CN102732636A - 一种检测肿瘤细胞egfr基因突变的方法及芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法，该方法以SEQ ID NO:1-8所示序列为引物、待测样品DNA为模板进行PCR扩增，SEQ ID NO:9-24所示序列的探针分别与所得扩增产物杂交，然后洗涤除去未结合的扩增产物，最后与偶联金纳米微粒的链亲和素孵育，根据金纳米微粒颜色变化判断突变结果。本发明基于芯片技术，利用生物素和链亲和素特异性结合的特征，将针对与吉非替尼、厄洛替尼等药物敏感性或耐药性相关的EGFR基因突变的探针组成芯片点阵，与生物素标记的扩增产物杂交后，用偶联金纳米微粒的链亲和素与扩增产物上标记的生物素特异性结合，从而准确判读突变结果。

Description

一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法及芯片

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法及芯片。

背景技术

表皮细胞生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR），属于受体酪氨酸激酶超家族成员，通过PI3K活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT，激活凋亡抑制蛋白Caspase9，抑制凋亡促进细胞增殖。

EGFR活性增高或持续性活化，将促使细胞过度增殖和肿瘤发生，并与肿瘤侵润转移、新生血管生成、抗凋亡等肿瘤细胞学行为密切相关。研究发现在40-80%的肺癌、14-91%的乳腺癌、33-74%的胃癌、40-80%的前列腺癌及36-100%的头颈部肿瘤中EGFR表达增高，且其表达水平与恶性程度呈负相关，表达水平越高预后越差，因而EGFR成为重要的肿瘤治疗靶分子。

针对EGFR的吉非替尼（商品名为易瑞沙）、厄洛替尼（商品名为特易凯）等小分子化学药物以及西妥昔单抗和帕尼单抗等大分子药物均已应用于临床。吉非替尼和厄洛替尼竞争性结合细胞内酪氨酸激酶结构域中的ATP结合位点，阻止受体自身磷酸化和下游信号分子活化，诱导肿瘤细胞凋亡。2004年Lynoh和Paeg最先发现EGFR基因突变与吉非替尼等药物敏感性相关，吉非替尼治疗NSCLC（非小细胞肺癌）总有效率为10-30%，EGFR基因突变肿瘤的有效率为75-95%，无基因突变肿瘤的有效率小于10%。EGFR基因突变肿瘤的单用吉非替尼疗效优于铂类和紫杉醇化疗，而野生型肿瘤则疗效不及铂类或紫杉醇化疗。此后，在不同人群中进行的临床实验均证实了EGFR基因突变在酪氨酸激酶抑制剂类药物敏感性/耐药性预测和指导用药上的价值。与酪氨酸激酶抑制剂类药物敏感性和耐药性相关的突变主要集中在EGFR基因的第18、19、20、21外显子区域。

吉非替尼和厄洛替尼等靶向药物价格昂贵，用药前分析肿瘤EGFR基因突变状态，有助于筛选对吉非替尼、厄洛替尼等酪氨酸激酶抑制剂类（TKIs）药物敏感的肿瘤患者，提高治疗的有效率，也避免浪费医疗资源。

针对EGFR基因突变检测，目前主要有DNA测序、TaqMan探针等检测方法。DNA测序技术操作复杂，设备及试剂昂贵。TaqMan探针等方法需多次扩增和检测，存在操作繁琐、费时费力、费用较高等局限性。因此迫切需要简便、快速和廉价的检测产品，以满足临床检测需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法及芯片，使得所述方法和芯片能够准确、简便、快速的检测与酪氨酸激酶抑制剂类抗癌药物如吉非替尼、厄洛替尼的敏感性和耐药性相关的EGFR基因突变。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：

步骤1、以SEQ ID NO:1-8所示序列为引物、肿瘤细胞DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，其中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示序列的5＇端均修饰有生物素；

步骤2、SEQ ID NO:9-24所示序列的探针分别与步骤1所得扩增产物杂交，然后洗涤除去未结合的扩增产物，最后与偶联金纳米微粒的链亲和素孵育，根据金纳米微粒颜色变化判断突变结果。

其中，所述杂交的DNA用量至少为10ng，所述探针的工作浓度优选为10-400nmol/L，更优选为100nmol/L。

临床研究结果显示，与吉非替尼、厄洛替尼等抗癌药物敏感性相关的EGFR基因的突变集中在第18-21外显子区域，其中，49%左右为第19外显子746-752密码子区域的插入/缺失突变，45%左右为第21外显子2573位点突变，5-10%为第18外显子2155位点突变和第21外显子2582位点突变。这些位置的突变能够影响酪氨酸激酶结构域的ATP结合口袋的空间结构，增加与吉非替尼、厄洛替尼等酪氨酸激酶抑制剂类抗癌药物的结合力，从而增加药物的敏感性。

而与吉非替尼、厄洛替尼等抗癌药物耐药性相关的EGFR基因的突变主要为第19外显子2281位点突变和第20外显子2369位点突变。这些位置的突变均影响吉非替尼、厄洛替尼等酪氨酸激酶抑制剂类抗癌药物与酪氨酸的结合力，增加药物的耐药性。

本发明根据现有临床研究结果，针对第18-21外显子区域的野生和突变DNA序列，利用OLIGO6.0软件分别涉及一对或多对特异性探针，见SEQ ID NO:9-24所示序列，所有探针经BLAST比较分析确认其特异性，能够针对现有已明确的影响吉非替尼、厄洛替尼等抗癌药物耐药性/敏感性的EGFR基因突变序列进行特异性结合。其中，SEQ IDNO:11、12、19、21、23、24所示序列的探针针对药物敏感性的突变，SEQ ID NO:14、15、17所示序列的探针针对药物耐药性的突变，其余探针均为对应的野生型探针，用于对照检测。

在所有的探针中，SEQ ID NO:9所示序列探针为针对第19外显子746-752密码子区域的插入/缺失突变上游位置的野生型探针，而SEQID NO:10所示序列探针为针对第19外显子746-752密码子区域的插入/缺失突变位置的野生型探针；SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示序列探针分别为针对第19外显子2237-2256位点的插失突变以及2254-2276位点的缺失突变的突变型探针；

SEQ ID NO:13所示序列探针为针对第19外显子2281位点突变位置的野生型探针，而SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示序列探针为针对第19外显子2281位点突变的突变型探针；

SEQ ID NO:16所示序列探针为针对第20外显子2369位点突变位置的野生型探针，而SEQ ID NO:17所示序列探针为针对第20外显子2369位点突变的突变型探针；

SEQ ID NO:18、20所示序列探针分别为针对第21外显子2573位点突变以及2582位点突变位置的野生型探针，SEQ ID NO:19、21所示序列探针分别为针对第21外显子2573位点突变以及2582位点突变的突变型探针；

SEQ ID NO:22所示序列探针为针对第18外显子2155位点突变位置的野生型探针，而SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示序列探针为针对第18外显子2155位点突变的突变型探针。

本发明所述方法利用生物素和链亲和素特异性结合的特征，将上述探针与生物素标记的扩增产物杂交后，用偶联金纳米微粒的链亲和素与扩增产物上标记的生物素特异性结合，然后借助金纳米微粒颜色的变化来判断突变结果，为保证检测准确性，本发明优选借助银染法增强信号，参见图1。与直接将金纳米微粒偶联探针的做法相比，本发明更加简便，减少金纳米微粒偶联各种探针的繁琐工作量。

本发明所述生物素标记的扩增产物是以SEQ ID NO:1-8所示序列为引物、待测样品DNA为模板进行PCR扩增获得，其中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示序列的5＇端均修饰有生物素。SEQ ID NO:1、2所示序列分别为扩增EGFR基因第18外显子区域基因组的上、下游引物（以下简称为EGFR-18F和EGFR-18R），SEQ ID NO:3、4所示序列分别为扩增EGFR基因第19外显子区域基因组的上、下游引物（以下简称为EGFR-19F和EGFR-19R），SEQ ID NO:5、6所示序列分别为扩增EGFR基因第20外显子区域基因组的上、下游引物（以下简称为EGFR-20F和EGFR-20R），SEQ ID NO:7、8所示序列分别为扩增EGFR基因第21外显子区域基因组的上、下游引物（以下简称为EGFR-21F和EGFR-21R）。相应的，如果将生物素标记在上游引物的5＇端，那么本发明所述探针应变为其互补链。

本发明所述引物除按照PCR引物设计的基本原则外，在各上、下游引物的5＇端均添加通用测序引物序列，便于直接进行测序验证。另外，所有引物具兼容性，便于多重PCR的操作。

在本发明所述方法中，所述肿瘤细胞可选自肿瘤组织、全血、脱落细胞、培养细胞等，本发明优选肿瘤组织，上述肿瘤细胞DNA可通过本领域常规方法提取获得，如浓盐法、阴离子去污剂法、酚氯仿抽提法、磁珠法、层析柱分离法或市售基因组提取试剂盒等。

在进行PCR扩增中，本发明优选Touch-down扩增程序，所述PCR除常规PCR外，还可以为多重PCR或非对称PCR。常规PCR可分别通过引物扩增含EGFR基因外显子18、19、20、21的局部DNA片段，50μl反应体系中含2×PCR Mix25μl，上、下游引物终浓度各200nmol/L，待测样品DNA100ng。Touch-down反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s→63-58℃（每循环降低0.5℃）退火30s→72℃延伸45s共10个循环，之后94℃30s→56℃30s→72℃45s,共25个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪下观察产物大小及特异性。

多重PCR反应条件同上，仅在引物浓度上进行优化EGFR-18F200nmol/L，EGFR-18R300nmol/L，EGFR-19F300nmol/L，EGFR-19R300nmol/L，EGFR-20F200nmol/L，EGFR-20R200nmol/L，EGFR-21F400nmol/L，EGFR-,21R300nmol/L，这对于本领域技术人员来说是能够轻易实现的。多重PCR可一次性扩增4个外显子的基因组，简化反应和操作。

非对称PCR反应条件同上，仅在引物浓度上进行优化，下游引物：上游引物为1:60，这对于本领域技术人员来说是能够轻易实现的。非对称PCR可直接获得以带有生物素标记的单链，可提高杂交检测的敏感性。

在杂交阶段，本领域技术人员公知要提前进行扩增产物变性处理，所述变性方法可以为碱变性、热变性等本领域常规方法。本发明优选在95℃热变性10min。本发明所述金纳米微粒市售可得，也可通过氯金酸还原法、白磷还原法、柠檬酸还原法、鞣酸还原法、硼氢化钠还原法、抗坏血酸还原法以及乙醇超声法等多种方法获得。

本发明杂交后通过链亲和素偶联金纳米微粒与扩增产物末端标记的生物素特异性结合实现，可直接检测金纳米微粒结合后颜色变化来判断是否发生所述突变性探针针对的突变。当探针捕获扩增产物浓度较高时，可直接通过肉眼观测颜色变化判读杂交结果。而当浓度较低时无法用肉眼识别，需对信号进行放大处理。因此，作为优选，本发明在与包被有金纳米微粒的链亲和素作用的步骤后还包括用银染法增强信号步骤，确保杂交结果准确被检测。所述银染液优选为硝酸银染液，以质量百分数计，包括0.6%明胶、2.55%柠檬酸、2.35%柠檬酸钠、1.7%氢醌和0.3%硝酸银，余量为水。

此外，本发明还提供一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的芯片，包括：

SEQ ID NO:1-8所示序列的扩增引物、固定有SEQ ID NO:9-24所示序列的探针的片基、偶联金纳米微粒的链亲和素；

其中，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示序列的5＇端均修饰有生物素。所述探针的工作浓度优选为10-400nmol/L，更优选为100nmol/L。

本发明所述芯片可根据检测需要，在片基上固定不同数量的探针，组成点阵，不加以具体限制，点阵之间用芯片围栏加以分割便于独立操作。

作为优选，本发明所述固定通过在SEQ ID NO:9-24所示序列的探针的5＇端修饰氨基，然后与醛基化的片基结合实现，所述氨基修饰优选为5＇—NH₂—C₆氨基修饰。除此之外，本发明所述的固定方式还可以通过将片基进行其他化学处理，如包被氨基硅烷、多聚赖氨酸、烷基化、硅烷化、氨基化等，然后对应的修饰探针5＇端进行结合，实现固定，这些对于本领域技术人员来说是能够轻易实现的。

作为优选方案，所述片基为硅片、玻璃片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜或尼龙膜，进一步优选为玻璃片。

为方便芯片产品的配套使用，本发明还包括杂交液，所述杂交液以质量百分数计，包括4.38%氯化钠、2.205%柠檬酸钠、0.2%SDS、50%甲酰胺，余量为水。

为方便芯片产品的配套使用，本发明还包括硝酸银染液，所述硝酸银染液以质量百分数计，包括0.6%明胶、2.55%柠檬酸、2.35%柠檬酸钠、1.7%氢醌和0.3%硝酸银，余量为水。

为方便芯片产品的配套使用，本发明还包括芯片围栏、基因微阵列杂交盒、芯片盖片。

利用本发明所述芯片和方法检测的EGFR基因突变结果，经测序验证，两者检测的结果一致，表明本发明所述方法具有高度的准确性。

由以上技术方案可知，本发明基于芯片技术，利用生物素和链亲和素特异性结合的特征，将针对与吉非替尼、厄洛替尼的敏感性和耐药性相关的EGFR基因突变的探针组成芯片点阵，与生物素标记的扩增产物杂交后，用偶联金纳米微粒的链亲和素与扩增产物上标记的生物素特异性结合，从而准确判读突变结果。

附图说明

图1所示为本发明所述方法的原理示意图；

其中，Ag表示用银染法增强检测信号过程中的银离子，GNP表示金纳米微粒，streptavidin表示链亲和素，Biotin表示生物素，PCR Product表示扩增产物，Mutant site表示突变位点，Probe表示探针，5＇—NH₂—C₆表示探针氨基修饰的方式；

图2所示为本发明芯片检测结果扫描图；

A1、A2、B1、B2、I5、I6、J5、J6、I9、I10、J9、J10均为SEQ IDNO:9所述序列探针的点阵位置；

A9、A10、B9、B10、I1、I2、J1、J2均为SEQ ID NO:10所述序列探针的点阵位置；

A5、A6、B5、B6均为SEQ ID NO:11所述序列探针的点阵位置；

E7、E8、F7、F8均为SEQ ID NO:12所述序列探针的点阵位置；

C1、C2、D1、D2均为SEQ ID NO:13所述序列探针的点阵位置；

C3、C4、D3、D4均为SEQ ID NO:14所述序列探针的点阵位置；

C5、C6、D5、D6均为SEQ ID NO:15所述序列探针的点阵位置；

C7、C8、D7、D8均为SEQ ID NO:16所述序列探针的点阵位置；

C9、C10、D9、D10均为SEQ ID NO:17所述序列探针的点阵位置；

E3、E4、F3、F4均为SEQ ID NO:18所述序列探针的点阵位置；

E5、E6、F5、F6均为SEQ ID NO:19所述序列探针的点阵位置；

G7、G8、H7、H8均为SEQ ID NO:20所述序列探针的点阵位置；

G9、G10、H9、H10均为SEQ ID NO:21所述序列探针的点阵位置；

G1、G2、H1、H2均为SEQ ID NO:22所述序列探针的点阵位置；

G3、G4、H3、H4均为SEQ ID NO:23所述序列探针的点阵位置；

G5、G6、H5、H6均为SEQ ID NO:24所述序列探针的点阵位置；

图3-A至图3-D所示为测序验证的图谱；其中，3-A为第18外显子图谱，3-B为第19外显子图谱，3-C为第20外显子图谱，3-D为第21外显子图谱；

3-D中所标示的区域为第21外显子2573位点突变，该位点存在两种峰，碱基大部分突变为C，少部分仍为A，为A/C杂合峰。

具体实施方式：

本发明公开了一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法和芯片，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例进一步阐述本发明。

实施例1：芯片制备

材料与试剂：醛基化玻璃片基、基因微阵列杂交盒、芯片盖片、芯片围栏、微阵列芯片离心管（购自北京博奥生物技术公司）；芯片点样仪（SpotBot Personal Microarray Robot)）为Telechem公司产品。

寡核苷酸探针设计及合成：采用OLIGO6.0软件设计寡核苷酸探针（见SEQ ID NO:9-24），5＇端氨基修饰（5’-NH₂-(CH₂)₆-），所有探针经BLAST比较分析确认其特异性，探针由英骏生物科技公司合成和HPLC纯化。

芯片制备：5’-NH₂-(CH₂)₆-修饰各探针，用点样液稀释至20μmol/L，采用SpotBot Personal Microarray Robot自动点样仪，SMP10B点样针加载探针到醛基化玻璃片上，点样直径365μm，间距460μm，每种探针重复4个样点，同时点制阴性对照质控样点，见图2。点样后玻璃片放入保湿盒中，在湿度75%、温度37℃下温育2h，室温下孵育过夜。取出芯片用1%SDS溶液漂洗2min，再用去离子水漂洗2min。将玻片浸入0.25%NaBH₄溶液中浸泡10min，再放入10μmol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液中浸泡10min，取出玻璃片依次用0.1%SDS溶液和去离子水各漂洗2min，晾干后于4℃保存备用。

实施例2：肿瘤细胞DNA提取及PCR扩增

待测样品：石蜡包埋福尔马林固定（FFPE）的肿瘤组织；

先进行脱石蜡处理，5-8片5-10μm厚FFPE肿瘤组织切片，放入1.5ml离心管内，于72℃孵育20min，用吸管除去溶出的石蜡液体，加入1ml预热至50℃的二甲苯溶液，50℃孵育10min，12000g离心2min后用吸管吸除二甲苯。重复加热和去除石蜡液体操作2次。加入1ml无水乙醇室温放置10min，12000g离心5min，吸管吸除乙醇后再依次加入90%、70%乙醇重复进行水合处理，最后用去离子水洗涤晾干。用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒（QIAamp DNA FFPE tissue kit，QIAGEN）提取DNA，参照说明书操作。所提取基因组DNA溶解于TE缓冲液中，用NanoDrop紫外分光光度仪测定DNA浓度，-20℃保存备用。

PCR扩增：以SEQ ID NO:1-8所示序列为引物分别扩增含EGFR基因外显子18、19、20、21的局部DNA片段，50μl反应体系中含2×PCR Mix25μl，上、下游引物终浓度各200nmol/L，待测样品DNA100ng。Touch-down反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s→63-58℃（每循环降低0.5℃）退火30s→72℃延伸45s共10个循环，之后94℃30s→56℃30s→72℃45s,共25个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪下观察产物大小及特异性。

实施例3：制备链亲和素偶联金纳米微粒（Streptavidin-AuNP）

金纳米微粒溶液的pH值用盐酸调节至6.5，每100μlAuNP溶液中加入100μl（250ng/μl）链亲和素，室温下轻轻振摇5min。加入100μl10%NaCl溶液室温下孵育2h。加入5%BSA至终浓度为2%室温下孵育15min，4℃下20000rpm离心45min，弃上清。叠氮钠缓冲液（20mMTirs-HCl pH6.2，2%BSA，0.02%NaN₃）洗涤红色沉淀，4℃下20000rpm离心45min，弃上清。重复洗涤和离心3遍，之后用叠氮钠缓冲液重悬沉淀，于4℃保存备用。

实施例4：芯片杂交

先对PCR产物变性处理，10μl PCR产物中加入40μl杂交液（包括4.38%氯化钠、2.205%柠檬酸钠、0.2%SDS、50%甲酰胺，余量为水）中混匀，95℃热变性10min，立即放入冰水混合液中5min。50μl变性后PCR产物滴加到芯片片基的杂交区域，加盖玻片后放入保湿盒内于42℃杂交3h。取出芯片用漂洗液I（2×SSC，0.1%SDS）漂洗2min，再用漂洗液II（0.1×SSC，0.1%SDS）漂洗2min，最后用去离子水漂洗2min，晾干。

实施例5：显色及信号放大

10μl偶联金纳米微粒（Streptavidin-AuNP）的链亲和素加入490μlPBS溶液中混匀，滴加约100μl到芯片片基的杂交区域，37℃孵育45min，用8×PBN（1.4mol/L NaNO3，10mmol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH7.4）室温下漂洗2min，共漂洗3次。再用去离子水漂洗2min×3次后晾干。芯片浸入硝酸银染液（0.6%明胶，2.55%柠檬酸，2.35%柠檬酸钠，1.7%氢醌，0.3%硝酸银）中室温孵育，此过程中观察颜色变化待显色清楚时（约10-15min）用去离子水漂洗终止银染反应。用扫描仪扫描芯片，分析芯片杂交的灰度值，据杂交强度值判断突变和基因型，结果见图2。

由图2结果可以判断，该肿瘤组织中部分肿瘤细胞EGFR基因为野生型，部分肿瘤细胞EGFR基因发生突变，为第21外显子2573位点突变，芯片检测显示为SEQ ID NO:18所述序列探针（芯片中位置为E3、E4、F3、F4）和SEQ ID NO:19所述序列探针（芯片中位置为E5、E6、F5、F6）均为阳性。

实施例6：测序验证

按1:25比例加入纯化试剂（核酸外切酶0.2units/μl，虾碱性磷酸酶0.05units/μl）至实施例2的PCR产物中，混匀后短暂离心，置PCR仪37℃消化20min，之后于80℃孵育20min灭活虾碱性磷酸酶和核酸外切酶。10μl测序反应体系中加入3μl PCR产物，2μl测序试剂，5μl去离子水。置于PCR仪反应：95℃15sec，50℃30sec，60℃90sec共40个循环。反应结束后加入20μl无水乙醇和2μl EDTA溶液，室温下沉淀30min，4℃下12000rpm离心10min，弃上清；加入70%乙醇30μl，4℃下12000rpm离心15min，弃上清，室温干燥。加入HIDI溶液8μl，上样至ABI-3130测序仪进行毛细管电泳判读测序结果，结果见图3。

由图3可知，EGFR基因第21外显子2573位点为A/C杂合峰，即少部分肿瘤细胞为野生型，该位点碱基为A；大部分肿瘤细胞为突变型，该位点碱基为C，与图2得知的结果完全一致，表明本发明所述方法具有高度准确性。

实施例7：临床检测及用药指导

李XX，65岁女性，病理诊断为肺腺癌。2010年10月收集石蜡包埋组织标本，采用实例2所述方法脱石蜡处理，QIAamp DNA FFPEtissue kit提取基因组DNA，实例2所述方法PCR扩增4个外显子区域，实例4、5所述方法杂交和银染，结果显示为EGFR基因第19外显子2237-2256位点的插失突变，测序结果显示为第19外显子2240-2257位点(-TAAGAGAAGCAACATCTC-)18碱基的序列缺失，根据生物信息分析和临床研究提示为EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变，易瑞沙或特罗凯等药物敏感，建议患者采用特罗凯治疗。治疗6个月后随访患者病情稳定，无明显毒副反应。

实施例8：本发明所述芯片

SEQ ID NO:1-8所示序列的扩增引物、固定有SEQ ID NO:9-24所示序列的探针（工作浓度为10nmol/L）的硅片、偶联金纳米微粒的链亲和素。

实施例9：本发明所述芯片

SEQ ID NO:1-8所示序列的扩增引物、固定有SEQ ID NO:9-24所示序列的探针（工作浓度为400nmol/L）的瓷片、偶联金纳米微粒的链亲和素、杂交液（包括4.38%氯化钠、2.205%柠檬酸钠、0.2%SDS、50%甲酰胺，余量为水）。

实施例10：本发明所述芯片

SEQ ID NO:1-8所示序列的扩增引物、固定有SEQ ID NO:9-24所示序列的探针（工作浓度为300nmol/L）的硝酸纤维素膜、偶联金纳米微粒的链亲和素、杂交液（包括4.38%氯化钠、2.205%柠檬酸钠、0.2%SDS、50%甲酰胺，余量为水）、硝酸银染液（0.6%明胶、2.55%柠檬酸、2.35%柠檬酸钠、1.7%氢醌和0.3%硝酸银，余量为水）

实施例11：本发明所述芯片

SEQ ID NO:1-8所示序列的扩增引物、固定有SEQ ID NO:9-24所示序列的探针（工作浓度为100nmol/L）的玻璃片、偶联金纳米微粒的链亲和素、杂交液（包括4.38%氯化钠、2.205%柠檬酸钠、0.2%SDS、50%甲酰胺，余量为水）、硝酸银染液（0.6%明胶、2.55%柠檬酸、2.35%柠檬酸钠、1.7%氢醌和0.3%硝酸银，余量为水）、芯片围栏、芯片盖片、基因微阵列杂交盒。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、以SEQ ID NO:1-8所示序列为引物、肿瘤细胞DNA为模板进行PCR扩增，获得扩增产物，其中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示序列的5＇端均修饰有生物素；

步骤2、SEQ ID NO:9-24所示序列的探针分别与步骤1所得扩增产物杂交，然后洗涤除去未结合的扩增产物，最后与偶联金纳米微粒的链亲和素孵育，根据金纳米微粒颜色变化判断突变结果。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR为多重PCR或非对称PCR。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述杂交的DNA用量至少为10ng。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述探针的工作浓度为10-400nmol/L。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括：

在与偶联金纳米微粒的链亲和素孵育的步骤后用银染法增强信号步骤。

6.一种检测肿瘤细胞EGFR基因突变的芯片，其特征在于，包括：

SEQ ID NO:1-8所示序列的扩增引物、固定有SEQ ID NO:9-24所示序列的探针的片基、偶联金纳米微粒的链亲和素；

其中，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示序列的5＇端均修饰有生物素。

7.根据权利要求6所述芯片，其特征在于，所述固定通过在所述探针的5＇端修饰氨基，然后与醛基化的片基结合实现。

8.根据权利要求6所述芯片，其特征在于，所述探针的工作浓度为10-400nmol/L。

9.根据权利要求6所述芯片，其特征在于，还包括杂交液，所述杂交液以质量百分数计，包括4.38%氯化钠、2.205%柠檬酸钠、0.2%SDS、50%甲酰胺，余量为水。

10.根据权利要求6所述芯片，其特征在于，还包括硝酸银染液，所述硝酸银染液以质量百分数计，包括0.6%明胶、2.55%柠檬酸、2.35%柠檬酸钠、1.7%氢醌和0.3%硝酸银，余量为水。

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