TWI692527B - 一種檢測病患試樣中表皮生長因子受體 (egfr)或克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物 (kras) 突變的kras基因檢測方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種檢測病患試樣中表皮生長因子受體(EGFR)或克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)突變的KRAS基因檢測方法，本發明可通過抑制野生型基因或不必要的基因的擴增，並選擇性地擴增及檢測所要檢測的極微量的靶基因，來有效地檢測試樣內所包含的微量的變異或特定基因序列。並且，可通過熔解曲線分析來同時辨別多種基因型。尤其，可使用為通過被確認為高檢測敏感度的極少量的突變基因型來輔助疾病的醫學病態的診斷、預後、監測、治療功效的評價、核酸及蛋白質轉導研究的方法等。

本發明包括利用組織等侵襲性標本和非侵襲性標本(血液、小便、痰、大便、唾液、細胞)來檢測表皮生長因數受體(EGFR)、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、神經母細胞瘤病毒癌基因(NRAS)等生物標誌物並評價生物標誌物的突變的存在的步驟，上述生物標誌物及突變的存在提供用於在相關疾病的生命週期檢測、疾病的預後、預測、決定疾病的治療方針、疾病的診斷/早期診斷、疾病的預防、疾病治療劑的開發中利用的方 法。

Description

一種檢測病患試樣中表皮生長因子受體(EGFR)或克爾斯滕大鼠肉瘤病毒 癌基因同源物(KRAS)突變的KRAS基因檢測方法

本發明涉及一種檢測病患試樣中表皮生長因子受體(EGFR)或克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)突變的KRAS基因檢測方法，隨著迅速並敏感地檢測基因試樣所包含的微量的突變，可用在多種用途，尤其可向基因突變檢測方法及對基因突變相關疾病的診斷或研究提供所需的多種資訊。

並且，本發明涉及敏感地檢測基因內微量含有的突變，由此輔助疾病或醫學病態的診斷、預後、疾病的監測、治療功效的評價、核酸及蛋白質信號轉導研究等的方法。並且，本發明涉及在對象中監測各種疾病(例如，癌)的發作的方法及監測復發的方法。

隨著執行基因檢查，可在具有疾病症狀的患者中確診或鑒別有所懷疑的遺傳病。並且，也可通過檢查是否存在引起疾病的基因的突變來預測提高疾病的發病可能性和危險度的疾病。在報告中指出，這種基因型的檢查可有助於疾病的預防、早期診斷、治療及管理，從而減少疾病的發病率和死亡率。

這種基因檢查以人體內的所有細胞在遺傳方面相同為前提 ，可以利用人體的任何組織進行基因檢查，但最容易的方法為在血液中提取去氧核糖核酸(DNA)來使用。多種試樣可以為去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、染色體、代謝物質等。

尤其，隨著查明腫瘤基因(Oncogenes)的變異(mutations)、腫瘤抑制基因(tumor suppressor genes)的變異、反常(deregulations)和染色體的異常(chromosomal abnormalities)等基因的異常干涉癌症的發明和藥物的預後判斷的事實，報告出多種研究(Fearson ER et al.,Cell.,1990；K.W Kinzler et al.,Cell.,1996；Manuel Serrano et al.,Cell.,1997；Amado RG et al.,J.Clin.Oncol.,2008,Raponi M et al.,Curr.Opin.Pharmacol.,2008；Siena S et al.,J.Natl.Cancer Inst.,2009)。

可通過對特異性基因的分析來間接地確認是否存在癌症的發病。例如，具有表皮生長因數受體(EGFR)核酸的相對增加，例如，具有如p53等腫瘤抑制基因的相對減少等。

並且，在腫瘤基因的功能和癌症的相關性及藥物反應性等報告中提出腫瘤基因的突變檢查的必要性。例如，有報告指出，若在結腸癌中頻頻觀察得到的克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)外顯子2(密碼子12、密碼子13)基因的突變檢查後，向正常的克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物患者投用作為抗表皮生長因數受體抗體(anti-EGFR antibody)治療劑的西妥昔單抗(cetuximab)，則反應率為35~45%左右(Lievre et al.Cancer Res 2006；66：3992-3995)，且在用於確認其他變異型大鼠肉瘤(RAS)的研究中，克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物外顯子2(密碼子12、密碼子13)的變異率為40~45%，在克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌 基因同源物外顯子2為正常的情況下，克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物密碼子61、密碼子146、神經母細胞瘤病毒癌基因(NRAS)密碼子61、密碼子12、密碼子13等的變異率為約15~20%，因此，若檢查癌除基因外顯子2之外的其他大鼠肉瘤突變，則大鼠肉瘤變異率增加(Douillard et al.N Engl J Med.2013)。

在癌症的治療中，以第一次抗癌化學療法劑決定適當的藥物極為重要。在大腸癌的情況下，在推出生物藥劑(Biologic agent)之前，以投用FOLFOX6(氟尿嘧啶(fluoropyrimidine)、亞葉酸鈣(leucovorin)、奧沙利鉑(oxaliplatin))或FOLFIRI作為第一次治療劑，並投用FOLFIRI或FOLFOX6作為第二次治療劑的兩種方法(Tournigand,et al.JCO 2004)進行治療。然而，隨著開發作為靶向治療劑的貝伐單抗(bevacizumab)和西妥昔單抗(cetuximab)，當進行第一次治療時，在向FOLFIRI追加貝伐單抗的情況下，已證明出具有生存期間延長效果，在晶體(CRYSTAL)研究中，若向正常的克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因患者並用FOLFIRI和西妥昔單抗，則呈現出生存期間延長的效果(Van Cutsem,J Clin Oncol.2011)。

並且，與多種靶向治療劑的開發一同報告出可預測這些藥劑的反應的因數的研究。代表性地，涉及表皮生長因數受體(EGFR)單克隆抗體和克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)基因的突變，表皮生長因數受體由於可通過克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物信號轉導體系來促進細胞的生長和轉移，因此在克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物信號轉導體系出現異常的情況下，即，在克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源 物或鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體B1(BRAF)發生突變的情況下，可減少阻斷表皮生長因數受體的效果。實際上，報告中指出，克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突變和鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體B1突變為可預測減少如西妥昔單抗或帕尼單抗(panitumumab)的表皮生長因數受體單克隆抗體的治療效果的標誌物(Eberhard DA J ClinOncol,2005/Karapetis CS,N Engl J Med,2008/Di Nicolantonio F J ClinOncol,2008)。

與此相關，在對阿斯利康制藥有限公司(Astrazeneca)的吉非替尼(gefitinib)單一療法的2期研究資料的小組分析資料中，證明出對吉非替尼表現出釋放學性反應的患者的臨床特性為女性、非吸煙者、腺癌及東洋人的事實，而且這種結果在之後的厄洛替尼(erlotinib)研究資料中也表現出出奇的一致的結果。並且，在BR.21的研究結果中也可觀察到與厄洛替尼反應相關的臨床要素中，在腺癌、非吸煙者、東洋人中存在類似的生存資料的差異。基於這種臨床資料，提出在與表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-KTI)發生反應的小組患者中存在可說明原因的某種分子機制的假設，且在假設癌基因依賴(oncogene addiction)的條件下，對表皮生長因數受體基因的堿基序列進行解讀後發現表皮生長因數受體發生突變。雖然已知在多種腫瘤(乳腺癌、神經膠質瘤、前列腺癌等)中，表皮生長因數受體發生突變，但其位置發生在大部分細胞外結構域(domain)中，也與表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑的反應無關。

相反，在決定表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑反應的突變確認結果，確認表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑在用於決定在細胞內產生作用的酪氨酸激酶結構域(tyrosin kinase domain)的外顯子內產 生，且確認這些為與腺嘌呤核苷三磷酸結合袋(ATP-binding pocket)或活性環(activation loop)相關的突變。表皮生長因數受體-酪氨酸激酶結構域(EGFR tyrosine kinase domain)由七個外顯子(18~24)構成，但大部分的表皮生長因數受體突變位於外顯子18~21且分為如下三種類型。外顯子19的缺失(deletion)占60%，外顯子21的錯義突變(L858R，missense mutation)占25%，剩餘的很罕見，但為外顯子18、外顯子20、外顯子21的點突變(point mutation)和外顯子20的插入/複製(insertion/duplication)。這種表皮生長因數受體突變被公認為選擇性地啟動用於在表皮生長因數受體的下部信號轉導通路中促進細胞及抗凋亡的蘇氨酸激酶(Akt)和轉錄啟動因數(STAT)通路，相反，不影響與細胞增殖相關的細胞外信號調節激酶(ERK，extracellular signal-regulated kinas)通路，因此被證明為若使用表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑，則會發生凋亡來表現迅速的效果。表皮生長因數受體酪氨酸激酶結構域的突變率發現於到目前為止所分析的非小細胞肺癌的約20%中，且以特別高的頻率發現於腺癌、東洋人、女性、非吸煙者等中，從而表現出與表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑反應率高的臨床指標完全一致的結果。然而，有報告指出，在發生表皮生長因數受體突變的情況下，若使用表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑，則生存率並未明顯增加。

在表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑耐性-表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑投入臨床不久，發現包括對表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑表現出極端反應的患者的大部分的患者終究會發生復發。目前，證明出外顯子20發生第二次突變(T790M)來獲得對吉非替尼 或厄洛替尼的耐性的事實，但推測這種突變會決定性地妨礙藥物在腺嘌呤核苷三磷酸結合袋中的氫鍵，且這也是在使用表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑的過程中需要克服的又一問題，因此，正在進行沒有獲得耐性問題的表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑的開發研究。

目前，作為決定對表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑的反應的要素中的一個，提出克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(K-ras)，但對於具有克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物外顯子2突變的患者來說，幾乎沒有發生表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑的進行反應的情況。 雖然告知在腺癌的30%中發現克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，但容易發生在吸煙者及男性之中，且在東洋中的頻率低的事實中呈現出與表皮生長因數受體突變幾乎完全相反的現象。基於此，也公開在腺癌的致癌過程中，非吸煙者通過表皮生長因數受體突變來發病，而吸煙者則通過克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物來發病的假設。除基於表皮生長因數受體第二次突變的獲得耐性之外，內生性耐性問題也是為了提高表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑的反應率而需要解決的問題，但推定目前作為與此相關的因數，與表皮生長因數受體配體(ligand)的作用、作為表皮生長因數受體的下部通路的磷脂醯肌醇(-3)激酶(PI3K)/蘇氨酸激酶(AKT)及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表皮生長因數受體-非依賴性活性化中四硝酸戊赤蘚醇(PTEN)的作用及除表皮生長因數受體之外的其他腫瘤通路(oncogenic pathway)(例如，胰島素樣生長因數受體通路(IGF-IR pathway))等有關。

西妥昔單抗((Cetuximab，C225，Erbitux)作為與表皮生長 因數受體的細胞外與收容性部位結構域III(domain III)相結合的鼠科/人嵌合(murine/human chimeric)單克隆抗體而阻斷表皮生長因數受體的二聚化。眾所周知，與單一療法相比，西妥昔單抗在與現有的細胞毒性抗癌療法的並用治療中效果明顯。在與順雙氯雙氨泊鉑(Cisplatin)並用的1期研究中確認沒有毒性，而在復發性非小細胞肺癌患者中基於免疫組織化學的表皮生長因數受體的表達在以+1以上的患者為對象的2期研究中與多西他奇(docetaxel)並用治療的結果，呈現出25%的反應率、60%以上的疾病調整率等振奮人心的結果。基於此，目前正在進行與多西他奇或培美曲塞(pemetrexed)的並用治療3期研究。目前，西妥昔單抗在大腸癌中得到承認，且有報告指出，在局部晚期頭頸部癌中因與釋放療法的並用治療而具有上升效果。

如上所述，除目前得到承認的表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑、吉非替尼、厄洛替尼及貝伐單抗之外，正在開發多種靶向治療劑，並執行活躍的臨床研究，而特定基因的突變型的敏感分析可向靶向治療劑的開發提供很多資訊。

尤其，雖然已經證明目前吉非替尼和厄洛替尼作為單一療法劑而僅對第二次治療中的一部分受限的患者呈現出效果的事實和獲得耐性問題、貝伐單抗作為第一次治療劑的效果，但可以提供為何只有一部分患者才可以使用的解開線索的資訊。並且，今後可以在研究中以多種方式使用與新的靶向治療劑和細胞毒性抗癌療法間的並用治療、靶向治療劑間的並用療法、作為手術後輔助療法劑的作用、對目標治療劑的選擇的分子生物學指標的開發等。

並且，抗表皮生長因數受體抗體抑制調整細胞增殖的大鼠肉瘤/促分裂原活化蛋白激酶機制，由此具有抑制癌細胞的增殖的效果，但在克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物發生變異的患者對抗表皮生長因數受體抗體不發生反應，因此，有報告指出在進行化學療法時，確認癌患者的基因型極為重要(Herreros-Villanueva et al.Clin Chim Acta.2014)，並且在報告仲介紹多種用於確認癌患者的基因型的檢查方法和技術。

由於具有臨床意義的突變的檢測極為重要，因此根據所要分析的目的或基因的種類來報告出用於診斷的多種檢測方法(Taylor CF,Taylor GR.Methods Mol.Med.,92：9,2004)。然而，由於分析試樣中存在的突變癌細胞的數量相對少於正常細胞，因此，對突變癌細胞的檢測極為困難，且需要高超的檢測技術(Chung et al,Clin Endocrinol,2006/Trovisco et al,J Pathol.,2004)。

作為基因變異檢查方法，具有作為傳統方法的桑格測序(sanger sequencing)、焦磷酸測序(pyrosequencing)、目前開發的即時螢光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)、數字聚合酶鏈式反應(digital PCR)等。桑格測序由於試劑的價格低廉且呈現出所有的測序，因此可找出新的變異型。焦磷酸測序雖然比桑格測序敏感度高，且速度快，而且還方便於數據解釋，但無法確認所有變異型(Tan et al.World J Gastroenterol 2012)。 即時螢光定量聚合酶鏈式反應具有即使沒有專門的背景知識也可以進行檢查，且可以以較少人力快速地進行檢查，而且敏感度和再現性優秀、便於解決所發生的問題的優點。

並且，作為用於檢測少量含有的突變的代表性方法，介紹基 於為了選擇性增加突變基因而在突變利用特異性引物的等位基因特異性(allele specific)聚合酶鏈式反應方法(Rhodes et al.,Diagn mol pathol.,6：49,1997)、天蠍式即時等位基因特異性聚合酶鏈式反應(scorpion Real-time allele specific PCR，DxS' scorpions and ARMS)方法(Mark et al.,Journal of Thoracic Oncology,4：1466,2009)、利用等位基因特異性引物技術和小溝結合物(MGB，minor groove binder)-探針來抑制野生型基因的擴增並且僅選擇性擴增突變基因後，利用探針技術(Taqman)探針來不包括發生突變的位置而檢測擴增產物的競爭性等位基因特異的TaqMan聚合酶鏈式反應(CAST PCR)方法(Didelot A et al.,Exp Mol Pathol.,92：275,2012)、可利用臨界變性溫度(TC，critical denaturation temperature)來增加突變的敏感度的低變性溫度下複合擴增聚合酶鏈式反應(Cold-PCR)方法(Zuo et al.,Modern Pathol.,22：1023,2009)等即時的聚合酶鏈式反應技術的多種分析方法，且這些方法容易且迅速地提供與多種癌相關的基因的變異診斷及分析(Bernard et al.,Clinical Chemistry,48：1178,2002)。

肽核酸(PNA，Peptide nucleic acid)為以N-(2-氨基乙基)甘氨醯胺為基本骨架的核酸類似物(Nielsen PE et al.,Science,254(5037)：1497,1991)。與去氧核糖核酸探針相比，肽核酸骨架作為電中性而對具有互補堿基序列的靶核酸具有更高的特異性。並且，由於具有不被核酸酶(Nuclease)或蛋白酶(protease)分解的優點，因而極其有用於利用探針的分子診斷方法(Egholm et al.,Nature,365：556,1993；Nielsen et al.,Bioconjugate Chem.,5：3,1994；Demidov,et al.,Biochem.Pharmacol.,48：1310,1994)。利用這種肽核酸的優點，1993年開發出聚合酶鏈式反應夾緊(clamping)技術(Henrik Orum et al.,Nucleic Acids Res.,21：5332,1993)。該技術作為將肽核酸探針與不需要擴增的基因相結合來抑制聚合酶鏈式反應擴增的技術，若利用與野生型基因互補的肽核酸探針，則在聚合酶鏈式反應中選擇性地抑制野生型基因的擴增，從而可迅速且準確地檢測與野生型相比存在極少量的突變。

並且，報告出應用肽核酸夾緊技術的多種技法。肽核酸-鎖核酸箝(美國公開專利第2013-0005589號；Yoshiaki Nagai et al.Cancer Res.,65(16)：7276,2005)方法為以對靶部位使具有野生型基因排列的肽核酸夾緊探針和具有變異基因排列的檢測用鎖核酸探針技術探針競爭性地進行雜交(hybridization)的方式設計來選擇性地進行擴增及檢測的方法。肽核酸雜交探針(hyb probe)(PNA as both PCR clamp and sensor probe；美國公開特許第2008-0176226號)為以使用肽核酸探針來代替現有羅氏公司(roche)的雜交探針系統的供體(donor)探針，並通過肽核酸探針來同時進行夾緊和檢測的方式設計的方法。肽核酸夾緊&嵌入劑檢測(PNA Clamping & intercalator detection)方法(Makito Miyake et al.,Biochem Biophys Res Commun.,2007)為利用肽核酸探針夾緊野生型基因並且僅選擇性地擴增突變型基因後利用嵌入劑來檢測擴增產物的方法等多種技法。

癌症由基因型的突變引起，大約有50~80種並不存在於非腫瘤細胞中的突變([Joneset al.,2008]；[Parsons et al.,2008]；[Wood et al.,2007])。作為檢測這種突變型的技法，具有活檢標本分析及迴圈如血液等體液的突變體腫瘤基因分析方法(Diehl et al.,2008)。然而，在分析活檢標本的情況下，可存在侵襲性、合併症等的有害性。並且，活檢分析方法從局 限的部位中提取組織試樣，但在腫瘤為異性或分散於正常組織內的情況下，組織試樣可以為假陽性體或假陰性體。為了克服這種方法，需要非侵襲性且高靈敏度的診斷方法。

並且，腫瘤組織的每個細胞所具有的突變種類可以不同(Heterogeneity)，且混有正常的細胞，因此，為了準確的突變檢查，必須執行通過高敏感度的檢查方法和顯微鏡檢查的腫瘤部位確認步驟及對於對相應部位的選擇性的去氧核糖核酸的提取及檢查。

並且，在血液等體液中迴圈的突變的去氧核糖核酸分析由於在體液中的突變體癌去氧核糖核酸的複製數極低，因此靈敏度本來就不充分(Gormally et al.,2007)。為了克服這種缺點，需要開發可檢測具有高特異性及高敏感度的腫瘤細胞的診斷方法。

有報告指出很多用於檢測基因多態性的方法，例如，可舉例聚合酶鏈式反應(PCR，Polymerase Chain Reaction)-限制性片段長度多態性(RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism)法等。聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性法為對於試樣的靶去氧核糖核酸以聚合酶鏈式反應擴增檢測目的的區域，並且對擴增物進行約束酶處理，以薩瑟思雜交來序列分析基於多態性的限制斷片長度的變化的方法。若在基因中存在目的變異，則可因約束酶的識別部位消失而通過是否存在切割，即，限制斷片長度的變化來檢測是否存在變異。然而，例如在聚合酶鏈式反應後，聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性法需要對所獲得的擴增物進行多種約束酶處理後進行分析，而所獲得的擴增物的約束酶處理過程因利用第一次執行的擴增產物而在結果中可能發生誤差。

目前，作為多態性的檢測方法，提出解鏈溫度(Tm，Melting Temperature)分析方法。通過解鏈溫度分析的多態性的檢測方法為使用與包括檢測目的的多態性的區域互補的探針，來形成檢測探針的雜交物(雙鏈核酸)，上述檢測探針與核酸互補。並且，上述解鏈溫度為對所獲得的雜交物進行加熱處理，從而以吸光度等的信號測定來檢測作為溫度上升的雜交物的單鏈核酸的解鏈點，並利用解鏈溫度值的結果來判斷多態性的方法。

雜交物的兩單鏈核酸的互補性越高，解鏈溫度值越高，而雜交物的兩單鏈核酸的互補性越低，解鏈溫度越低。因此，可計算出與基因互補的探針之間的雜交物的解鏈溫度值(評價基準值)，並對所要檢查的核酸和與探針的解鏈溫度值(測定值)進行比較後，判別所檢查的核酸的檢測對象部位是否與目的基因相同。並且，在測定值低於檢查平均基準值的情況下，可判斷出被檢核酸的檢測對象部位為其他型。

雜交物的兩單鏈核酸的互補性越高，解鏈溫度值越高，而雜交物的兩單鏈核酸的互補性越低，解鏈溫度越低。因此，可計算出與基因互補的探針之間的雜交物的解鏈溫度值(評價基準值)，並對所要檢查的核酸和與探針的解鏈溫度值(測定值)進行比較後，判別所檢查的核酸的檢測對象部位是否與目的基因相同。並且，在測定值低於檢查平均基準值的情況下，可判斷出被檢核酸的檢測對象部位為其他型。

例如，基因的多態性的檢測在疾病的診斷及治療法的選擇方面非常重要。因此，本發明的目的在於，提供可以以簡單且優秀的敏感度來判別作為疾病相關基因的表皮生長基因受體、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神經母細胞瘤病毒癌基因的多態性檢測用探針及其用途。

作為基因變異檢查方法，具有作為傳統方法的桑格測序、焦磷酸測序、目前開發的即時螢光定量聚合酶鏈式反應、數字聚合酶鏈式反應等。桑格測序因試劑的價格低廉且呈現出所有的測序而可找出新的變異型。然而，桑格測序具有敏感度低，檢查時間長且可進行主觀性分析的缺點。作為桑格測序和即時螢光定量聚合酶鏈式反應的中間步驟的焦磷酸測序雖然比桑格測序敏感度高，且速度快，還便於數據解釋，但無法確認所有變異型。並且，在與即時螢光定量聚合酶鏈式反應進行比較時，可找出比即時螢光定量聚合酶鏈式反應特定的變異型，並且也可通過數據分析來確認新的基因變異，但檢查所消耗的時間變長且敏感度低(Tan et al.World J Gastroenterol 2012 October 7；18(37)：5171-5190)。

尤其，應用於本技術的即時螢光定量聚合酶鏈式反應即使沒有專門的背景知識也可以進行檢查，且可以以減少人力快速地進行檢查。 並且，敏感度和再現性優秀、便於解決所發生的問題。然而，由於以發生變化的測序(sequencing)為對象來發現基因，因此無法找打所有變異型。

因此，本發明提供以高的檢測敏感度檢測極少量的突變基因型的方法，並將這種方法利用於疾病的生命週期監測、疾病的預後、預測、決定疾病的治療方針、疾病的診斷/早期診斷、疾病的預防、疾病治療劑的開發等。

為了更為敏感地即時檢測靶核酸，利用夾緊探針(clamping probe)和一同包含螢光子及淬滅基團的螢光檢測探針(detection probe)的混合體來確認可以選擇性地以高敏感度檢測所需基因，並確認容易進行相鄰的突變檢測，而且確認野生型基因和靶核酸基因的解鏈溫度差異，從而 確認可以利用熔解曲線(melting curve)分析來同時通過多靶核酸的檢測判別基因型。

為了更為敏感地檢測靶核酸，本發明發明了包含用於即時檢測靶核酸的一個以上的檢測探針及用於抑制野生型基因或不必要基因的擴增的夾緊探針的探針混合體和利用上述探針混合體的同時多靶核酸檢測方法及利用上述同時多靶核酸檢測方法的分子診斷試劑盒。

本發明的探針混合體提供利用在相同鏈上競爭性地進行雜交的夾緊探針及由報告基團(reporter)和淬滅基團(quenching)相結合的一個以上的檢測探針的同時多靶核酸檢測方法及其用途。

可利用本發明的探針混合體系統來應用於分子診斷、產前診斷、早期診斷、癌症診斷、基因相關診斷、基因物質診斷、感染菌的診斷、抗藥性細菌的判別、法醫學、生物體的種類判別等多種分子診斷技術。

尤其，為了對癌症患者實施適當的診斷及治療，需要確認癌瘤的多種分子特性。並且，比基本的方法更為敏感且特異性高的本發明的技術可檢測正常基因內所包含的微量的基因表達、點突變、融合基因等，並且便於理解癌症總體的遺傳性基礎，而且可應用於診斷及治療。

一般情況下，本發明敏感地檢測體液內，尤其，血液內所含有的表皮生長因數受體、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神經母細胞瘤病毒癌基因等的突變型，由此輔助相關的疾病、其他醫學性病態及早期診斷/診斷治療功效、監測及評價。並且，可包括對與疾病相關的突變檢測結果和正常對比組進行比較來確認突變型和疾病間的相關關係或其他醫學性病態(例如，癌症)的步驟。並且，本發明可使通過基因型來確認的 治療方法及藥物反應性預測決定變得可能。

若利用本發明的靶核酸檢測方法，則可抑制野生型基因或不必要的基因的擴增，且可通過極微量的靶核酸基因的選擇性的擴增和選擇性的檢測來有效地檢測由試樣內所包含的單堿變異及堿基的缺失或插入引起的變異，並且可使用多個檢測探針和多個擴增抑制探針來同時分析擴增曲線和熔解曲線，從而不僅可以同時進行多靶核酸檢測及定量，而且可通過熔解曲線分析來判別基因型。並且，可以以高敏感度檢測靶，因此可極為有效地使用於需要極少量靶檢測的早期診斷。

例如，根據本發明的多態性檢測用探針，可以簡單且以優秀的依賴性判別表皮生長因數受體、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神經母細胞瘤病毒癌基因所包含的微量的突變型。具體地，例如，在試樣中，即使是在目的野生型的基因和變異型的基因共存的情況下，也執行使用本發明的多態性檢測用探針的解鏈溫度分析，由此可以簡單且以優秀的依賴性檢測多態性的種類或是否存在變異。因此，本發明對含有大量的野生型基因和微量的變異型基因的試樣尤其有用。根據本發明，由於可簡單且以優秀的依賴性判別表皮生長因數受體、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神經母細胞瘤病毒癌基因的多態性，因此，例如可在如上所述的疾病的診斷及治療法的選擇方面反映檢測結果。因此，本發明可謂對醫療領域等極為有用。

本發明涉及利用用於抑制野生型或不必要的基因的擴增的夾緊探針和由報告基團及淬滅基團相結合的檢測探針來同時檢測多靶核酸的方法及上述檢測方法的應用。

本發明的檢測探針可為選擇性地檢測所要檢測的靶核酸基因的探針。夾緊探針可意味著與野生型基因或不必要的基因互補結合來在進行聚合酶鏈式反應期間抑制聚合酶延伸反應的探針，探針混合體意味著由一個以上的檢測探針及夾緊探針構成的探針系統。

本發明的靶核酸可意味著所要檢測的所有種類的核酸，且可包括突變基因或不包括突變基因。可以以包含遺傳體去氧核糖核酸(genomic DNA)和線粒體去氧核糖核酸(mitochondrial DNA)、病毒去氧核糖核酸(viral DNA)的所有種類的基因或包含信使核糖核酸(mRNA)、核糖體核糖核酸(ribosomal RNA)、非編碼核糖核酸(non-cording RNA)、轉運核糖核酸、病毒核糖核酸(viral RNA)等所有種類的核糖核酸為特徵，但並不局限於此。在雜交、退火(annealing)或擴增條件下，與引物或探針進行退火或雜交。

本發明的雜交意味著互補的單鏈核酸形成雙鏈核酸。可在兩個核酸的堿基序列間互補性一致的情況下實現雜交，或者即使存在一部分錯配(mismatch)的堿基的情況下也可以實現雜交。雜交所需的互補性的反應的進行程度可根據溫度等雜交條件而變得不同。

本發明的突變作為在野生型基因堿基序列中發生變異的突變，不僅包括單核酸多態性(SNP，single nucleotide polymorphism)，而且還包括由堿基的取代、缺失或插入引起的變異。並且，包括可在自然中發 生的體細胞突變(somatic mutation)和生殖細胞突變(germ line mutation)，而且還無限制地包括人為誘導堿基序列的變異的人工突變等。

本發明的體細胞變異被譽為通過信號轉導過程的反常等來導致細胞發生癌變的主要原因。有意義的體細胞突變(somatic mutation)可例舉克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體B1、表皮生長因數受體、JAK2、HER2、BCL-ABL、神經母細胞瘤病毒癌基因、人V-HA-RAS肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)、異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)、，新陳代謝基因異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)、C-KIT、TP53、表皮生長因數受體、PIK3CA等各種與癌症相關的基因。本發明確認本發明對體細胞基因表皮生長因數受體、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神經母細胞瘤病毒癌基因的突變的情況作出反應，並公開其應用領域。

在本發明中，檢測探針或夾緊探針作為與靶核酸互補結合的所有核酸及核酸類似物，可分別選自由寡核苷酸(oligonucleotide)、肽核酸(peptide nucleic acids)及鎖核酸(Locked nucleic acid)組成的組中。由於用於聚合酶鏈式反應的聚合酶一般具有核酸酶(nuclease)活性，存在發生探針受損的可能性，因此，優選地，使用如肽核酸等對核酸酶穩定的合成核酸。並且，檢測探針起到選擇性地檢測目的靶核酸基因的作用，因此，可使用本發明所屬技術領域公知的用於檢測核酸的探針。

優選地，在本發明的一實施例中使用肽核酸探針，且肽核酸探針作為人工合成去氧核糖核酸而可以與靶去氧核糖核酸或核糖核酸以特異性的方式相結合，並且由於對核酸酶穩定，因此可進行基於探針的熔解曲線分析。並且，由於肽核酸探針具有在與去氧核糖核酸相結合後抑制聚 合酶的延伸反應的性質，因此，在本發明中，使用以與野生型基因實現完全實現雜交的方式製備的肽核酸探針作為夾緊探針，且為了同時以多重方式檢測靶核算，肽核酸檢測探針與靶核酸基因實現完整的雜交。

並且，在本發明中，夾緊探針及檢測探針可在N末端、C末端或探針(合成核酸)骨架的α、β、γ、接頭(Linker)位置結合天然氨基酸及合成氨基酸的支鏈等特定官能團，由此帶來立體結構性變化，上述氨基酸可以以不具有電荷，或者具有陰電荷或陽電荷為特徵，但並不局限於此，可使用本發明所屬技術領域公知的探針立體結構變化及電荷賦予方法。

本發明的檢測探針的兩末端可以與能夠對報告基團和報告基團螢光進行猝滅(quenching)的淬滅基團相結合，並且可包含嵌入(intercalating)螢光物質。報告基團作為吸收、釋放特定波長的光來釋放螢光的物質，意味著可標誌於探針來確認是否實現靶核酸和探針之間的雜交的物質，可以為選自由螢光素(fluorescein)、螢光素氯三嗪(fluorescein chlorotriazinyl)、羅丹明綠(rhodamine green)、羅丹明紅(rhodamine red)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)、異硫氰酸螢光素(FITC)、俄勒岡綠(Oregon green)、超級綠色螢光(Alexa Fluor)、羧基螢光素(FAM)、JOE、羅紅黴素(ROX)、六亞甲基四胺(HEX)、德克薩斯紅(Texas Red)、四亞甲基二碸四胺(TET)、四甲基若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)、羧基四甲基羅丹明(TAMRA)、青黴素(Cyanine)系列染料及三碳菁(thiadicarbocyanine)染料組成的組中的一種以上，但並不局限於此，可使用本發明所述技術領域公知的釋放螢光的物質。

並且，淬滅基團意味著吸收報告基團所釋放的光來減少螢光 強度的物質，可以為選自苯甲酸(Dabcyl)、羧基四甲基羅丹明、Eclipse、二氯二氰基苯醌(DDQ)、QSY、黑莓猝滅(Blackberry Quencher)、黑洞猝滅(Black Hole Quencher)、Qxl、愛荷華黑(Iowa black)FQ、愛荷華黑RQ、IRDye QC-1組中的一種以上，且並不局限於此，根據種類的不同，淬滅基團減少螢光強度的範圍也不同，從而可以考慮其來使用。

利用本發明的探針混合體的同時，多靶核酸檢測方法的特徵在於，利用與野生型基因或不必要的基因互補結合來抑制聚合酶延伸反應的一個或一個以上的夾緊探針來選擇性地擴增所要檢測的靶核酸基因，並利用用於特異性地檢測靶核酸的一個或一個以上的檢測探針來檢測是否存在多靶核酸或監測濃度，而且可利用探針混合體的靶核酸的檢測來即時一同分析擴增曲線及熔解曲線。

本發明的夾緊探針及檢測探針為在相同鏈上與靶基因進行雜交，或者與夾緊探針及檢測探針互補的鏈雜交來同時進行野生型基因的阻斷(blocking)及靶核酸基因的檢測的方法。即，若夾緊探針完全與野生型基因雜交(perfect match)，則可抑制野生型基因的擴增，因此可進行極微量的靶核酸基因的選擇性的擴增及檢測，並且，可使用一個以上的額檢測探針來同時檢測多靶核酸。

在利用探針混合體的靶基因的擴增過程中，在退火步驟中夾緊探針和檢測探針向相同鏈或互不相同的互補的鏈進行退火，並且具有報告基團和淬滅基團的檢測探針與所要檢測的靶核酸基因特異性地相結合，來表現出擴增曲線信號(螢光)。在之後的延伸(extension)步驟中，夾緊探針依然與野生型基因或不必要的基因進行雜交，從而抑制野生型基因或 不必要基因的擴增，並且，由於以低於靶核酸的延伸步驟的解鏈溫度製備出檢測探針，因此，檢測探針與靶核酸相分離來進行擴增。

可通過這種擴增過程來即時分析擴增曲線，且可利用在上述擴增過程中產生的擴增產物來分析熔解曲線。在熔解曲線分析步驟中，檢測探針雖然在較低溫度下與靶核酸基因進行雜交，來呈現出螢光信號，但隨著溫度上升，上述檢測探針與靶核酸相分離來猝滅螢光。

一般情況下，為了同時檢測多個靶核酸，以往的利用即時的聚合酶鏈式反應的擴增曲線分析方法在試樣內檢測靶核酸的過程中，使用螢光物質，因此，為了檢測兩種以上的靶核酸而需要與靶數量相同的具有螢光物質的探針，從而多重檢測受到限制，但本發明的同時檢測多靶核酸的方法可利用探針混合體來同時執行擴增曲線及熔解曲線分析，因此以可利用一個螢光物質來進行多靶的檢測為特徵。

在本發明的一實施例中，可以為了確認溶解溫度的差異而在肽核酸的γ位置導入具有陰電荷的L-谷氨酸(L-glutamic acid)或D-谷氨酸(D-glutamic acid)、不具有電荷的L-丙氨酸(L-alanine)或D-丙氨酸(D-alanine)、具有陽電荷的L-賴氨酸(L-lysine)或D-賴氨酸(D-lysine)的支鏈，且可合成在接頭位置導入L-賴氨酸、L-谷氨酸的肽核酸探針。

在肽核酸骨架的γ位置結合D-谷氨酸等來賦予結構性變化(立體結構及電荷變異)的肽核酸探針與沒有結構性變化的肽核酸探針相比時，靶去氧核糖核酸和單堿錯配去氧核糖核酸的解鏈溫度之差(△解鏈溫度)大幅度增加，且對本發明的結構實施變形的肽核酸探針也增加對單堿序列發生變異的特意性，從而使野生型基因和靶核酸基因的溶解溫度差異 變得顯著，因此，可改善對於即時的擴增曲線的非特異結合，並減少可在熔解曲線分析時出現的問題。

一般情況下，為了同時檢測多個靶核酸而利用以往的實施聚合酶鏈式反應的擴增曲線分析方法在試樣內檢測靶核酸的過程中使用螢光物質，因此，為了檢測兩種以上靶核酸而需要與靶數量相同數量的具有螢光物質的探針，使得多重檢測受到限制，但本發明的同時檢測多靶核酸的方法可利用探針混合體來同時執行對擴增曲線及熔解曲線的分析，因此以可利用一種螢光物質來進行多靶的檢測為特徵。

並且，利用本發明的探針混合體的同時檢測多靶核酸的方法並不局限於對擴增曲線及熔解曲線的同時分析，而是可以單獨或依次分析擴增曲線或熔解曲線，並且根據需要，可以只執行擴增曲線或熔解曲線分析來檢測靶核酸。尤其，在不需要定量分析的情況下，即使省略擴增曲線分析而僅分析熔解曲線也可區分是否存在靶核酸或基因型。

本發明的同時檢測多靶核酸的方法具體包括：步驟(a)，在包含靶核酸的標本試樣中混合由夾緊探針及檢測探針構成的探針混合體及引物來進行雜交，並獲得即時的擴增曲線；步驟(b)，在上述擴增步驟之後，一邊使溫度發生變化，一邊獲得擴增產物和檢測探針間的熔解曲線；以及步驟(c)，單獨分析或依次分析或同時分析所獲得的上述即時的擴增曲線及熔解曲線。

上述步驟(a)的夾緊探針及檢測探針可根據所要檢測的靶核酸的數量進行多種調整，在獲得上述熔解曲線的步驟中，可以為了減少擴增產物的濃度的解鏈溫度值的偏差而在獲得熔解曲線的步驟之前，與獲 得即時的擴增曲線的步驟單獨地追加5迴圈以上的聚合酶鏈式反應迴圈，優選地，可追加5至20迴圈的聚合酶鏈式反應迴圈。

並且，本發明的檢測方法可利用同時檢測多靶核酸的方法，上述同時檢測多靶核酸的方法包括：步驟(a)，在包含靶核酸的標本試樣中混合由夾緊探針及檢測探針構成的探針混合體及引物來進行雜交，並獲得即時的擴增曲線；以及步驟(b)，分析所獲得的上述即時的擴增曲線，或者可包括：步驟(a)，在包含靶核酸的標本試樣中混合由夾緊探針及檢測探針構成的探針混合體及引物來進行雜交；步驟(b)，一邊使溫度發生變化，一邊使雜交後的上述產物解鏈來獲得熔解曲線；以及步驟(c)，分析所獲得的上述熔解曲線。

在本發明中，可通過即時的聚合酶鏈式反應來執行上述獲取擴增曲線或熔解曲線的步驟，而擴增曲線的分析的特徵在於，可以以測定迴圈閾值(CT，cycle threshold)來進行分析。若試樣記憶體在靶核酸或試樣所包含的靶核酸的量較多，則達到閾值(threshold)的迴圈數量會變少，從而較少地測定出迴圈閾值，因此可確認是否存在靶核酸，也可確認早期靶核酸的量。

並且，熔解曲線分析作為通常在結束即時的聚合酶鏈式反應之後最後進行的步驟，可將標本的溫度降低至適當範圍的30~55℃內的溫度後，按每秒鐘0.5至1℃的速度增加至90℃，並測定螢光的信號大小，若檢測探針和靶核酸(可以與檢測探針互補結合的靶核酸的一側鏈)隨著溫度的上升而分離，則會使螢光猝滅，使得螢光信號突然下降，從而可通過解鏈峰值(melting peak)來確認是否存在靶核酸。

本發明的同時檢測多靶核酸的方法的特徵在於，可檢測在10ng以下的標本試樣中以0.01%、0.1%至100%比率包含的靶核酸。

在本發明中，“試樣”包括多種試樣，優選地，利用本發明的方法來分析生物試樣(biosample)。可分析源於植物、動物、人類、真菌、細菌及病毒的生物試樣。在分析源於哺乳類或人類的試樣的情況下，上述試樣可來源於特定組織或器官。組織的代表性例包括鍵、皮膚、肌肉或神經組織。器官的代表性例包括眼、腦、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心臟、淋巴、血液、骨、軟骨、胰腺、腎、膽囊、胃、小腸、睾丸、卵巢、子宮、直腸、神經系統、腺和內部血管。所分析的生物試樣包括來源於生物學根源的某種細胞、組織、流體(fluid)或可根據本發明來容易地進行分析的其他介質(medium)，而這包括為了人類、動物、人類或動物的消耗而從所製備的食物中獲得的試樣。並且，所分析的生物試樣包括體液試樣，體液試樣包括血液、血清、血漿、淋巴、母乳、小便、大便、眼內液、唾液、精液、腦提取物(例如，腦粉碎物)、脊髓液、闌尾、脾臟和扁桃體組織提取物，但並不局限於此。

試樣的靶核酸為去氧核糖核酸或核糖核酸，且上述分子可以為雙鏈或單鏈形體。在作為早期物質的核酸為雙鏈的情況下，優選地，將雙鏈分成單鏈，或者製成部分單鏈形態，對鏈進行分離的眾所周知的方法包括熱、堿、甲醯胺、尿素、乙二醛處理處理、酶方法(例如，解螺旋酶作用)及結合蛋白，但並不局限於此。

在另一觀點中，本發明涉及利用本發明的同時檢測多靶核酸的方法，並包含由夾緊探針及檢測探針構成的探針混合體的靶核酸的同時 多重檢測用試劑盒及用途。

在另一觀點中，本發明可使用為通過根據本發明的檢測方法來以高的檢測敏感度確認的極少量突變基因型，來輔助對疾病的醫學性病態的診斷、預後、監測、治療功效的評價、核酸及蛋白質轉導研究的方法等。本發明包括利用組織等侵襲性標本和非侵襲性標本(血液、小便、痰、大便、唾液、細胞)來檢測表皮生長因數受體、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、神經母細胞瘤病毒癌基因等生物標誌物並評價生物標誌物的突變的存在的步驟，上述生物標誌物及突變的存在提供用於在相關疾病的生命週期檢測、疾病的預後、預測、決定疾病的治療方針、疾病的診斷/早期診斷、疾病的預防、疾病治療劑的開發中利用的方法。

與此相關，本發明具有可一次性且更迅速地且低廉地進行多種基因檢查的優點，尤其，若僅應用決定特定癌症治療藥劑的基因的變形來探知本技術，則目前可僅以檢查一種基因的費用來探知與對應疾病相關的所有基因的變形。與此相關，肺癌患者需要與表皮生長因數受體、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、第二型受體、MET、TP53、神經母細胞瘤病毒癌基因、PIK3CA等基因的變異一同檢查是否存在EML4-淋巴瘤激酶、ROS1、KIF5B-RET基因解鏈，而結腸癌只有檢查克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體B1、TP53、神經母細胞瘤病毒癌基因、PIK3CA等基因的變異，才可以給予患者臨床性的幫助。

並且，本發明作為與臨床遺傳體相關的技術，可迅速根據個人的基因資訊來制定醫療，從而可使用於由治療費用、藥物副作用引起的損失、節約新藥開發費用等多個領域。尤其，本發明可基於特定基因類型 的藥物療法、以東洋人為對象的多種臨床研究來提供可以選擇更為適合的治療劑的機會。

遺傳病為由基因異常引起的疾病，表現為存在於體細胞內的基因異常，而由於相同基因異常也存在於生殖細胞(精子、卵子)，因此，其表現型也向子孫轉導的疾病。發生基因異常的原因如下：第一，當去氧核糖核酸被複製時，存在自然產生的誤差；第二，具有可通過多種化學物質及環境因素來引起的可能性。目前，按報告指出的人類基因組計畫的研究，人類細胞記憶體在30000~40000個基因，根據這種結果，可推定人類遺傳病的種類極多，並且，除目前為止公開於世的遺傳病的種類之外，還存在多種遺傳病，而且可預測至今未被研究發現的遺傳病更是數不勝數。

期待本發明的通過優秀檢測敏感度的基因研究可作為預測未被發現的遺傳病的種類的工具來使用。例如，在克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物中，可判斷若在密碼子12的多態性及密碼子13的多態性中至少一側為變異型，例如，對西妥昔單抗等抗表皮生長因數受體抗體藥呈現出耐性，且為野生型，則判斷為無法呈現耐性。

多因數基因疾病的發生很受環境的影響，且家族遺傳的概率也根據個體和對應疾病而變得極為不同的現象為基因多態性(genetic polymorphism)。在相同基因中，每個人均表現出不同狀態的現象稱為基因多態性，但其具有短串聯重複(STR，short tandem repeat)、單核酸多態性(single nucleotide polymorphism)等種類。短串聯重複意味著2~5個短堿基序列的反復表現，而單核酸多態性意味著在基因中的每1.0kb中具有至少一個不同的堿基序列。短串聯重複用於親子鑒定，單核酸多態性則在個人識 別至疾病的發病可能性或者預後判斷、對特定藥物的反應範圍內廣泛地進行使用及研究。在基因多態性中，在組內以1%以內存在的現象稱為“突變”，但目前在癌症、糖尿病、阿爾茨海默病等主要疾病中對於基因多態性及突變的研究變得活躍，並且可以為了研究多態性及突變而應用本發明的技術。

為了進行基因的變異型檢測而進行提取標本所包含的癌細胞的基因和通過多種技術來分析患者基因的方法。在尋找基因變異型時，重要的是檢測方法的敏感度(sensitivity)。敏感度意味著在整個基因中可檢測多少%的變異型，桑格測序的假陰性(false engative)率為10%、焦磷酸測序約為5%，而目前所開發的新方法的假陰性率為1%、0.1%左右，因此被看作是具有優秀的敏感度(Nam et al.Korean J Pathol.2014)。並且，有報告指出，根據標本的品質，基因分析結果變得不同，因此，為了進行準確的基因檢查，需要徹底管理分子檢查過程(19.Nam et al.Korean J Pathol.2014)。

通過多種檢查來執行基因的診斷性檢查(Diagnostic test)，用於在具有疾病症狀的患者中確診或鑒別診斷所懷疑的遺傳疾病。並且，對目前雖然沒有症狀，但具有遺傳疾病的家族病史的人執行是否存在成為發病原因的突變的檢查，從而可預測疾病的發病可能性和發病危險度逐漸變高的疾病。這種基因型檢查可有助於疾病的預防、早期診斷、治療及管理，從而可減少疾病的發病率和死亡率。

尤其，在人體內的所有細胞在遺傳性方面相同的前提下，能夠以人體的某種組織來進行基因型檢查，但最簡單地，以從血液中提取去 氧核糖核酸來使用為目的。並且，在遺傳體內的變異中，為了檢測與遺傳疾病相關的變化，試樣可以為去氧核糖核酸、核糖核酸、染色體、代謝物質等。基因的檢查方法具有直接分析構成去氧核糖核酸和核糖核酸的方法、間接確認與疾病基因一同遺傳的基因型及分析代謝產物的生物化學試驗(biochemical test)或染色體試驗(cytogenetic test)。

根據所要檢查的目的，能夠以多種方法執行基因型檢查。尤其，基因型的單核酸多態性及突變化可通過與等位基因特異性的探針的雜交、基於酶的突變檢測、錯配的異形結合體的化學性切割(文獻[Cotton et al.,1988])、基於錯配的堿基的核糖核酸的切割(文獻[Myers et al.,1985])、質譜法(美國專利號第6994960號、第7074563號、第7198893號)、核酸測序、單鏈構象多態性(SSCP)(文獻[Orita et al.,1989])、變性梯度凝膠電泳(DGGE)(文獻[Fischer and Lerman，1979a]、[Fischer and Lerman，1979b])、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)(文獻[Fischer and Lerman，1979a]、[Fischer and Lerman，1979b])、限制性片段長度多態性(RFLP)(文獻[Kanand Dozy，1978a]、[Kan and Dozy，1978b])、寡核苷酸連接分析法(OLA)、等位基因特異聚合酶鏈式反應(ASPCR)(美國專利號第5639611號)、連接酶鏈反應(LCR)及其變形方法(文獻[Abravaya et al.,1995]、[Landegren et al.,1988]、[Nakazawa et al.,1994])、流式細胞測定式異形結合體分析(WO/2006/113590)及其組合/變形來檢測。尤其，可通過基因表達系列分析(SAGE，Serial analysis of gene expression)技法來測定基因表達水準(文獻[Velculescu et al.,1995])。這種多種方法中的適當的分析方法可根據分析的具體目的、患者的狀態/病例及(多個)特定癌症、所要檢測、監測或治 療的疾病或其他醫學性病態而不同。

本發明的實施方式涉及在對象中監測疾病(例如，癌症)發作的方法及還在個體監測疾病復發的方法。本發明的實施方式也涉及非癌症和/或醫學性病態也具有遺傳相關性和/或原因，且這種疾病和/或醫學性病態也可被本發明所述的方法診斷和/或監測的事實。

本申請所記述的可適用於本發明的疾病或其他醫學性病態包括腎病、尿崩症、I型糖尿病、II型糖尿病、腎臟疾病腎小球腎炎、細菌性或病毒性腎炎腎小球、IgA腎病、過敏性紫癜(Henoch-Schonlein)、膜增生性腎小球腎炎、膜性腎病、乾燥綜合症、腎病綜合症微小病變、局灶性腎小球硬化症及相關疾病、急性腎功能衰竭、急性腎小管間質性腎炎、腎盂腎炎、血管炎症性疾病、先兆子癇、腎移植排斥、麻風病、反流性腎病、腎結石、遺傳性腎病、水囊腫病、水質海綿狀疾病、多囊性腎病、普通染色體顯性多囊腎病，普通染色體劣性多囊腎病，結節性硬化症、腦視網膜血管瘤病(von Hippel-Lindau disease)、家族性薄層-腎小球基底膜病、膠原III腎小球病、纖連蛋白腎小球病、奧爾波特綜合征、法布裏病、指甲-髕骨綜合征、先天性泌尿畸形、單克隆丙種球蛋白病、多發性骨髓瘤、澱粉樣變和相關疾病、熱病、家族性地中海熱、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染愛滋病(AIDS)、炎症性疾病、系統性血管炎、結節性多動脈炎、韋格納肉芽腫病、多動脈炎、壞死性及新月腎小球腎炎、多發性肌炎-皮肌炎、胰腺炎、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、痛風、血液病、鐮狀細胞病、血栓性血小板減少症紫癜、範科尼綜合征、移植、急性腎損傷、過敏性腸綜合征、溶血-尿毒癥綜合症、急性皮質壞死、腎栓塞、外傷及外科手術、擴散性損 傷、燒傷、腹部及血管手術、麻痹誘導、藥物使用或濫用藥物的副作用、循環系統疾病，心肌梗死、心臟衰竭、末梢血管疾病、高血壓、冠心病心臟疾病、非動脈粥樣硬化心血管疾病、動脈粥樣硬化心血管疾病、皮膚疾病、中暑、全身性硬化症、呼吸系統疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、阻塞性睡眠呼吸暫停、高山缺氧或內分泌疾病、肢端肥大症、糖尿病或尿崩症，但並不局限於此。被監測或被分析的癌症可為所有種類的癌症。上述癌症不受限制，包括上皮細胞癌，例如，肺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、乳腺癌、腦癌、結腸癌及前列腺腺癌。還包括胃腸癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、神經癌、腎癌、視網膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、生殖泌尿癌、膽囊癌、黑素瘤及白血病。並且，本發明的方法及組合物也可以在個體中等同適用於非-惡性腫瘤(例如，神經纖維瘤、腦膜瘤、雪旺氏細胞瘤)的檢測、早期診斷/診斷及預後。

對患有指定的疾病/醫學性病態(例如，癌症的臨床類型或亞型)的一個以上的對象的體液中的核酸進行分析，並與未患有指定疾病/醫學性病態的一個以上的對象的核酸進行比較來確認該核酸內容物間的差異。上述差異不受限制，可以為包括核酸表達水準、可選剪接變體、基因拷貝數變體(CNV)、核酸變形、單核苷酸多態性及核酸的突變(插入、缺失或單一核糖核酸變化)的任意遺傳性異常。一旦確認特定核酸的遺傳性參數上的差異為對特定疾病的差異，就可以執行與臨床及統計學的留意數量相對應地包括對象的追加研究，從而確立特定核酸的遺傳性異常和疾病之間的相關關係。

有報告指出，需要開發綜合個人的基因、蛋白質、環境資訊 來進行適合於個人的預防、診斷、治療的醫學發展的多種技術，例如，雖然目前在非小細胞肺癌患者中通過桑格去氧核糖核酸(Sanger DNA)堿基序列分析或逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、螢光原位雜交(FISH)等方法來確認表皮生長因數受體突變或單一基因變異，從而選擇治療藥劑，但今後通過本技術來檢查全基因組或外顯子組(exome)、轉錄組(transcriptome)來有助於個人定制型治療。

若由基因的變異引起疾病，則只要更換有問題的基因就可以進行治療。例如，1990年在美國，從因為缺乏製造腺試脫氨酶(ADA，adenosine deaminase)的基因而患有嚴重的先天性免疫缺陷的少女提取T淋巴細胞後，向上述淋巴細胞放入腺甙脫氨酶基因後重新向血液中注入，結果，可恢復免疫功能。將利用上述基因來治療疾病的方法稱為基因治療(gene therapy)。

如上述例所示，基因治療可以被分為提取作為目標的細胞來放入特定基因之後重新注入的體外(ex-vivo)基因治療和直接向目標組織注入特定基因來期待治療效果的體內(in-vivo)基因治療。目前的基因治療大部分以癌症治療為目的。這可以被分為直接向癌細胞注入用於猝滅癌細胞的抗癌基因或用於對抗癌劑變得敏感的基因的方法和向白血球放入分泌多個細胞因數(cytokin)的基因來使其浸透癌細胞或由癌細胞自身分泌細胞因數來促發免疫反應的方法。癌或後天性免疫缺陷綜合症(AIDS)及單一基因疾病等為目前基因治療的主要目的。可向用於這種基因治療的基因型的確認方法提供多種資訊。並且，活躍地進行針對特定人口組或人種的基因多態性和差異的研究，並且希望可將本技術應用於此。

並且，在癌症的情況下，很難知道對應基因是否對特定致癌物質更為脆弱、是否降低復原被破壞基因的功能、是否使參與癌症預防的免疫功能變得脆弱、是否使所有可能性變得可能等。因此，一個基因同時干涉多種疾病，且多個基因也與一種疾病相關。並且，在多因數遺傳疾病的情況下，即使有上述基因，也未必發生疾病。例如，最有名的癌基因為與乳腺癌相關的乳腺癌敏感性基因(BRCA1)突變基因，但具有該基因的女性至65歲為止，可有60%患上乳腺癌。相反，普通女性的12%患有該病。 這是因為乳腺癌為極為常見的西方的例，且在韓國，由於存在飲食生活等環境的差異而不一定如此。然而，此基因僅說明整體乳腺癌中的3%，此外還有數不勝數的不為人知的因數。並且，在該基因的持有者中，如果60%患有乳腺癌，就不一定意味著只要是持有者就一定患有此病。然而，毋庸置疑，該基因對乳腺癌的診斷和治療有相當的意義。對於其他疾病，呈現出如此高的相關關係的基因並不多，具有更為高的敏感度的本發明的技術及方法可發掘疾病的相關關係高的基因。並且，通過對基因多態性的藥物反應的差異的研究，可向定制醫學提供多種資訊。

癌症為遺傳體疾病，且在遺傳性的趣向中加上環境性刺激，從而借助多個基因變異來產生癌細胞，並增殖癌細胞來重複發生變異。目前作為重要的概念，具有癌基因依賴(oncogenic addiction)和合成致死(synthetic lethality)。癌基因依賴為基於多種遺傳性異常中一個或兩個基因異常的非正常性信號轉導通路的持續性活性化來對癌症的發生和增殖及維持起到擔當核心作用，以此可鈍化這種基因來治療癌症的理論。合成致死為即使在抑制各個的基因時不能滅絕癌細胞，但在同時抑制兩種基因時， 可破壞癌症細胞的概念。像這樣，若找出核心基因並理解基因的相互作用，則可獲得更好的治療效果，而且可使用利用本技術的多種資訊。

尤其，癌症的標本與其他疾病的標本不同，具有基因組遺傳體和原發性癌症部位和轉移癌部位等多種部位的體細胞癌症遺傳體資訊，從而可進行多種臨床性使用。對此，可通過分析利用本發明的標本基因型的單核酸多態性和染色體數變異(CNV)，來使用於每個人的癌症發生危險度的評價及早期診斷。

癌症特異體細胞去氧核糖核酸變異具有特定基因的突變、擴增、缺失、解鏈、甲基化等，它們的分析結果不僅使用於癌症發生危險度的評價，而且還用於各患者的診斷和治療。不僅是去氧核糖核酸變異，而且核糖核酸及蛋白質的表達程度、個體免疫反應或細胞因數的分泌程度也可使用於每個患者的癌症發生危險度的評價及各患者的診斷和治療。

目前，最受矚目的癌症遺傳體資訊為從各個癌症組織或血液中檢測的癌基因的突變。驅動突變(Driver mutation)的大部分作為癌基因，是決定對應患者的癌症的發生及發作、對治療劑的反應的最主要的基因變化。隨著更為敏感地檢測這種基因的變化，對於癌症的定制醫療，可使用為在各個的癌組織或血液中確認轉移基因變化來找出適合的治療法的道具具。尤其，隨著使用為可敏感地檢測對應患者的特定基因變化通路分析和並非熱點(hot spot)的稀有點(rare point)變異的方法，可使用為癌症遺傳體的大數據。

與此相關，對於肺腺癌，已公開約為10個驅動突變，且有報告指出以這些變形為靶向的幾種藥物。例如，作為表皮生長因數受體酪氨 酸激酶抑制劑的吉非替尼的反應應答率為約70%，具有表皮生長因數受體-活性化變異的患者在10個月內即使沒有腫瘤發作也可以生存。基於這種研究，肺腺癌的治療戰略從基於組織接近轉向驅動突變相關治療法。不同民族間的幾種驅動突變的發生頻率存在差異，因此表現出為了開發肺癌的新藥物靶標(druggable targets)及靶向治療而需要進行廣範圍的遺傳性研究。

被稱為驅動突變的具有遺傳性變形的癌細胞與不具有這種變形的細胞相比，在生存及生長方面具有優勢。驅動突變在用於對激酶等信號蛋白進行加密的基因中發生，且上述驅動突變可以以揭示並維持腫瘤發生的結構來產生生存信號。

從遺傳學角度來看，癌症的種類非常多，且活躍地發生變化，因此，當對治療產生耐性或在發生發作、轉移時，在診斷當時發生擔當重要作用的驅動突變和其他新突變，或者由診斷時並不重要的突變(passenger mutation)擔當主要作用。目前，與因步驟性刺激和突變而發生癌的多步驟模型(multi-step model)不同，介紹一次以多發性地發生很多變異的危機模型(crisis model,chromothripsis)的概念，並將腫瘤的進化和異質性作為所要解決的最為艱難且最為重要的問題，利用本技術來敏感地檢測多種突變，由此可確認多種資訊。

並且，目前可使用為對局限基因檢查及使用的每個人的基因表達差異、在癌組織中的原發性癌症和轉移部位的癌組織的多種基因變化化、在患者的體內由持續性進化引起的變化等的監測。尤其，從癌症患者獲得組織的過程為會給患者帶來很多負擔的極為困難的過程，相反，本發明可使用少量的組織或者可從容易採集的血液中實施癌症特異基因檢測方 法，從而可通過多種臨床性證明來使用為多種數據。

利用於肺癌的預防、早期診斷/診斷、預後及治療方法的決定

眾所周知，肺癌作為普遍發作的癌症，是全世界範圍癌症相關死亡的主要原因。隨著導入低劑量電腦斷層掃描技術，雖然提高早期診斷比率，但肺癌依然是預後極為不樂觀的致命性疾病。

對於肺癌患者而言，只要具有表皮生長因數受體基因的活性化突變，表皮生長因數受體阻斷酪氨酸激酶抑制劑(易瑞沙、特羅凱等)就對治療有效。在以往的表皮生長因數受體活性突變檢查法中，直接堿基序列分析方法為標準法，也可使用更為靈敏的肽核酸箝術(PNA clamp)。 並且，使用新一代堿基序列分析法的離子激流(Ion Torrent)分析結果，與以往的肽核酸箝術具有相同靈敏度，並且也可在各患者組織去氧核糖核酸中檢測變異頻率，從而可獲得較為準確的資訊。並且，與通過直接堿基序列分析方法來檢測發生變異的患者組相比，在靈敏的方法中檢測到變異的患者的表皮生長因數受體阻斷酪氨酸激酶抑制劑的治療效果具有更高的臨床有用性，從而報告出以準確且敏感的方式進行檢測極為重要。

在肺癌患者的情況下，至少存在一個表皮生長因襲受體突變體意味著患者可從使用作為表皮生長因數受體靶向化合物的吉非替尼或厄洛替尼的治療方法中獲得利益。有報告指出，在多種類型的癌症中，表皮生長因數受體實現異常活性化或超表達。至今，還在進行尋找對肺癌的發生起到核心作用的靶，並理解遺傳多樣性的研究，而且可進行使用本發明的遺傳多樣性的理解研究。

在肺癌中實現活性化的腫瘤基因具有表皮生長因數受體、淋巴瘤激酶、大鼠肉瘤、ROS1、MET、RET等，且以這種核心腫瘤基因為靶的治療劑可選擇性地去除癌細胞。表皮生長因數受體作為受體家族酪氨酸激酶結構域受體組(tyrosine kinase receptors family；EGFR，HER-2，ErbB-3，ErbB-4)中的一個，是具有細胞外配體結構域(extracelluar ligand-binding domain)和酪氨酸激酶結構域(tyrosine kinase domain)的細胞內域(intra-cellar domain)的跨膜酪氨酸激酶(transmembrane tyrosine kinase)。 若配體與組成同型二聚體(Homodimer)或異源二聚體(heterodimer)的受體相結合，則使細胞內的酪氨酸激酶結構域實現活性化，而像這樣被表皮生長因數受體刺激的信號使磷脂醯肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蘇氨酸激酶/mTOR、大鼠肉瘤/迅速加速性纖維肉瘤(RAF)/促分裂原活化蛋白激酶、JAK/轉錄啟動因數信號轉導通路活性化。吉非替尼和厄洛替尼為抑制表皮生長因數受體酪氨酸激酶結構域的具有代表性的藥劑。

表皮生長因數受體激酶結構域的突變被公開為是可預測表皮生長因數受體酪氨酸激酶抑制劑的效果的因數，這種突變從組織學角度來看主要在腺癌、女性、非吸煙者、東洋人中進行表達。基於多次臨床試驗的結果，對當前診斷為非小細胞肺癌4期腺癌的患者執行表皮生長因數受體突變檢查，並在存在突變時，投用表皮生長因數受體酪氨酸激酶抑制劑作為早期治療。

並且，大鼠肉瘤原癌基因(proto-oncogene)具有克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、神經母細胞瘤病毒癌基因及人V-HA-RAS肉瘤 病毒癌基因同源物等，並且擔當調整細胞增殖、分化和生存的作用。大鼠肉瘤蛋白質在非活性化狀態下與鳥苷二磷酸(GDP，guanosine diphosphate)相結合，若鳥苷二磷酸被鳥苷三磷酸(GTP，guanosine triphosphate)取代，則蛋白質實現活性化來使大鼠肉瘤/迅速加速性纖維肉瘤/丁酮(MEK)/促分裂原活化蛋白激酶和磷脂醯肌醇3-激酶蘇氨酸激酶/mTOR信號轉導體系活性化。在肺癌中，約在20%中呈現出大鼠肉瘤/迅速加速性纖維肉瘤/丁酮/促分裂原活化蛋白激酶信號轉導體系的活性化，且主要基於克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突變的活性化，而很少有V-HA-RAS肉瘤病毒癌基因同源物或神經母細胞瘤病毒癌基因的突變。有報告指出，由於克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物對肺癌的發生擔當重要的作用，因此具有很多視其為靶的研究，但利用對大鼠肉瘤蛋白質的翻譯後過程(post translational processing)進行抑制的法尼基(farnesyltransferase)抑制劑和對大鼠肉瘤的反義去氧核苷酸的研究並未取得成功。並且，有報告指出，在具有克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突變的情況下，使表皮生長因數受體之後步驟的信號轉導體系持續性地實現活性化來呈現出對表皮生長因數受體酪氨酸激酶抑制劑的抵抗性，從而可使用用於確認上述現象的本發明。

另一方面，隨著公開對非小細胞肺癌的發生和發作產生重要影響的分子生物學機制，並開發出多種診斷方法和靶向治療劑，從而增加非小細胞肺癌患者的生存率。尤其，若存在表皮生長因數受體突變的腺癌患者服用表皮生長因數受體酪氨酸激酶結構域抑制劑，則與以往的抗癌劑相比，顯著增加反應率和中位無進展生存期。尤其，克唑替尼(crizotinib)因選擇利用可預測反應的準確的生物學標誌物的患者，來急劇減少藥物批 准所消耗的時間和費用而受到矚目，但雖然有很多研究，卻依然表現出不樂觀的預後，並且還存在在預防和診斷、治療中需要解決的問題。其原因中的一個可例舉肺癌的遺傳性異質性(heterogeneity)。

本發明的表皮生長因數受體、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、神經母細胞瘤病毒癌基因突變型檢查結果通過執行肺癌的藥劑感受性檢查來預測對有利於非小細胞肺癌的作為酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的吉非替尼(易瑞沙(Iressa))和厄洛替尼(特羅凱(Tarceva))處方的預後，從而可以在決定患者的治療方針方面提供決定性的資訊。尤其，表皮生長因數受體突變作為可以準確預測對吉非替尼(易瑞沙)和厄洛替尼(特羅凱)的反應的標誌物，提倡用作表皮生長因數受體突變的陽性非小細胞肺癌患者的第一次抗癌藥劑。

並且，克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突變作用為不與酪氨酸激酶抑制劑藥物發生反應的藥物抵抗性的強有力的預測因數，主要在外顯子2號的密碼子12和13中發現克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突變。克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突變發現於非小細胞肺癌的15~30%中，且主要在吸煙患者中觀察得到，且與表皮生長因數受體突變以互斥的方式發現。

另一方面，肺癌的靶向治療劑以於1990年代開發的作為細胞毒性抗癌劑的長春瑞濱(vinorelbine)、吉西他濱(gemcitabine)、紫杉烷(taxanes)等與鉑(platinum)製劑之間的並用化學療法使非小細胞肺癌患者的治療效果得到改善，但作為傳統型細胞毒性抗癌劑治療，對發作性及轉移性非小細胞肺癌患的治療不具有明顯的效果。之後，作為對肺癌的病 態生理的分子生物學研究，吉非替尼和厄洛替尼作為屬於小分子(small molecule)表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑的靶向治療劑，使用為單一療法的第二次或第三次治療劑。並且，確認目前被稱為貝伐單抗的血管新生抑制劑在發作性非小細胞肺癌患者的第一次早期治療方面，與紫杉醇/卡鉑或吉西他濱/卡鉑等以往的化學療法劑的三聯療法對生存期間的提高具有意義。

上述吉非替尼以具有治療經歷的發作性非小細胞肺癌患者為對象，在2期研究中呈現出9~19%的治療反應率，而在40%以上的患者中存在症狀的好轉，但在之後執行的大型隨機安慰劑對比的3期研究中，在以往的紫杉醇/卡鉑細胞毒性抗癌療法追加吉非替尼的結果，並未呈現出對治療反應率、疾病進展時間(TTP，time to progression)及生存率提高的顯著差異。並且，根據目前發表的4期研究在肺癌易瑞沙生存評價(ISEL，Iressa Survival evaluation in Lung Cancer)資料中呈現出吉非替尼使用組與安慰劑對比組相比，生存率沒有顯著的差異。只是在小組分析中，非吸煙者和東洋人卻表現出生存率的差異。目前，只有在具有表皮生長因數受體突變，或者女性、腺癌、非吸煙者等三個條件中滿足兩種以上的情況下，才使用為第二次抗癌療法劑，在第一次、第二次抗癌治療中使用紫杉烷類製劑和鉑的情況下，使用為第三次抗癌療法劑。

並且，厄洛替尼以具有治療經歷的非小細胞肺癌患者為對象，在2期研究中以13%的反應率和51%的疾病調整率呈現出與吉非替尼類似的結果，且利用免疫組織化學(immunohistochemistry)方法，以表皮生長因數受體超表達患者為對象。然而，在利用第一次療法在吉西他濱/順雙 氯雙氨泊鉑及卡鉑/紫杉醇追加厄洛替尼來觀察效果的大規模3期研究中，並未呈現出反應率及生存期間顯著改善的效果。然而，厄洛替尼作為第二次療法劑，若與安慰劑對比，在作為2：1隨機3期研究的BR.21結果中，表現出無進展生存期為2.2：1.8個月、總生存期6.7：4.7個月的顯著差異，因此被報告為在非小細胞肺癌中證明生存資料提高的目標治療劑。

目前，有研究表明，在沒有表皮生長因數受體突變的肺癌患者中，以往的抗癌劑比靶向治療劑更為有效。對韓國國內肺癌患者中占60%左右的表皮生長因數受體突變陰性肺癌患者的治療而言，以往的細胞毒性抗癌劑與作為表皮生長因數受體靶抗癌劑的“易瑞沙”或“特羅凱”相比比，更為有效。在對表皮生長因數受體靶抗癌劑和以往的抗癌劑治療進行的臨床試驗和患者的治療結果進行元分析的結果，靶抗癌劑的功效存在爭論，因此，在整個表皮生長因數受體突變陰性患者組中執行用於查明何為最優的治療藥劑的研究，結果，利用以往細胞毒性抗癌劑進行治療的情況與利用表皮生長因數受體靶抗癌劑進行治療的情況相比，表皮生長因數受體突變陰性患者的癌症的發作速度變慢(中位無進展生存期6.4個月vs 4.5個月)，且腫瘤大小也更加減少(反應率16.8%vs7.2%)。這種結果在使用這些抗癌劑作為第一次治療劑的情況和使用這些抗癌劑作為第二次治療劑的情況中均被觀察。因此，今後在表皮生長因數受體突變陰性患者中，與表皮生長因數受體抑制劑相比，優先推薦使用以往的抗癌劑等對藥物反應性檢查而言，突變檢查的結果很重要。

利用於大腸癌的預防、早期診斷/診斷、預後及治療方法的決定

另一方面，有報告指出，至今已確認的大腸癌的發病原因為由遺傳性、後天性變化積累併發生細胞的形質轉換，並且通過形質轉換的細胞的增殖來產生腫瘤。大腸癌作為參與腫瘤的發生且已知具有遺傳學機制的腫瘤中的一種，目前，實際臨床適用這種遺傳學異常來治療患者。本發明可對這種癌症機制的研究有意義。

作為癌基因的大鼠肉瘤以人V-HA-RAS肉瘤病毒癌基因同源物、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、神經母細胞瘤病毒癌基因三種形態存在，並製成起到分子開關作用的三磷酸鳥苷水解酶(GTPase，Guanosine triphosphate hydrolase)。大鼠肉瘤起到向核內轉導細胞外生長信號的作用，但若使大鼠肉瘤活性化，則通過迅速加速性纖維肉瘤/促分裂原活化蛋白激酶、磷脂醯肌醇3-激酶/蘇氨酸激酶、Mekk/蛋白激酶等多種通路來轉換(transformation)細胞，並起到抑制如p53或TGF-β通路等腫瘤抑制通路的作用。大鼠肉瘤中最頻繁地在大腸癌中引起突變的為克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，而集中發生於密碼子12、密碼子13、密碼子61，對斷片-介質三磷酸鳥苷水解(GAP-mediated GTP hydrolysis)具有抵抗性，從而維持持續性活性化的狀態。

用於大腸癌診斷的大便潛血試驗(fecal occult blood test)在數十年間使用為篩查非侵襲性大腸癌的方法，且在多個研究中指出可減少大腸癌死亡率(Mandel JS,N Engl J Med,1993/Kronborg O,Lancet 1996)。 然而，當篩選大腸癌，尤其，大腸癌的機制病變時，存在敏感度降低的問題。為了解決這種問題，執行大便去氧核糖核酸檢查，但其實是在大便中檢測大腸癌中所發生的突變或啟動子甲基化的方法。有報告指出，在2004 年，與大便潛血試驗相比，利用在大便中測定包含抗原提呈細胞、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、P53等的突變和BAT-26、長去氧核糖核酸等的21個標誌物的方法對大腸癌的敏感度更為優秀(52%vs13%)，且有報告指出，在2008年，在利用克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、抗原提呈細胞基因的突變和波形蛋白(vimentin)基因的啟動子甲基化等三個標誌物的研究中，發作性腺瘤發現率為46%，從而比大便潛血試驗的10~17%更為優秀(Imperiale TF N Engl J Med，2004)。已知，對於早期大腸癌，這種大便去氧核糖核酸檢查具有46~77%的敏感度，因此比大便潛血試驗優秀，從而目前已成為為大腸癌篩查法。此外，正在進行在血液或小便中找出與大腸癌相關的去氧核糖核酸、核糖核酸、蛋白質等來用於篩查的研究，對此，可容易地找出利用本發明技術的篩查後補或確認特定突變的影響力等。

並且，已查明在致癌期之前，遺傳體不穩定和後天性變化起到重要作用，並且已查明參與癌發生的多個信號轉導體系，由此開發利用在大腸癌中發現的遺傳性、後天性變化的新早期診斷方法，而且可以與新藥劑開發一同作為對於大腸癌的預後和治療反應的預測因數來使用，並可貢獻於個人定制治療的發展。

利用於結腸癌的預防、早期診斷/診斷、預後及治療方法的決定

轉移性結腸癌(mCRC)作為西方的第二個癌症致死的原因，基於針對表皮生長因數受體單克隆抗體，例如，西妥昔單抗及帕尼單抗的治療給予轉移性結腸癌患者顯著的生存利益，並且是目前對於這些患者的治療療法的標準成分。即，單獨或與其他抗腫瘤性藥物組合後，與這 些單克隆抗體中的一種，例如，西妥昔單抗與基於鉑的化學療法組合後，也為了治療被命名為頭頸部腫瘤的具有頭頸部的鱗狀細胞癌的患者而下處方。

單克隆抗體與表達在癌細胞上的外部抗原相結合。只要一旦相結合，就顯示為癌細胞被患者的免疫系統破壞。除了靶向癌細胞，單克隆抗體可被設計成作用於腫瘤生長所需的其他細胞類型及分子上。單克隆抗體可通過阻斷破壞惡性腫瘤細胞的特定細胞受體來防止腫瘤生長。治療性單克隆抗體西妥昔單抗及帕尼單抗與表皮生長因數受體相結合，且防止通過表皮生長因數受體誘導的細胞內信號通路(即，大鼠肉瘤-迅速加速性纖維肉瘤-丁酮-細胞外信號調節激酶級聯及磷脂醯肌醇3-激酶-蘇氨酸激酶通路)的活性化。不幸的是，並不是具有轉移性結腸癌的所有患者對包含單克隆抗體的治療療法產生反應。還未充分瞭解像這樣不產生反應的機制。

對克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS，Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)蛋白質實施加密的基因可來源於人類，且可位於人類的染色體12(p12.1)，而克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物蛋白質為由此加密的蛋白質。克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因可具有向GenBank accession no.NM_004985，NM_033360提供的核苷酸序列的同源物。

克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物為表皮生長因數受體下游效應，且對抗表皮生長因數受體單克隆抗體的第一次抗拒的標記。克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物對轉移性結腸癌患者治療的最優化具有相當大的影響力。結腸腫瘤的40%在克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物中 藏有突變，且這些患者沒有抗表皮生長因數受體單克隆抗體的效果。目前，在臨床實施中對抗表皮生長因數受體單克隆抗體治療考慮的所有轉移性結腸癌患者應通過克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物測試，並且若檢測到克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突變，則患者只能從西妥昔單抗或帕尼單抗治療中排除。

並且，具有野生型克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物腫瘤的轉移性結腸癌患者的一部分依然無法從抗表皮生長因數受體單克隆抗體得到利益。在野生型克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物對象中，在與化學療法組合時，對抗表皮生長因數受體單克隆抗體的反應率大約為60%，而向化學療法難治患者單獨投用時，則低於20%。

不僅是磷酸酶及張力蛋白同源物表達的損失，而且還使如絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶的鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體B1(B-Raf)及磷脂醯肌醇3-激酶等其他表皮生長因數受體下游基因的突變活性化，以及在其他表皮生長因數受體調整蛋白質中的變化被評價為對於至今為止不具有決定性結果的抗表皮生長因數受體治療的反應的有利的後補。

大鼠肉瘤蛋白質及迅速加速性纖維肉瘤蛋白質為形成基於大鼠肉瘤/迅速加速性纖維肉瘤/促分裂原活化蛋白激酶通路的細胞內信號轉導的級聯的蛋白質。在上述大鼠肉瘤/迅速加速性纖維肉瘤/促分裂原活化蛋白激酶通路中，迅速加速性纖維肉瘤蛋白質被活性型大鼠肉瘤蛋白質活性化，丁酮蛋白質被活性型迅速加速性纖維肉瘤蛋白質活性化，並且，促分裂原活化蛋白激酶蛋白質被活性型丁酮蛋白質活性化。由此，調整細胞的增殖及分化。

貝伐單抗/FOLFIRI並用療法為適合用作轉移性結腸癌的第一次治療劑的治療劑，並可延長反應率、中位無進展生存期、總生存期間(Hurwitz H,et al.NEJM 2004,6.Petrelli et al.Clin Colorectal Cancer.2013 Sep；12(3)：145-51)。作為轉移性結腸癌的第二次治療劑，對中位無進展生存期、總生存率呈現出效果的治療劑為貝伐單抗和阿柏西普(ziv-aflibercept)(Giantonio et al.JCO 2007 14.Tabernero et al.European Journal of Cancer 50,320-331,2014)。貝伐單抗在第一次治療中與抗癌化學療法並用，且在第一次復發後，在作為第二次治療變更抗癌化學療法後持續投用貝伐單抗時時，顯著延長中位無進展生存期、總生存率(Bennouna et al.Lancet Oncol.14：29：37,2013)。

實施例

實施例1

實施例1-1．標本採集

獲得從參加隨機安排2期試驗的192名非小細胞肺癌患者的組織標本和血液中分離的血漿標本。在組織標本的情況下，利用堿基序列分析方法來獲得結果，並且利用本發明的同時檢測多靶核酸的方法來在血漿中進行表皮生長因數受體試驗。

實施例1-2．去氧核糖核酸的提取

在本實驗中，利用凱傑公司(QIAGEN)的QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit(Cat# 55114)來提取去氧核糖核酸。對此進行簡要說明如下，向1ml的血漿(plasma)標本添加800μl的包含100μl的蛋白酶K(Proteinase K)和1.0μg的載體核酸的緩衝液(Buffer)ACL，並攪 拌好後，在60℃溫度下處理1小時。在進行培養之後，添加1.8ml的ACB緩衝液，之後在冰(ice)上放置5分鐘。在利用真空(vacuum)來將上述溶液放入柱狀物(column)後，以緩衝液ACW1 600μl、緩衝液ACW2 750μl、100%乙醇750μl的順序進行洗滌。在真空系統(vacuum system)中分離柱狀物來以14000rpm中離心分離3分鐘後，在56℃溫度下處理10分鐘，從而去除剩餘乙醇。在柱狀物添加緩衝液AVE 100μl來在14000rpm下進行1分鐘的離心分離後，溶出脫氧核糖核酸。在熔融(C-Melting)實驗中按5μl的量使用所溶出的去氧核糖核酸。

實施例1-3．表皮生長因數受體突變的確認

利用從血漿中提取的去氧核糖核酸來執行用於檢測表皮生長因數受體變異的聚合酶鏈式反應。對此進行簡要說明如下，在19μl的用於檢測外顯子18、外顯子19、外顯子20及外顯子21突變47種的10種試劑(G719X、E19del A、E19del B、S768I、T790M、E20ins A、E20ins B、L858R、L861Q、EIC)中分別混合1μl的耐熱性去氧核糖核酸聚合酶(Taq DNA polymerase)(韓國Enzynomics公司，(Enzynomics.,Korea))後，添加5μl的去氧核糖核酸。在50℃溫度下進行2分鐘的聚合酶鏈式反應，來進行尿嘧啶糖基化酶滅活後，在95℃溫度下進行15分鐘的早期變形並執行15迴圈(在95℃溫度下執行30秒鐘、在70℃溫度下執行20秒鐘、在63℃溫度下執行1分鐘)、35迴圈(在95℃溫度下執行10秒鐘、在53℃溫度下執行20秒鐘、在73℃溫度下執行20秒鐘)。之後，在95℃溫度下培養15分鐘，在35℃溫度下培養5分鐘後，每次分別增加0.5℃的溫度，直到35℃~75℃為止，且每3秒鐘測定信號(羧基螢光素、六亞甲基四胺、羅紅黴素、Cy5)，來導出解鏈溫 度結果值。上述聚合酶鏈式反應均適用於從192名患者的血漿提取的去氧核糖核酸。

實施例1-4．與組織(tissue)結果間的相關性及生存率的分析

本發明的利用熔融技術來從血漿標本提取的基因的表皮生長因數受體試驗結果，與以往組織標本的一致率為81.3%(95%置信區間(confidence interval)[CI]，75.0-86.5)、敏感度及特異度也分別確認為62.0%(95% CI，47.2-75.4)、88.0%(95% CI，81.5-92.9)。並且，與組織標本相比，在血漿試樣中還檢測到表皮生長因數受體T790M(n=8)、exon20ins(n=5)。表1表示接受表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑治療(吉非替尼(Gefitinib、Iressa)或厄洛替尼(Erlotinib、Tarceva)的114名之間的平均中位無進展生存期(median progression-free survival(PFS))結果。

使用本發明的方法來對表皮生長因數受體突變檢測結果分析中位無進展生存期，結果，可以確認顯著的生存結果。

實施例2

以非小細胞肺癌患者為對象的克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突變的檢測

實施例2-1．標本的採集

獲得從參加隨機安排2期試驗的135名非小細胞肺癌患者的 組織標本和從血液獲得分離的血漿標本。在組織標本的情況下，利用堿基序列分析方法來獲得結果，並且利用本發明的同時檢測多靶核酸的方法來在血漿中進行克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物試驗。

實施例2-2．去氧核糖核酸的提取

在本實驗中，使用凱傑生物公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Cat# 55114)來提取去氧核糖核酸。對此進行簡要說明如下，向1ml的血漿(plasma)標本添加800μl的包含100μl的蛋白酶K(Proteinase K)和1.0μg的載體核酸的緩衝液(Buffer)ACL，並攪拌好後，在60℃溫度下處理1小時。在進行培養後，添加1.8ml的ACB緩衝液，並在冰(ice)上放置5分鐘。在利用真空來將上述溶液落放入柱狀物後，以600μl的緩衝液ACW1(Buffer ACW1)、750μl的緩衝液ACW2(Buffer ACW2)、750μl的100%乙醇的順序對柱狀物進行清洗。在真空系統中分離柱狀物，並在14000rpm的轉速下進行3分鐘的離心分離後，在56℃的溫度下進行10分鐘的處理，從而去除殘留的乙醇。向柱狀物添加100μl的緩衝液AVE來以14000rpm進行1分鐘的離心分離後，溶出脫氧核糖核酸。在熔融(C-Melting)實驗中按5μl的量使用所溶出的去氧核糖核酸。

實施例2-3．確認克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突變

利用從血漿中提取的去氧核糖核酸來執行用於檢測克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物變異的聚合酶鏈式反應。對此進行簡要說明如下，向19μl的用於檢測外顯子2、外顯子3及外顯子4的突變29種的9種試劑(KC12a、KC12b、KC13a、KC13b、KC59、KC61、KC117、KC146、 KIC)中分別混合1μl的耐熱性去氧核糖核酸聚合酶(韓國Enzynomics公司)後，添加5μl的去氧核糖核酸。在50℃的溫度下進行2分鐘的聚合酶鏈式反應，來進行尿嘧啶糖基化酶(UDG)滅活(inactivation)，之後在95℃的溫度下進行15分鐘的初期變性後，執行15迴圈(在95℃的溫度下執行30秒、在70℃的溫度下執行20秒、在63℃的溫度下執行1分鐘)、35迴圈(在95℃的溫度下執行10秒、在53℃的溫度下執行20秒、在73℃的溫度下執行20秒)。之後，在95℃的溫度下培養15分鐘，並在35℃的溫度下培養5分鐘後，每次分別增加0.5℃的溫度，直到35℃~75℃為止，且每3秒鐘測定信號(羧基螢光素、六亞甲基四胺、羅紅黴素、Cy5)，來導出解鏈溫度結果值。 上述聚合酶鏈式反應均適用於從135名患者的血漿中提取的去氧核糖核酸。

實施例2-4．與組織結果間的相關性及生存率的分析

本發明的利用熔融技術來從血漿標本提取基因的克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物試驗結果，與以往組織標本間的一致率為81.5%(95%置信區間[CI]，73.9-87.6)、敏感度及特異度分別確認為25.0%(95% CI，5.5-57.2)、87.0%(95% CI，79.7-92.4)。並且，與組織標本相比，血漿標本還從16患者的標本中檢測出突變。表2表示接受表皮生長因數受體-酪氨酸激酶抑制劑治療的114名患者的平均中位無進展生存期結果。

使用本發明的方法來對克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突變檢測結果進行中位無進展生存期分析的結果，可確認顯著的生存結 果。

Claims (10)

1. 一種檢測病患試樣中表皮生長因子受體(EGFR)或克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)的突變的KRAS基因檢測方法，以診斷、預防、治療或預後癌症疾病包括：(a)藉由混合一引物和一探針混合體以進行雜交，該探針混合體由為檢測病患試樣中之EGFA或KRAS突變的一檢測探針、以及抑制野生型EGFR基因或野生型KRAS基因擴增的一夾緊探針(clamping probe)所構成，並取得一即時擴增曲線；(b)在擴增後改變溫度而取得介於一擴增產物和該檢測探針之間的一解離曲線(dissociation curve)；並(c)分別、連續或同時分析所取得的該即時擴增曲線和該解離曲線，其中，該檢測探針和該夾緊探針為肽核酸(PNA)，且為了修正結構而將一胺基酸或一胺基酸的一支鏈連接到該檢測探針和該夾緊探針的伽馬位置(γ、gamma position)。
2. 一種檢測病患試樣中表皮生長因子受體(EGFR)或克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)突變的KRAS基因檢測方法，以提供利用管理酪氨胺酸激酶抑制劑(TKI)治療癌症疾病的必要資訊，包括：(a)藉由混合一引物和一探針混合體以進行雜交，該探針混合體由為檢測病患試樣中之EGFA或KRAS突變的一檢測探針、以及抑制野生型EGFR基因或野生型KRAS基因擴增的一夾緊探針所構成，並取得一即時擴增曲線；(b)在擴增後改變溫度而取得介於一擴增產物和該檢測探針之間的一解離曲線；並 (c)分別、連續或同時分析所取得的該即時擴增曲線和該解離曲線，其中，該檢測探針和該夾緊探針為肽核酸(PNA)，且為了修正結構而將一胺基酸或一胺基酸的一支鏈連接到該檢測探針和該夾緊探針的伽馬位置(γ、gamma position)。
3. 一種檢測病患試樣中克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)之突變的KRAS基因檢測方法，以提供利用西妥昔單抗(Cetuximab)或帕尼單抗(Panitumumab)治療癌症疾病的必要資訊，包括：(a)藉由混合一引物和一探針混合體以進行雜交，該探針混合體由為檢測病患試樣中之KRAS突變的一檢測探針、以及抑制野生型KRAS基因擴增的一夾緊探針(clamping probe)所構成，並取得一即時擴增曲線；(b)在擴增後改變溫度而取得介於一擴增產物和該檢測探針之間的一解離曲線；並(c)分別、連續或同時分析所取得的該即時擴增曲線和該解離曲線，其中，該檢測探針和該夾緊探針為肽核酸(PNA)，且為了修正結構而將一胺基酸或一胺基酸的一支鏈連接到該檢測探針和該夾緊探針的伽馬位置(γ、gamma position)。
4. 根據申請專利範圍第1至3項當中任一項方法，特徵在於癌症選自由肺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、乳腺癌、腦癌、結腸癌、前列腺癌、胃腸癌、頭頸癌，非小細胞肺癌、神經癌、腎癌、視網膜癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌、生殖道癌、膽囊癌、黑素瘤及白血病組成的組群。
5. 根據申請專利範圍1至3項當中任一項方法，其特徵在於病患試樣係選自由血液、血清、血漿、淋巴、母乳、尿液、排泄物、眼內液、唾液、 精液、腦提取物、脊髓液以及盲腸、脾臟及扁桃腺的提取物。
6. 根據申請專利範圍第1至3項當中任一項方法，其特徵在於將報告基團(reporter)及淬滅基團(quencher)連接至該檢測探針。
7. 根據申請專利範圍第1至3項當中任一項的方法，其特徵在於利用即時的聚合酶鏈式反應(PCR，polymerase chain reaction)來進行擴增。
8. 根據申請專利範圍第1至3項當中任一項的方法，其特徵在於除了取得該即時的擴增曲線外，在取得(b)中的該解離曲線前另新增至5至20的個循環的PCR反應。
9. 根據申請專利範圍第2項的方法，特徵在於該酪氨酸激酶抑制劑(TKI)為吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)。
10. 一種使用申請專利範圍的第1至3項中EGFR或KRAS基因檢測的試劑盒。