PT2046985E - Método para a detecção de mutações de egfr em amostras de sangue - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE MUTAÇÕES DE EGFR EM AMOSTRAS DE SANGUE"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à detecçao de mutações de EGFR numa amostra de sangue (soro/plasma) de um indivíduo.

ANTECEDENTES 0 cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada com o cancro em homens e mulheres. A prevalência do cancro do pulmão é apenas precedida pelo cancro da próstata em homens e cancro da mama em mulheres. Recentemente, o cancro do pulmão ultrapassou a doença cardíaca como a principal causa de mortalidade relacionada com o tabagismo. Adicionalmente, a maior parte dos doentes que desenvolve cancro do pulmão fuma e tem lesão relacionada com tabagismo no coração e pulmões, tornando as terapias cirúrgicas ou de multimodalidade agressivas opções menos viáveis. A maior parte dos carcinomas do pulmão é diagnosticada num estádio avançado, conferindo um prognóstico reservado. 0 cancro de células não pequenas do pulmão (NSCLC) contribui para, aproximadamente, 75% de todos os cancros do pulmão. 0 NSCLC é um agregado heterogéneo de histologias. As 1 histologias mais comuns são o carcinoma epidermóide ou escamoso, adenocarcinoma e carcinoma de células grandes. Vários estudos tentaram identificar marcadores clínicos, laboratoriais e moleculares que pudessem auxiliar os médicos e investigadores a distinguir subgrupos de doentes NSCLC. Entre estas linhas, diversos estudos mostraram que o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é sobreexpresso em 40 a 80 porcento de cancros de células não pequenas do pulmão e muitos outros cancros epiteliais. A sinalização de receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) aberrante é crítica para limitar a sensibilidade a agentes anticanerígenos e a activação de tirosina cinase independente de ligando de EGFR é, frequentemente, causada por mutações de EGFR no domínio extracelular, as quais foram observadas em diversos tipos de tumores, tal como glioblastoma multiforme. A sinalização de EGFR é desencadeada pela ligação de factores de crescimento, tal como o factor de crescimento epidérmico (EGF). A autofosforilação e transfosforilação dos receptores, através dos seus domínios de tirosina cinase, conduzem ao recrutamento de efectores a jusante e à activação de sinais proliferativos e de sobrevivência celular.

Duas mutações contribuem para, aproximadamente, 90% das mutações de EGFR referidas até à data em adenocarcinomas do pulmão. Na população caucasiana, o tipo de mutação mais comum, verificado em cerca de 65% dos casos com as mutações de EGFR, é uma curta deleção, em fase, dos nucleótidos 9, 12, 15, 18 ou 24 no exão 19. A segunda mutação mais comum, verificada em cerca de 35% dos casos com as mutações de EGFR, é uma mutação pontual 2 (CTG em CGG) no exão 21 no nucleótido 2573 que resulta na substituição de leucina por arginina no codão 858 (L858R), adjacente ao motivo DFG no lobo carboxi-terminal no gancho de activação da cinase.

Estas mutações de EGFR são mutações somáticas bona fide em NSCLC e não foram identificadas em outros tipos de tumores primários. Além disso, as mutações de EGFR são um forte determinante da resposta tumoral a gefitinib no cancro de células não pequenas do pulmão (NSCLC). Outras mutações muito menos comuns foram descritas nos exões 18, 20 e 21.

Até à data, o rastreio para estas mutações tem sido baseado na sequenciação directa ou análise de polimorfismo de conformação de cadeia simples. Os métodos de amplificação de ácido nucleico (por exemplo, a reacção de polimerização em cadeia) permitem a detecção de um pequeno número de moléculas mutantes de entre um fundo de moléculas normais. Embora os meios alternativos de detecção de um pequeno número de células tumorais (tal como citometria de fluxo) tenham estado, em geral, limitados a malignidades hematológicas, os ensaios de amplificação de ácido nucleico deram provas de serem sensíveis e específicos na identificação de células malignas e para a previsão de prognóstico após quimioterapia.

Foram desenvolvidas diversas estratégias de amplificação de ácido nucleico para detecção de um pequeno número de moléculas mutantes em tecido tumoral sólido. Por exemplo, um método sensível e específico identifica ADN do oncogene ras mutante, com base no fracasso na clivagem de um sítio de restrição no 12° codão crucial (Kahn et al. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes via "enriched" PCR 3 amplification. Oncogene. Junho de 1991; 6(6): 1079-83). Podem ser aplicados protocolos semelhantes para detectar qualquer região mutada de ADN num neoplasma, permitindo a detecção de outro ADN de oncogene ou ADN associado a tumor. Uma vez que o ADN mutado pode ser detectado não apenas no cancro primário mas também em lesões precursoras e locais metastáticos, os ensaios de amplificação de ácido nucleico proporcionam um meio de detecção e monitorização precoce ou tardia do cancro, no decurso da doença.

Outros estudos utilizaram ensaios de amplificação de ácido nucleico para analisar o sangue periférico de doentes com cancro, para detectar ADN intracelular extraído de células cancerígenas em circulação em doentes. Contudo, deve ser acentuado que estes estudos tentam utilizar ensaios de amplificação de ácido nucleico para detectar ADN intracelular extraído de células cancerígenas em circulação. O ensaio é realizado na fracção celular do sangue de doentes tendo cancro, utilizando o sedimento celular ou células no sangue total e a fracção de soro ou plasma é, de um modo convencional, ignorada ou descartada antes da análise. Uma vez que uma tal abordagem requer a presença de células cancerígenas metastáticas em circulação (para tumores não hematológicos), é de utilização clínica limitada em doentes com cancros precoces e não é útil na detecção de neoplasmas não hematológicos não invasivos ou estados pré-malignos.

Sabe-se da técnica anterior, que quantidades pequenas mas significativas de ADN normal circulam no sangue de pessoas saudáveis e verificou-se que esta quantidade aumenta em estados cancerígenos. A técnica anterior contém divulgação em que ADN de oncogene mutante poderia ser detectado em plasma ou soro de 4 sangue periférico de doentes de cancro. Contudo, estes relatos também estavam, em geral, limitados a doentes com cancro avançado ou doença neoplásica ou proliferativa conhecida. Alguns autores (Kimura et al., 2006. EGFR Mutation of Tumor and Serum in Gefitinib-Treated Patients with Chemotherapy-Naive Non-small Cell Lung Câncer) descreveram que as mutações no gene de EGFR podem ser detectadas em amostras séricas de doentes sofrendo de NSCLC. O referido documento descreve a detecção de tais mutações por meio de PCR e sequenciação, utilizando iniciadores flanqueando as referidas mutações.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para a detecção de mutações no gene de EGFR numa amostra de sangue de um indivíduo, o referido método compreendendo: (i) a obtenção do ADN da referida amostra; (ii) a amplificação da sequência de ácidos nucleicos correspondendo a uma região específica do gene de EGFR por meio de PCR, utilizando uma sonda de Proteína-Ácido

Nucleico, em que a referida sonda de Proteína-Ácido

Nucleico é capaz de reconhecer e hibridar-se, de um modo específico, com a sequência de EGFR de tipo selvagem inibindo, desse modo, a sua amplificação; e (iii) a detecção da referida mutação.

Aqui, a requerente desenvolveu e validou um ensaio baseado na reacção de polimerização em cadeia (PCR) para a detecção das mutações de EGFR mais comuns em amostras de plasma/soro. Este ensaio oferece sensibilidade analítica superior, através do 5 melhoramento da amplificação de alelos mutantes nas amostras a analisar, por meio da utilização de uma sonda de Proteína-Ácido Nucleico (PNA), em comparação com métodos padrão, em que são empregues iniciadores flanqueando as mutações para amplificação de PCR e, adicionalmente, análise de sequenciação. Deste modo, é aqui proporcionada uma abordagem robusta e acessível para a rápida identificação da maior parte dos doentes de cancro do pulmão que sejam susceptíveis à resposta a inibidores específicos de EGFR.

Adicionalmente, embora a análise directa de tecido neoplásico seja, frequentemente, difícil ou impossível (tal como nos casos de doença oculta, não reconhecida) , o método anteriormente descrito tem a vantagem de utilizar sangue, tal como sangue periférico, para a detecção da referida mutação. 0 sangue periférico é facilmente acessível e favorável a ensaios baseados em ácido nucleico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para facilitar a compreensão da presente descrição, será explicado abaixo o significado de alguns termos e expressões no contexto da invenção: 0 termo ''indivíduo", refere-se a um humano macho ou fêmea de qualquer idade ou raça. De um modo preferido, inclui humanos tendo ou suspeitos de terem cancro de células não pequenas do pulmão (NSCLC). Os métodos de diagnóstico para NSCLC e a delineação clínica de diagnósticos de NSCLC são bem conhecidos pelos especialistas nas técnicas médicas. Como exemplos, os métodos para identificação de indivíduos 6 suspeitos de terem NSCLC podem incluir exame físico, historial médico da família do indivíduo, historial médico do indivíduo, biópsia de pulmão ou um determinado número de tecnologias de imagiologia, tal como ecografia. 0 termo "ácido nucleico" refere-se a um composto multimérico, compreendendo nucleósidos ou análogos de nucleósidos gue tenham bases heterocíclicas azotadas, ou análogos de bases, que sejam ligados por ligações fosfodiéster, de modo a formar um polinucleótido. 0 termo "ADN" refere-se a ácido desoxirribonucleico. Uma sequência de ADN é uma sequência desoxirribonucleica. 0 ADN é um longo polímero de nucleótidos e codifica a sequência dos resíduos de aminoácidos em proteínas, utilizando o código genético. 0 termo "sonda de Proteína-Ácido Nucleico" refere-se a um análogo de ADN sintético, no qual a estrutura fosfodiéster é substituída por unidades repetitivas de N-(2-aminoetil) glicina, às quais são conjugadas as bases purina e pirimidina por meio de um ligante metilcarbonilo.

Num aspecto, a invenção refere-se a um método, aqui referido como um "método da invenção", para a detecção de mutações no gene de EGFR numa amostra de sangue de um indivíduo, o referido método compreendendo: (i) a obtenção do ADN da referida amostra; (ii) a amplificação da sequência de ácidos nucleicos correspondendo a uma região específica do gene de EGFR por meio de PCR, utilizando uma sonda de Proteína-Ácido Nucleico, em que a referida sonda de Proteína-Ácido Nucleico é capaz de reconhecer e hibridar-se, de um modo 7 específico, com a sequência de EGFR de tipo selvagem inibindo, desse modo, a sua amplificação; e (iii) a detecção da referida mutação. 0 método da invenção pode ser utilizado para detectar qualquer mutação do gene de EGFR. Numa forma particular de realização da invenção, a mutação no gene de EGFR a detectar é seleccionada do grupo consistindo de: deleções ELREA no exão 19, a mutação L858R no exão 21 e a mutação T790M.

Amostras

Exemplos ilustrativos, não limitativos, de amostras a partir das quais os ácidos nucleicos podem ser extraídos e analisados, utilizando o método da invenção, incluem mas não estão limitados a sangue, normal ou cancerígeno (soro ou plasma) e outros fluidos corporais contendo ácidos nucleicos que possam ser detectados.

Para efectuar o método da invenção, é obtida uma amostra do indivíduo em estudo. Numa forma particular de realização, a amostra é uma amostra de sangue. As amostras podem ser obtidas de indivíduos anteriormente diagnosticados, ou não, com NSCLC, ou de indivíduos que estejam a receber ou tenham recebido anteriormente tratamento anti-NSCLC. Numa forma de realização, a amostra é uma amostra de um indivíduo tendo tecido de função pulmonar normal, i. e., um indivíduo sem indícios de NSCLC.

Na prática da invenção, o sangue é retirado por métodos padrão para um tubo de recolha, de um modo preferido, compreendendo vidro siliconizado, sem anticoagulante para preparação de soro ou com EDTA, heparina, ou anticoagulantes semelhantes, de um modo muito preferido EDTA, para preparação de plasma. 0 plasma pode, opcionalmente, ser subsequentemente convertido em soro por incubação do plasma anticoagulado com um volume igual de cloreto de cálcio, a 37 °C, durante um breve período, de um modo muito preferido, durante 1-3 minutos, até ocorrer a coagulação. 0 coágulo pode ser, depois, sedimentado por uma breve centrifugação e o plasma desproteinizado removido para outro tubo. Alternativamente, a centrifugação pode ser omitida. 0 soro também pode ser obtido utilizando tubos activadores de coágulo.

Amplificação de ADN

Numa particular forma de realização da invenção, o soro ou plasma podem ser utilizados directamente para identificação do ADN mutante. Noutra forma particular de realização, o ácido nucleico é extraído de plasma ou soro como uma etapa inicial da invenção. Em tais casos, o ADN total extraído das referidas amostras representaria o material de trabalho adequado para amplificação subsequente.

Após a obtenção da amostra, é efectuada a amplificação de ácido nucleico. Numa forma particular de realização, a amplificação do ADN é efectuada por meio de PCR. Os princípios e condições gerais para amplificação e detecção de ácidos nucleicos, tal como a utilização de PCR, são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Em particular, a Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR), efectuada pelo método da presente invenção utiliza iniciadores oligonucleotídicos ou oligonucleótidos de amplificação apropriados e específicos para 9 amplificar, de um modo específico, as sequências alvo de EGFR. Exemplos ilustrativos, não limitativos, de tais oligonucleótidos de amplificação incluem as sequências de SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2. Os termos "iniciadores oligonucleotídicos" ou "oligonucleótidos de amplificação" são aqui utilizados, sem distinção, e referem-se a um ácido nucleico polimérico tendo, em geral, menos de 1000 resíduos, incluindo aqueles numa gama de tamanhos tendo um limite inferior de cerca de 2 a 5 resíduos e um limite superior de cerca de 500 a 900 resíduos. Em formas de realização preferidas, os iniciadores oligonucleotídicos são numa gama de tamanhos tendo um limite inferior de cerca de 5 a cerca de 15 resíduos e um limite superior de cerca de 100 a 200 resíduos. De um modo mais preferido, os iniciadores oligonucleotídicos da presente invenção são numa gama de tamanhos tendo um limite inferior de cerca de 10 a cerca de 15 resíduos e um limite superior de cerca de 17 a 100 resíduos. Embora os iniciadores oligonucleotídicos possam ser purificados de ácidos nucleicos de ocorrência natural são, em geral, sintetizados utilizando qualquer uma de uma variedade de métodos enzimáticos ou químicos bem conhecidos. Numa forma particular de realização da invenção, tais iniciadores oligonucleotídicos possibilitam a amplificação específica dos fragmentos de ADN correspondendo à deleção de nucleótidos específicos no exão 19 no gene de EGFR.

Deste modo, numa forma particular de realização, o método da invenção pode ser utilizado para a detecção de deleções de ELREA no exão 19. Numa forma de realização preferida, a presente invenção refere-se a um método para a detecção de deleções de 9, 12, 15, 18 ou 24 nucleótidos no exão 19 no gene de EGFR. Noutra forma particular de realização, o método da invenção pode ser utilizado para a detecção da mutação L858R no exão 21 do gene de 10 EGFR. Noutra forma de realizaçao, o método da invenção pode ser utilizado para a detecção da mutação T790M no gene de EGFR. 0 termo "oligonucleótido de amplificação" refere-se a um oligonucleótido que se hibrida a um ácido nucleico alvo, ou seu complemento, e participa numa reacção de amplificação de ácido nucleico. Oligonucleótidos de amplificação incluem iniciadores e iniciadores promotores, nos quais a extremidade 3' do oligonucleótido é enzimaticamente alongada utilizando outra cadeia de ácido nucleico como o molde. Em algumas formas de realização, um oligonucleótido de amplificação contém, pelo menos, cerca de 10 bases contíguas e, de um modo mais preferido, cerca de 12 bases contíguas que são complementares a uma região da sequência alvo (ou sua cadeia complementar) . As bases de ligação alvo são, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 80% e, de um modo mais preferido, cerca de 90% a 100% complementares à sequência a que se ligam. Um oligonucleótido de amplificação tem, de um modo preferido, cerca de 10 a cerca de 60 bases em comprimento e pode incluir nucleótidos modificados ou análogos de bases.

Os termos "amplificar" ou "amplificação" referem-se a um processo para produzir múltiplas cópias de uma sequência de ácidos nucleicos alvo, ou o seu complemento, ou os seus fragmentos (i. e., o produto amplificado pode conter menos do que a sequência alvo completa). Por exemplo, podem ser produzidos fragmentos através da amplificação de uma porção do ácido nucleico alvo, através da utilização de um oligonucleótido de amplificação que se hibridiza e inicia a polimerização a partir de uma posição interna do ácido nucleico alvo. Métodos de amplificação conhecidos incluem, por exemplo, a amplificação de Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR), amplificação mediada 11 por replicase, amplificação de reacção em cadeia da ligase (LCR), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA) e amplificação associada a transcrição ou mediada por transcrição (TMA) . A amplificação por PCR utiliza ADN polimerase, iniciadores para cadeias opostas e ciclização térmica, de modo a sintetizar múltiplas cópias de ADN ou ADNc. A amplificação mediada por replicase utiliza QB-replicase para amplificar sequências de ARN. A amplificação de LCR utiliza, pelo menos, quatro oligonucleótidos diferentes para amplificar cadeias complementares de um alvo, através da utilização de ciclos de hibridação, ligação e desnaturação. A SDA utiliza um iniciador que contém um sítio de reconhecimento para uma endonuclease de restrição e uma endonuclease que faz cortes numa cadeia de um dúplice de ADN hemimodifiçado que inclui a sequência alvo, seguido de uma série de etapas de extensão de iniciador e deslocamento de cadeia. T ambém é conhecido um método de amplificação de deslocamento de cadeia isotérmico que não se baseia nos cortes de endonuclease. A amplificação associada a transcrição ou mediada por transcrição utiliza um iniciador que inclui uma sequência promotora e uma ARN polimerase específica para o promotor, de modo a produzir múltiplos transcritos a partir de uma sequência alvo amplificando, deste modo, a sequência alvo.

As formas de realização preferidas da presente invenção amplificam as sequências alvo de EGFR, utilizando os presentes oligonucleótidos de amplificação, numa amplificação de reacção de polimerização em cadeia (PCR). Um especialista na técnica irá entender que estes oligonucleótidos de amplificação podem ser facilmente utilizados em outros métodos de amplificação de ácido nucleico que utilizam a extensão de iniciador mediada por polimerase. 12

Na etapa de amplificação do método da invenção, a sequência de ácidos nucleicos correspondendo a uma região especifica do gene de EGFR é amplificada por meio de PCR, utilizando uma sonda de Proteina-Ácido Nucleico (PNA). As sondas de PNA são análogos de ácido nucleico, em que a estrutura de fosfato de açúcar de um ácido nucleico natural foi substituída por uma estrutura de péptido sintético, habitualmente formada a partir de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina, resultando num mímico aquiral e não carregado. Esta nova molécula é quimicamente estável e resistente a clivagem hidrolítica (enzimática) e, deste modo, não se espera que seja degradada dentro de uma célula viva. Não obstante todas estas variações de ácidos nucleicos naturais, a PNA ainda é capaz de ligação específica de sequência a ADN, assim como ARN, obedecendo às regras de ligação de hidrogénio de Watson-Crick. Os seus complexos híbridos exibem extraordinária estabilidade térmica e exibem propriedades únicas de força iónica. Em muitas aplicações, as sondas de PNA são preferidas às sondas de ácido nucleico em virtude de, contrariamente aos dúplices ácido nucleico/ácido nucleico, que são desestabilizados sob condições de baixa salinidade, os dúplices PNA/ácido nucleico são formados e permanecem estáveis sob condições de muito baixa salinidade. Os especialistas na técnica de hibridação de ácido nucleico irá reconhecer que os factores geralmente utilizados para impor ou controlar a estringência de hibridação incluem concentração de formamida (ou outro reagente químico desnaturante), concentração salina (i. e., força iónica), temperatura de hibridação, concentração de detergente, pH e a presença ou ausência de caotrópicos. A estringência óptima para uma combinação de sonda/sequência alvo é, frequentemente, estabelecida pela técnica bem conhecida de fixação de vários dos supramencionados factores de estringência 13 e, depois, determinação do efeito de variação de um único factor de estringência. Os mesmos factores de estringência podem ser modulados para controlar, desse modo, a estringência de hibridação de uma PNA a um ácido nucleico, com a excepção de que a hibridação de uma PNA é razoavelmente independente da força iónica. A estringência óptima para um ensaio pode ser determinada, de um modo experimental, por examinação de cada factor de estringência, até ser alcançado o grau desejado de discriminação.

Os oligómeros de PNA podem ser preparados seguindo protocolos de síntese de fase sólida padrão para péptidos (Merrifield, B. 1986. Solid-phase synthesis. Science 232, 341-347) utilizando, por exemplo, uma resina de poliestireno de (metil-benzidril)amina como o suporte sólido. As PNAs podem conter uma arquitectura quimérica, tal como uma quimera PNA/ADN, onde um oligómero de PNA está fundido a um oligómero de ADN.

As amostras clínicas contêm moléculas de ADN com o alelo de tipo selvagem, adicionalmente a moléculas de ADN com o alelo mutante. Assim, sob condições normais, é difícil detectar mutações de EGFR (alelo mutante) num fundo de grandes dimensões de genes de EGFR de tipo selvagem (alelo de tipo selvagem) . A sonda de PNA utilizada pela requerente é capaz de reconhecer e hibridar-se, de um modo específico, com a sequência de EGFR de tipo selvagem. Como um exemplo ilustrativo, não limitativo, a sonda de PNA a utilizar para efectuar o método da presente invenção compreende a sonda de PNA, descrita como a SEQ ID N° 3, no Exemplo acompanhando a presente invenção. Tal sonda é adicionada à mistura de reacção de PCR inibindo, deste modo, a amplificação do alelo de tipo selvagem e favorecendo a 14 amplificação do alelo mutante presente na amostra, i. e., mutante de EGFR, facilitando a sua detecção posterior. Os especialistas na técnica irão entender que uma sonda de PNA adequada não necessita de ter exactamente estas sequências de ácidos nucleicos de sondagem, de modo a serem operativas mas, frequentemente, modificadas de acordo com as condições particulares de ensaio. Por exemplo, podem ser preparadas sondas de PNA mais curtas, por truncamento da sequência de ácidos nucleicos se a estabilidade do híbrido necessitar de ser modificada para, desse modo, baixar a Tm e/ou ajustar para estringência. De um modo semelhante, a sequência de ácidos nucleicos pode ser truncada numa extremidade e alongada na outra extremidade, desde que a sequência de ácidos nucleicos discriminante permaneça dentro da sequência da sonda de PNA. Tais variações das sequências de ácidos nucleicos de sondagem, dentro dos parâmetros aqui descritos, são consideradas como sendo formas de realização desta invenção.

Como pode ser observado no Exemplo 1 da presente invenção, as condições da reacção de polimerização em cadeia utilizando tal sonda de PNA, aplicada no método da presente invenção, são de modo a que apenas 40 ciclos de amplificação sejam suficientes para a obtenção de um produto de amplificação de PCR preciso, compreendendo um fragmento genómico de 120 pb, incluindo a mutação de interesse do exão 19 no gene de EGFR.

As condições gerais para o PCR do método da presente invenção são como ilustradas no Exemplo 1 da presente invenção. Neste exemplo, o ADN utilizado para a reacção de amplificação por PCR é de amostras de plasma/soro. 15

Detecção de mutação de ADN

Foram anteriormente divulgados muitos métodos para detecção e análise dos produtos de amplificação por PCR. De modo particular, a detecção de mutantes de sequência de ADN pode prosseguir por intermédio de qualquer de um determinado número de métodos conhecidos dos especialistas na técnica (Kilger et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 2032-4). Numa particular forma de realização da invenção, a etapa de detecção do método da invenção é efectuada por meio de sequenciação de ácido nucleico. São exemplos ilustrativos, não limitativos, de métodos de sequenciação de ácido nucleico a sequenciação em ciclo (Sarkar et ai., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 1269-70) ou sequenciação directa de didesoxinucleótido, em que algum ou todo o ADN de interesse que foi recolhido da amostra é utilizado como um molde para reacções de sequenciação. Em reacções de sequenciação padrão é utilizado um iniciador oligonucleotídico, ou conjunto de iniciadores, especifico para o gene ou ADN de interesse. Podem ser utilizados outros métodos de sequenciação de ADN, tais como sequenciação por hibridação, sequenciação utilizando um chip contendo muitos oligonucleótidos para hibridação (como, por exemplo, aqueles produzidos pela Affymetrix Corp.; Ramsay et al. , 1998, Nature Biotechnology 16: 40-44; Marshall et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 27-31),

sequenciação por HPLC (DeDionisio et al., 1996, J Chromatogr A 735: 191-208) e modificações de estratégias de sequenciação de ADN, tais como ensaio de diagnóstico especifico de alelo multíplice (MASDA; Shuber et al. , 1997, Hum. Molec. Genet. 6: 337-47), impressão digital didesoxi (Sarkar et al., 1992, Genomics 13: 441-3; Martincic et al., 1996, Oncogene 13: 2039-44) e métodos de PCR baseados em sonda fluorogénica (tal como 16

Taqman; Perkin-Elmer Corp.; Heid et al., 1996, Genome Res. 6: 986-94) e métodos baseados em clivagem.

Alternativamente, a amplificação pode ser efectuada utilizando iniciadores que sejam marcados de um modo apropriado e os produtos de extensão de iniciadores amplificados podem ser detectados utilizando processos e equipamento para detecção da marca. De um modo preferido, as sondas desta invenção são marcadas com, pelo menos, um grupo detectável, em que o grupo ou grupos detectáveis são seleccionados do grupo consistindo em: um conjugado, um sistema de detecção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, um marcador de spin, um radioisótopo, uma enzima, um hapteno, um éster de acridinio e um composto luminescente. Como um exemplo ilustrativo, não limitativo, no método da presente invenção, os iniciadores utilizados podem ser marcados com um fluoróforo. De um modo mais particular, o iniciador inverso do método da presente invenção é marcado com o fluoróforo 6-FAM na sua extremidade 5'. Este fluoróforo emite fluorescência com um comprimento de onda de pico de 522 nm. 0 PCR pode ser efectuado utilizando um dos iniciadores marcados, por exemplo, com qualquer dos corantes FAM, HEX, VIC ou NED.

Numa forma de realização preferida da invenção, a detecção e análise posteriores do ADN amplificado com o método da invenção são efectuadas pela técnica GeneScan, como é ilustrada no Exemplo acompanhando a presente invenção. Deste modo, como um exemplo ilustrativo, não limitativo, para efectuar a etapa de detecção do método da invenção, uma alíquota da reacção de PCR (de um modo típico, 1 pL) é adicionada a 9 pL de formamida HI-DI e 0,25 pL de padrão de tamanhos GeneScan marker -500 LIZ. Após desnaturação, a amostra é colocada no Analisador Genético ABI 3130 e é efectuada a electroforese capilar. Os dados em bruto 17 são analisados utilizando o software GeneScan. Esta análise é muito importante, uma vez que os produtos de PCR irão ser classificados por tamanhos, por extrapolação para um padrão de tamanhos na amostra. Utilizando esta técnica, os requerentes são capazes de detectar, num modo muito preciso e exacto a mutação de interesse. A invenção é adicionalmente ilustrada com os Exemplos seguintes que são proporcionados para ilustrar determinadas formas de realização da presente invenção, e não devem ser interpretados como limitando a invenção. EXEMPLO 1

Determinação da deleção de ELREA no exão 19 do gene de EGFR por GeneScan

Materiais e Métodos: 1- Recolha de amostra

Sangue venoso (10 mL) de cada indivíduo foi colocado dentro de tubos contendo 50 mmol de EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) por litro e o ADN genómico foi isolado com o kit QIAmp® DNA blood Mini (Qiagen, Alemanha) , de acordo com as instruções do fabricante. 18 2- Preparação de reacção GeneScan 1.1- Materiais — Analisador de ADN Abi Prism 3130 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems) - Placa de Reacção óptica de 96 Poços (Applied

Biosystems, Cat. N° 4306737) 1.2- Mistura de reacçao de PCR com sonda de PNA A mistura de reacção de PCR foi preparada como se segue: - 2,5 pL de Tampão lOx (Ecogen) - 0,5 pL de MgCl2 a 50 mM (Ecogen) - 0,625 pL de dNTP a 10 mM (Promega)

- 1,25 pL de cada iniciador a 10 pM - 0,1 pL de TAQ polimerase (Ecogen) - 12,5 pL de sonda de PNA a 5 mM (Applied Biosystems) - 5 pL de ADN de soro ou plasma - Adicionar H20 destilada estéril para um volume final de 25 pL. 1.3- Mistura de reacçao de PCR sem sonda de PNA A mistura de reacção de PCR foi preparada como se segue: - 2,5 pL de Tampão lOx (Ecogen) - 0,5 pL de MgCl2 a 50 mM (Ecogen) 19 - 0,625 pL de dNTP a 10 mM (Promega) - 1,25 pL de cada iniciador a 10 pM 0, 1 pL de TAQ polimerase (Ecogen) - 5 pL de ADN de soro ou plasma - Adicionar H20 destilada estéril para um volume final de 25 pL. O iniciador inverso foi marcado com o fluoróforo 6-FAM (o 6-FAM emite fluorescência com um comprimento de onda de pico de 522 nm).

Iniciador Directo: ACTCTGGATCCCAGAAGGTGAG (SEQ ID N° 1)

Iniciador Inverso: 6-FAM- CCACACAGCAAAGCAGAAACTC (SEQ ID N° 2)

Sequência de sonda de PNA: Ac-AGATGTTGCTTCTCTTA (SEQ ID N° 3)

1.3- Programa PCR O PCR foi realizado como se segue: 95 °C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 °C, durante 30 segundos, 58 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 1 minuto e uma extensão final de 72 °C durante 5 minutos. 3- Preparação GeneScan - 9 pL de formamida HI-DI (Applied Biosystems) - 0,25 pL de padrão de tamanhos GeneScan marker -500 LIZ (Applied Biosystems) 20 1 pL de produto de PCR final diluído

As amostras foram desnaturadas a 93 °C, durante 3 minutos e arrefecidas sobre gelo, durante 10 minutos. Foram, depois, submetidas a electroforese capilar e, subsequentemente, submetidas a um comprimento de onda de excitação de 494 nm, para detecção de comprimento de onda de emissão a 522 nm, no analisador de ADN ABI 3130.

Resultados:

Foi analisado um total de 41 amostras de soro/plasma por GeneScan para detecção de deleções no exão 19. Todas as amostras analisadas eram de doentes com mutações positivas em tecido tumoral.

Os resultados da análise GeneScan mostram que 55% das amostras com mutações positivas em tecido tumoral também eram positivas por análise Genescan (Tabela 1).

Tabela 1. Análise de mutaçao de EGFR de exão 19 no soro/plasma de doentes com mutações positivas em tecido tumoral.

Mutações de EGFR em tumor S/P positivo S/P negativo N= 41 N= 22 (55%) N=19 (45%) Macho 8 8 Fêmea 14 11 Erlotinib 21 (continuação)

Mutações de EGFR em tumor S/P positivo S/P negativo 1a linha 12 11 2s linha 10 S Nunca fumador 15 12 Ex-fumador 7 6 Fumador 0 1 Extracção de sangue Antes de tratamento 16 9 Após tratamento 5 S Desconhecido 1 2 CR+PR 1+12 1+6 SD + PD 0+1 2+0 EXEMPLO 2

Determinação da mutação L858R no exão 21 do gene de EGFR por GeneScan

Materiais e Métodos: 1- Recolha de amostra

Sangue venoso (10 mL) de cada indivíduo foi colocado em tubos contendo 50 mmol de EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) por litro e o ADN genómico foi isolado com o kit QIAmp® DNA blood Mini (Qiagen, Alemanha) , de acordo com as instruções do fabricante. 22 2- Reacção Taqman (ensaio de actividade de 5' nuclease) 1.1- Materiais AB 7000 ou 7900HT (Applied Biosystems)

1.2- Mistura de reacçao de PCR (ensaio de actividade de 5' Nuclease) com sonda de PNA A mistura de reacção de PCR foi preparada como se segue (Tabela 2) :

Tabela 2

Mistura de Reacçao Concentr. Concentr. Para cada Final de Stock amostra (μΙΟ Mistura Universal lx 2x 12,5 TaqMan Mas ter Iniciador F 0,6 μΜ 10 μΜ 1,5 Iniciador R 0,6 μΜ 10 μΜ 1,5 Sonda wt-VIC 0,2 μΜ 10 μΜ Ο ΟΊ Sonda mut-FAM £ :=5- CN Ο 10 μΜ Ο ΟΊ PNA 0,5 μΜ 10 μΜ 1,25 ADN de soro ou plasma 5 Água 5,25 23 0 PCR foi realizado como se segue: 60 °C durante 2 min., seguido de 50 ciclos, a 95 °C, durante 10 min., seguido de 50 ciclos, a 95 °C, durante 15 segundos e 60 °C durante 1 min. 30 seg.

3- Iniciadores, sondas e PNA

A sonda para detecção de sequências de tipo selvagem foi marcada com o fluorocromo VIC, enquanto a sonda para detecção do alelo mutante foi marcada com o fluorocromo FAM

Iniciador Directo: AACACCGCAGCATGTCAAGA (SEQ ID N° 4)

Iniciador Inverso: TTCTCTTCCGCACCCAGC (SEQ ID N° 5)

Sonda para a detecção do alelo de tipo selvagem, marcada com o fluorocromo VIC: VIC-TCACAGATTTTGGGCTGGCCAAAC-TAMRA (SEQ ID N° 6)

Sonda para a detecção do alelo mutante, marcada com o fluorocromo FAM: 6-FAM-CAGATTTTGGGCGGGCCAAAC-TAMRA (SEQ ID N° 7)

Sonda de PNA: AGTTTGGCCAGCCCA (SEQ ID N° 8)

Resultados:

Foi analisado um total de 41 amostras de soro/plasma por GeneScan para detecção de mutações em L858R. Todas as amostras analisadas eram de doentes com mutações positivas em tecido tumoral.

Os resultados da análise do ensaio de actividade de 5' nuclease mostram que 55% (L858R) das amostras com mutações positivas em tecido tumoral também eram positivas por esta análise (Tabela 3) .

Tabela 3

Mutações de EGFR em tumor S/P positivo S/P negativo N= 41 N= 22 (55%) N=19 (45%) EXEMPLO 3

Determinação da mutação T790M no gene de EGFR por reacção Taqman

Materiais e Métodos: 1 — Recolha de amostra

Sangue venoso (10 mL) de cada indivíduo foi colocado em tubos contendo 50 mmol de EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) por litro e o ADN genómico foi isolado com o kit QIAmp® DNA blood Mini (Qiagen, Alemanha) , de acordo com as instruções do fabricante. 25 2- Reacçao Taqman (ensaio de actividade de 5' nuclease) 1.1- Materiais - AB 7000 ou 7900HT (Applied Biosystems)

1.2- Mistura de reacção de PCR (ensaio de actividade de 5' Nuclease) com sonda de PNA A mistura de reacção de PCR foi preparada como no exemplo 2 (ver a Tabela 2): 0 PCR foi realizado como se segue: 60 °C durante 2 min., seguido de 50 ciclos, a 95 °C, durante 10 min., seguido de 50 ciclos, a 95 °C, durante 15 segundos e 60 °C durante 1 min. 30 s.

3- Iniciadores, sondas e PNA

A sonda para detecção de sequências de tipo selvagem foi marcada com o fluorocromo VIC, enquanto a sonda para detecção do alelo mutante foi marcada com o fluorocromo FAM

Iniciador Directo: AGGCAGCCGAAGGGC (SEQ ID N° 9)

Iniciador Inverso: CCTCACCTCCACCGTGCA (SEQ ID N° 10)

Sonda para a detecção do alelo de tipo selvagem, marcada com o fluorocromo VIC: VIC- TGAGCTGCGTGATGA-MGB (SEQ ID N° 11) 26

Sonda para a detecçao do alelo mutante, marcada com o fluorocromo FAM: 6-FAM-TGAGCTGCATGATGA-MGB (SEQ ID N° 12) Sonda de PNA: TCATCACGCAGCTC (SEQ ID N° 13)

Resultados:

Foi analisado um total de 4 amostras de soro/plasma. Todas as amostras analisadas eram de doentes com mutações positivas em tecido tumoral.

Os resultados da análise do ensaio de actividade de 5' nuclease mostram que 75% (T790M) das amostras com mutações positivas em tecido tumoral também eram positivas por esta análise (Tabela 4 para T790M).

Tabela 4

Mutações de EGFR em tumor S/P S/P positivo negativo N= 4 N= 3 N=1 (75%) (25%) 27 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> PANGAEA BIOTECH, S.A.

<120> MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE MUTAÇÕES DE EGFR EM AMOSTRAS DE SANGUE

<130> P1665EPPC <140> Documento EP 07787764.5 <141> 2007-07-20 <150> Documento EP06117551 <151> 2006-07-20 <16 0> 13 <170> Patentln versão 3.5

<210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Iniciador directo concebido para a detecção de deleção de ELREA no exão 19 do gene de EGFR <40 0> 1 actctggatc ccagaaggtg ag 22 <210> 2 28

<211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador inverso concebido para a detecção de deleção de ELREA no exão 19 do gene de EGFR 0 iniciador é modificado por marcação da sua extremidade 5' com o fluoróforo 6-FAM. <400> 2 ccacacagca aagcagaaac tc 22

<210> 3 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sonda de Proteina-Ácido Nucleico (PNA) concebida para a detecção de deleção de ELREA no exão 19 do gene de EGFR. O iniciador é modificado com um grupo Ac na sua extremidade 5'. <400> 3 agatgttgct tctctta 17 <210> 4

<211> 20 <212> ADN 29 <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador directo concebido para detecção da mutaçao L858R no exão 21 do gene de EGFR <400> 4 aacaccgcag catgtcaaga 20 <210> 5 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador inverso concebido para detecção da mutação L858R no exão 21 do gene de EGFR <40 0> 5 ttctcttccg cacccagc 18 <210> 6 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda concebida para a detecção do alelo do gene de EGFR de tipo selvagem na região da mutação L858R. 0 iniciador é modificado com um grupo VIC na extremidade 5'. <400> 6 tcacagattt tgggctggcc aaac 24 30 <210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sonda concebida para a detecção do mutante L858R no alelo do gene de EGFR. 0 iniciador é modificado com um grupo 6-FAM na extremidade 5'. <40 0> 7 cagattttgg gcgggccaaa c 21 <210> 8 <211> 15 <212> ADN <213> <22 0> Sequência artificial <223> Sonda de Proteina-Ácido Nucleico (PNA) concebida para a detecçao da mutaçao L858R no exao 21 do gene de EGFR. <400> 8 agtttggcca gccca 15 <210> 9 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência artificial 31 <220>

<220> Iniciador directo concebido para detecção da mutação T790M no exão 21 do gene de EGFR <400> 9 aggcagccga agggc 15

<210> 10 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> Iniciador inverso concebido para detecção da mutação T790M no exão 21 do gene de EGFR <40 0> 10 cctcacctcc accgtgca 18

<210> 11 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sonda concebida para a detecção do alelo do gene de EGFR de tipo selvagem na região da mutação T790M. O iniciador é modificado com um grupo VIC na extremidade 5'. <40 0> 11 tgagctgcgt gatga 15 32 <210> 12 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sonda concebida para a detecção do mutante T790M no alelo do gene de EGFR. 0 iniciador é modificado com um grupo 6-FAM na extremidade 5'. <40 0> 12 tgagctgcat gatga 15 <210> 13 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sonda de Proteina-Ácido Nucleico (PNA) concebida para a detecçao da mutaçao T790M no exao 21 do gene de EGFR. <40 0> 13 tcatcacgca gctc 14

Lisboa, 13 de Agosto de 2010 33

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a detecção de mutações no gene de EGFR numa amostra de sangue de um indivíduo, o referido método compreendendo: (i) a obtenção do ADN da referida amostra; (ii) a amplificação da sequência de ácidos nucleicos correspondendo a uma região específica do gene de EGFR por meio de PCR, utilizando uma sonda de Proteína-Acido Nucleico, em que a referida sonda de Proteína-Ácido Nucleico é capaz de reconhecer e hibridar-se, de um modo específico, com a sequência de EGFR de tipo selvagem inibindo, desse modo, a sua amplificação; e (iii) a detecção da referida mutação.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a mutação no gene de EGFR a detectar é seleccionada do grupo consistindo de: deleções de ELREA no exão 19, mutação L858R no exão 21 e mutação T790M.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida amostra de sangue é uma amostra de soro ou plasma.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa de detecção é realizada por meio de sequenciação de ácido nucleico.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa de detecção é realizada por meio da tecnologia GeneScan. 1
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a tecnologia GeneScan compreende a utilização de um i oligonucleotídico que é fluorescentemente marcado extremidade 5' com um corante fluorescente.
7. 7. Método da reivindicação 6, em que o referido fluorescente é seleccionado do grupo consisti corantes 6-FAM, HEX ou NED. Lisboa, 13 de Agosto 2010 referida niciador na sua corante ndo nos 2