WO2015139422A1 - 一种金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用 - Google Patents

一种金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用 Download PDF

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WO2015139422A1
WO2015139422A1 PCT/CN2014/085081 CN2014085081W WO2015139422A1 WO 2015139422 A1 WO2015139422 A1 WO 2015139422A1 CN 2014085081 W CN2014085081 W CN 2014085081W WO 2015139422 A1 WO2015139422 A1 WO 2015139422A1
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metal
island
metal nano
gold
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刘开
袁超
刘庄
赵信博
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苏州纳达生物科技有限公司
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553—Metal or metal coated
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors

Definitions

  • the present invention relates to the field of metal nano-island carriers, methods for their preparation, and applications in immunoassays. Background technique:
  • Humoral immunoassays are extremely important in biomedical research and early diagnosis of disease, especially for the early detection and screening of a range of major diseases such as cardiovascular and cerebrovascular diseases.
  • existing immunoassay techniques such as radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescent immunoassay (FIA), colloidal gold immunohistochemistry Analysis Technology (GICA) also has some problems such as low sensitivity and poor specificity.
  • fluorescent immunoassay technology although theoretically capable of achieving labeling at a single molecule level, is severely degraded by the back-fluorescence of biomolecules, laser-scattering noise, etc. (usually only on the order of tens of pg).
  • the invention aims to solve the problems of large background noise and low detection sensitivity in the existing fluorescence immunoassay, and provides a metal nano island carrier, a preparation method thereof and application in immunodetection.
  • a metal nano island carrier is obtained by forming a metal nano island on a surface of a carrier material, wherein the metal nano island is discrete, and the metal nano island has a size of 10 to 500 nm, and the metal nano island is The gap between them is 5 ⁇ 200 nm.
  • the carrier material is a solid phase material or a suspension material.
  • the solid phase material is a two-dimensional planar structure.
  • the solid phase material may be a slide, a silicon wafer, a quartz, a polyvinylidene fluoride film or a nitrocellulose membrane.
  • the suspension material may be glass microbeads, magnetic beads, polystyrene microspheres, polymethyl methacrylate microspheres, polystyrene magnetic microspheres or polymethyl methacrylate magnetic microspheres.
  • the metal may be a silver, a gold-silver alloy or a silver/gold core shell structure.
  • the method for preparing the metal nano island carrier is specifically carried out according to the following steps:
  • reaction solution for arranging the grown metal nano islands adding the reducing agent to the solution containing the metal ions and mixing uniformly; wherein the molar ratio of the reducing agent to the metal ions contained is (: 0.5 ⁇ 2:) : 1 ; the concentration of the metal ion solution is 0.1 ⁇ 5 mM;
  • the carrier material adsorbing a layer of gold nano-seed on the surface obtained in the first step is placed in the reaction solution of the grown metal nano-island obtained in the second step, and the reaction is shaken at 18 to 30 ° C for 2 to 60 min;
  • the carrier material obtained by the reaction in the third step is taken out, washed with water, and dried to obtain a metal nano island carrier.
  • the gold nanoseed in the first step is obtained by reducing Au 3+ by chemical reduction, and then bonded to the surface of the carrier material by physical adsorption or chemical coupling interaction.
  • the gold nano-seed adsorbed on the surface of the carrier material in the first step has a particle diameter of 1 to 20 nm.
  • the carrier material in the first step is a solid phase material or a suspension material.
  • the solid phase material is a two-dimensional planar structure.
  • the solid phase material may be a slide, a silicon wafer, a quartz, a polyvinylidene fluoride film or a nitrocellulose membrane.
  • the suspension material may be glass beads, magnetic beads, polystyrene microspheres, polymethyl methacrylate microspheres, polystyrene magnetic microspheres or polymethyl methacrylate magnetic microspheres.
  • the metal may be a silver, a gold-silver alloy or a silver/gold core shell structure.
  • the reducing agent in the second step is NaBH 4 , NH 2 OH, N 2 H 4 , CH 2 0 or C 6 H 12 0 6 .
  • the metal ion solution is a mixed solution of one or both of an Ag + solution or an Au 3+ solution.
  • the molar ratio of the reducing agent to the metal ion contained in the second step is (0.7 1.5): 1.
  • the molar ratio of the reducing agent to the metal ion contained in the second step is 1:1.
  • the concentration of the metal ion solution in the second step is 0.3 to 5 mM.
  • the concentration of the metal ion solution in the second step is 0.5 to 1 mM.
  • the water in the fourth step is deionized water.
  • the application of the metal nano-island carrier in the immunoassay is that the capture molecule in the biochip captures the corresponding substance, performs fluorescence scanning and data analysis, and then completes the immunoassay, wherein the metal nano-island carrier is used as a modified carrier for the capture molecule.
  • the metal nano-island carrier is used as a modified carrier for the capture molecule.
  • the metal nano island carrier surface modification tumor marker antibody molecule is prepared into a biochip to realize the application in early detection of tumor.
  • the metal nano island carrier surface is modified to prepare an autoimmune disease-associated antigen, and the antibody molecule is prepared into a biochip to realize the application in autoimmune disease detection.
  • the metal nano island carrier surface modification hepatitis B antibody molecule, influenza virus DNS sequence, conjugate antibody, Plasmodium antigen (or antibody), and Escherichia coli antibody are prepared into a biochip to realize the detection of infectious diseases.
  • the metal nano island carrier surface modified interleukin, interferon, tumor necrosis factor superfamily, colony stimulating factor, chemokine or growth factor monoclonal antibody is prepared into a biochip to realize the detection of cytokines .
  • the metal nano island carrier surface modification is prepared into a biochip for monoclonal antibodies of different diseases to realize the application of Elispot detection to the captured target cell secretion.
  • the biochip is a microarray biochip or a suspension biochip.
  • Advantages of the invention 1.
  • the invention is based on a wet chemical synthesis method, and realizes the preparation of different kinds of metal nano island functional carriers on the surface of the carrier material by the in-situ reduction growth process induced by the gold nanoseed, and further utilizes the prepared metal nanometers.
  • the surface plasmon resonance effect of the island carrier is highly sensitive to immunoassay, especially the near-infrared fluorescence enhancement technology is used to greatly reduce the background fluorescence noise, and the ultra-sensitive detection of fm level is realized;
  • the invention realizes the continuous adjustment of the plasmon resonance absorption peak of the metal nano island carrier by controlling the kind of metal and the size, shape and spacing of the nano island, covering the visible to near infrared region (420 1700). A series of bands of nm) that meet the needs of immunoassays.
  • Figure 1 is a scanning electron micrograph of a slide silver nano island carrier of Test 1;
  • Figure 2 is a scanning electron micrograph of the slide silver/gold core-shell structure nano island carrier of test three;
  • Figure 3 is the slide silver nano island carrier of test one and the silver/gold core shell structure of test three Comparison chart of plasma absorption spectrum curves of nano island carriers;
  • Figure 5 is a comparison of the fluorescence intensity of the surface of the glass-nano nano island carrier of the ordinary glass and the test one;
  • Figure 6 is a scanning electron micrograph of the polystyrene microsphere obtained in the first step of the experiment 5; Comparison of the effects of the magnetic polystyrene microspheres obtained in the first step of the middle and the magnetic polystyrene microspheres gold nano island carriers obtained in the fifth step of the experiment in the magnet enrichment before and after the magnet enrichment;
  • Figure 8 is a graph showing the ultraviolet absorption spectrum of the magnetic polystyrene microsphere gold nano island carrier obtained in Test 6. detailed description:
  • One embodiment is a metal nano island carrier obtained by forming metal nano islands on a surface of a carrier material.
  • the metal nano islands are discrete, and the size of the metal nano islands is 10 ⁇ .
  • the gap between the metal nano islands is 5 to 200 nm.
  • Two embodiments of the present invention differ from the first embodiment in that: the carrier material is a solid phase material or a suspension material. Others are the same as in the first embodiment.
  • the solid phase material may be a slide, a silicon wafer, a quartz, a polyvinylidene fluoride film or a nitrocellulose membrane. Others are the same as the specific embodiments one to three.
  • the suspension material may be glass microbeads, magnetic beads, polystyrene microspheres, polymethyl methacrylate microspheres, Polystyrene magnetic microspheres or polymethyl methacrylate magnetic microspheres. Others are the same as the specific embodiments one to four.
  • the metal may be a silver, a gold-silver alloy or a silver/gold core-shell structure. Others are the same as in the first embodiment.
  • This embodiment is a method for preparing a metal nano-island carrier, and specifically, according to the following steps:
  • reaction solution for arranging the grown metal nano islands adding the reducing agent to the solution containing the metal ions and mixing uniformly; wherein the molar ratio of the reducing agent to the metal ions contained is (: 0.5 ⁇ 2:) : 1 ; The concentration of the metal ion solution is 0.1 to 5 mM;
  • the carrier material adsorbing a layer of gold nano-seed on the surface obtained in the first step is placed in the reaction solution of the grown metal nano-island obtained in the second step, and the reaction is shaken at 18 to 30 ° C for 2 to 60 min; 4.
  • the carrier material obtained by the reaction in the third step is taken out, washed with water, and dried to obtain a metal nano island carrier.
  • the metal nano island functional carrier is realized by in situ chemical reduction growth induced by gold nanoseeds.
  • the unit mM is mmol/L.
  • Embodiment 8 The difference between this embodiment and Embodiment 7 is that: the gold nanoseed in the first step is obtained by reducing Au 3+ by chemical reduction, and then using physical adsorption or chemical coupling to each other. The effect is bonded to the surface of the carrier material. Others are the same as in the seventh embodiment.
  • the operation method in the first step is specifically completed according to the following steps:
  • Nano seed carrier material 1 ml of THPC reducing agent was added to an aqueous solution containing 1 mM NaOH, stirred vigorously for 30 min, to be used; b, quickly injected 1 mL of AuHC solution into step a, vigorously stirred at room temperature for 30 min; c. The obtained gold nanoseed solution is aged at room temperature for 24 h in the dark; d. The carrier material is placed in the gold nanoseed solution obtained by the step c, and reacted at room temperature for 10 to 300 min to obtain a surface adsorbed gold. Nano seed carrier material
  • DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENT 10 The difference between this embodiment and one of the specific embodiments 7 to 9 is that the carrier material in the first step is a solid phase material or a suspension material. Others are the same as the specific embodiments 7 to 9. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS One of the differences between this embodiment and one of the seventh to tenth embodiments is that the solid phase material has a two-dimensional planar structure. Others are the same as the specific embodiments 7 to 10.
  • the solid phase material may be a slide, a silicon wafer, a quartz, a polyvinylidene fluoride film or a nitrocellulose. membrane. Others are the same as the specific embodiments 7 to 11.
  • the suspension material may be glass microbeads, magnetic beads, polystyrene microspheres, polymethyl methacrylate. Microspheres, polystyrene magnetic microspheres or polymethyl methacrylate magnetic microspheres. Others are the same as the specific embodiments 7 to 12.
  • the metal may be a silver, a gold-silver alloy or a silver/gold core shell structure. Others are the same as the specific embodiments 7 to 13.
  • the difference between this embodiment and one of the specific embodiments 7 to 14 is:
  • the reducing agent in the second step is NaBH 4 , NH 2 OH, N 2 H 4 , CH 2 0 or C. 6 H 12 0 6 .
  • Others are the same as the specific embodiments 7 to 14.
  • the metal ion solution is a mixed solution of one or two of an Ag + solution or an Au 3+ solution. Others are the same as the specific embodiments 7 to 15.
  • the present embodiment is an application of a metal nano-island carrier in immunoassay, which captures a corresponding substance in a biochip, performs fluorescence scanning and data analysis, and then completes an immunoassay, wherein The metal nano island carrier is used as a modified carrier of a capture molecule to form a biochip.
  • the metal nano island carrier surface is modified with a hepatitis B antibody molecule, an influenza virus DNS sequence, a combined disease antibody, Plasmodium antigen (or antibody), E. coli antibody prepared into a biochip to achieve infection Application in the detection of sexual diseases. Others are the same as the specific embodiments 22 to 25.
  • the metal nano island carrier surface is modified with interleukin, interferon, tumor necrosis factor superfamily, Monoclonal antibodies to colony stimulating factors, chemokines or growth factors are prepared into biochips for use in the detection of cytokines. Others are the same as the specific embodiments 22 to 25.
  • biochip is a microarray biochip or a suspended biochip. Others are the same as the specific embodiments 22 to 27.
  • Experiment 1 a silver nano island carrier obtained by forming silver nano islands on a surface of a glass slide, wherein the silver nano islands are discrete, and the average size of the silver nano islands is between 100 and 500 nm, The gap between the silver nano islands is 30 to 100 nm.
  • the preparation method of the silver nano island carrier is specifically carried out according to the following steps:
  • the reaction solution for growing the silver nano-island CH 2 0 is added to the A g N0 3 solution, and the mixture is uniformly mixed; wherein, the molar ratio of CH 2 0 to A g N0 3 is 0.5:1; The molar concentration of the A g N0 3 solution is 1 mM;
  • Figure 1 is a scanning electron micrograph of the silver nano island carrier of Experiment 1. From Fig. 1, it can be seen that the average size of the silver nano islands is between 100 and 500 nm, and the gap between the silver nano islands is 30 to 100 nm.
  • Test 2 a gold-silver alloy nano island carrier obtained by forming a gold-silver alloy nano island on the surface of the glass slide, wherein the gold-silver alloy nano island is discrete, and the gold-silver alloy nano island is The average size is between 100 and 500 nm, and the gap between the gold-silver alloy nano islands is 30 100 nm.
  • the preparation method of the gold-silver alloy nano island carrier is specifically carried out according to the following steps:
  • Test 3 Silver/gold core-shell structure nano island carrier
  • the silver/gold core-shell structure nano island carrier is obtained by forming a silver/gold core-shell structure nano island on the surface of the slide, and the silver/gold core-shell structure nano island is discrete, and the silver/gold core is Average of shell structure nano islands The size is between 100 and 500 nm, and the gap between the nano/islands of the silver/gold core-shell structure is 30 to 100 nm.
  • the preparation method of the silver/gold core-shell structure nano island carrier is specifically carried out according to the following steps: 1. adsorbing a layer of gold nano-seed on the surface of the slide to obtain a glass slide with surface-adsorbed gold nano-seed;
  • the glass slide coated with gold nano-seed on the surface obtained in the first step is placed in the reaction solution of the grown silver nano-island obtained in the second step, and reacted at 20 ° C for 30 min;
  • the slide obtained in the third step was placed in the AuHC solution, and the reaction was continued for 1 hour to coat the surface of the silver nano-island with a gold nanoshell; the molar concentration of the AuHC solution was 10 ⁇ ;
  • the slides completed in the fourth step are taken out, washed with water, and dried to obtain a silver/gold core-shell structure nano-island carrier.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of the silver/gold core-shell structure nano island carrier of Experiment 3. From Fig. 2, it can be seen that the average size of the silver/gold core-shell structure nano-islands is between 100 and 500 nm, and the gap between the silver nano-islands is 30 to: I00 nm.
  • FIG. 3 is a plasma absorption spectrum curve; wherein, the solid line is a plasma absorption spectrum curve of a silver nano island carrier, and the broken line is a plasma absorption spectrum curve of a silver/gold core-shell structure nano island carrier. From Fig. 3, it can be seen that the absorption peaks of the two carriers are located near 450 nm and 420 nm, respectively, and the OD value is 0.60.
  • coating the gold shell layer causes a change in the intrinsic absorption peak of the silver intrinsic, so theoretically Changing the stoichiometry and structure of silver-gold nano islands can achieve its ion
  • the resonance absorption peak is regulated from the visible light to the near-infrared region, thereby realizing fluorescence enhancement and ultrasensitive immunodetection analysis over a wide spectral range.
  • the fluorescence intensity test was performed on the ordinary glass, the silver nano island carrier obtained in the test 1, and the silver/gold core-shell structure nano island carrier obtained in the test 3.
  • Test method BSA with Cy5.5 labeling was tested according to a certain concentration gradient on different carriers such as ordinary glass and silver nano islands and silver/gold core-shell nano islands: 100, 10, 1, 0.1, 0.01 , 0 g / ml, and then analyzed with a commercial Odyssey fluorescence scanner (Licor), the results of which are shown in Figure 4. From Fig. 4, it can be observed that the silver nano island carrier and the silver/gold core-shell structure nano island have obvious fluorescence enhancement effects.
  • Fig. 5 The results of the surface fluorescence intensity signals of the ordinary glass and silver nano island carriers obtained by the analysis of the image by the analysis software are shown in Fig. 5; wherein, the country is ordinary glass, and ⁇ is a silver nano island carrier. From Fig. 5, it can be observed that the fluorescence intensity of the silver nano island carrier is increased by about 10 times with respect to ordinary glass, and the detection limit is increased by about 2 orders of magnitude.
  • Test 4 Glass microbeads silver nano island carrier
  • the preparation method of the glass microbead silver nano island carrier is specifically carried out according to the following steps: 1.
  • the glass microbeads are added to the gold nano seed solution, the reaction is stirred at room temperature for 30 min, and then washed three times by centrifugation to obtain a surface. Glass beads for adsorbing gold nanoseeds;
  • the glass microbeads adsorbing a layer of gold nano-seed on the surface obtained in the first step are placed in the reaction solution of the grown silver nano-island obtained in the second step, and reacted at 20 ° C for 60 min;
  • the glass microbeads obtained by the reaction in the third step are centrifuged, washed with water, and redispersed in an aqueous solution to obtain a glass microbead silver nano island carrier.
  • Test 5 Polystyrene microspheres silver nano island carrier
  • the preparation method of the polystyrene microsphere silver nano island carrier is specifically carried out according to the following steps: 1.
  • the polystyrene microspheres are prepared by a dispersion polymerization method, and the polystyrene microspheres have a uniform size and a diameter of about 3.5 ⁇ ;
  • the polystyrene microspheres adsorbing a layer of gold nano-seed on the surface obtained in the second step are placed in the reaction solution of the grown silver nano-island obtained in the third step, and reacted at 20 ° C for 60 min ;
  • the polystyrene microspheres which have been reacted in the fourth step are centrifuged, washed with water, and redispersed into an aqueous solution to obtain a polystyrene microsphere silver nano island carrier.
  • the preparation method of the magnetic bead silver nano island carrier is specifically carried out according to the following steps:
  • the magnetic beads completed in the fourth step are centrifuged, washed with water, and redispersed into an aqueous solution to obtain a magnetic gold nano island carrier.
  • the magnetic polystyrene microsphere gold nano island carrier obtained in Test 6 was subjected to ultraviolet absorption spectrum measurement to obtain Fig. 8. From Fig. 8, it can be observed that there is a distinct gold plasma absorption peak at 540 nm, so it can be proved that the surface of the magnetic polystyrene beads can adsorb the gold nano-seed, thereby providing material support for the subsequent growth of the gold nano-island film.
  • Test 7 Metal nano island carrier surface modification tumor marker antibody molecule Preparation of microarray biochip in the early detection of tumors, the specific operation methods are as follows: First, 12 different tumor marker antibodies: carbohydrate antigen CA19- 9, carbohydrate antigen CA125, carcinoembryonic antigen CEA, ferritin Ferritin, human chorionic gonadotropin Beta-HCG, alpha-fetoprotein AFP, prostate heterogeneous antigen PSA, growth hormone HGH, carbohydrate antigen CA15-3, neurons The specific enolase NSE and the like were modified to the surface of the metal nano-island functional carrier according to different arrays, and then blocked with 5% BSA for 2 h at room temperature to prepare a microarray biochip.
  • the patient serum sample is added to the surface of the chip, the antibody will capture the relevant tumor marker antigen on the surface, and finally the fluorescent labeled secondary antibody is added, and the fluorescence signal scanning and data analysis are performed by using the confocal scanner, and the pair can be quickly completed. Screening for tumors.
  • Test 8 Preparation of metal nano island carriers into microarray biochips for detection of systemic lupus erythematosus.
  • cytokine analysis There are many autoantibodies in patients with lupus erythematosus. More than 95% of patients are anti-nuclear antibody positive, anti-DNA (double-stranded, single-strand), anti-histone, anti-RNA-non-histone, anti-ribonucleoprotein (mainly Smith) Antigen, anti-granulocyte, anti-platelet, anti-smooth muscle and other antibodies, wherein anti-double-stranded DNA and anti-Smith antigen are relatively specific, the positive rate is 60% and 30%, respectively, while the positive rate in other connective tissue diseases, Less than 5%.
  • the biochip was fabricated by modifying the corresponding monoclonal antibody molecular microarray on the surface of the slide metal nano island carrier to realize the detection of systemic lupus erythematosus.
  • Test 9 Preparation of a metal nano island carrier as a microarray biochip for the detection of rheumatoid arthritis. (cytokine analysis)
  • Rheumatoid arthritis is a common autoimmune disease characterized by chronic inflammatory lesions of the synovial membrane. Detection of immunoglobulin and complement in RA patients plays an important role in understanding the humoral immune function of RA patients and in the diagnosis, prognosis and therapeutic effects of RA.
  • the use of metal nano island carriers to modify different monoclonal antibody arrays can improve the immunoglobulin and complement, rheumatoid factor in serum of RA patients:), anti-cyclic citrullinated peptide antibody (anti-CCP:), C-reaction Detection sensitivity of protein (CRP:), anti-streptolysin (ASO).
  • Test 10 Preparation of metal nano island carriers into microarray biochips for detection of hepatitis B virus. (infectious disease detection)
  • HBsAg is the outer membrane protein of hepatitis B virus (HBV) and is the first marker in serum. It quickly disappears in acute hepatitis, and if it does not disappear after 6 months, it can become a carrier of chronic hepatitis (CH) or HBsAg and can last for years or decades.
  • CH chronic hepatitis
  • HBsAg The detection of HBsAg is of great significance for the diagnosis and identification of hepatitis B, the investigation of epidemiology, the screening of blood donors, the prognosis judgment and the treatment effect and the screening of drugs.
  • the HBs monoclonal antibody was coated on the surface of the metal nano island carrier to prepare a hepatitis B virus detection kit, and the serum HBsAg was detected by the sandwich method. If the sample contains HBsAg, it is bound by the surface of the carrier, and then fluorescently labeled anti-HBs polyclonal antibody is added to form a sandwich complex. The scanner reads to determine
  • Metal nano island carrier surface modification tumor marker antibody molecule Preparation of suspension biochip in the early detection of tumor, the specific operation method is as follows: First, based on different sizes of magnetic polystyrene beads Preparing a metal nano island functional carrier, and then encoding different sizes of polystyrene beads by quantum dots with different fluorescence emission (such as 600, 700, 800 nm), and respectively labeling nucleic acids for different detection materials on the surface of the carrier , antibodies, antigens and other molecules to achieve detection of different diseases. After the target molecule is captured, the microspheres are further labeled with a fluorescently labeled secondary antibody, and the self-developed near-infrared flow cytometry system is used for data acquisition and molecularization, and finally the diagnosis result is given.
  • quantum dots with different fluorescence emission such as 600, 700, 800 nm

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Abstract

一种金属纳米岛载体及其制备方法和在制备免疫检测的试剂中的应用，涉及金属纳米岛载体及其制备方法和在制备免疫检测的试剂中的应用的领域。该金属纳米岛载体解决了现有荧光免疫分析中背景噪声大、检测灵敏度低的问题。金属纳米岛载体是在载体材料表面形成金属纳米岛而得到的，其制备方法：一、在载体材料表面吸附金纳米种子；二、配置生长金属纳米岛反应液；三、在载体材料表面生长金属纳米岛；四、清洗、干燥。金属纳米岛载体在制备免疫检测的试剂中的应用，使用金属纳米岛载体作为捕获分子的修饰载体制成生物芯片，进行荧光扫描和数据分析，进而完成免疫检测。该金属纳米岛载体具有高灵敏度、大大降低背景荧光噪声，实现了fm级的超灵敏检测。该金属纳米岛载体适用于功能材料、生物芯片和制备免疫检测的试剂领域。

Description

技术领域：
本发明涉及金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用的领域。 背景技术：
体液免疫检査在在生物医学研究和疾病早期诊断中具有极为重要的研究价 值， 尤其是实现对心脑血管、 癌症等一系列重大疾病的早期检测和筛査的关键 所在。 然而要实现对这些体液中较低浓度目标分子的分析检测， 现有的免疫检 测技术如放射免疫分析 （RIA)、 酶联免疫吸附分析 （ELISA)、 荧光免疫分析 (FIA)、 胶体金免疫层析技术（GICA) 还存在着灵敏度低、 特异性差等一些问 题。 尤其是荧光免疫检测技术， 虽然理论上能够实现对单分子水平的标记， 但 由于受到生物分子背荧光、激光散射噪声等影响而严重降低了其检测灵敏度（通 常只能到几十 pg数量级）。
发明内容：
本发明是要解决现有的荧光免疫分析中背景噪声大、 检测灵敏度低的问题， 而提供了一种金属纳米岛载体及其制备方法和在免疫检测中的应用。
一种金属纳米岛载体， 是在载体材料表面形成金属纳米岛而得到的， 所述 的金属纳米岛是分立的，所述的金属纳米岛的尺寸为 10~500 nm，所述的金属纳 米岛之间的间隙为 5~200 nm。
所述的载体材料为固相材料或悬浮材料。
所述的固相材料为二维平面结构。
所述的固相材料可以为玻片、 硅片、 石英、 聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素 膜。 所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、 磁珠、 聚苯乙烯微球、 聚甲基丙烯酸甲 酯微球、 聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。
所述的金属可以为银、 金 -银合金或银 /金核壳结构。
制备金属纳米岛载体的方法， 具体是按照以下歩骤进行的：
一、 在载体材料表面吸附一层金纳米种子， 得到了表面吸附金纳米种子的 载体材料；
二、 配置生长金属纳米岛的反应溶液： 将还原剂加入到含有金属离子的溶 液中， 混合均匀； 其中， 所述的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为 (：0.5~2：) : 1 ; 所述的金属离子的溶液的浓度为 0.1~5 mM;
三、 将歩骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载体材料放入歩骤二中 得到的生长金属纳米岛的反应溶液中， 在 18~30°C下振荡反应 2~60 min;
四、 将歩骤三中反应完成的载体材料取出， 用水清洗， 干燥， 即得到金属 纳米岛载体。
所述的歩骤一中的金纳米种子是通过化学还原法还原 Au3+得到的， 然后利 用物理吸附或化学偶联相互作用结合到载体材料表面的。
所述的歩骤一中的载体材料表面吸附的金纳米种子的粒径为 1~20 nm。
所述的歩骤一中的载体材料为固相材料或悬浮材料。
所述的固相材料为二维平面结构。
所述的固相材料可以为玻片、 硅片、 石英、 聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素 膜。
所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、 磁珠、 聚苯乙烯微球、 聚甲基丙烯酸甲 酯微球、 聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。
所述的金属可以为银、 金 -银合金或银 /金核壳结构。 所述的歩骤二中的还原剂为 NaBH4， NH2OH, N2H4, CH20或 C6H1206。 所述的金属离子溶液为 Ag+溶液或 Au3+溶液中的一种或两种的混合溶液。 所述的歩骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为 (0.7 1.5)： 1。
所述的歩骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为 1： 1。
所述的歩骤二中的金属离子的溶液的浓度为 0.3~5 mM。
所述的歩骤二中的金属离子的溶液的浓度为 0.5~1 mM。
所述的歩骤四中的水为去离子水。
金属纳米岛载体在免疫检测中的应用， 是生物芯片中的捕获分子捕获相应 的物质， 进行荧光扫描和数据分析， 进而完成免疫检测， 其中使用所述金属纳 米岛载体作为捕获分子的修饰载体制成生物芯片。
所述的金属纳米岛载体表面修饰肿瘤标志物抗体分子制备成生物芯片实现 在肿瘤的早期检测中的应用。
所述的金属纳米岛载体表面修饰自体免疫疾病相关的抗原、 抗体分子制备 成生物芯片实现在自体免疫疾病检测中的应用。
所述的金属纳米岛载体表面修饰乙肝抗体分子、 流感病毒 DNS序列、 结合 病抗体、 疟原虫抗原 （或抗体)、 大肠杆菌抗体制备成生物芯片实现在传染性疾 病的检测中的应用。
所述的金属纳米岛载体表面修饰白细胞介素、 干扰素、 肿瘤坏死因子超家 族、 集落剌激因子、 趋化因子或生长因子的单克隆抗体制备成生物芯片实现在 细胞因子的检测中的应用。
所述的金属纳米岛载体表面修饰对不同疾病的单克隆抗体制备成生物芯片 实现在对捕获的目标细胞分泌物进行 Elispot检测中的应用。
所述的生物芯片为微阵列生物芯片或悬浮式生物芯片。 本发明的优点： 一、 本发明是基于湿化学合成方法， 通过金纳米种子诱导 的原位还原生长过程在载体材料表面实现了不同种类金属纳米岛功能载体的制 备， 并进一歩利用制备的金属纳米岛载体表面等离子体共振效应进行高灵敏度 的免疫检测分析， 尤其是利用近红外荧光增强技术大大降低了背景荧光噪声， 实现了 fm级的超灵敏检测；
二、 本发明是通过控制金属的种类以及纳米岛的尺寸、 形貌、 间距等来实 现调控金属纳米岛载体的等离子体共振吸收峰的连续可调， 涵盖了从可见光到 近红外区域 （420 1700 nm) 的一系列波段， 满足免疫检测的需求。
附图说明：
图 1为试验一的载玻片银纳米岛载体的扫描电子显微镜图；
图 2为试验三的载玻片银 /金核壳结构纳米岛载体的扫描电子显微镜图； 图 3为试验一的载玻片银纳米岛载体和试验三的载玻片银 /金核壳结构纳米 岛载体的等离子吸收光谱曲线对比图；
图 4为普通玻璃、 试验一的载玻片银纳米岛载体和试验三的载玻片银 /金核 壳结构纳米岛载体的荧光扫描对比图；
图 5为普通玻璃和试验一的载玻片银纳米岛载体表面荧光强度的对比图； 图 6为试验五中歩骤一得到的聚苯乙烯微球的扫描电子显微镜图； 图 7为试验六中歩骤一得到的磁性聚苯乙烯微球和试验六中歩骤五得到的 磁性聚苯乙烯微球金纳米岛载体在磁铁富集作用前后的效果对比图；
图 8为试验六得到的磁性聚苯乙烯微球金纳米岛载体的紫外吸收光谱图。 具体实施方式：
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方 式间的任意组合。 具体实施方式一： 本实施方式是一种金属纳米岛载体， 是在载体材料表面 形成金属纳米岛而得到的， 所述的金属纳米岛是分立的， 所述的金属纳米岛的 尺寸为 10~500 nm， 所述的金属纳米岛之间的间隙为 5~200 nm。
具体实施方式二： 本实施方式与具体实施方式一的不同点是： 所述的载体 材料为固相材料或悬浮材料。 其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三： 本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是： 所述的 固相材料为二维平面结构。 其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四： 本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点是： 所 述的固相材料可以为玻片、 硅片、 石英、 聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜。 其 它与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五： 本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点是： 所 述的悬浮材料可以为玻璃微珠、 磁珠、 聚苯乙烯微球、 聚甲基丙烯酸甲酯微球、 聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。 其它与具体实施方式一至四 相同。
具体实施方式六： 本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点是： 所 述的金属可以为银、 金 -银合金或银 /金核壳结构。 其它与具体实施方式一至五相 同。
具体实施方式七： 本实施方式是制备金属纳米岛载体的方法， 具体是按照 以下歩骤进行的：
一、 在载体材料表面吸附一层金纳米种子， 得到了表面吸附金纳米种子的 载体材料；
二、 配置生长金属纳米岛的反应溶液： 将还原剂加入到含有金属离子的溶 液中， 混合均匀； 其中， 所述的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为 (：0.5~2：) : 1 ; 所述的金属离子的溶液的浓度为 0.1~5 mM;
三、 将歩骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载体材料放入歩骤二中 得到的生长金属纳米岛的反应溶液中， 在 18~30 °C下振荡反应 2~60 min; 四、 将歩骤三中反应完成的载体材料取出， 用水清洗， 干燥， 即得到金属 纳米岛载体。
所述的金属纳米岛功能载体是通过金纳米种子诱导的原位化学还原生长实 现的。
所述的单位 mM为 mmol/L。
具体实施方式八： 本实施方式与具体实施方式七的不同点是： 所述的歩骤 一中的金纳米种子是通过化学还原法还原 Au3+得到的， 然后利用物理吸附或化 学偶联相互作用结合到载体材料表面的。 其它与具体实施方式七相同。
所述的歩骤一中的操作方法， 具体按照以下歩骤完成的：
a、 将 1 ml的 THPC还原剂加入到含有 1 mM NaOH的水溶液中， 剧烈搅拌 30 min， 待用； b、 向歩骤 a中迅速注入 l mL的 AuHC 溶液， 室温下剧烈搅拌 反应 30 min; c、 将得到的金纳米种子溶液置于室温下避光熟化 24 h; d、 将载 体材料放入歩骤 c得到的金纳米种子溶液中， 室温下反应 10~300 min， 即得到 表面吸附金纳米种子的载体材料
具体实施方式九： 本实施方式与具体实施方式七至八之一的不同点是： 所 述的歩骤一中的载体材料表面吸附的金纳米种子的粒径为 l~20 nm。其它与具体 实施方式七至八相同。
具体实施方式十： 本实施方式与具体实施方式七至九之一的不同点是： 所 述的歩骤一中的载体材料为固相材料或悬浮材料。 其它与具体实施方式七至九 相同。 具体实施方式 ^一： 本实施方式与具体实施方式七至十之一的不同点是： 所述的固相材料为二维平面结构。 其它与具体实施方式七至十相同。
具体实施方式十二： 本实施方式与具体实施方式七至 ^一之一的不同点是： 所述的固相材料可以为玻片、 硅片、 石英、 聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜。 其它与具体实施方式七至十一相同。
具体实施方式十三： 本实施方式与具体实施方式七至十二之一的不同点是： 所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、 磁珠、 聚苯乙烯微球、 聚甲基丙烯酸甲酯微 球、 聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。 其它与具体实施方式七 至十二相同。
具体实施方式十四： 本实施方式与具体实施方式七至十三之一的不同点是： 所述的金属可以为银、 金 -银合金或银 /金核壳结构。 其它与具体实施方式七至十 三相同。
具体实施方式十五： 本实施方式与具体实施方式七至十四之一的不同点是： 所述的歩骤二中的还原剂为 NaBH4， NH2OH, N2H4, CH20或 C6H1206。 其它与 具体实施方式七至十四相同。
具体实施方式十六： 本实施方式与具体实施方式七至十五之一的不同点是： 所述的金属离子溶液为 Ag+溶液或 Au3+溶液中的一种或两种的混合溶液。 其它 与具体实施方式七至十五相同。
具体实施方式十七： 本实施方式与具体实施方式七至十六之一的不同点是： 所述的歩骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为 (0.7 1.5)： 1其它与具体 实施方式七至十六相同。
具体实施方式十八： 本实施方式与具体实施方式七至十七之一的不同点是： 所述的歩骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为 1 : 1。 其它与具体实施 方式七至十七相同。
具体实施方式十九： 本实施方式与具体实施方式七至十八之一的不同点是： 所述的歩骤二中的金属离子的溶液的浓度为 0.3~5 mM。 其它与具体实施方式七 至十八相同。
具体实施方式二十： 本实施方式与具体实施方式七至十九之一的不同点是： 所述的歩骤二中的金属离子的溶液的浓度为 0.5~1 mM。 其它与具体实施方式七 至十九相同。
具体实施方式二 ^一： 本实施方式与具体实施方式七至二十之一的不同点 是： 所述的歩骤四中的水为去离子水。 其它与具体实施方式七至二十相同。
具体实施方式二十二： 本实施方式是一种金属纳米岛载体在免疫检测中的 应用， 是生物芯片中的捕获分子捕获相应的物质， 进行荧光扫描和数据分析， 进而完成免疫检测， 其中使用所述金属纳米岛载体作为捕获分子的修饰载体制 成生物芯片。
具体实施方式二十三： 本实施方式与具体实施方式二十二的不同点是： 所 述的金属纳米岛载体表面修饰肿瘤标志物抗体分子制备成生物芯片实现在肿瘤 的早期检测中的应用。 其它与具体实施方式二十二相同。
具体实施方式二十四： 本实施方式与具体实施方式二十二或二十三的不同 点是： 所述的金属纳米岛载体表面修饰自体免疫疾病相关的抗原、 抗体分子制 备成生物芯片实现在自体免疫疾病检测中的应用。 其它与具体实施方式二十二 或二十三相同。
具体实施方式二十五： 本实施方式与具体实施方式二十二至二十四之一的 不同点是：所述的金属纳米岛载体表面修饰乙肝抗体分子、流感病毒 DNS序列、 结合病抗体、 疟原虫抗原 （或抗体)、 大肠杆菌抗体制备成生物芯片实现在传染 性疾病的检测中的应用。 其它与具体实施方式二十二至二十五相同。 具体实施方式二十六： 本实施方式与具体实施方式二十二至二十五之一的 不同点是： 所述的金属纳米岛载体表面修饰白细胞介素、 干扰素、 肿瘤坏死因 子超家族、 集落剌激因子、 趋化因子或生长因子的单克隆抗体制备成生物芯片 实现在细胞因子的检测中的应用。 其它与具体实施方式二十二至二十五相同。
具体实施方式二十七： 本实施方式与具体实施方式二十二至二十六之一的 不同点是： 所述的金属纳米岛载体表面修饰对不同疾病的单克隆抗体制备成生 物芯片实现在对捕获的目标细胞分泌物进行 EKspot检测中的应用。 其它与具体 实施方式二十二至二十六相同。
具体实施方式二十八： 本实施方式与具体实施方式二十二至二十七之一的 不同点是： 所述的生物芯片为微阵列生物芯片或悬浮式生物芯片。 其它与具体 实施方式二十二至二十七相同。
采用下述试验验证本发明的效果：
试验一： 银纳米岛载体， 在载玻片表面形成银纳米岛而得到的， 所述的银 纳米岛是分立的， 所述的银纳米岛的平均尺寸在 100~500nm之间， 所述的银纳 米岛之间的间隙为 30~100nm。
银纳米岛载体的制备方法， 具体是按照以下歩骤进行的：
一、 在载玻片表面吸附一层金纳米种子， 得到了表面吸附金纳米种子的载 玻片；
二、 配置生长银纳米岛的反应溶液： 将 CH20加入到 AgN03溶液中， 混合 均匀； 其中， 所述的 CH20与 AgN03的摩尔比为 0.5 : 1 ; 所述的 AgN03溶液的 摩尔浓度为 ImM;
三、 将歩骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载玻片放入歩骤二中得 到的生长银纳米岛的反应溶液中， 在 20 °C下反应 30 min;
四、 将歩骤三中反应完成的载玻片取出， 用水清洗， 干燥， 即得到银纳米 岛载体。
对试验一得到的银纳米岛载体进行扫描电子显微镜测试， 得到图 1。 图 1为 试验一的银纳米岛载体的扫描电子显微镜图。 从图 1中， 可以看出银纳米岛的 平均尺寸在 100 500 nm之间， 银纳米岛之间的间隙为 30 100 nm。
试验二： 金-银合金纳米岛载体， 在载玻片表面形成金-银合金纳米岛而得到 的， 所述的金 -银合金纳米岛是分立的， 所述的金-银合金纳米岛的平均尺寸在 100~500 nm之间， 所述的金-银合金纳米岛之间的间隙为 30 100 nm。
金 -银合金纳米岛载体的制备方法， 具体是按照以下歩骤进行的：
一、 在载玻片表面吸附一层金纳米种子， 得到了表面吸附金纳米种子的载 玻片；
二、 配置生长金-银合金纳米岛的反应溶液： 将 NH2OH加入到 AgN03溶液 和 AuHC 溶液的混合溶液中， 混合均匀； 其中， 所述的 NH2OH与 AgN03的摩 尔比为 2： 1； 所述的 AuHC 与 AgN03的摩尔比为 1： 1； 所述的 AgN03溶液的 摩尔浓度为 0.5 mM; 所述的 AuHC 溶液的摩尔浓度为 0.5 mM;
三、 将歩骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载玻片放入歩骤二中得 到的生长金-银合金纳米岛的反应溶液中， 在 20°C下震荡反应 30分钟；
四、 将歩骤三中反应完成的载玻片取出， 用水清洗， 干燥， 即得到金 -银合 金纳米岛载体。
试验三： 银 /金核壳结构纳米岛载体
银 /金核壳结构纳米岛载体， 在载玻片表面形成银 /金核壳结构纳米岛而得到 的， 所述的银 /金核壳结构纳米岛是分立的， 所述的银 /金核壳结构纳米岛的平均 尺寸在 100~500nm之间，所述的银 /金核壳结构纳米岛之间的间隙为 30~100nm。 银 /金核壳结构纳米岛载体的制备方法， 具体是按照以下歩骤进行的： 一、 在载玻片表面吸附一层金纳米种子， 得到了表面吸附金纳米种子的载 玻片；
二、 配置生长银纳米岛的反应溶液： 将 CH20加入到 AgN03溶液中， 混合 均匀； 其中， 所述的 CH20与 AgN03的摩尔比为 1： 1 ; 所述的 AgN03溶液的摩 尔浓度为 1 mM;
三、 将歩骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载玻片放入歩骤二中得 到的生长银纳米岛的反应溶液中， 在 20 °C下反应 30 min;
四、 将歩骤三中得到的载玻片放入 AuHC 溶液中， 继续反应 1小时， 使银 纳米岛表面包覆一层金纳米壳层； 所述的 AuHC 溶液的摩尔浓度为 10 μΜ;
五、 将歩骤四中反应完成的载玻片取出， 用水清洗， 干燥， 即得到银 /金核 壳结构纳米岛载体。
对试验三得到的银纳米岛载体进行扫描电子显微镜测试， 得到图 2。 图 2为 试验三的银 /金核壳结构纳米岛载体的扫描电子显微镜图。 从图 2中， 可以看出 银 /金核壳结构纳米岛的平均尺寸在 100 500 nm之间， 银纳米岛之间的间隙为 30〜： I00 nm。
对试验一得到的银纳米岛载体和试验三得到的银 /金核壳结构纳米岛载体进 行等离子吸收光谱测试， 得到图 3。 图 3是等离子吸收光谱曲线； 其中， 实线为 银纳米岛载体等离子吸收光谱曲线， 虚线为银 /金核壳结构纳米岛载体等离子吸 收光谱曲线。 从图 3中， 可以得到两个载体的吸收峰分别位于 450 nm和 420nm 附近， OD值为 0.60上下， 可以看出包覆金壳层会引起银本征等离子吸收峰的 变化， 因此理论上通过改变银-金纳米岛的化学计量比和结构能够实现等其离子 共振吸收峰从可见光到近红外区的调控， 从而实现对宽光谱范围的荧光增强和 超灵敏免疫检测分析。
对普通玻璃、 试验一得到的银纳米岛载体和试验三得到的银 /金核壳结构纳 米岛载体进行荧光强度测试。 测试方法： 采用 Cy5.5标记的 BSA按一定的浓度 梯度在普通玻璃和银纳米岛及银 /金核壳结构纳米岛等不同载体上进行了点样测 试： 100， 10， 1， 0.1， 0.01， 0 g/ml，然后用商品化的 Odyssey荧光扫描仪 (Licor) 进行分析， 扫描结果如图 4所示。 从图 4中， 可以观察到银纳米岛载体和银 /金 核壳结构纳米岛都有明显的荧光增强效果。 将此图片通过分析软件测量后得到 的普通玻璃和银纳米岛载体表面荧光强度信号结果如图 5所示； 其中， 國为普 通玻璃， ▲为银纳米岛载体。 从图 5中， 可以观察到银纳米岛载体相对于普通 玻璃的荧光强度约增强了 10倍， 检测限约提高了 2个量级。
试验四： 玻璃微珠银纳米岛载体
玻璃微珠银纳米岛载体的制备方法， 具体是按照以下歩骤进行的： 一、 将玻璃微珠加入到金纳米种子溶液中， 室温下搅拌反应 30 min， 然后 离心清洗 3次， 得到了表面吸附金纳米种子的玻璃微珠；
二、 配置生长银纳米岛的反应溶液： 将 CH20加入到 AgN03溶液中， 混合 均匀； 其中， 所述的 CH20与 AgN03的摩尔比为 1： 1 ; 所述的 AgN03溶液的摩 尔浓度为 0.5 mM;
三、 将歩骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的玻璃微珠放入歩骤二中 得到的生长银纳米岛的反应溶液中， 在 20°C下反应 60 min;
四、 将歩骤三中反应完成的玻璃微珠离心， 用水清洗， 重新分散到水溶液 中， 即得到玻璃微珠银纳米岛载体。
试验五： 聚苯乙烯微球银纳米岛载体 聚苯乙烯微球银纳米岛载体的制备方法， 具体是按照以下歩骤进行的： 一、 利用分散聚合法制备聚苯乙烯微球， 聚苯乙烯微球尺寸均匀， 直径约 为 3.5 μπΐ;
二、 将聚苯乙烯微球加入到金纳米种子溶液中， 室温下搅拌 12小时， 使材 料表面吸附一层金纳米种子， 得到了表面吸附金纳米种子的聚苯乙烯微球； 三、 配置生长银纳米岛的反应溶液： 将 CH20加入到 AgN03溶液中， 混合 均匀； 其中， 所述的 CH20与 AgN03的摩尔比为 1： 1 ; 所述的 AgN03溶液的摩 尔浓度为 0.5 mM;
四、 将歩骤二中得到的表面吸附一层金纳米种子的聚苯乙烯微球放入歩骤 三中得到的生长银纳米岛的反应溶液中， 在 20 °C下反应 60 min;
五、 将歩骤四中反应完成的聚苯乙烯微球离心， 用水清洗， 重新分散到水 溶液中， 即得到聚苯乙烯微球银纳米岛载体。
对试验五中歩骤一得到的聚苯乙烯微球进行扫描电子显微镜的测试， 得到 图 6。 从图 6中， 可以观察到制备得到的聚苯乙烯微球的尺寸分布非常均匀，直 径约为 3.5 μπι。
试验六： 磁珠金纳米岛载体
磁珠银纳米岛载体的制备方法， 具体是按照以下歩骤进行的：
一、制备磁性 Fe304纳米粒子，并将其吸附到聚苯乙烯小球表面，得到磁珠； 二、 将磁珠加入到金纳米种子溶液中， 室温下搅拌 12小时， 使材料表面吸 附一层金纳米种子， 得到了表面吸附金纳米种子的磁珠；
三、 配置生长金纳米岛的反应溶液： 将 NH2OH加入到 AuHC 溶液中， 混 合均匀； 其中， 所述的 N OH与 AuHC 的摩尔比为 1： 1； 所述的 AuHC 溶 液的摩尔浓度为 1 mM; 四、 将歩骤二中得到的表面吸附一层金纳米种子的磁珠放入歩骤三中得到 的生长金纳米岛的反应溶液中， 在 20 °C下搅拌反应 60 min;
五、 将歩骤四中反应完成的磁珠离心， 用水清洗， 重新分散到水溶液中， 即得到磁珠金纳米岛载体。
对试验六歩骤一制备得到的磁性聚苯乙烯微球和试验六歩骤五得到的磁性 聚苯乙烯微球金纳米岛载体在磁铁富集作用前后分别进行了扫描电子显微镜测 试， 对比后得到图 7。 从图 7中， 可以看出磁性聚苯乙烯小球在吸附金纳米种子 功能载体后仍具有很强的磁富集效果。
对试验六得到的磁性聚苯乙烯微球金纳米岛载体进行紫外吸收光谱测试， 得到图 8。 从图 8中， 可以观察到在 540 nm处具有明显的金等离子吸收峰， 因 此可以证明磁性聚苯乙烯小球表面可以吸附金纳米种子， 从而为后面进一歩生 长金纳米岛膜提供材料支撑。
试验七： 金属纳米岛载体表面修饰肿瘤标志物抗体分子制备成微阵列生物 芯片在肿瘤的早期检测中的应用， 具体操作方法如下： 首先将 12种不同的肿瘤 标志物抗体：糖类抗原 CA19-9,糖类抗原 CA125,癌胚抗原 CEA,铁蛋白 Ferritin, 人类绒毛膜性腺激素 Beta-HCG, 甲型胎儿蛋白 AFP, 前列腺等异性抗原 PSA, 生长激素 HGH， 糖类抗原 CA15-3 , 神经元特异烯醇化酶 NSE等按不同的阵列 修饰到金属纳米岛功能载体表面， 再利用 5% BSA室温下封闭 2 h， 制备成微阵 列生物芯片。 然后将病人血清样品滴加到芯片表面， 抗体就会把相关的肿瘤标 志抗原捕获在表面， 最后加入荧光标记的二抗， 利用共聚焦扫描仪进行荧光信 号扫描和数据分析， 即可快速完成对肿瘤的筛査。
试验八： 金属纳米岛载体制备成微阵列生物芯片在系统性红斑狼疮的检测 中的应用。 （细胞因子分析） 红斑狼疮患者体内存在多种自身抗体， 95%以上病人抗核抗体阳性，可出现 抗 DNA (双股、 单股）、 抗组蛋白、 抗 RNA—非组蛋白、 抗核糖核蛋白 （主要 为 Smith抗原）、 抗粒细胞、 抗血小板、 抗平滑肌等抗体， 其中抗双股 DNA和 抗 Smith抗原具相对特异性， 阳性率分别为 60%和 30%， 而在其他结缔组织病 的阳性率， 均低于 5%。 利用玻片金属纳米岛载体表面修饰相应的单克隆抗体分 子微阵列， 制作生物芯片， 实现对系统性红斑狼疮的检测。
试验九： 金属纳米岛载体制备成微阵列生物芯片在类风湿性关节炎的检测 中的应用。 （细胞因子分析）
类风湿性关节炎是常见的以关节滑膜慢性炎症病变为主要表现的自身免疫 性疾病。 检测 RA病人免疫球蛋白及补体， 对了解 RA患者体液免疫功能及在 RA诊断、 判断预后及治疗效果等方面的作用具有重要作用。 利用金属纳米岛载 体表面修饰不同的单克隆抗体阵列，可以提高 RA患者血清中的免疫球蛋白及补 体、 类风湿因子 ：)、 抗环瓜氨酸肽抗体 (抗 -CCP：)、 C-反应蛋白 (CRP：)、 抗链球 菌溶血素 （ASO) 的检测灵敏度。
试验十： 金属纳米岛载体制备成微阵列生物芯片在乙型肝炎病毒的检测中 的应用。 （传染病检测）
HBsAg是乙型肝炎病毒（HBV)的外膜蛋白， 是血清中首先出现的标志物。 在急性肝炎时它很快消失， 若 6个月以后仍不消失者， 可成为慢性肝炎 （CH) 或 HBsAg携带者， 并可持续几年或几十年。 HBsAg的检测对于乙型肝炎的诊断 和鉴别、 流行病学的调査、 献血员的筛选、 预后判断及治疗效果的考察和药物 的筛选具有重要的意义。 在金属纳米岛载体表面上包被 HBs单抗， 制备乙肝病 毒检测试剂盒， 利用夹心法原理检测血清中 HBsAg。 若样本中含有 HBsAg, 则 被载体表面结合， 再加入荧光标记的抗 HBs多抗， 形成夹心复合物， 最后通过 扫描仪读数， 从而判定结果。
试验十一： 金属纳米岛载体表面修饰肿瘤标志物抗体分子制备成悬浮式生 物芯片在肿瘤的早期检测中的应用， 具体操作方法如下： 首先在以不同尺寸的 磁性聚苯乙烯小球等为基底制备金属纳米岛功能载体， 然后利用具有不同荧光 发射的量子点 （如 600， 700， 800 nm ) 分别对不同尺寸的聚苯乙烯小球进行编 码， 并在载体表面分别标记针对不同检测物的核酸、 抗体、 抗原等分子， 从而 实现对不同疾病的检测。 在捕获目标分子后用荧光标记的二抗对微球进行进一 歩的标记显色， 并利用自主研发的近红外流式细胞计数系统进行数据采集和分 子， 最终给出诊断结果。

Claims

WO 2015/139422 权 利 要 求 书 PCT/CN2014/085081
1、 一种金属纳米岛载体， 其特征在于： 金属纳米岛载体是在载体材料表面 形成金属纳米岛而得到的， 所述的金属纳米岛是分立的， 所述的金属纳米岛的 尺寸为 10~500 nm， 所述的金属纳米岛之间的间隙为 5~200 nm。
2、 根据权利要求 1所述的一种金属纳米岛载体， 其特征在于所述的载体材 料为固相材料或悬浮材料； 所述的固相材料为二维平面结构； 所述的固相材料 可以为玻片、 硅片、 石英、 聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜； 所述的悬浮材料 可以为玻璃微珠、 磁珠、 聚苯乙烯微球、 聚甲基丙烯酸甲酯微球、 聚苯乙烯磁 性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球； 所述的金属可以为银、 金 -银合金或银 / 金核壳结构。
3、 一种制备金属纳米岛载体的方法， 其特征在于： 制备方法具体是按照以 下歩骤进行的：
一、 在载体材料表面吸附一层金纳米种子， 得到了表面吸附金纳米种子的 载体材料；
二、 配置生长金属纳米岛的反应溶液： 将还原剂加入到含有金属离子的溶 液中， 混合均匀； 其中， 所述的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为 (：0.5~2：) : 1 ; 所述的金属离子的溶液的浓度为 0.1~5 mM;
三、 将歩骤一中得到的表面吸附一层金纳米种子的载体材料放入歩骤二中 得到的生长金属纳米岛的反应溶液中， 在 18~30°C下振荡反应 2~60 min;
四、 将歩骤三中反应完成的载体材料取出， 用水清洗， 干燥， 即得到金属 纳米岛载体。
4、 根据权利要求 3所述的制备金属纳米岛载体的方法， 其特征在于所述的 歩骤一中的金纳米种子是通过化学还原法还原 Au3+得到的， 然后利用物理吸附 或化学偶联相互作用结合到载体材料表面的； 所述的歩骤一中的载体材料表面 吸附的金纳米种子的粒径为 l~20 nm。
5、 根据权利要求 3所述的制备金属纳米岛载体的方法， 其特征在于所述的 歩骤一中的载体材料为固相材料或悬浮材料； 所述的固相材料为二维平面结构； 所述的固相材料可以为玻片、 硅片、 石英、 聚偏二氟乙烯膜或硝酸纤维素膜； 所述的悬浮材料可以为玻璃微珠、 磁珠、 聚苯乙烯微球、 聚甲基丙烯酸甲酯微 球、 聚苯乙烯磁性微球或聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球； 根据权利要求 7所述的 制备金属纳米岛载体的方法， 其特征在于所述的金属可以为银、 金 -银合金或银 / 金核壳结构。
6、 根据权利要求 3所述的制备金属纳米岛载体的方法， 其特征在于所述的 歩骤二中的还原剂为 NaBH4， NH2OH, N2H4, CH20或 C6H1206; 所述的歩骤二 中的金属离子溶液为 Ag+溶液或 Ag+与 Au3+的混合溶液。
7、 根据权利要求 3或 6所述的制备金属纳米岛载体的方法， 其特征在于所 述的歩骤二中的还原剂与含有的金属离子的摩尔比为 (0.7~1.5)： 1 ; 所述的歩骤 二中的金属离子的溶液的浓度为 0.3~5 mM。
8、 如权利要求 1或 2所述的金属纳米岛载体在免疫检测中的应用， 其特征 在于： 生物芯片中的捕获分子捕获相应的物质， 进行荧光扫描和数据分析， 进 而完成免疫检测， 其中使用所述金属纳米岛载体作为捕获分子的修饰载体制成 生物芯片。
9、 根据权利要求 8所述的金属纳米岛载体在免疫检测中的应用， 其特征在 于金属纳米岛载体在免疫检测中的应用包括： 所述的金属纳米岛载体表面修饰 肿瘤标志物抗体分子制备成生物芯片实现在肿瘤的早期检测中的应用； 所述的 金属纳米岛载体表面修饰自体免疫疾病相关的抗原、 抗体分子制备成生物芯片 实现在自体免疫疾病检测中的应用； 所述的金属纳米岛载体表面修饰乙肝抗体 分子、 流感病毒 DNS序列、 结合病抗体、 疟原虫抗原 （或抗体）、 大肠杆菌抗 体制备成生物芯片实现在传染性疾病的检测中的应用； 所述的金属纳米岛载体 表面修饰白细胞介素、 干扰素、 肿瘤坏死因子超家族、 集落剌激因子、 趋化因 子或生长因子的单克隆抗体制备成生物芯片实现在细胞因子的检测中的应用； 所述的金属纳米岛载体表面修饰对不同疾病的单克隆抗体制备成生物芯片实现 在对捕获的目标细胞分泌物进行 Elispot检测中的应用。
10、 根据权利要求 8或 9中所述的金属纳米岛载体在免疫检测中的应用， 其特征在于所述的生物芯片为微阵列生物芯片或悬浮式生物芯片。
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