本发明的特定实施方式中，这类寡核苷酸引物能够特异性扩增DNA片段，所述DNA片段对应于EGFR基因外显子19的特定核苷酸缺失。
因此，在特定实施方式中，本发明的方法可以用于检测外显子19的ELREA缺失。在优选的实施方式中，本发明涉及检测EGFR基因外显子19中9、12、15、18或者24个核苷酸的缺失。在另一个特定实施方式中，本发明的方法可以用于检测EGFR基因外显子21的L858R突变。在另一个特定实施方式中，本发明的方法可以用于检测EGFR基因外显子21的T790M突变。
术语“扩增寡核苷酸”是指与靶核酸或者其互补序列杂交并且参与核酸扩增反应的寡核苷酸。扩增寡核苷酸包括引物和启动子-引物，其中利用另一核酸链作为模板，酶延伸所述寡核苷酸的3′端。在一些实施方式中，扩增寡核苷酸包含至少大约10个连续碱基，和优选的大约12个连续碱基，所述碱基与靶序列(或者其互补链)区互补。靶结合碱基与其结合的序列优选的至少大约80％互补，和更优选的大约90％到100％互补。扩增寡核苷酸优选的长大约10到大约60个碱基，可以包括修饰的核苷酸或者碱基类似物。
术语“扩增(amplify)”或者“扩增(amplification)”是指产生靶核酸序列或者其互补序列或者其片段(即，扩增产物可以包含不完整的靶序列)多拷贝的步骤。例如，利用与靶核酸的内部位置杂交并从此起始聚合的扩增寡核苷酸，通过扩增所述靶核酸的一部分来产生片段。已知的扩增方法包括，例如，聚合酶链式反应(PCR)，复制酶介导的扩增，连接酶链式反应(LCR)扩增，链置换扩增(SDA)以及转录相关或者转录介导的扩增(TMA)。PCR扩增使用DNA聚合酶、相反链的引物和热循环来合成DNA或者cDNA的多拷贝。复制酶介导的扩增使用QB-复制酶来扩增RNA序列。LCR扩增通过利用杂交、连接和变性的循环，使用至少4种不同的寡核苷酸来扩增靶的互补链。SDA使用引物(包含限制性核酸内切酶的识别位点)和核酸内切酶(在包含靶序列的半修饰DNA双链体的一条链上产生切口)，继之以一系列引物延伸和链置换步骤。不依赖于核酸内切酶切口的等温链置换扩增方法也是已知的。转录相关或者转录介导的扩增使用包含启动子序列的引物和对所述启动子特异的RNA聚合酶以从靶序列产生多转录本，从而扩增靶序列。
本发明优选的实施方式在聚合酶链式反应(PCR)扩增中利用所述扩增寡核苷酸来扩增EGFR靶序列。本领域技术人员将理解这些扩增寡核苷酸可以非常方便的用于其他核酸扩增方法，所述扩增方法使用聚合酶介导的引物延伸。
在本发明方法的扩增步骤中，利用蛋白-核酸(PNA)探针通过PCR扩增对应于EGFR基因特异区的核酸序列。PNA探针是核酸类似物，其中天然核酸的糖磷酸骨架被合成肽骨架(通常由N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单位形成)取代，产生非手性和不带电荷的模拟物。这种新分子是化学稳定的，并且抗水解(酶)切割，因此预期不会在活细胞内降解。尽管这些都不同于天然核酸，但PNA仍然能够遵从Watson-Crick氢键键合规则，序列特异性的结合DNA以及RNA。其杂交复合物显示极高的热稳定性，并展示独特的离子强度性质。在许多应用中，相对于核酸探针更优选PNA探针，因为与在低盐条件下不稳定的核酸/核酸双链不同，PNA/核酸双体在非常低的盐条件下形成并且保持稳定。核酸杂交领域的普通技术人员都知道通常用于施加或控制杂交严谨性的因素包括甲酰胺浓度(或者其他化学变性试剂)，盐浓度(即，离子强度)，杂交温度，去污剂浓度，pH以及离液剂的存在与否。通常用公知的设定上述几种严谨性因素，然后确定改变单个严谨性因素的影响的技术，来发现探针/靶序列组合的最适严谨性。除了PNA的杂交基本不依赖于离子强度之外，可以调节相同严谨性因素从而控制PNA和核酸杂交的严谨性。通过检查各种严谨性因素直到实现所需鉴别度，就可以用实验方法确定分析的最适严谨性。
利用例如(甲基-二苯甲基)胺聚苯乙烯树脂作为固相支持物，按照肽的标准固相合成步骤(Merrifield，B.1986.Solid-phase synthesis(固相合成).Science 232，341-347)可以制备PNA寡聚物。PNAs可以包含嵌合结构，诸如PNA/DNA嵌合体，其中PNA寡聚物与DNA寡聚物融合。
除了具有突变等位基因的DNA分子外，临床样品还包含具有野生型等位基因的DNA分子。所以，在正常情况下，在野生型EGFR基因(野生型等位基因)的大背景下，很难检测到EGFR突变(突变等位基因)。在特定情况下，本发明人使用的PNA探针能够特异性识别并杂交野生型EGFR序列。作为说明但非限制性的实例，用于实施本发明方法的PNA探针包括在本发明所附实施例中SEQ ID NO：3所示的PNA探针。将这类探针添加到PCR反应混合物中，从而抑制野生型等位基因的扩增，促进样品中存在的突变等位基因即EGFR突变体的扩增，有利于其之后的检测。本领域普通技术人员将理解合适的PNA探针不是必须具有完全一样的所述探针核酸序列才能有效，而是可以根据特定的分析条件进行改变。例如，如果需要改变杂交的稳定性从而降低Tm和/或调整严谨性，则可以通过核酸序列的截短来制备更短的PNA探针。类似地，只要区别核酸序列仍位于PNA探针序列内，则核酸序列可以在一端被截短，而在另一端延伸。本文所述参数内探针核酸序列的这类变化被认为是本发明的实施方式。
如本发明的实施例1中可以观察到，在本发明方法中应用的利用这类PNA探针的聚合酶链式反应条件使得只要40个扩增循环就足以获得包括120bp基因组片段的精确PCR扩增产物，所述基因组片段包括EGFR基因外显子19的目标突变。
本发明方法中PCR的常规条件显示于本发明的实施例1。在该实施例中，用于PCR扩增反应的DNA来自于血浆/血清样品。
DNA突变的检测
先前已经公开了用于检测和分析PCR扩增产物的许多方法。特别地，可以采用本领域技术人员已知的大量方法中的任意一种进行DNA序列突变的检测(Kilger et al.，1997，Nucleic Acids Res.25：2032-4)。在本发明的特定实施方式中，通过核酸测序进行本发明方法的检测步骤。说明但非限制性的核酸测序方法的实例是循环测序(Sarkar et al.，1995，Nucleic Acids Res.23：1269-70)或者直接双脱氧核苷酸测序，其中从样品收集的部分或者完整目标DNA被用作测序反应的模板。对目标基因或者DNA特异的寡核苷酸引物或者引物组被用于标准测序反应。可以使用其他DNA测序的方法，诸如杂交测序，利用包含许多用于杂交的寡核苷酸的“芯片”进行测序(诸如由Affymetrix Corp.制造的芯片；Ramsay et al.，1998，Nature Biotechnology 16：40-44；Marshall etal.，1998，Nature Biotechnology 16：27-31)，HPLC测序(DeDionisio etal.，1996，J Chromatogr A 735：191-208)，和DNA测序策略的变化诸如多重等位基因特异性诊断分析(MASDA；Shuber et al.，1997，Hum.Molec.Genet.6：337-47)，双脱氧指纹法(Sarkar et al.，1992，Genomics13：441-3；Martincic et al.，1996，Oncogene13：2039-44)，和基于荧光探针的PCR方法(诸如Taqman；Perkin-Elmer Corp.；Heid et al.，1996，Genome Res.6：986-94)以及基于裂解酶的方法。
可选择地，可以利用被适当标记的引物进行扩增，而扩增的引物延伸产物可以利用检测所述标记的步骤和装置来检测。优选的本发明的探针用至少一种可检测的部分标记，其中所述可检测的一个或多个部分选自：偶联物，分枝检测系统，生色团，荧光团，自旋标记物，放射性同位素，酶，半抗原，吖啶酯和发光化合物。作为说明但非限制性的实例，在本发明方法中使用的引物可以用荧光团标记。更特别的，本发明方法的反向引物在其5′端用6-FAM荧光团标记。该荧光团发射峰值波长为522nm的荧光。可以通过用例如FAM、HEX、VIC或者NED染料标记的引物之一来进行PCR。
在本发明一个优选的实施方式中，如本发明所附实施例所示，随后对本发明方法扩增的DNA的检测和分析是通过GeneScan技术进行的。因此，作为进行本发明方法中检测步骤的说明但非限制性的实例，将PCR反应物等分试样(通常是1μl)添加到9μl甲酰胺HI-DI和0.25μlGeneScan标志物-500LIZ大小标准品。变性后，将样品置于ABI 3130遗传分析仪中，进行毛细管电泳。利用GeneScan软件分析原始数据。这种分析是非常重要的，因为将根据样品中的大小标准品外推出PCR产物的大小。利用该技术，本发明人能够以非常精确和准确的方式检测到目标突变。
本发明还通过下列实施例进行说明，所述实施例用于显示本发明的某些实施方式，但不应被理解为限制本发明。
实施例1
通过GeneScan确定EGFR基因外显子19的ELREA缺失
材料和方法：
1-样品收集
将每位个体的静脉血(10ml)放入包含50mmol EDTA(乙二胺四乙酸)每升的管中，然后按照制造商的说明书，利用QIAmp
Figure A200780031604D0012132001QIETU
DNA血液小量试剂盒(Qiagen，Germany)分离基因组DNA。
2-GeneScan反应准备
1.1-材料
-Abi Prism 3130 DNA分析仪(Perkin-Elmer，Applied Biosystems)
-96孔光反应板(Applied Biosystems，产品目录号4306737)
1.2-包含PNA探针的PCR反应混合物
如下制备PCR反应混合物：
-2.5μl缓冲液10x(Ecogen)
-0.5μl 50mM MgCl2(Ecogen)
-0.625μl 10mM dNTPs(Promega)
-1.25μl 10μM各种引物
-0.1μl TAQ聚合酶(Ecogen)
-12.5μl 5mM PNA探针(Applied Biosystems)
-来自血清或者血浆的5μl DNA
-添加无菌蒸馏水至终体积25μl。
1.3-不含PNA探针的PCR反应混合物
如下制备PCR反应混合物：
-2.5μl缓冲液10x(Ecogen)
-0.5μl 50mM MgCl2(Ecogen)
-0.625μl 10mM dNTPs(Promega)
-1.25μl 10μM各种引物
-0.1μl TAQ聚合酶(Ecogen)
-来自血清或者血浆的5μl DNA
-添加无菌蒸馏水至终体积25μl。
反向引物用6-FAM荧光团(6-FAM发射峰值波长为522nm的荧光)
标记。
正向引物：ACTCTGGATCCCAGAAGGTGAG(SEQ ID NO：1)
反向引物：6-FAM-CCACACAGCAAAGCAGAAACTC(SEQ ID NO：2)
PNA探针序列：Ac-AGATGTTGCTTCTCTTA(SEQ ID NO：3)
1.3-PCR程序
如下进行PCR：95℃5分钟，然后是40个循环：95℃30秒，58℃30秒和72℃1分钟，最后在72℃延伸5分钟。
3-GeneScan准备
-9μl甲酰胺HI-DI(Applied Biosystems)
-0.25μl GeneScan标志物-500LIZ大小标准品(AppliedBiosystems)
-1μl稀释的PCR终产物
样品在93℃变性3分钟，在冰上冷却10分钟。然后将样品进行毛细管电泳，随后接受494nm的激发波长，在ABI 3130 DNA分析仪上检测522nm的发射波长。
结果：
通过GeneScan总共分析了41份血清/血浆样品，以检测外显子19的缺失。所有被分析的样品都来自肿瘤组织具有阳性突变的患者。
GeneScan分析结果显示，55％的样品(肿瘤组织具有阳性突变)经Genescan分析也是阳性的(表1)。
 
肿瘤的EGFR突变 S/P阳性 S/P阴性
N＝41 N＝22(55％) N＝19(45％)
男性女性 814 811
埃洛替尼(Erlotinib)一线二线               1210 118 
从不吸烟者曾吸烟者吸烟者     1570  1261 
血液提取物治疗前治疗后未知       1651  982
CR+PRSD+PD 1+120+1  1+62+0
表1.患者(其肿瘤组织具有阳性突变)的血清/血浆中EGFR外显子 19突变分析。
实施例2
通过GeneScan确定EGFR基因外显子21的L858R突变
材料和方法：
1-样品收集
将每位个体的静脉血(10ml)放入包含50mmol EDTA(乙二胺四乙酸)每升的管中，然后按照制造商的说明书，利用QIAmp
Figure A200780031604D0012132001QIETU
DNA血液小量试剂盒(Qiagen，Germany)分离基因组DNA。
2-Taqman反应(5’核酸酶活性分析)
1.1-材料
-AB 7000或者7900HT(Applied Biosystems)
1.2-包含PNA探针的PCR反应(5′核酸酶活性分析)混合物
如下(表2)制备PCR反应混合物：
 
反应混合物 终浓度 母液浓度 每份样品(μl)    
通用TaqMan Master混合物 1x 2x 12.5
引物F 0.6μM 10μM 1.5
引物R 0.6μM 10μM 1.5
探针wt-VIC 0.2μM 10μM 0.5
探针mut-FAM 0.2μM 10μM 0.5
PNA 0.5μM 10μM 1.25
血清或者血浆DNA 5
水 5.25
表2
如下进行PCR：60℃变性2分钟，继之50个循环：95℃ 10分钟，然后是50个循环：95℃ 15秒和60℃ 1分30秒。
3-引物，探针和PNA
检测野生型序列的探针用荧光染料VIC标记，而检测突变等位基因的探针用荧光染料FAM标记
正向引物：AACACCGCAGCATGTCAAGA(SEQ ID NO：4)
反向引物：TTCTCTTCCGCACCCAGC(SEQ ID NO：5)
用荧光染料VIC标记的检测野生型等位基因的探针：
VIC-TCACAGATTTTGGGCTGGCCAAAC-TAMRA(SEQ ID NO：6)
用荧光染料FAM标记的检测突变等位基因的探针：
6-FAM-CAGATTTTGGGCGGGCCAAAC-TAMRA(SEQ ID NO：7)
PNA探针：AGTTTGGCCAGCCCA(SEQ ID NO：8)
结果：
通过GeneScan总共分析了41份血清/血浆样品，以检测L858R的突变。所有被分析的样品都来自肿瘤组织具有阳性突变的患者。
5′核酸酶活性分析结果显示，55％(L858R)的样品(肿瘤组织具有阳性突变)经这种分析也是阳性的(表3)。
 
肿瘤的EGFR突变 S/P阳性 S/P阴性
N＝41 N＝22(55％) N＝19(45％)
表3
实施例3
通过Taqman反应确定EGFR基因外显子21的T790M突变
材料和方法：
1-样品收集
将每位个体的静脉血(10ml)放入包含50mmol EDTA(乙二胺四乙酸)每升的管中，然后按照制造商的说明书，利用QIAmp
Figure A200780031604D0012132001QIETU
DNA血液小量试剂盒(Qiagen，Germany)分离基因组DNA。
2-Taqman反应(5′核酸酶活性分析)
1.1-材料
-AB 7000或者7900HT(Applied Biosystems)
1.2-包含PNA探针的PCR反应(5′核酸酶活性分析)混合物
按照实施例2所述(参见表2)制备PCR反应混合物。
如下进行PCR：60℃ 2分钟，继之50个循环：95℃ 10分钟，然后是50个循环：95℃ 15秒和60℃ 1分30秒。
3-引物，探针和PNA
检测野生型序列的探针用荧光染料VIC标记，而检测突变等位基因的探针用荧光染料FAM标记。
正向引物：AGGCAGCCGAAGGGC  (SEQ ID NO：9)
反向引物：CCTCACCTCCACCGTGCA  (SEQ ID NO：10)
用荧光染料VIC标记的检测野生型等位基因的探针：
VIC-TGAGCTGCGTGATGA-MGB  (SEQ ID NO：11)
用荧光染料FAM标记的检测突变等位基因的探针：
6-FAM-TGAGCTGCATGATGA-MGB(SEQ ID NO：12)
PNA探针：TCATCACGCAGCTC  (SEQ ID NO：13)
结果：
总共分析了4份血清/血浆样品。所有被分析的样品都来自肿瘤组织具有阳性突变的患者。
5′核酸酶活性分析结果显示，75％(T790M)的样品(肿瘤组织具有阳性突变)经这种分析也是阳性的(针对T790M的表4)。
 
肿瘤的EGFR突变 S/P阳性 S/P阴性
N＝4 N＝3(75％) N＝1(25％)
表4
序列表
<110>临床及分子肺癌基金会
<120>检测血液样品中EGFR突变的方法
<130>P1665PC00
<160>13
<170>PatentIn version3.4
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因外显子19的ELREA缺失的正向引物
<400>1
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因外显子19的ELREA缺失的反向引物。通过用6-FAM荧光团标
记该引物的5′端对其进行修饰。
<400>2
Figure A200780031604D00182
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因外显子19的ELREA缺失的蛋白-核酸(PNA)探针。该引物在其
5′端用Ac基团修饰。
<400>3
Figure A200780031604D00183
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因外显子21的L858R突变的正向引物
<400>4
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因外显子21的L858R突变的反向引物
<400>5
Figure A200780031604D00192
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于在L858R突变区检测野生型EGFR基因的等位基因的探针。该引物在其5′端用
VIC基团修饰。
<400>6
Figure A200780031604D00193
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因的等位基因中L858R突变的探针。该引物在其5′端用6-FAM基
团修饰。
<400>7
Figure A200780031604D00194
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因外显子21的L858R突变的蛋白-核酸(PNA)探针。
<400>8
Figure A200780031604D00195
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因外显子21的T790M突变的正向引物
<400>9
Figure A200780031604D00201
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因外显子21的T790M突变的反向引物
<400>10
Figure A200780031604D00202
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于在T790M突变区检测野生型EGFR基因的等位基因的探针。该引物在其5′端用
VIC基团修饰。
<400>11
<210>12
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因的等位基因中T790M突变的探针。该引物在其5′端用6-FAM基
团修饰。
<400>12
Figure A200780031604D00204
<210>13
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于检测EGFR基因外显子21的T790M突变的蛋白-核酸(PNA)探针。
<400>13
Figure A200780031604D00205

Claims (7)

1.检测个体血液样品中EGFR基因突变的方法，所述方法包括：
(i)从所述样品获得DNA；
(ii)利用蛋白-核酸探针，通过PCR扩增对应于所述EGFR基因的特异区域的核酸序列；和
(iii)检测所述突变。
2.如权利要求1所述的方法，其中待检测的所述EGFR基因突变选自：外显子19的ELREA缺失，外显子21的L858R突变和外显子21的T790M突变。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述血液样品是血清或者血浆样品。
4.如权利要求1所述的方法，其中通过核酸测序进行所述检测步骤。
5.如权利要求1所述的方法，其中通过GeneScan技术进行所述检测步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述GeneScan技术包括利用寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物的5′端用荧光染料进行荧光标记。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述荧光染料选自6-FAM、HEX或者NED染料。
CNA2007800316040A 2006-07-20 2007-07-20 检测血液样品中egfr突变的方法 Pending CN101506385A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06117551.9 2006-07-20
EP06117551A EP1881079A1 (en) 2006-07-20 2006-07-20 Method for the detection of EGFR mutations in blood samples

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101506385A true CN101506385A (zh) 2009-08-12

Family

ID=37564107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007800316040A Pending CN101506385A (zh) 2006-07-20 2007-07-20 检测血液样品中egfr突变的方法

Country Status (19)

Country Link
US (2) US8637245B2 (zh)
EP (2) EP1881079A1 (zh)
JP (1) JP2009544283A (zh)
KR (1) KR20090042263A (zh)
CN (1) CN101506385A (zh)
AT (1) ATE469247T1 (zh)
AU (1) AU2007275140B2 (zh)
CA (1) CA2658694A1 (zh)
CY (1) CY1110736T1 (zh)
DE (1) DE602007006809D1 (zh)
DK (1) DK2046985T3 (zh)
ES (1) ES2346589T3 (zh)
HK (1) HK1128497A1 (zh)
HR (1) HRP20100414T1 (zh)
PL (1) PL2046985T3 (zh)
PT (1) PT2046985E (zh)
RS (1) RS51428B (zh)
SI (1) SI2046985T1 (zh)
WO (1) WO2008009740A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102732636A (zh) * 2012-07-17 2012-10-17 海南医学院 一种检测肿瘤细胞egfr基因突变的方法及芯片
CN103882137A (zh) * 2014-04-03 2014-06-25 长沙三济生物科技有限公司 一种检测egfr基因858密码子突变的试剂盒及其应用
CN103923974A (zh) * 2014-01-27 2014-07-16 上海涌泰生物医药科技有限公司 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法
CN103923975A (zh) * 2014-01-27 2014-07-16 上海涌泰生物医药科技有限公司 一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法
CN105886648A (zh) * 2016-06-06 2016-08-24 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒
CN106536758A (zh) * 2014-07-25 2017-03-22 帕那金股份有限公司 利用夹紧探针及检测探针的多靶核酸检测方法的应用

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101193905B (zh) 2005-02-11 2014-06-25 纪念斯隆-凯特林癌症中心 用于检测抗药egfr突变体的方法和组合物
GB0714058D0 (en) * 2007-07-19 2007-08-29 Abertec Ltd detection of methylation in nucleic acid sequences
US9417190B2 (en) 2008-09-23 2016-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
WO2011120020A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Quantalife, Inc. Droplet transport system for detection
US11130128B2 (en) 2008-09-23 2021-09-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection method for a target nucleic acid
US9598725B2 (en) 2010-03-02 2017-03-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Emulsion chemistry for encapsulated droplets
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US9764322B2 (en) 2008-09-23 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for generating droplets with pressure monitoring
US9399215B2 (en) 2012-04-13 2016-07-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sample holder with a well having a wicking promoter
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
US9132394B2 (en) 2008-09-23 2015-09-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US8951939B2 (en) 2011-07-12 2015-02-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel
US8633015B2 (en) * 2008-09-23 2014-01-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler
US12090480B2 (en) 2008-09-23 2024-09-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Partition-based method of analysis
US9492797B2 (en) 2008-09-23 2016-11-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US10512910B2 (en) 2008-09-23 2019-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based analysis method
CA2767056C (en) 2009-09-02 2018-12-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for mixing fluids by coalescence of multiple emulsions
DE102010025496A1 (de) * 2009-10-09 2011-04-21 Universität Duisburg-Essen Verfahren zur Detektion von Genveränderungen, insbesondere Mutationen
JP2013510564A (ja) 2009-11-13 2013-03-28 パンガエア ビオテック、ソシエダッド、リミターダ 肺癌におけるチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答を予測するための分子バイオマーカー
KR101819938B1 (ko) 2010-02-26 2018-01-19 주식회사 파나진 Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｅｇｆｒ 돌연변이 검출 방법 및 키트
EP2550351A4 (en) 2010-03-25 2014-07-09 Quantalife Inc DETECTION SYSTEM FOR DROPLET-BASED ANALYZES
EP2550528B1 (en) 2010-03-25 2019-09-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
WO2012002447A1 (ja) * 2010-06-30 2012-01-05 武田薬品工業株式会社 変異ポリヌクレオチドの検出方法
JP5860667B2 (ja) * 2010-10-29 2016-02-16 アークレイ株式会社 Ｅｇｆｒエクソン２１ｌ８５８ｒ遺伝子多型検出用プライマーセット及びその用途
EP2447378B1 (en) * 2010-10-29 2017-06-21 ARKRAY, Inc. Probe for detection of polymorphism in EGFR gene, amplification primer, and use thereof
CN103429331B (zh) 2010-11-01 2016-09-28 伯乐生命医学产品有限公司 用于形成乳液的系统
EP2468883A1 (en) 2010-12-22 2012-06-27 Pangaea Biotech S.L. Molecular biomarkers for predicting response to tyrosine kinase inhibitors in lung cancer
US12097495B2 (en) 2011-02-18 2024-09-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for detecting genetic material
EP2492688A1 (en) 2011-02-23 2012-08-29 Pangaea Biotech, S.A. Molecular biomarkers for predicting response to antitumor treatment in lung cancer
WO2012129187A1 (en) 2011-03-18 2012-09-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals
EP2702175B1 (en) 2011-04-25 2018-08-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
WO2013019751A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Bio-Rad Laboratories, Inc., Library characterization by digital assay
WO2013190089A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Pangaea Biotech, S.L. Molecular biomarkers for predicting outcome in lung cancer
WO2015127234A1 (en) * 2014-02-20 2015-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of ibrutinib to treat egfr mutant cancer
CN104131091B (zh) * 2014-07-21 2016-04-06 思博奥科生物信息科技（北京）有限公司 用于检测人类egfr基因突变的引物及方法
CN105838777A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海张江转化医学研发中心有限公司 ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法
CN107574233A (zh) * 2017-10-25 2018-01-12 长沙三济生物科技有限公司 用于检测egfr基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法
CN108728536A (zh) * 2018-05-25 2018-11-02 广州永诺生物科技有限公司 人egfr基因t790m位点检测的引物、探针、pcr反应液和试剂盒
CN109554444A (zh) * 2018-12-31 2019-04-02 新羿制造科技（北京）有限公司 一种检测核酸突变顺反式结构的方法及其试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005118876A2 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Genentech, Inc. Egfr mutations

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102732636A (zh) * 2012-07-17 2012-10-17 海南医学院 一种检测肿瘤细胞egfr基因突变的方法及芯片
CN103923974A (zh) * 2014-01-27 2014-07-16 上海涌泰生物医药科技有限公司 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法
CN103923975A (zh) * 2014-01-27 2014-07-16 上海涌泰生物医药科技有限公司 一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法
CN103923975B (zh) * 2014-01-27 2016-01-20 上海涌泰生物医药科技有限公司 一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法
CN103923974B (zh) * 2014-01-27 2016-02-03 上海涌泰生物医药科技有限公司 一种检测egfr基因外显子20 t790m点突变的试剂盒和方法
CN103882137A (zh) * 2014-04-03 2014-06-25 长沙三济生物科技有限公司 一种检测egfr基因858密码子突变的试剂盒及其应用
CN103882137B (zh) * 2014-04-03 2016-04-27 长沙三济生物科技有限公司 一种检测egfr基因858密码子突变的试剂盒及其应用
CN106536758A (zh) * 2014-07-25 2017-03-22 帕那金股份有限公司 利用夹紧探针及检测探针的多靶核酸检测方法的应用
TWI692527B (zh) * 2014-07-25 2020-05-01 南韓商帕那金股份有限公司 一種檢測病患試樣中表皮生長因子受體 (egfr)或克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物 (kras) 突變的kras基因檢測方法
CN105886648A (zh) * 2016-06-06 2016-08-24 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20100414T1 (hr) 2010-09-30
JP2009544283A (ja) 2009-12-17
CY1110736T1 (el) 2015-06-10
EP2046985A1 (en) 2009-04-15
DE602007006809D1 (de) 2010-07-08
KR20090042263A (ko) 2009-04-29
ES2346589T3 (es) 2010-10-18
US8637245B2 (en) 2014-01-28
EP1881079A1 (en) 2008-01-23
SI2046985T1 (sl) 2010-09-30
HK1128497A1 (en) 2009-10-30
AU2007275140A1 (en) 2008-01-24
ATE469247T1 (de) 2010-06-15
DK2046985T3 (da) 2010-09-27
US20100009360A1 (en) 2010-01-14
PL2046985T3 (pl) 2010-10-29
CA2658694A1 (en) 2008-01-24
PT2046985E (pt) 2010-08-24
RS51428B (en) 2011-04-30
US20140113293A1 (en) 2014-04-24
AU2007275140B2 (en) 2013-06-20
EP2046985B1 (en) 2010-05-26
WO2008009740A1 (en) 2008-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101506385A (zh) 检测血液样品中egfr突变的方法
CN107419018B (zh) 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
CA2902167A1 (en) Method for amplification and assay of rna fusion gene variants, method of distinguishing same and related primers, probes, and kits
WO2003028531A2 (en) Detection of tumor rna in plasma and serum
CN108611412A (zh) 一种egfr基因突变检测的引物探针组合及其应用
CN111511925B (zh) 用于扩增靶核酸的方法及用于扩张靶核酸的组合物
CN101434985B (zh) K-ras基因突变的定量检测方法
CN101423866A (zh) 检测K-ras基因突变的PNA、探针、引物及方法
CN104328164A (zh) 荧光探针杂交法检测人egfr基因突变试剂盒
WO2011087709A2 (en) Eml4-alk translocations in lung cancer
WO2020151283A1 (zh) 一种基于选择性消除野生链背景干扰的基因突变检测方法
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN103484551B (zh) 一种用于检测egfr基因热点突变的试剂盒及其检测方法
CN105969908B (zh) Ctnnb1第三外显子突变检测引物探针及其试剂盒
CN101266207A (zh) 肿瘤修复基因突变的荧光实时pcr检测方法及试剂系统
CN102021228B (zh) 用于组织或全血egfr基因突变检测的特异性引物
KR20220131709A (ko) 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물
CN102899390A (zh) 小细胞肺癌标志物及其检测
CN101130819A (zh) 微卫星不稳定性细胞的检测方法以及试剂盒
JP4315812B2 (ja) 癌腫の分子診断および予後
US9062350B2 (en) Method of mutation detection in blood cell-free DNA using primer extension (PE) and PCR
JP7297902B2 (ja) 分析方法及びキット
EP2229454A1 (en) Assay for prediction of response to met antagonists
CN108103158A (zh) 一种高特异性的胚系碱基突变pcr检测方法
CN115961039A (zh) 一种egfr基因l858r突变的寡核苷酸组合检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20090812